11 Número de publicación: Int. Cl.: 72 Inventor/es: De Simone, Claudio. 74 Agente: Carpintero López, Francisco

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 3/74 (06.01) C12N 1/ (06.01) A23L 1/ (06.01) A23G 4/12 (06.01) A61K 6/00 (06.01) A61P 31/00 (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Combinación de bacterias de ácido láctico y su uso para la prevención y/o tratamiento de infecciones y estados patológicos inflamatorios. Prioridad: IT RM99A00 73 Titular/es: ACTIAL Farmaceutica Lda. Rua dos Ferreiros, Funchal (Madeira), PT 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: De Simone, Claudio 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 ES T3 1 2 DESCRIPCIÓN Combinación de bacterias de ácido láctico y su uso para la prevención y/o tratamiento de infecciones y estados patológicos inflamatorios. La presente invención se refiere a una combinación de bacterias de ácido láctico y su uso para preparar un suplemento alimenticio, un producto para la higiene o una preparación farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de infecciones y estados patológicos inflamatorios causados por bacterias, virus u hongos, en especial en la boca, vagina, uretra, nariz, ojos oídos. Las bacterias de ácido láctico son bacterias Gram-positivas que producen ácido láctico mediante la fermentación de glucosa. Streptococcus thermophilus está incluida también esta definición por convenio. Es bien conocido que las cepas de bacterias lácticas que producen H 2 O 2 pueden actuar como reguladores de la flora bacteriana en orificios corporales y sobre membranas mucosas. Se ha demostrado que las bacterias lácticas productoras de H 2 O 2 pueden antagonizar E. coli, N. gonorrhoea, G. vaginalis, C. trachomatis, U. urealyticum y B. bivius. No obstante, estas bacterias tienen solo un beneficio limitado cuando se usan en la práctica médica. Esto se puede apreciar por el hecho de que las preparaciones basadas en bacterias lácticas (por ejemplo pesarios vaginales) destinadas al tratamiento de infecciones por los microorganismos anteriores (por ejemplo vaginitis) no están muy consideradas por los médicos, quienes prefieren tratar a sus pacientes con antibióticos o agentes quimioterápicos. Hasta donde llegan los conocimientos de los autores de la invención, no se ha atribuido acción antibacteriana o reguladora de la flora en orificios corporales y en membranas mucosas a bacterias lácticas que utilizan arginina. Se ha descubierto de forma sorprendente que la actividad de las bacterias lácticas productoras de H 2 O 2 se potencia de forma considerable mediante la adición de una o más cepas de bacterias lácticas que puedan utilizar arginina. La arginina forma parte de diversos péptidos encontrados en fluidos biológicos y también está presente como arginina libre. Muchas especies bacterianas la utilizan para su propia nutrición y crecimiento. Las bacterias lácticas que utilizan arginina pueden, por tanto, privar a otras bacterias patógenas o potencialmente patógenas de una cierta cantidad de arginina que -aunque no suficiente para interrumpir su crecimiento- hacen que sean más susceptibles a la acción del H 2 O 2 producido por las bacterias lácticas. La presente invención proporciona por tanto una combinación de bacterias lácticas como se define en las reivindicaciones, que comprende: 3 (a) un primer componente consistente en al menos una cepa de bacteria láctica productora de H 2 O 2, y (b) un segundo componente consistente en al menos una cepa de bacterias lácticas que utilizan arginina La cepa de bacterias lácticas en el componente (a) se elige de un grupo constituido por las cepas de las especies Lactobacillus crispatus, Lactobacillus salivarius y Lactobacillus casei, mientras que la cepa de la bacteria láctica en el componente (b) es la cepa Lactobacillus brevis CD2 depositada en el DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania el 6 de febrero de 1998 con el número de acceso DSM según el Tratado de Budapest. La relación del número de bacterias en el componente (a) al número de bacterias en el componente (b) varía con preferencia de 1:0 a 0:1 y, más especialmente de 1: a :1, siendo la relación más preferida 1:1. La combinación se puede administrar en forma de dosis unitaria que comprende de 1 x 2 a x 11 bacterias de componente (a) y de 1 x 2 a x 11 bacterias de componente (b), con preferencia 1 x 9 bacterias de componente (a) y 3 x 9 bacterias de componente (b). La combinación también se puede administrar en forma de comprimidos, comprimidos para desleír, caramelos, gomas de mascar, cápsulas de gelatina, pesarios, supositorios y microenemas, así como en forma de granulado, cremas dentales y geles, polvos para la dentadura postiza, enjuagues bucales, dentífricos, pulverizadores, suspensiones y pomadas. De acuerdo con otra realización de la invención, la combinación comprende además al menos otra cepa de bacteria láctica elegida del grupo constituido por: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum y Streptococcus thermophilus. La combinación también puede comprender vitaminas, bases de amonio cuaternario, sales minerales, antioxidantes y agentes contra la placa. 2

3 ES T3 La invención también se refiere al uso de una combinación de bacterias lácticas como se define en la reivindicaciones que comprende: (a) un primer componente consistente en al menos una cepa de bacteria láctica productora de H 2 O 2, y (b) un segundo componente consistente en al menos una cepa de bacterias lácticas que utilizan arginina para preparar un suplemento alimentario, un producto para la higiene o una preparación farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de infecciones y estados patológicos inflamatorios causados por bacterias, virus u hongos, en especial en la boca, vagina, uretra, nariz, ojos y oídos. Estas infecciones y estados patológicos inflamatorios incluyen gingivitis, periodontitis, mucositis y estomatitis causadas por fármacos y/o agentes físicos, síndrome de Behçet, diaqueratosis de la cavidad oral, glositis, llagas en la garganta, sialadenitis, sialolitiasis, penfingo, líquen plano, síndrome de Sjogren, vaginosis, vaginitis, uretritis, prostatitis, proctitis, otitis, conjuntivitis, rinitis, sinusitis, leucoplasia, aftas, herpes e infecciones por Helicobacter pilori en la cavidad oral. La combinación también se puede usar con ventaja para el tratamiento de la cavidad oral como desodorante oral, agente antiinflamatorio, anticaries y/o antiplaca. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar los diversos aspectos de la invención con más detalle aunque no se considerarán en modo alguno que son limitantes de la invención. Ejemplo 1 Se evaluó el efecto inhibidor de bacterias lácticas productoras de H 2 O 2 (Componente A); bacterias lácticas que utilizan arginina (Componente B); y la combinación de las dos cepas, de forma específica en la relación 1:1 (Combinación AB); sobre el crecimiento de bacterias potencialmente patógenas. De forma resumida, se ajustó primero el cultivo de las bacterias lácticas a ensayar a ph neutro, debido a que un ph ácido inhibe de por si el crecimiento bacteriano. La suspensión se sometió a filtración estéril y el filtrado se usó para impregnar una serie de discos de papel absorbente ( µl de filtrado por disco). Los discos se colocaron en una placa de medio de crecimiento selectivo que se había inoculado con 0,1 ml de Gardnerella vaginalis (una cepa que provoca vaginosis y que se aisló en un laboratorio) junto con un disco control que se impregnó únicamente con µl de agua destilada. Después de incubar durante 24 horas a 37ºC, se evaluó la inhibición del crecimiento de los patógenos midiendo el diámetro del halo