Test de resistencia a ARV. Dra Cristina Marson Hospital Rawson
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- Juana Silva de la Cruz
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1 Test de resistencia a ARV Dra Cristina Marson Hospital Rawson
2 HIV RESISTENCIA A DR. Es la habilidad del virus VIH de entrar en la célula humana y multiplicarse en presencia de Drogas Antirretrovirales que usualmente impiden su replicación
3 CUAL ES LA IMPORTANCIA DE LA RESISTENCIA A ARV Una de las primeras causas de falla de tratamiento Su aparición basal es causa de respuesta sub-optima Puede ser transmitida Limita el uso de Dr. En el futuro
4 ORIGEN DE LA RESISTENCIA La replicación del VIH es sujeta a errores 2º a la ausencia de un mecanismo efectivo de lectura a prueba de errores Se genera un alto nº de mutaciones que resultan en la producción de proteínas no funcionales Algunas mutaciones emergen en los sitios blancos de los ARV
5 DEFINICIONES Virus Salvaje: virus original, previo al inicio de los ARV Fitness viral: habilidad de un virus para competir con otro virus en un ambiente definido. Ej. virus resistente sobre el salvaje Capacidad de replicación: se refiere a la habilidad del virus a replicar puede aumentar o disminuir con ciertas mutaciones
6 DEFINICIONES BARRERA GENETICA: numero de mutaciones especificas que son necesarias para hacer a un virus resistente a un medicamento especifico. FALLO VIROLOGICO: supresión viral incompleta, o rebote después de alcanzar los limites de detección ADHERENCIA : apego de las indicaciones para la toma de los medicamentos
7 TRATAMIENTO ARV Aumento de la expectativa de vida Diagnostico temprano Buenos tratamientos Mejorar la calidad de vida Régimen eficaz Simplificado Momento del inicio CD4 >500 Cel/mm3 Comienzo tardío <200 CD4
8 ESTRATEGIA DE SIMPLIFICACION Disminuir el nº de comprimidos Frecuencia de dosis Reducción cantidad de droga Reducción en la complejidad Mejorar adherencia
9 FACTORES RELACIONADOS ÉXITO VIROLOGICOS CV CD4 Basal Adherencia Adicciones Condición social Edad del paciente Tratamiento original Toxicidad / Efectos adversos de las drogas Calidad de la atención medica
10 REPUNTES VIROLOGICOS TRANSITORIOS BLIPS Valores de CV aislados y transitorios entre >50 y 1000 copias/ml.- No se asocian a mayor riesgo de fracaso virológico Ante la presencia de Blips debemos: evaluar adherencia, y barrera genética TAR Cuando es muy frecuente la presencia de Blips algunos autores lo asocian a MR
11 DEFINICION DE FALLO CLINICO: evento relacionado después de 3 meses de TARV INMUNOLOGICO: aumento de CD4,25-50 Cel/mm3 respecto del basal en 12 meses VIROLOGICO: CV >50 copias/ml, confirmada con una 2º medición de CV luego de 24 semanas de haber iniciado el trat. ARV (o haberse modificado)
12 FARMACOCINETICA MALA ADHERENCIA PROVISION IRREGULAR FALLO ATENCION MEDICA INTOLERANCIA TTO SUBOPTIMOS TOXICIDAD
13 DEBEMOS ANALIZAR SIEMPRE Tipo de fallo Tratamientos previos Tiempo de tratamientos previos Adicciones del paciente Antec. personales Enf. Oportunistas vs Marcadoras Enf. concomitantes Adherencia Relación medico/paciente Toxicidad / tolerancia CV Y CD4 Basales y actuales
14 IMPACTO DE MULTIPLES TTO ARV EN LA RESP. VIROLOGICA ARV en pacientes naive ARV en pacientes experimentados ARV en pacientes en 1º Fallo ARV en pacientes en 2º Fallo ARV en pacientes multifallados El 1º tratamiento debe ser el mejor
15 PARA QUE EXISTA RESISTENCIA Generalmente se necesitan mas de 2 Mutaciones Relevantes En el caso de IP de alta barrera genética mas de 3
16 TEST DE RESISTENCIA Ensayo de secuenciamiento del Gen del VIH para detectar mutaciones que confieren RESISTENCIA a drogas Antirretrovirales
17 Cuantas mutaciones se necesitan para crear resistencia? Mutaciones Sencillas: M184V (emtricitabina, lamivudine) K65R (tenofovir) L74V (didanosina) K103N (NNRTI) Mutaciones Múltiples: TAM s (estavudina, zidovudine) Protease (inhibidores de proteasas) Para la mayoría de las drogas se necesitan varias mutaciones para crear resistencia (Barrera genética alta) La resistencia no es todo o nada - es un continuo entre total susceptibilidad a total resistencia.
