PCR y Lateral Flow Aspergillus

Transcripción

1 Nuevas herramientas diagnósticas en Aspergilosis invasiva : PCR y Lateral Flow Aspergillus Dra. Paulette Legarraga Laboratorio Microbiología Departamento de Laboratorios Clínicos Pontificia Universidad Católica de Chile

2 Temas a tratar 1. Introducción métodos tradicionales 2. Lateral flow device Desarrollo del test Nuestra experiencia Desempeño en la literatura 3. PCR Generalidades del PCR Estandarización Experiencia Comparación con literatura Evidencia de la utilidad de este marcador 4. Conclusiones

3 Métodos diagnósticos actuales para infecciones fúngicas invasoras Método Características Visualización directa /Cultivo Baja sensibilidad (50%) y VPP 72%, colonización vía aérea Dificultad toma de muestra Galactomanano Sensibilidad 29 a 100%: Varía según: tipo de muestra, paciente y punto de corte Falsos positivos entre 5 a 83% (reactividad cruzada) Complejo? Costo B-D-glucano No es especifico Sensibilidad 64 a 100%, especificidad 45 a 92% Técnicamente complejo Costo

4 Habremos llegado? PCR y Lateral Flow

5 Purificación de anticuerpos monoclonales MAb JF5 del tipo IgG contra un epitope glicoproteico de Aspergillus Específicos para especies de Aspergillus pero con reactividad cruzada para Penicillium y Paecilomyces variotii Sin reactividad cruzada con β lactámicos o ciclofosfamida Thornton. CR. Clin. Vaccine Immunol. 2008, 15(7):

6 Localización glicoproteína Inmunofluorescencia muestra presencia del antígeno en pared y secretada durante crecimiento activo pero no en conidias no germinadas Thornton. CR. Clin. Vaccine Immunol. 2008, 15(7):

7 Desarrollo del test Desarrollo de un test en formato inmunocromatográfico

8 Meta-análisis Pan Z et al. Journal of Medical Microbiology (2015), 64, SUERO: Sensibilidad: 0,68(0,52-0,81) Especificidad: 0,87(0,8-0,92) LBA: Sensibilidad: 0,86(0,76-0,93) Especificidad: 0,93(0,89-0,96)

9 Evaluación del LFD en muestras de suero y LBA para el diagnóstico de Aspergilosis invasora en un Hospital Universitario Delama Ignacio 1, Legarraga Paulette 2,3, González Tamara 3, García Patricia 2, 3, Rabagliati Ricardo 1 1 Departamento Enfermedades Infecciosas del Adulto, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2 Departamento de Laboratorios Clínicos, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3 Laboratorio de Microbiología Red Salud UC-CHRISTUS. Análisis retrospectivo Se evaluaron los antecedentes clínicos de las muestras de GM congeladas en nuestro laboratorio ( ) Clasificación de las muestras según criterios EORTC: AI (+): AI probada/probable AI (-): no AI Se identificaron además las muestras de pacientes con AI posible

10 Resultados Se analizaron 142 muestras: 113 suero 29 a LBA 98 pacientes: 33 AI probada/probable (33.6%) 15 AI posible (15,3%) 53 sin AI (54%) Neoplasia más frecuente LMA (25%) Características pacientes Mediana de edad 50,9 años Sexo masculino 59 (60,2%) Enfermedad de base Neoplasia hematológica 43 (43,9%) Trasplante de órgano sólido 6 (6,1%) Trasplante de precursores hematopoyéticos 13 (13,3%) Tumor sólido 5 (5,1%) VIH/SIDA 5 (5,1%) Otro 20 (20,4%) Riesgo inmunológico RAN < 500 cel/mm3 11 (11,2%) RAN < 100 cel/mm3 31 (31,6%) Uso de corticoides 22 (22,4%) Terapia inmunosupresora 27 (27,5%)

11 Resultados Sensibilidad % (IC 95%) Especificidad % (IC 95%) LR(+) LR(-) Sangre 70.9%( ) 53.5%( ) 1.5 ( ) 0.54 ( ) LBA 83.3%( ) 38.5%(17.71,-64.48) 1.3 ( ) 0.43( ) Total 73.1%( ) 50% ( ) 1.4 ( ) 0.53( ) Sensibilidad comparable a otros marcadores pero con menor especificidad

12 Concordancia con GM Resultados GM LFD Negativo Positivo Total general Negativo Positivo Total general Concordancia entre ambos métodos de un 62.41%. El índice de concordancia Kappa fue de = 0.202, considerado como un acuerdo mediano

13 Positivo débil? Línea leve en todas las muestras incluso con buffer Requeriría de establecimiento de punto de corte (Held et al. Infection (2013) 41: )

14 Estudio multicéntrico Alto valor predictivo negativo 96% 19% muestras FP Eigl et al. Critical Care (2015) 19:178

15 PCR Aspergillus

16 PCR Aspergillus Desarrollada hace más de 20 años PCR in house Muestras: suero, sangre total y LBA Desempeño técnica presenta gran variabilidad entre los estudios Muestra utilizada Partidores (rrna, mitocondrial, otro) Método de extracción Criterios de positividad utilizados No incluida en los criterios EORTC por falta de estandarización de los métodos disponibles

17 Estandarización Recomendaciones Estándar acordado por la WHO que permitirá tener material para programas de control de calidad externo White PL et al. JCM 2010, 48(10):3753 White PL et al. JCM 2011, 49(11):3842.