alrededor del disco en milímetros. Se llevó a cabo una segunda serie de ensayos con Streptococcus mutans como patógeno diana, siendo esta especie el agente causante de la placa dental y la caries. La caracterización de las bacterias como productoras de H 2 O 2 se realizó por la reacción de benzidina peroxidasa clásica, que revela las colonias de bacterias que producen H 2 O 2 por una coloración azul. La actividad de arginina deshidrolasa se determinó para evaluar la capacidad de las bacterias lácticas para utilizar arginina (M.C. Manca de Nadra, Milchwissenschaft, 37 (1982) páginas ]. Las bacterias lácticas se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Estados Unidos. 4 Cepa bacteriana Halo de inhibición (actividad anti-g. vaginalis, mm) Productor de H 2 O 2 (Componente A) 0 6 Lactobacillus crispatus (ATCC 39197) 7 Lactobacillus salivarius (ATCC 11741) Lactobacillus crispatus + Lactobacillus salivarius 63 Utilizador de arginina (Componente B) Lactobacillus brevis (ATCC 14869) 0 Lactobacillus fermentum (ATCC 14931) 2 Lactobacillus brevis + Lactobacillus fermentum 0 Combinación AB (relación de A a B 1:1) Lactobacillus crispatus + Lactobacillus brevis 112 Lactobacillus crispatus + Lactobacillus fermentum 0 Lactobacillus salivarius + Lactobacillus brevis 117 Lactobacillus salivarius + Lactobacillus fermentum 4 3

4 ES T3 (Continuación) Productor de H 2 O 2 (Componente A) Cepa bacteriana Halo de inhibición (actividad anti-s. mutants, mm) Lactobacillus crispatus (ATCC 39197) 98 Lactobacillus salivarius (ATCC 11741) 2 Lactobacillus crispatus + Lactobacillus salivarius 99 Utilizador de arginina (Componente B) 1 2 Lactobacillus brevis (ATCC 14869) 0 Lactobacillus fermentum (ATCC 14931) 1 Lactobacillus brevis + Lactobacillus fermentum 1 Combinación AB (relación de A a B 1:1) Lactobacillus crispatus + Lactobacillus brevis 118 Lactobacillus crispatus + Lactobacillus fermentum 126 Lactobacillus salivarius + Lactobacillus brevis 121 Lactobacillus salivarius + Lactobacillus fermentum 1 Ejemplo 2 Se prepararon comprimidos para desleír con la siguiente composición unitaria: 3 Combinación AB (Lactobacillus salivarius + Lactobacillus brevis, relación 1:1) Manitol Sacarina Polioxietileno Estearato de magnesio Talco Sílice 00 millones 0 mg mg 0 mg 1 mg 2 mg mg 4 0 Estos comprimidos se administraron a cuatro voluntarios a los que se pidió que no se lavaran los dientes o usaran goma de mascar durante la semana anterior. Los sujetos tomaron tres comprimidos al día durante una semana, después de las comidas, dejando que los comprimidos se disolvieran en la boca. Las evaluaciones clínicas se realizaron tanto para el índice de placa dental como para el índice de placa gingival. Para la placa dental se usó el siguiente sistema de puntuación en seis dientes (primer molar superior derecho; incisivo central superior izquierdo; primer premolar superior izquierdo; primer molar inferior izquierdo; incisivo central inferior derecho; primer premolar inferior derecho): 0 - sin aparición de placa 1 - no hay placa visible 2 - placa visible placa muy evidente. El siguiente sistema de puntuación se adoptó para evaluar la placa gingival, usando el margen de los seis dientes anteriormente mencionados: 0 - sin inflamación 1 - ligera inflamación 4

5 2 - inflamación moderada con hemorragia al contacto ES T3 3 - inflamación notable, con tendencia a hemorragia espontánea. Los datos combinados obtenidos para los seis dientes de los cuatro voluntarios fueron los siguientes: Sujeto Índice de placa dental Índice de placa gingival días 0 7días Nº Nº Nº Nº Ejemplo Se trataron durante diez días cuatro sujetos con un diagnóstico clínico e histológico de úlceras aftosas recurrentes con seis comprimidos para desleír al día, cuya composición se da en el Ejemplo 2. Todos los pacientes tratados mostraron una curación completa de las