18 TAMS ANALOGOS TIMIDINICOS AZT-D4T Vía Buena: K67N, K70R, K219Q/E R de bajo nivel para: AZT, Menor R cruzada Vía Mala: M41L, T215Y, L210W Mayor nivel de resistencia R: AZT, Aumento de la R cruzada Reduce la susceptibilidad a Tenofovir Multirresistencia Q151, T69, 69SS Debe tener mas de 4 TAMS
19 Que es la Resistencia Viral? Una reducción de susceptibilidad continua al efecto inhibitorio de la droga. Mas Susceptible Mas Resistente
20 TIPOS DE RESISTENCIA SELECCIONADAS O ADQUIRIDAS por tratamiento 2º Secundarias -Puede perdurar mas de un año -Tienden a revertir a la forma salvaje NATURALES O PRIMARIAS/ TRANSMITIDAS -Previas al uso de fármacos debido a variabilidad viral.
21 SUPRESION VIRAL INCOMPLETA
22 RESISTENCIA A DR. FRACASO DE TERAPIA ARV FALTA DE ADHERENCIA INTOLERANCIA A DR. LA TOXICIDAD NIVELES INSUFICIENTES DE DR.
23 COMO OCURREN LAS RESISTENCIAS R. a drogas ocurre cuando la disminución de la susceptibilidad es tan severa que el virus no responde al tto. Un pte. puede estar R a todas las drogas incluyendo las que nunca utilizo La R a drogas es causada por patrones complejos de Mutaciones
24 CUANDO OCURREN LAS RESISTENCIAS Cuando el virus tiene la oportunidad de replicarse en presencia de concentración SUBINHIBITORIA de la DR. - No adherencia al tto - Farmacocinética o interacciones - que causan una exposición a dr. inadecuadas
25 POR QUE ES IMPORTANTE ENTENDER LA RESISTENCIA R es el factor que mas limita la eficacia de las dr. Las pruebas de R pueden ayudar a mejorar la respuesta al tratamiento R a la Dr. A puede llegar a causar R cruzada a la Dr. B R puede limitar las opciones terapéuticas
26 RESISTENCIA A LA TERAPIA ANTIRETROVIRAL COMO OCURREN LAS RESISTENCIAS? VIH se replica a gran velocidad se estima en 10 billones de partic. virales diarias VIH comete muchos errores [mutaciones] durante la replicación Algunos errores reducen la susceptibilidad a Dr. ARV
27 Dinámica del Virus y Resistencia a Drogas CARGA VIRAL t HAART Virus Salvaje (susceptible a droga) Virus Mutante (resistente a droga) TIEMPO
28 Por qué aparece carga viral si el tratamiento me estaba funcionando? Replicación Viral 100% < 20% Sensitivo El virus salvaje se replica mejor que el virus mutante en ausencia de droga Resistente El virus mutante se continua replicando en presencia de drogas. 0 TIEMPO
29 Dinámica del Virus y Resistencia a drogas Carga Viral t Mono terapia o dual Virus salvaje (susceptible droga) Virus mutante (resistente a droga) TIEMPO
30 Designación de letras para Aminoácidos A Alanina I Isoleucina R Aspargina C Citosina K Lisina S Serina D E Acido Aspártico Acido Glutámico L Leucina T Treonina M Metionina V Valina F Fenilalanina N Aspargina W Triptofano G Glicina P Prolina Y Tirosina H Histidina Q Glutamina
31 IDENTIFICANDO LAS MUTACIONES M184V 184 posición del Codón M Metionina Aminoácido salvaje WILD TYPE (VIH que no ha sido expuesto a drogas) V Valina Aminoácido Mutante METIONINA fue cambiado por VALINA
32 IDENTIFICANDO LAS MUTACIONES M184M Aa, salvaje en posición 184 M184V Aa mutante en posición 184 M184I Aa mutante en posición 184 M184M/V mezcla de Aa salvajes y mutantes en posición 184