18 Kits comerciales PCR-RT desarrollada por PathoNostics (AsperGenie) Detección de Aspergillus sp A. fumigatus A. terreus Detecta resistencia a azoles (L98H, Tandem repeat 34, T289A, Y121F) Uso en muestras LBA Tiempo de reacción: 2,5 hrs Validado para ser utilizado en LightCycler 480 (Roche), Rotor-Gene 6000 (Corbett) and Rotor- Gene Q (Qiagen) PCR-RT desarrollado por Myconostica Validado para muestras de suero y respiratorias Aprobación CE Disponible Kit de extracción Tiempo de procesamiento +/-4 hrs (completo) Cepheid SmartCycler, AB7500 (1.4), LightCycler 2.0 y Stratagene Mx3000 series

19 Desarrollo de un RT-PCR para la detección de Aspergillus fumigatus en pacientes con riesgo de aspergilosis invasora Wozniak A, Sanhueza F, Rabagliati R, Vizcaya C, Rivera G, Pérez R, Flores J, Miranda C, Castillo C y P García Objetivo: Desarrollar un test para detección de A. fumigatus en muestras de sangre, suero, o LBA de pacientes con riesgo de AI basado en una reacción de Q-PCR dirigida al rrna 28S Se analizaron de manera prospectiva 41 muestras (sangre, suero, tejido o LBA) de 23 pacientes con riesgo de AI provenientes del Hospital Clínico de la Universidad Católica. Clasificación de los pacientes según criterios EORTC (factores de riesgo, imagenología, resultados de GMN y cultivo) Pacientes con AI posible fueron considerados como negativos

20 Metodología PCR en tiempo real Partidores dirigidos a zona específica del RNA ribosomal 28S de A. fumigatus y sonda Taqman (Challier y cols., 2004; J Clin Micro 42: ). Se utiliza la plataforma de PCR Tiempo real de Applied Biosystems (StepOne) con una temperatura de annealing 57 C. StepOne (Applied Biosystems)

21 Resultados: parámetros analíticos y clínicos Diagnóstico Clínico Positivo Negativo Total Q-PCR Positiva Negativa Total LOD: 3,85 esporas/reacción Sensibilidad = 83% Especificidad = 100% VPP = 100% VPN = 88%

22 Resultados concordancia GMN y PCR GM Positivo Negativo Total Q-PCR Positiva Negativa Total Concordancia (ʎ) = / 37 = 76% Índice kappa = ʎ - P e / 1 - P e = 0,76 0,61 / 1 0,61 = 0,38 P e = 0,61 (proporción de concordancia por azar) Grado de concordancia real: Discreto Escala de valoración de kappa según Landis y Koch: Kappa grado de acuerdo < 0,00 sin acuerdo >0,00-0,20 insignificante 0,21-0,40 discreto >0,41-0,60 moderado 0,61-0,80 sustancial 0,81-1,00 casi perfecto

23 Desempeño general Sensibilidad en sangre es mejor que biomarcadores (GM y BDG) para la misma muestra White et al. JCM 2015;61(8):1293

24 Desempeño general La especificidad del PCR en LBA es mejor que la del GMN White et al. JCM 2015;61(8):1293

25 Desempeño general Sensibilidad en sangre es mejor que biomarcadores (GM y BDG) para la misma muestra White et al. JCM 2015;61(8):1293

26 Ventajas del uso de PCR

27 Uso combinado de marcadores y tratamiento empírico Estudio prospectivo, randomizado, 240 pacientes 2 grupos: con y sin uso de marcadores (PCR en sangre y GMN ) Resultados: Disminución del número de tratamientos empíricos Morrissey, et al. The lancet Infect Dis 2013; 13(6): 519

28 Ventajas del uso de PCR: disminución del tiempo para el diagnóstico Prospectivo, 200 pacientes Uso de GMN solo vs PCR y GMN Resultados: Uso de PCR permite un diagnóstico más precoz Aguado et al. CID 2015;60(3):405

29 Ventajas usos PCR junto a GMN: Buen VPN y sensibilidad Morrissey, et al. The lancet Infect Dis 2013; 13(6): 519

30 Conclusiones Métodos tradicionales necesarios LFD Aspergillus: Fácil realización Desempeño similar a GMN? Necesidad de establecer un punto de corte No disponible aún sesgo de publicación? PCR Kits comerciales disponibles Estandarización mejora su desempeño Tendría utilidad en muestras de suero/sangre El uso combinado de GMN junto a PCR demuestra una buena sensibilidad con un alto VPN pero no está definido su esquema de uso