úlceras al finalizar el curso de diez días y ninguno de ellos tuvo nuevas úlceras durante el mes siguiente. Para mejorar el aroma y apariencia de la combinación AB bacteriana, se pueden añadir agentes colorantes y edulcorantes adecuados, tales como sacarina, esencia de menta y xilitol, como es habitual y bien conocido por los expertos en la técnica. La combinación AB se puede administrar en forma de granulado, caramelos, goma de mascar, cápsulas de gelatina, cremas y geles dentales, polvos para la dentadura postiza, enjuagues bucales, dentífricos, comprimidos, pesarios, supositorios, pulverizadores, suspensiones y microenemas. Ejemplo 4 Preparación de una pasta dental Base de pasta dental 4 0 Composición porcentual: Fosfato cálcico dihidratado 37,% Glicerol (8% en agua),0% Aroma (aceite de menta) 1,0% Carboximetilcelulosa sódica 1,0% Agua purificada,8% Sacarina sódica (solución acuosa al 1%) 2,% Lauril sulfato sódico 2,0% Agua purificada,2% 0,0% 6 Composición en peso: Fosfato cálcico dihidratado Glicerol (8% en agua) Aroma (aceite de menta) Carboximetilcelulosa sódica Agua purificada Sacarina sódica (solución acuosa al 1%) Lauril sulfato sódico Agua purificada 337, g 270,0 g 9,0 g 9,0 g 187,2 g 22, g 18,0 g 48,8 g 900,0%

6 ES T3 El glicerol se añadió al fosfato cálcico dihidratado, que se había molido y pasado a través de un tamiz de malla 0. La mezcla se dejó hidratar, dando lugar a una pasta homogénea densa. El aroma (1% de esencia de menta) se añadió en este punto. Se hidrato la carboximetil celulosa de sodio en agua durante la noche (concentración de 4,6% en agua purificada). La solución de sacarina sódica se añadió al gel espeso resultante. El gel polimérico se vertió en un mortero que ya contenía el fosfato cálcico que se había hidratado con glicerol y se mezclaron intensamente los componentes. Se preparó por separado una solución aproximadamente 28% de laurilsulfato sódico en agua purificada. 1 2 La solución de laurilsulfato sódico se añadió entonces a la pasta espesa de fosfato dicálcico. La pasta homogénea espesa resultante, que tenía buenas propiedades reológicas se mezcló durante unos pocos minutos y luego se refinó haciéndola pasar por una refinador con rodillos. Esto proporcionó una pasta homogénea color blanco nieve con un agradable aroma de menta. Se hicieron pasar a través de un tamiz de malla 0 38, g de bacterias lácticas liofilizadas (L. salivarius + L. brevis, 1 : 1; CFU/g) y se añadió en pequeñas porciones al resto (770 g) de la base de pasta dental anterior. La pasta homogénea resultante tenía un color marrón ligeramente pálido y un olor a menta. Ejemplo Preparación de comprimidos vaginales de liberación rápida Se prepararon comprimidos vaginales recubiertos con una capa efervescente mediante granulación por vía húmeda. Los comprimidos pesaban mg cada uno y contenían 0 mg de la combinación de bacterias lácticas como sustancia activa. Cada comprimido vaginal tenía la siguiente composición: 3 4 Bacterias lácticas liofilizadas y seleccionadas ( x 9 de L. brevis, x 9 de L. salivarius y 90 x 9 de L. plantarum por gramo) Lactosa Almidón de maíz Ácido adípico Bicarbonato sódico Estearato de magnesio Ácido esteárico Sílice coloidal 0,0 mg 1368,0 mg 246,0 mg 192,0 mg,0 mg,0 mg 9,0 mg,0 mg,0 mg 0 6 6

7 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Combinación de bacterias de ácido láctico que comprende 1 (a) un primer componente constituido por al menos una cepa de bacteria láctica productora de H 2 O 2, y (a) un segundo componente constituidos por al menos una cepa de bacteria láctica que utiliza arginina, seleccionándose el componente (a) del grupo constituido por las cepas de las especies Lactobacillus crispatus, Lactobacillus salivarius y Lactobacillus casei, y el componente (b) es la cepa Lactobacillus brevis CD2 depositada en el DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, el 6 de febrero de 1998 con número de acceso DSM a tenor del tratado de Budapest. 