33 RESISTENCIA RESISTENCIA PRIMARIA: es la observada en pacientes sin experiencia previa a ARV RESISTENCIA SECUNDARIA: es la presencia de Mutaciones relevantes en pacientes experimentados por presión de selección de dr. Baja prevalencia de resistencia primaria Transmisión global de cepas R en el mundo es del 9% aproximadamente
34 COMO SE MIDE LA RESISTENCIA IC50 es la concentración de droga requerida para inhibir el 50% de la replicación viral Mientras mas baja IC50 mas Potente es la droga
35 MEDICION DE RESISTENCIA FOLD CHANGE Nivel de cambio IC50 paciente/ic50 control Mayor nivel de cambio = A mayor R
36 RESISTENCIA GENOTIPICA GENOTIPICA: cambio en el genoma viral Detecta Mutaciones FENOTIPO: mide la habilidad del virus para crecer en diferentes concentraciones de ARV
37 GENOTIPO Detecta mutaciones Interpretación: requiere conocimientos de las Mutaciones seleccionadas y R cruzada Sensibilidad: mayor sensibilidad para detectar mezclas Costo: relativamente bajo
38 FENOTIPO Mide la habilidad del virus para crecer en diferentes concentraciones de dr Interpretación: visual por barras Sensibilidad: refleja susceptibilidad de la especie dominante Mayor costo
39 RESISTENCIA FENOTIPICA FENOTIPICA: es la reducción de la susceptibilidad del virus frente a una Dr. *Aumento de IC50 en relación a la cepa Patrón, denominada FC fenotípica O CCO2 feno virtual Cuantas veces cambio IC50 en la cepa Patrón
40 TEST DE RESISTENCIA META Seleccionar drogas activas para un nuevo régimen Ayudar a las decisiones de tratamiento Determinar si un virus Resistente fue transmitido
41 METODOLOGIA Amplificación del Gen TR y de la Proteasa por RT-PCR Secuenciamiento del ADN de ampliaciones generados por Especies Dominantes Las mutaciones están limitadas a aquellas presentes en + 20% de Viriones Plasmaticos
42 CUANTAS MUTACIONES SE NECESITAN PARA CREAR R MUTACIONES SENCILLAS M184V EMT 3TC K65R TDF L74V DDI K103N NNRTI MUTACIONES MULTIPLES TAM S D4T AZT PROTEASAS IP
43 PARA LA MAYORIA DE LAS DR. SE NECESITAN VARIAS MUTACIONES PARA CREAR RESISTENCIA BARRERA GENETICA ALTA *GENERALMENTE SON LOS IP
44 ~ 9 kb METODOLOGÍA PARA EL ESTUDIO DE RESISTENCIAS pol (RT/PR) Obtención de secuencias de gp41 Integrasa Uso de diferentes programas para corrección y análisis de secuencias
45 Pruebas de Genotipo y Fenotipo RNA de VIH Translación a una línea de amino ácidos Genotipo evalúa esto Doblado como una proteína funcional Fenotipo evalúa esto
46 MÉTODOS GENOTÍPICOS: Secuenciación Cebador marcado para replicación Cadena a secuenciar Plasma Extracción RNA viral RT-PCR cdna Amplicones 4 mezclas de reacción que incluye cada uno de los diferentes ddntp que paran la replicación Electroferograma Productos de la reacción de replicación Separación de productos por electroforesis
47 vircotype REPORT RESISTANCE ANALYSIS vircotype page 1
48 SUSCEPTIBILIDAD Sensible: IC50 4< Cepa Ref Parc.Res:IC > Cep.Ref Resistente: IC50 +10> Cep.Ref
49 FENOTIPO REAL CAPACIDAD DE REPLICACION EN CULTIVO FRENTE A DETERMINADAS CONCENTRACIONES DE ARV. PERMITE EL ANALISIS CUANTITATIVO DE CONCENTRACION DE DR. QUE SERIA NECESARIO PARA LA INHIBICION DE LA REPLICACION DEL VIRUS
50 FENOTIPO VIRTUAL Medición Cuantitativa estimada de susceptibilidad No detecta poblaciones minoritarias menos del 20% Provee CUT OFF clínicos obtenidos de una Base de datos, puntos de corte biológicos BCO CUT OFF de Max, y Min, estandarizados
51 Capacidad de Replicación La CR indica la habilidad del virus del paciente a replicarse relativo a la mediana de la población de virus salvaje (NL4-3) La mediana del valor de CR de una población salvaje de define como el 100%
52 MUTACIONES CLAVES INTR M184V TAMs mutaciones asociadas a los analogos de la timidina K65R L74V Mutaciones q confieren resistencia multiple: complejo Q151M, inserción T69S
53 Mutaciones claves para INNTR Baja barrera genética Mas comunes K103N, Y181C Reacción cruzada entre ellos Otras mutaciones adicionales Y188L, L100I, V106A, G190S/A, M230L (2 o mas mutaciones resistencia amplia de clase) Etravirina V90I, A98G, L100I ninguna se asocia a resistencia de alto nivel
54 SCORE DE SUSCEPTIBILIDAD DE ETRAVIRINA Esta basado en análisis genotypico El score esta basado por la suma de peso de las mutaciones presentes Monogram System, Tibotec system Score interpretación: 0-2 Susceptible Intermedia > 4: mayor o igual Resistente
55 RILPIVIRINA INNTR K101E, V189I, Y181C, V90I, H221Y, E138K mas frecuente, resistencia cruzada
56 INHIBIDORES DE PROTEASAS La mayoría IP tienen alta barrera genética La disminución de la sensibilidad requiere la acumulación de varias mutaciones Atazanavir: I50L 184v y N88S Darunavir: I50L, I54L/M,L76V Lopinavir: V32I, I47V/A Fosamprenavir I50V disminuye la susceptibilidad a LPV y DRV
57 IP Mutaciones múltiples afectaran a la mayoria de los IP probados Mutaciones mayores M46I, V82A/T/S, L90M IP busteados con ritonavir aumenta la barrera genética.-
58 INHIBIDORES DE LA INTEGRASA Y CCR Inhibidores de la Integrasa seleccionan mutaciones especificas que les confieren resistencia Tres vias identificadas para Raltegravir N155H Q148K/R/H resistencia de alto nivel Y143C/R Resistencia cruzada con elvitegravir
59 RESISTENCIA AL MARAVIROC Maraviroc: actúa bloqueando una de las membranas de superficie de los CD4 y el correceptor CCR5 el utiliza para unirse a ella y penetrar en su interior.- TROFILE co-receptor tropism assay
60 Hipersusceptibilidad a ZDV con resistencia a TDF, ABC, 3TC, NVP RT: K65R, 103N, M184V, Y181C
61 RECOMENDACIONES PARA EL USO DE PRUEBAS DE R FALLO TERAPUETICO NO SUPRESION SUPRESION INCOMPLETA RESPUESTA LENTA PACIENTES RECIENTEMENTE INFECTADOS EMBARAZADAS
62 RECORDAR El paciente debe estar con tratamiento ARV mínimo 20 a 30 días En lo posible con el mismo tratamiento que esta en fallo Debe tener mas de 1000 copias en su CV para considerar fallo ANALIZAR el test de resistencia conjuntamente con los test previos si los hubiere
63 RECORDAR Utilizar base de datos Realizar los cambios lo mas pronto posible Reforzar la adherencia Siempre utilizar por lo menos 2 dr nuevas activas
64 ALGORITMOS RESISTENCIA DB/default.htm
65 MUCHAS GRACIAS!!!
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