2. Combinación según la reivindicación 1, en la que la relación del número de bacterias en el componente (a) al número de bacterias en el componente (b) varía de 1:0 a 0:1. 3. Combinación según la reivindicación 2, en la que la citada relación varía de 1: a :1. 4. Combinación según la reivindicación 3, en la que la citada relación es 1: Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en unidades de dosis unitaria que comprenden de 1 x 2 a x 11 bacterias de componente (a) y de 1 x 2 a x 11 bacterias de componente (b). 6. Combinación según la reivindicación, que comprende 1 x 9 bacterias de componente (a) y 3 x 9 bacterias de componente (b). 7. Combinación según la reivindicación ó 6, en forma de comprimidos, comprimidos para desleír, caramelos, goma de mascar, cápsulas de gelatina, pesarios, supositorios y microenemas. 8. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en forma de granulados, cremas y geles dentales, polvos para la dentadura postiza, enjuagues bucales, dentífricos, pulverizadores, suspensiones y pomadas. 9. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos una cepa adicional de bacteria láctica elegida de un grupo constituido por Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum y Streptococcus thermophilus.. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además vitaminas, bases de amonio cuaternario, sales minerales, antioxidantes y agentes contra la placa. 11. Uso de una combinación de bacterias lácticas que comprende: (a) un primer componente constituido por al menos una cepa de bacteria láctica productora de H 2 O 2, y (b) un segundo componente constituido por al menos una cepa de bacteria láctica que utiliza arginina, seleccionándose el componente (a) del grupo constituido por las cepas de las especies Lactobacillus crispatus, Lactobacillus salivarius y Lactobacillus casei, y el componente (b) es la cepa Lactobacillus brevis CD2 depositada en el DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, el 6 de febrero de 1998 con número de acceso DSM a tenor del tratado de Budapest, para preparar un suplemento alimentario, un producto para la higiene o una preparación farmacéutica que tiene actividad inhibidora del crecimiento del agente patógeno para la prevención y/o tratamiento de infecciones y estados patológicos inflamatorios causados por bacterias, virus u hongos, en especial en la boca, vagina, uretra, nariz, ojos y oídos. 12. Uso según la reivindicación 11, en la que las infecciones y estados patológicos inflamatorios incluyen gingivitis, periodontitis, mucositis y estomatitis provocados por fármacos y/o agentes físicos, síndrome de Behçet, diaqueratosis de la cavidad oral, glositis, llagas en la garganta, sialadenitis, sialolitiasis, penfingo, líquen plano, síndrome de Sjogren, vaginosis, vaginitis, uretritis, prostatitis, proctitis, otitis, conjuntivitis, rinitis, sinusitis, leucoplasia, aftas, herpes e infecciones por Helicobacter pilori en la cavidad oral. 13. Uso según la reivindicación 11 ó 12 para el tratamiento de la cavidad oral como como agente antiinflamatorio, anticaries y/o antiplaca. 14. Uso según la reivindicación 11, para el tratamiento de la cavidad oral como desodorante. 1. La composición según la reivindicación 1, en la que el componente (a) es Lactobacillus crispatus. 7

8 ES T3 16. La composición según la reivindicación 1, en la que el componente (a) es Lactobacillus salivarius. 17. La composición según la reivindicación 1, en la que el componente (a) es Lactobacillus salivarius y el componente (b) comprende además Lactobacillus fermentum. 18. La composición según las reivindicaciones 13-17, en la que la relación del número de bacterias en el componente (a) al número de bacterias en el componente (b) es 1: