UNIVERSIDAD DE GRANADA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Fisiología Vegetal

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1 UNIVERSIDAD DE GRANADA FACULTAD DE CIENCIAS Deprtmento de Fisiologí Vegetl CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN Deprtmento de Microiologí TESIS DOCTORAL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA DE LAS PLANTAS A ESTRESES OSMÓTICOS INDUCIDOS POR MICROORGANISMOS AUTÓCTONOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL (HONGOS MICORRÍCICO ARBUSCULARES Y BACTERIAS) ADRIANA MARULANDA AGUIRRE Grnd, 26

2 Editor: Editoril de l Universidd de Grnd Autor: Adrin Mrulnd Aguirre D.L.: Gr ISBN:

3 UNIVERSIDAD DE GRANADA FACULTAD DE CIENCIAS Deprtmento de Fisiologí Vegetl ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Deprtmento de Microiologí del Suelo y Sistems Simióticos ESTUDIO DE LOS MECANISMOS IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA DE LAS PLANTAS A ESTRESES OSMÓTICOS INDUCIDOS POR MICROORGANISMOS AUTÓCTONOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL (HONGOS MICORRÍCICO ARBUSCULARES Y BACTERIAS) Memori que present l Ingeniero Agrónomo Adrin Mrulnd Aguirre pr spirr l Título de Doctor Fdo.: Adrin Mrulnd Aguirre Vº Bº Los Directores Fdo.: Dr.Dª Rosrio Azcón González de Aguilr Profesor de Investigción Estción Experimentl del Zidín CSIC Fdo.: Dr.Dº.José Miguel Bre Nvrro Profesor de Investigción Estción Experimentl del Zidín CSIC

4 Los trjos de investigción que se exponen en l presente Memori de Tesis Doctorl, fueron relizdos en el grupo de Micorrizs del Deprtmento de Microiologí del Suelo y Sistems Simióticos de l Estción Experimentl del Zidín, finncido l myor prte por un ec predoctorl concedid por l Agenci Espñol de Cooperción Interncionl (AECI). Los resultdos presentdos en est Tesis Doctorl hn sido pulicdos en ls siguientes revists interncionles: Mrulnd, A., Azcón, R., Ruiz-Lozno, J.M. Contriution of six rusculr mycorrhizl fungl isoltes to wter uptke y Lctuc stiv plnts under drought stress. Physiologi Plntrum (23) 119: Mrulnd-Aguirre A; Porcel R; Bre JM nd Azcón R. Drought tolernce nd ntioxidnt ctivities in lvender plnts colonized y ntive drought-tolernt or droughtsensitive Glomus species. Mycroil Ecology (26). Envido Mrulnd, A., Bre, J. M., Azcón, R. n indigenous drought-tolernt strin of Glomus intrrdices ssocited with ntive cteri improves wter trnsport nd root development in retm spherocrp. Mycroil Ecology (26). En impresión Mrulnd-Aguirre, A.; Azcón, R.; Ruiz-Lozno, J.M.; Aroc, R. Opposite effects Bcillus megterium on Lctuc stiv L. growth depending on the rusculr mycorrhizl fungi co-inoculted: Physiologicl nd iochemicl trits. Journl Plnt Growth Regultion (26) Envido Mrulnd-Aguirre, A.; Azcón, R.; Bgo, A. Interctions etween the rusculr mycorrhizl (AM) fungus Glomus intrrdices nd two utochthonous cteri from isoltes semirid mediterrnen ecosystem: A dixenic culture study. New Phytol (26) Envido Así mismo, prte de los resultdos de est Tesis Doctorl hn sido presentdos en los siguientes Congresos y Reuniones Científics: COST 838 Prg (Aril, 26). Congreso Interncionl de Micorrizs "Exploring nd Exploting the Nturl AM Fungl Diversity in Stressed Soil-Plnt Systems". Grnd. Espñ. (Julio, 26)

5 A mis pdres y hermn

6 Piens, cree, sueñ y trévete WALT DISNEY

7 AGRADECIMIENTOS El cmino no h sido siempre fácil, sin emrgo l espernz, los sueños e ilusiones no hn dejdo nunc de estr presentes. Sueños de los cules ustedes hn sido cómplices incondicionles. Por eso, mil grcis. No es fácil pr mi escriir est prte sin olvidr lguien, y no urrir l lector. Espero por tnto, que estos grdecimientos no sen un mero listdo de nomres, sino que todos y cd uno de los que he enumerdo hn significdo lgo pr mí durnte estos cinco ños que h durdo l relizción de est tesis doctorl. Antes de nd, quiero grdecer Pilr, Antonio y Pedro. Mi fmili en Grnd. Por estr siempre hí desde el principio hst el finl, dí dí; poyándome, nimándome en los momentos difíciles que se psn en culquier tesis y en l vid. Agur. Y l fmili Ry Grrido, por comprtir sus ilusiones y legrís. Seguidmente, grdecer mis directores de Tesis. Los doctores Dª Rosrio Azcón González y D. José Miguel Bre Nvrro, por herme ddo l oportunidd de estr en su grupo y poder relizr est tesis doctorl. Quiero grdecerles demás, su yud, poyo y enseñnzs lo lrgo de este periodo de mi vid, sin olvidr l mistd que me h unido ellos, no sólo en el plno profesionl, sino tmién en el personl. Chro y José Miguel no hn sido únicmente mis directores de Tesis, Hn sido y son stnte más. Tmién quiero grdecerles el her intentdo infundirme l comprensión, l pcienci, l sidurí, el conocimiento y un espíritu de trjo que dn continumente, no con plrs, sino como dee de ser, con su ejemplo dirio. A l Dr. Concepción Azcón, que como sudirector de l EEZ, siempre est corriendo por los psillos intentndo que todo slg ien y l Dr. Nuri Ferrol, siempre dispuest solucionr culquier prolem, que con su pregunt que como v todo durnte los pseos en el scensor, me h infundido ánimos pr seguir delnte. Al Dr. Jun Mnuel Ruiz Lozno, por que durnte el trnscurso de est tesis h sido como un director más, siempre disponile pr resolver culquier dud y dr un consejo con un plr criños, muchs grcis Junm. Al Dr. Alert Bgo, por su simptí l reciirme en su escritorio y tener un chiste pr culquier situción complicd. Quiero grdecer mis compñeros del lortorio: Iván, siempre hs estdo pr escuchrme y yudrme en los momentos que ms he necesitdo un migo, y son tres ños que llevmos juntos y espero que sen muchos más, eres el mejor, compi!!, Plo y Crlos que unque y no están con nosotros siempre serán prte del 31. A mis compñeros de grupo: Almuden, Astrid que estuvieron conmigo los primeros ños, Crmen l crmel l niñ ms criños y l mejor mig, te voy extrñr pr

8 comer, Custodi, Chon, Jvier, José, Mri crmen, Ricrdo, un person encntdor, no tengo plrs pr grdecerte lo mucho que me hs yuddo l terminr, espero que todo te vy muy ien, Rosit y Soni, tu eres l siguiente!! A los recién incorpordos: Alí, Antonio, Jco, Jun, Jvier, Krim, Mri José, Plom, Silvi, Vness, y Virgini Animo!!! A los de los otros deprtmentos por su yud Y en generl tods ls persons de l Estción Experimentl del Zidín, que de un u otr form hn contriuido l desrrollo de est tesis: Germán, José Luis, Mri Pep, Mosse, Slomé, Virgini, Yimi y el Sr. Ricrdo, que con su legrí se hce el trjo más grdle. A mis migos, los que he podido conservr lo lrgo de mi vid: Andre, Roert, y Rfel, grcis por sus compñí durnte el trnscurso de est tesis. A los que y se fueron, pero siguen siendo migos: An, Edson, Myr, Jhon, Jcqueline, Andre. A mis migos de Colomi en Grnd: Din, Alejndro, Mrcel, Pol y l últim en llegr Crol, por esos momentos pr ñorr l comid, l músic y el pisje Colomi, te quiero!. Al resto de mis migos: Chro, Belén, Emilio, Glori, Jesús, Lur, Miguel Teres y por supuesto los de l comid de los viernes que seguro me flt lguno por mencionr. Por último, pero no por ser menos importnte, mis pdres, Ros Mº y Jvier, si no fuer por ellos no estrí quí escriiendo, grcis por intentr infundirme lo lrgo de mi vid, l ondd, l honrdez, l constnci y l dedicción, vlores de los que siempre estré muy orgullos. A mi hermn, Crolin, por herme soportdo tod su vid y mis primos, que con su ejemplo me nimn seguir delnte. Muchs grcis todos!!!

9 Índice ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN 1. Nturlez, interés y finlidd de l investigción Ojetivos Ojetivo generl Ojetivos específicos Antecedentes iliográficos El déficit hídrico Crcterístics de los ecosistems mediterráneos Micorrizs rusculres. Su importnci e implicción en el estrés hídrico de los vegetles Bcteris PGPR. Crcterístics e identificción de isldos ntivos y su cpcidd protector frente condiciones dverss Importnci de l intercción de los isldos hongos MA y cteris PGPR en l protección ls plnts frente condiciones dverss II. MATERIAL Y MÉTODOS GENERALES 1. Mteril iológico y condiciones de crecimiento Mteril vegetl Plnts utilizds Cultivo de plnts Sustrto utilizdo Esterilizción, germinción y siemr de semills Solución nutritiv Condiciones de cultivo Determinción del estdo hídrico del suelo Mteril fúngico Hongos MA utilizdos Producción y conservción de inoculo Tinción de ríces micorrizds Tinción con Azul Tripán (TB) Tinciones vitles Succinto deshidrogens (SDH) Fosfts lclin (ALP) Cuntificción de l colonizción micorrícic Longitud del micelio extrrdicl Cultivo monoxénico Mteril cterino Aislmiento de cteris prtir de suelo rizosférico Identificción de cteris i

10 Índice Inoculción de cteris Conservción de ls ceps Determinciones fisiológics Producción de ioms Cuntificción de nódulos Longitud de ríz Contenido hídrico Determinciones ioquímics y enzimátics Determinciones ioquímics Aundnci nturl de 13 C Concentrción de nutrientes Determinción del AIA Glomlin Determinciones enzimátics en el suelo Actividd deshidrogens Actividd fosfts Actividd glucosids Análisis estdísticos Presentción de los experimentos 29 III. CAPITULOS ESPECÍFICOS Cpítulo 1. Evlución generl de los isldos utóctonos (hongos AM y cteris) de l Sierr de Bz crcterístics y mecnismos de tolernci condiciones dverss Evlución de l ctividd de los hongos MA utóctonos que resultn más eficientes en condiciones de limitd disponiilidd hídric Evlución de l efectividd de los hongos MA utóctonos isldos prtir de suelo rizosférico de l Sierr de Bz Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Estudio de l cpcidd de los microorgnismos de vid lire utóctonos (cteris) pr l producción de metolitos secundrios relciondos con su ctividd jo condiciones de estrés Selección de ls cteris ms representtivs en suelo (Bz) rizosférico, y evlución de su vitlidd y ctividd niveles crecientes de estrés osmótico (inducido con PEG) Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones ii

11 Índice Evlución de l efectividd de los isldos cterinos utóctonos, jo condiciones de estrés hídrico: Ensyo en microcosmos sore el desrrollo vegetl Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Determinción si ls cteris islds son exclusivmente rizosférics o son cpces de desrrollrse endofíticmente Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Nivel de tolernci y dptción l estrés osmótico (vlordo en términos de ufc ml -1 y prolin) de ls especies utóctons islds frente un PGPR usd como de referenci (B. thuringiensis) Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Evlución de l intercción de los isldos utóctonos (hongos MA y cteris) y estudio de los mecnismos fisiológicos y ioquímicos relciondos con su ctividd de protección de ls plnts jo condiciones de limitción hídric Evlución de l intercción hongos MA-cteris utóctonos en microcosmos Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Evlución de l dinámic de infección de los isldos MA utóctonos G. constrictum y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Determinción de l intercción G. intrrdices proveniente de cultivo monoxénico (de colección) con microorgnismos isldos en l Sierr de Bz, en microcosmos Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones iii

12 Índice Evlución de l dinámic de infección de los isldos MA utóctonos G. mossee y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Evlución de l dinámic de l infección de los isldos AM, G. mossee utóctono y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Determinción de l cpcidd colonizdor del micelio producido por G. mossee (MA ó MR) y generdo jo l influenci del metolismo microino P. putid o B. megterium Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Determinción de l intercción direct (no medid por l plnt) entre los endofitos G. mossee (utóctono o de referenci (BEG 119) con B. megterium (l más tolernte l estrés osmótico y más eficiente (en términos de crecimiento) Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Conclusiones Cpítulo 2. Contriution of six rusculr mycorrhizl fungl isoltes to wter uptke y Lctuc stiv L. plnts under drought stress Resumen Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Discusión Agrdecimientos Cpítulo 3. Drought tolernce nd ntioxidnt ctivities in lvender plnts colonized y ntive drought-tolernt or drought-sensitive Glomus species Resumen Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Discusión Agrdecimientos iv

13 Índice Cpítulo 4. Un indigenous drought-tolernt strin of Glomus intrrdices ssocited with ntive cteri improves wter trnsport nd root development in Retm spherocrp Resumen Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Discusión Cpítulo 5. Physiologicl nd iochemicl trits in the interction etween three strins of Glomus ssocited with ntive cteri in Lctuc stiv L. under nutritionl stress conditions Resumen Mteril y Métodos Determinciones Resultdos Discusión Agrdecimientos Cpítulo 6. Interctions etween the rusculr mycorrhizl (AM) fungus Glomus intrrdices nd two utochthonous cteri from isoltes semirid mediterrnen ecosystem: A dixenic culture study Resumen Mteril y Métodos Resultdos Discusión Conclusión Agrdecimientos V. CONCLUSIONES VI. BIBLIOGRAFÍA v

14 I. Introducción I. INTRODUCCIÓN 1. Nturlez, interés y finlidd de l investigción L escsez de gu se perfil como uno de los prolems ms grves que v ordr l humnidd este siglo. En Espñ, ls zons árids y semi-árids constituyen csi l mitd del territorio ncionl, lo que lo convierte en el pís europeo con más extensión de zons con riesgo de desertificción. En el sur-este de Espñ, concretmente en l provinci de Grnd (Sierr de Bz), se encuentr un ecosistem mediterráneo crcterizdo por un precipitción escs y vrile y un lto impcto humno. L limitción hídric, produce tierrs secs con ecosistems frágiles, ltmente susceptiles de degrdción, por lo cul se consider uno de los principles fctores limitntes del crecimiento y l producción vegetl; que contriuye l deterioro del sistem suelo-plnt, desencdenndo un círculo de efectos negtivos:. L crenci de plnts degrd el suelo y l vid microin y. L usenci de propágulos microinos, fect culquier proceso nturl inducido de revegetción, presentndo prolems pr prosperr decudmente. El conocimiento de los mecnismos fisiológicos que ls plnts desrrolln pr tolerr un determindo tipo de estrés osmótico es de sum importnci pr el éxito de su dptción en este miente y su potencil uso en progrms de reforestción. L resistenci de ls plnts un estrés, se estlece por l proporción entre el estrés externo y el cmio interno de ests; y el estrés, puede definirse como un fctor externo que produce un efecto negtivo sore l fisiologí de l plnt. El nivel ó rngo del estrés iológico se mide como un intensidd o un concentrción. Un de ls estrtegis que hn desrrolldo ls plnts pr tolerr el estrés hídrico, demás de ls estrictmente fisiológics, como: reducción del áre folir y cmio en ls relciones hídrics, en lgunos csos scisión de hojs, etc., es l socición con microorgnismos rizosféricos (hongos y cteris), con vists incrementr tnto el potencil explortorio de sus ríces pr umentr, l disponiilidd de los nutrientes. Ls ríces liern l medio circundnte pequeñs cntiddes de compuestos orgánicos como zúcres o minoácidos, que fvorecen el crecimiento de diversos microorgnismos su lrededor, generándose un comunidd enormemente complej por sus intercciones que se conoce como rizosfer. Ls intercciones en l rizosfer, pueden ser tnto positivs como negtivs. Dependiendo de los microorgnismos implicdos, si l intercción es positiv, su efecto consiste en estimulr el desrrollo de l plnt y propicin que se ctiven los mecnismos de defens y se expresen respuests ioquímics, como son, entre otrs, ctividdes fotosintétics, ctividdes enzimátics (metolismos del monio, 1

15 I. Introducción metolismo oxidtivo, proteíns, prolin, especies rectivs de oxígeno (ROS), etc.), en respuest de defens locl. 2. Ojetivos 2.1. Ojetivo generl Evlur los efectos y los mecnismos implicdos en l resistenci de ls plnts estreses generdos por l flt de gu, inducidos por ls intercciones de microorgnismos promotores del crecimiento vegetl (hongos micorrícico rusculres y cteris) utóctonos de l zon mediterráne en el desrrollo de ls plnts típics de est zon Ojetivos específicos 1. Evlución generl de los isldos utóctonos (hongos AM y cteris) de l Sierr de Bz crcterístics y mecnismos de tolernci condiciones dverss 1.1. Evlur l ctividd de los hongos MA utóctonos que resultn más eficientes en condiciones de limitd disponiilidd hídric Estudir l cpcidd de los microorgnismos de vid lire utóctonos (cteris) pr l producción de metolitos secundrios relciondos con su ctividd jo condiciones de estrés Evlur l intercción de los isldos utóctonos (hongos MA y cteris) y estudir los mecnismos fisiológicos y ioquímicos relciondos con su ctividd de protección de ls plnts jo condiciones de limitción hídric. 2. Anlizr ls diverss ctividdes que llevn co los hongos MA del género Glomus, los más comunes en el contexto del desrrollo de ls plnts en sistems sosteniles en suelos neutro-lclinos crcterísticos del áre mediterráne: 2.1. Evlur ls crcterístics diferenciles que presentn los hongos MA pr yudr ls plnts prosperr en situciones de sequí y limitción nutritiv Estudir los mecnismos implicdos en los hongos MA dptdos condiciones de estrés frente otros de referenci. 2

16 I. Introducción 3. Evlución de l comptiilidd y efectividd de isldos microinos simiontes (hongos MA) y sprofitos (cteris) y quellos fctores que rigen l dptilidd de los hongos MA, de los microorgnismos promotores del crecimiento vegetl y de l socición de estos jo estrés osmótico en condiciones de inverndero: 3.1. Determinr los cmios en ls crcterístics iológics (ctividdes enzimátics) y físico-químics que se producen en l plnt inoculd y que puedn estr relciondos con l tolernci ls condiciones de estrés Determinr los mecnismos fisiológicos y ioquímicos que en el vegetl inoculdo (hongo MA y cteri) podrín están implicdos en l protección de ls plnts frente l estrés. 4. Determinción de l intercción específic de los isldos utóctonos (hongos MA y cteris) en cultivo dixénico, jo condiciones de estrés osmótico medinte dición de NCl. 3. Antecedentes iliográficos L informción disponile se v nlizr sistemtizdmente como sigue: 3.1. El déficit hídrico 3.2. Crcterístics de los ecosistems mediterráneos 3.3. Micorrizs rusculres. Su importnci e implicción en el estrés hídrico de los vegetles 3.4. Bcteris PGPR. Su cpcidd protector frente condiciones dverss 3.5. Importnci en l intercción de hongos MA y cteris PGPR en l protección ls plnts frente condiciones de estrés 3

17 I. Introducción 3.1. El déficit hídrico El Estrés hídrico El déficit hídrico es considerdo unos de los fctores ióticos más importntes y limitntes del crecimiento y desrrollo vegetl (Ruíz- Lozno, 23). Aunque diverss especies de plnts pueden vrir en su sensiilidd y respuest l disminución del potencil de gu cusdo por el déficit hídrico, puede ser sumido que tods ls plnts tienen un cpcidd innt pr expresr respuests l estrés (Bohnert et l., 1995). El déficit de gu ocurre cundo l ts de trnspirción excede l cptción de gu, y este es un componente de diferentes estreses, incluyendo l sequí, l slinidd y l j tempertur. L hilidd de tod plnt pr responder y sorevivir l déficit hídrico depende completmente de los mecnismos de l plnt que puedn integrr ls respuests celulres (Bry, 1997) Efectos fisiológicos del déficit hídrico El juste osmótico es unos de los mecnismos que utiliz l plnt pr mntener su turgenci celulr pesr de encontrrse en situciones de disminución del potencil hídrico (Azcón-Bieto, 1993). El juste osmótico posiilit sí el mntenimiento, en condiciones de sequí, de l turgenci y de los procesos dependientes de l mism. Este juste osmótico se produce por un concentrción ctiv de solutos en l célul. Al umentr l osmolridd, disminuye el potencil hídrico del citoplsm, hciéndole más fácil tomr gu y tolerr el estrés (Orcutt y Nielsen, 2). El juste osmótico es un mecnismo importnte en l tolernci l sequí de ls plnts. Ls plnts pueden responder l tensión osmótic con modificciones niveles tnto morfológicos, ntómicos y celulres que permiten que ls plnts eviten l tensión o incrementen su tolernci (Bry, 1997). Ls dptciones morfológics y ntómics pueden ser de vitl importnci pr cierts especies de plnts, pero no son un respuest generl de tods ls especies. En contrste, ls respuests celulres l tensión osmótic precen ser conservds en el reino vegetl Metolismo oxidtivo en condiciones de sequí L producción de especies ctivs de oxígeno es estimuld por fctores dversos mientles como l exposición l elevd iluminción, l sequí. Ls temperturs extrems, l cumulción de metles pesdos, l rdición UV, los contminntes tmosféricos, incluidos el ozono, estreses mecánicos y físicos, y tmién se producen en respuest l invsión por ptógenos (Foyer, 1997, Knigh y Knigh, 21). Cundo l producción de especies rectivs de oxígeno super l cpcidd del tejido pr eliminrls, l prición de estrés oxidtivo se ve fvorecid. Los niveles de ntioxidntes de jo peso moleculr como el gluttion y scorto, sí como l ctividd de enzims ntioxidntes umentn generlmente en plnts en condiciones de estrés, y est respuest está correlciond con un umento de l tolernci (Hlliweel y Gutteridge, 2) 4

18 I. Introducción Actividdes enzimátics metólics Ls ríces son los sensores primrios de los déficits hídricos, y ls señles ioquímics trnsportds desde ls ríces cusn muchs de ls perturciones fisiológics que se oservn en ls prtes éres de plnts sometids sequí. Se h sugerido que, muy prolemente, dichs señles son cmios en el tipo y concentrción de hormons exportdors ls prtes éres, muy posilemente con l corriente trnspirtori. 5

19 I. Introducción 3.2. Crcterístics de los ecosistems mediterráneos Los mientes mediterráneos se crcterizn por un mecnismo climático de lternnci regulr de un estción cálid y sec, con un estción frí y húmed, lo que condicion un crcterístics ecológics determinds, comunes en vris áres del plnet, ls que se considern que poseen un clim mediterráneo. Son definitoris l sequí estivl pronuncid, undnte rdición solr y precipitciones irregulres y esporádics, pero torrenciles, en otoño-invierno (López-Bermúdez & Aldlejo, 199). Fíg 1. Uicción y tipo de suelo de l Sierr de Bz (Grnd) En Espñ, lo encontrmos en el sur este de l penínsul iéric, más concretmente en l Sierr de Bz (Grnd). Se h selecciondo como zon de estudio. L ioms ére de los ecosistems mediterráneos áridos es pequeñ, unque l proporción de ioms suterráne, con respecto l ioms ére, es más lt que en otros ecosistems; L vegetción se distriuye desigulmente, lo que unido un índice del áre folir jo, ocsion un coertur escs. El suelo prece prcilmente desnudo y l reciir directmente l rdición solr se gudizn los efectos de l escsez de gu (Montlvo, 1992). En los ecosistems desrrolldos en mientes mediterráneos, como en culquier otro ecosistem terrestre, el equilirio nturl que rige l estilidd de los mismos puede ser perturdo por cmios en l ctividd de gentes nturles (procesos climáticos, geomorfológicos o pleotectónicos, etc.), consecuentemente, l estructur, morfologí y l diversidd de especies de l vegetción potencil se degrd, proceso 6

20 I. Introducción concomitnte con un deterioro generlizdo de ls propieddes físico-químics y iológics del suelo (Requen et l., 1996). Se se que ls distints especies vegetles ctún de form diferente y, de hecho, difieren en su grdo de idoneidd en cunto su eficci pr l protección del suelo. Concretmente, los rustos del mtorrl mediterráneo, con cpcidd de enrizr profundmente, tienen un lto potencil en ese sentido, pero, precismente, son dichs especies ls que hn sufrido más gresión ntrópic (direct o indirectmente) en el sudeste iérico. Ello, en unión de cierts limitciones ecofisiológics inherentes su reproducción, hce que l recuperción nturl de ests especies se muy lent (Alvdlejo et l., 1996) Crcterístics de los Suelos Degrddos En suelos degrddos, ocurre un descenso en el número de propágulos de l microiot del suelo, su diversidd y/o de su ctividd; Ello se dee que l plnt es l fuerz motriz de l vid microin en el suelo, lo cul es fundmentl ddo que los microorgnismos, su vez, vn compensr l plnt medinte cciones importntes pr su crecimiento y nutrición. El deterioro de los sistems sueloplnt, en cunto que fect ls relciones plntmicroorgnismos, desencden un círculo vicioso de efectos negtivos. Si no hy plnts, se degrd l vid microin y si no hy propágulos microinos, culquier proceso nturl o inducido de revegetción present prolems pr prosperr decudmente. 7

21 I. Introducción 3.3. Micorrizs rusculres y su importnci e implicción en el estrés hídrico de los vegetles Además de los sistems protectores intrínsecos de ls plnts contr el estrés, l myorí de ls plnts crecen en socición con numerosos microorgnismos del suelo que puede livir los síntoms del estrés, como es el cso de l socición con los hongos formdores de micorrizs rusculres (MA). El mutulismo supone un relción eneficios pr los dos orgnismos implicdos, y tnto el hongo como l plnt se ven fvorecidos por l socición: Ls plnts mejorn sus propieddes pr l dquisición de nutrientes y su nivel de tolernci situciones de estrés (sore todo l sequí) (Augé, 21), mientrs que el hongo dquiere un nicho ecológico protegido y los nutrientes fotosintéticos de l plnt (Smith & Red, 1997) Aspectos generles de los hongos formdores de micorrizs rusculres (HMA) Se trt de un simiosis prácticmente universl, no sólo porque csi tods ls especies vegetles son susceptiles de ser micorrizds sino tmién porque puede estr presente en l myorí de los háitts nturles. Ls micorrizs son tn ntigus como ls propis plnts y se conoce su existenci desde hce más de cien ños; estimándose que proximdmente el 95% de ls especies vegetles conocids estleces de form nturl y constnte este tipo de simiosis con hongos del suelo. Existen siete tipos de micorriz que se hn clsificdo, siguiendo criterios estructurles, funcionles y txonómicos, en: Arutoides, Ectendomicorrizs, Ectomicorrizs, Endomicorrizs o Micorrizs Arusculres (MA), Ericoides, Monotropoides y Orquidioides. En cunto l estructur formd, l tipo de colonizción y l cntidd de especies vegetles y fúngics implicds, se puede decir que ls micorrizs rusculres son ls de myor importnci y ls que más mplimente se encuentrn distriuids (tnto nivel geográfico como dentro del Reino Vegetl). Este tipo de micorriz se encuentr en condiciones nturles en l myorí de los cultivos tropicles y sutropicles de interés gronómico (Sieverding, 1991) y está presente en l myorí de ls Angiosperms; siendo ls fmilis Chenopodicee y Crucifere, ls excepciones de myor importnci (Frnci, 1993). L socición simiótic MA se form en muchs especies perennes leñoss, incluyendo muchs Gimnosperms prte de ls Pináces (Hrley y Smith, 1983). 8

22 I. Introducción Los hongos formdores de micorrizs rusculres pertenecen l clse Zigomicetes y se crcterizn porque producen, lo lrgo de su cliclo de vid, uns estructurs conocids como rúsculos (en todos los csos) y vesículs (en l myorí de ellos). Ls vesículs son estructurs glooss e irregulres que ctún como órgnos de reserv de lípidos. Los rúsculos son ls estructurs responsles de l trnsferenci idireccionl de nutrientes entre los simiontes, relizd en l interfse plnt-hongo producid este nivel (Frncl, 1993) Morfologí y desrrollo de l simiosis MA L colonizción del hongo se extiende por l epidermis y el prénquim corticl, nunc penetr en l endodermos ni en los tejidos vsculres y meristemáticos (Hrley y Smith, 1983); estleciendo un mrcd diferenci con ls infecciones rdicles de hongos ptógenos que si penetrn en los hces conductores y meristems. El proceso de formción de l simiosis comienz con l germinción de ls espors de resistenci en el suelo, cundo ls condiciones mientles de tempertur y humedd son fvorles (Boln y Aott, 1983). Trs l emisión del tuo o tuos germintivos, el micelio del hongo crece hst encontrr un ríz hospeddor, donde form entonces un estructur similr un presorio y penetr entre ls céluls epidérmics o trvés de los pelos rdicles. Después de l penetrción comienz l colonizción del tejido prenquimático de l ríz. En l cp intern de este tejido se formn los rusculos, producidos por un rmificción msiv de l hif después de penetrr l pred celulr. L hif rmificd se encuentr roded por l memrn plsmátic de ls céluls del prénquim corticl, siendo el espcio poplástico producido entre l memrn plsmátic y el hongo l zon de intercmio de nutrientes. L vid de los rusculos es muy cort, inferior 15 dís (Dvid, 1994). Ls vesículs se formn generlmente en los extremos de ls hifs del hongo y pueden producirse lo lrgo de todo el prénquim corticl colonizdo; suelen precer más trde que los rúsculos y son considerds órgnos de reserv, principlmente de lípidos (Beily y Kidy, 198; Cooper y Lösel, 1978). L colonizción del hongo puede extenderse tmién medinte hifs exteriores (runners) por ls superficie de l ríz y penetrr en ést intervlos irregulres (Sieverding, 1991). Cundo l infección intern está ien estlecid, ls hifs del hongo pueden crecer externmente desde l ríz de l plnt hci el suelo (micelio externo) y explorr un volumen de suelo inccesile ls ríces; con ello l plnt ument 9

23 I. Introducción considerlemente su superficie de sorción, de 1 1 veces (Gil, 1995), y por tnto su cpcidd de cptción de nutrientes y de gu. Los hongos formdores de micorrizs rusculres producen, normlmente, espors prtir del micelio externo, y tmién en lgunos csos, ls formn en el interior de l ríz prtir de micelio interno. Ls espors de resistenci pueden permnecer inlterds en el suelo por mucho tiempo, mientrs que ls hifs del hongo se colpsn trs un permnenci en suelo de 2 4 semns si no encuentrn un ríz hospeddor, (Boln y Aott, 1983) Efecto de los hongos MA sore el crecimiento de ls plnts Bre y Azcón-Aguilr (1982) demostrron que es cpz de producir compuestos de nturlez hormonl, unque se desconoce si estos compuestos son soridos por l plnt hospeddor. L MA ltern el nivel de sustncis reguldors del crecimiento en los tejidos de ls plnts (Allen et l., 1982) y su trnsporte de unos tejidos otros (Dixon et l., 1988). En l myorí de los csos prece existir un efecto hormonl, pero result extremdmente difícil diferencir los efectos producidos por ls hormons del hongo, los producidos por ls hormons vegetles y los producidos indirectmente por el estdo nutricionl de ls plnts como consecuenci de l micorrizción. L citoquinin, demás de promover l síntesis de proteíns (especilmente en los retoños), l división y l expnsión celulr (Vn Stden y Dvey, 1979), puede desempeñr un ppel importnte como medidor de l correlción entre ls concentrciones de fósforo y ls funciones de l plnt como pueden ser: el desrrollo vegettivo, l fotosíntesis y el lmcenmiento de lmidón. Se dice que ests fitohormons son ls medidors más importntes de l infección con Endomicorrizs por ser sintetizds primrimente en los meristemos rdicles. Un umento en el número y ctividd de los primordios, puede inducir un umento en l producción de citoquinin. L micorrizción, l igul que l plicción de fósforo l suelo, produce un umento del crecimiento de l plnt y de l ríz, y por tnto del número de extremos o primordios rdicles. Se plnte que los niveles de etileno que estimuln l formción y desrrollo de ls MA pueden estr relciondos con l resistenci de l plnt hospeddor fctores de estrés del suelo (Ishii y Kdoy, 1994). Bjos niveles de etileno producidos por estrés en l plnt, precen inhiir temporlmente el crecimiento de ls ríces, pero l mismo tiempo se promueve l ctividd del hongo micorrícico en l rizosfer, con lo que se minimiz el efecto estresnte sore l plnt. L consecuenci de l cción del hongo es un lterción positiv del equilirio hormonl de l plnt que fvorece su estdo fisiológico y nutricionl. L dependenci de l micorrizción es el grdo hst el cul un plnt depende de l condición de estr micorrizd pr otener un crecimiento óptimo un determindo nivel de fertilidd de suelo (Gerdermnn, 1975). Se hn relizdo numerosos estudios en los que se demuestr que l inoculción rtificil con hongos MA especies de interés grícol, increment l nutrición y el crecimiento de l plnt, y le 1

24 I. Introducción permite su vez superr situciones de estrés iótico y iótico (Clvet y Cmprui, 1996ª; Frnci 1993; Perrin, 1991). Los efectos eneficiosos de l introducción rtificil de inóculo micorrícico resultn más evidentes en suelos donde ls polciones de hongos MA ntivos no existen, o hn sido eliminds por empleo de práctics grícols desfvorles pr su desrrollo como l fumigción del suelo y el cultivo intensivo. L micorrizción temprn de ls plnts puede ser tmién interesnte en situciones en que l cntidd de inóculo MA en el suelo grícol se muy j o por l existenci de un cultivo nterior no hospeddor, y/o donde ls polciones utóctons no sen lo suficientemente gresivs y eficces (Rhodes, 1984; Sieverding, 1991). Se h demostrdo un efecto eneficioso de l inoculción temprn pr l myorí de los cultivos hortícols y pr los cítricos (Cmprui et l., 1995; Grndison y Cooper, 1986; Mc Guidwin, 1985; O Bnnon et l., 1979; Smith y Kpln, 1988). Los eneficios económicos se derivn de un myor y más uniforme producción, un myor rpidez de crecimiento y entrd en producción de ls plnts, un mejor clidd de l cosech y un horro en fertilizntes, riego y productos fitosnitrios. 11

25 I. Introducción 3.4. Bcteris PGPR. Crcterístics e identificción de isldos ntivos y su cpcidd protector frente condiciones dverss El nomre cteri deriv del término genérico Bcterium (stón), definido por el zoólogo lemán C.G. Eherenerg en 1932, como uno de los cutro géneros de los Infusori nimli. El nomre fue introducido como ctegorí generl por Ferdinnd Cohn en 1872, y posteriormente como uno de los grupos del reino Protist, por Ernst Heckel, en En l txonomi ctul, el término cteri no posee ctegorí txonómic; esto es lógico, y que desde el punto de vist iológico cteri es sinónimo de procriot y desde el estlecimiento como ctegorí txonómic del Reino Procriot, existí un ciert redundnci l empler el término cteri en un ctegorí txonómic de inferior rngo. El término cteri quedrí pues, como sinónimo de procriot y es en este sentido en el que v ser utilizdo en ls págins que siguen. Ls cteris son orgnismos con orgnizción celulr, es decir, l igul que el resto de seres vivos conocidos, su unidd vitl funcionl es l célul. El tipo de orgnizción celulr es l procriótic, crcterizd porque su mteril genético (normlmente un solo cromosom circulr de ADN de dole her) no está recluido en un recinto rodedo de memrn, sino inmerso en el citoplsm; este cromosom se replic de modo mitótico y l división celulr suele ser por fisión inri. Crecen de mitocondris, plstos, retículo endoplsmático, etc. En relidd, l citologí de los procriots sigue utilizndo l mism nomencltur que l eucriot, unque ls homologís son más que dudoss. Existe dicionlmente un concepto que pr nosotros es fundmentl: jo un punto de vist funcionl, un procriot es un entidd iológic unicelulr, de tmño medio inferior un eucriot y que es cpz de lcnzr densiddes de polción notlemente superior y, en generl, en función de sus crcterístics de regulción, puede dptrse con grn rpidez mientes muy fluctuntes. De lo nterior expuesto puede extrerse inmeditmente un consecuenci de grn repercusión e impcto en l iologí de microorgnismos: l rápid prición de polciones cterins jo condiciones de selección inédits hst el momento. Ello, deido tnto l cpcidd genétic de expresr informción presente en l célul pero no expresd nteriormente, o l selección de mutntes espontáneo preexistentes en l polción, o un crcterístic fundmentl de los procriots, como es l trnsmisión horizontl de l informción génic Tmño y morfologí L principl crcterístic de ls cteris, como en todo microorgnismo, es si reducido tmño. Ls cteris miden generlmente entre,5 y 2 µm, y su volumen celulr lcnz como máximo unos pocos µm 3. Sin emrgo ls cteris utóctons en medios oligotróficos pueden tener menos de,5 µm. En sí misms, ni ls pequeñs dimensiones ni tmpoco l metodologí que crcteriz l Microiologí constituyen únicmente el motivo de un seprción txonómic de los microorgnismos. En cmio, juegn un ppel esencil efectos txonómicos l morfologí, fisiologí y ecologí de estos orgnismos. 12

26 I. Introducción En los orgnismos de tmño cterino, l relción superficie/volumen es muy lt, lo que condicion un lt ts de intercción con el medio miente. Asimismo, el pequeño tmño de ls cteris influye decisivmente en su flexiilidd metólic, l exigir un economí de los sistems enzimáticos ctivos presentes, en un momento determindo, en un célul del tmño de un cteri. Así, los mecnismos de regulción de l expresión génic y del metolismo juegn en ls cteris un ppel predominnte. Desde el punto de vist ecológico, ls cteris se comportn como oportunists, multiplicándose rápidmente cundo ls condiciones de su miente son fvorles. Aunque existen diferencis de un otr especie, ls cteris, deido fundmentlmente su pequeño tmño, deen comodrse l estrtegi evolutiv de tipo r Estructur de l célul cterin Como se h menciondo, un de ls crcterístics más conspicus de ls céluls procriots es l flt de comprtimentción sd en un sistem de memrns unitris. Est usenci csi generlizd de orgánulos de tipo memrnoso, condicion l dquisición por prte de l memrn plsmátic de muchs funciones que en los eucriots están confinds en orgánulos específicos. L memrn plsmátic de los procriots constituye un rrer de permeilidd más estrict que l memrn eucriot. Los ojetos de myor tmño cpces de trvesr est rrer son siempre de dimensiones moleculres. Como consecuenci, l célul cterin crece en generl de ls propieddes de endocitosis y exocitosis, típics de l célul eucriot, y de un propiedd quizás más importnte: L cpcidd de dquirir endosimiontes celulres. Consecuenci simismo de ls propieddes singulres de su memrn plsmátic, ls cteris crecen de dptciones sds en l exocitosis, cpces de regulr l tensión osmótic intern. Como respuest est crcterístic de sus memrns y de su dptción un medio osmóticmente vrile, ls cteris hn desrrolldo un pred celulr cpz de contrrrestr ls vriciones de l presión osmótic extern. Aunque l composición de ls predes celulres procriótics es vrile, uno de sus componentes, el glucopéptido, se present invrilemente, excepción hech de ls rqueocteris, Plnctomyces y forms relcionds. Est mcromolécul es l responsle de ls propieddes de rigidez de l pred celulr cterin y de l morfologí celulr. L cpcidd de sintetizr glucopéptidos es un crcterístic de los procriots que los distingue de los eucriots. Se se que l rizosfer de ls plnts constituye un ecosistem complejo, donde el suplemento continuo de nutrientes j concentrción ví exuddos rdiculres, estimul el crecimiento cterino. 13

27 I. Introducción 3.5. Importnci e l intercción de los isldos hongos MA y cteris PGPR en l protección ls plnts frente condiciones de estrés En generl, se puede decir que el funcionmiento de un ecosistem edáfico depende en grn medid de l ctividd microin del suelo, ddo que los ciclos iogeoquímicos que ocurren en l nturlez son propulsdos por microorgnismos que, demás, protgonizn diverss cciones que producen eneficios pr ls plnts l que se socin (Bre & Jeffries 1995; Bre 22). En muchos csos ls intercciones estlecids son de tipo positivo, llegándose registrr un efecto de sinergismo, donde l presenci de l MA y del otro microorgnismo produce un incremento del crecimiento, vigor y protección de l plnt. Se hn propuesto un serie de mecnismos trvés de los cules ocurre l intercción micorrizs/ptógenos, y que no se h demostrdo nunc que los hongos MA ctúen directmente sore éstos, y se por ntgonismos, ntiiosis, o por depredción, sino que su efecto es indirecto. Los mecnismos son los siguientes (Azcón-Aguilr y Bre 1996). -Cmios en l nutrición de l plnt hospeddor. -Alterciones en l exudción rdiculr. Un mejor estdo nutricionl de l plnt puede vrir sus exuddos y lterr sí ls polciones de microorgnismos, y se por lterciones en l germinción de espors de hongos ptógenos y su penetrción, que en l myorí de los csos se produce por estímulos de ls propis exudciones rdiculres. -Activción de los mecnismos de defens de ls plnts medinte l inducción de l producción de determindos metolitos secundrios en ls ríces como lignins, fenoles, fitolexins, etileno, quinz y peroxids (Gininzzi-Person et l. 1994; Morndo 1996). -Competenci por los sitios de infección en l ríz. -Competenci por los fotosinttos del hospeddor. Con respecto estos dos mecnismos, podemos decir que l inoculción temprn de ls plnts puede grntizr un menor penetrción de ptógenos rdiculres. Incremento de l tolernci de ls plnts ptógenos del suelo. Est puede estr dd por un compensción de los dños ocsiondos por los mismos. 14

28 II. Mteril y Métodos II. MATERIAL Y MÉTODOS GENERALES 1. Mteril iológico y condiciones de crecimiento 1.1. Mteril vegetl Plnts utilizds Ls plnts utilizds en este trjo, en función de su origen se considern como plnts utóctons Lvnd (Lvndul spic), Retm (Retm spherocrp) ó plnts de referenci Lechug (Lctuc stiv L. vr. Romn), Tréol (Trifolium repens vr. violet), Míz (Ze mys L. vr. Geron) y Sorgo (Sorghum icolor); ests últims seleccionds por su sensiilidd ls condiciones de estrés, crecimiento rápido y producción de ioms Cultivo de plnts Sustrto utilizdo En todos los experimentos el sustrto est compuesto por un mezcl de suelo:ren en proporción (v/v) dependiendo de l procedenci del suelo, el cul se explicrá en cd uno de los experimentos plntedos. Los suelos utilizdos ern procedentes de l Sierr de Bz y de l Estción Experimentl de Zidín (Grnd). Presentn ls siguientes crcterístics físicoquímics: Análisis de suelo Sierr de Bz EEZ ph (gu) M.O. (%) N (mg.kg -1 ) P (NHCO 3 -extrctle P) (mg.kg -1 ) K (mg.kg -1 ) Aren/Limo/Arcill (%) 57.8 / 19 / / 43.6 / 2.5 Tl. Crcterístics físico-químics de los suelos utilizdos L ren de curzo (< 2 mm) er previmente lvd y esterilizd en utoclve 2 min. A 12ºC. El suelo er tmizdo (2 mm) y esterilizdo por tindlizción en utoclve vpor fluente (1ºC durnte 1h, 3 dís consecutivos). De est form, qued lire de propágulos de micorrizs y otros orgnismos que puedn interferir en el experimento Esterilizción, germinción y siemr de semills Ls semills de Lechug, Sorgo y Tréol, se esterilizron en superficie con un solución de lejí comercil l 1% durnte 15 min., trs lo cul se enjugron con undnte gu destild estéril hst remover culquier trz de residuo que pued 17

29 II. Mteril y Métodos interferir con l germinción. Se colocron directmente en ls mcets definitivs pr su germinción. Ls semills de Míz, se imiieron durnte 1 min., en etnol l 7%, se enjugron con undnte gu destild estéril. Se curieron con lejí l 2% durnte 15 min., continución se enjugron con undnte gu destild estéril, se germinron en condiciones de esterilidd en medio MS (Murshigue nd Skoog, 1962) durnte 48 hors y se seleccionron ls semills homogénes pr relizr el experimento. Ls semills de Lvnd, se imiieron durnte 8 min., en H 2 O 2 l 15%, se enjugron con undnte gu destild estéril y se colocron en plcs estériles, con ppel mojdo en ls dos tpders, en oscuridd 25ºC hst su germinción. Ls semills de Retm, se imiieron durnte 3 min., en H 2 SO 4 l 98%, se enjugron con undnte gu destild estéril hst l eliminción totl del ácido. Se curieron con HCl l 5% durnte 5min., continución se enjugron con gu destild estéril (mínimo 5 veces cd 3 min.), se colocron en vermiculit estéril, en oscuridd 25ºC hst su germinción Solución nutritiv pr ls plnts Ls plnts de Míz reciieron un porte único en el momento de l siemr de 25 ml de solución nutritiv MS, sin scros y sin fitgel (Murshigue nd Skoog, 1962). L composición de l solución nutritiv es l siguiente: Componentes Concentrción (mg/l) en MS Solución mdre (mg/l) cntidd MS Mcro I usdo como 1x stock 1 litro NH 4 NO g KNO g MgSO 4.7H 2 O g KH 2 PO ml/l MS Mcro II usdo como 1x stock 1 litro CCl2.H2O g (1 ml/l) FeNEDTA usdo como 1x stock 1 ml 1 ml/l g MS Micros usdo como 1x stock 1 ml H 3 BO mg MnSO4.2H2O mg ZnSO 4.7H 2 O mg N 2 MoO 4.2H 2 O mg CuSO 4.5H 2 O mg CoCl 2.2H 2 O mg KI mg 1 ml/l 18

30 II. Mteril y Métodos Componentes Concentrción (mg/l) en MS Solución mdre (mg/l) cntidd Mio-inositol usdo como 1x stock 1 ml g 1 ml/l MS Vitmins usdo como 1x stock 1 ml Acido Nicotinico mg Pidoxin-HCl mg Timin-HCl mg Glicin mg 1 ml/l,2% phytgel,5% glucos preprdo en MS Ls plnts de Lechug, utilizds en el ensyo Contriución de 6 isldos fúngicos en l cptción de gu jo condiciones de estrés ) (Ver cpítulo X), reciieron 1 ml de solución nutritiv Hewitt, por semn, modificd pr contener 4 mm N+1mM P ó 2 mm N+.5 mm P (Hewitt, 1952con el ojetivo de conseguir plnts con tmño y contenido en nutrientes similres en todos los trtmientos. L composición de l solución nutritiv es l siguiente: Compuesto Concentrción (µm) Solución mdre (g/l) 1 litro (ml) KNO 3 3x1 3 3,3 1 C(NO 3 ).4H 2 O 9x1 3 11,5 2 NH 2 PO 4.2H 2 O 3 18,4 2,5 MgSO 4.7H 2 O 15 18,4 2 EDTA-Fe 67 2,45 1 MnSO 4.7H 2 O 13 1,5 1 CuSO 4.5H 2 O 1 2,4,1 ZnSO 4.2H 2 O 1 4,22,1 H 3 BO ,6,1 NMoO 4.2H 2 O,15,35,1 Ajustr ph 7 Ls plnts de Lvnd, Retm, Sorgo y Tréol no reciieron ningún tipo de solución nutritiv Condiciones de cultivo El tmño de los contenedores pr el cultivo de ls plnts nunc excedió de 1c.c. En lgunos csos ls plnts crecieron jo condiciones de inverndero: 7-9% de humedd reltiv, temperturs dí/noche de ºC, fotoperiodo de 16h. En los ensyos en los que ls plnts crecieron en cámr de cultivo, ls condiciones de l cámr fueron: 7-8% de humedd reltiv, temperturs dí/noche de 25-15ºC, fotoperiodo de 16h. y un intensidd luminos de 35 µmol m -2 s -1 (Li-Cor, Lincoln, NE, USA, modelo LI-188B). 19

31 II. Mteril y Métodos Determinción del estdo hídrico del suelo Ls plnts fueron regds dirimente según necesitdes, excepción de quellos ensyos en los cules se pretendió estudir el efecto del estrés hídrico, en cuyo cso ls mcets se pesron y regron dirimene justándose l cntidd de gu l cpcidd de cmpo según trtmientos. Los trtmientos diseñdos en contenedores de volumen myor 5 c.c., el contenido de gu en el suelo se controló medinte el ThetProe ML2 (AT-Delt-D Device, Ltd, UK), que mide el contenido volumétrico en gu del suelo en se cmios en l constnte dieléctric del suelo cundo está húmedo. El contenido volumétrico de gu en el suelo es un cociente entre el volumen de gu presente en el suelo y el volumen totl de l muestr de suelo, por lo que es un prámetro dimensionl expresdo como % vol (Roth et l., 1992). El suministro de gu portdo en cd uno de los ensyos depende de l cpcidd de cmpo plnted. Se midió dirimente l finl de l mñn Mteril fúngico Hongos MA utilizdos Se utilizron como especies de hongos MA de referenci, isldos procedentes de dos áres desértics de ls provincis de Alicnte y Almeri (Espñ). Ls especies fueron Glomus corontum Giovnnetti, isldo EEZ 17, BEG 49; Glomus intrrdices (Schenck nd Smith), isldo EEZ 6, BEG 121; Glomus clroideum Schenck nd Smith, isldo EEZ 23; Glomus constrictum Trppe, isldo EEZ 22; Glomus geosporum (Nicol. y Gerd.) Wlker, isldo EEZ 4 y Glomus mossee (Nicol. nd Gerd.) Gerd. y Trppe, isldo EEZ 7, BEG 122. Y como especies de hongos MA utóctonos, isldos procedentes del prque nturl de l Sierr de Bz (provinci de Grnd, Espñ), Glomus mossee, Glomus constrictum, Glomus clroideum, Glomus corontum, los más representtivos de l zon Producción y conservción del inóculo Pr producir mteril de inóculo de ls especies de hongos MA utóctons, se utilizron plnts de Sorgo (Sorghum icolor) + Míz (Ze mys) +Tréol (Trifolium repens), en mcrocosmos de 6 L. El sustrto er conformdo por un mezcl de sepiolit, vermiculit y ren (1:1:1) (v/v). Se dicionó un feritiliznte de lierción lent (15:15:15).5 g L -1. A los 3 meses, y se h desrrolldo l micorrizción, pr utilizr el mteril como inóculo. Todos los inóculos mostrron un lt cpcidd infectiv. 2

32 II. Mteril y Métodos F % M% m% % A% G. mossee G. constrictum G. corontum G. clroideum Tl. Colonizción del inóculo producido (%) El inóculo otenido, est formdo por suelo, espors, micelio y frgmentos de ríz micorrizdos. Se conserv en un lugr tempertur miente y en condiciones de oscuridd Tinción de ríces micorrizds Tinción con Azul Tripn (TB) Un vez otenids ls ríces en el momento de l cosech, fueron teñids siguiendo el método de tinción de Phillips & Hymn (197). El colornte zul tripán, tiñe ls estructurs que contienen quitin, principl componente de ls predes celulres de lgunos hongos, entre ellos los formdores de micorrizs rusculres (Brtinicki-Grcí, 1968). De est form se tiñen los componentes del hongo en el interior de l ríz, permneciendo est sin colornte. Este método, consiste en clentr ls ríces en KOH 1% (p/v) durnte 2 min., l ño mrí, psdos los cules se lvn con undnte gu y se cidificn con HCL.1N durnte 5 min., con el fin de preprr ls ríces pr l entrd del colornte. Un vez elimindo el HCl, se dicion un solución de.5% zul tripán en ácido láctico (p/v) y se mntienen nuevmente l ño mrí durnte 15-2 min. Un vez teñids se elimin el exceso de colornte y ls ríces se conservn en ácido láctico hst posterior oservción Tinciones vitles Succinto deshidrogens (SDH) Revel ls estructurs fúngics MA vivs (Smith & Gininzzi Person, 199). Ls ríces cortds y depositds en ño de hielo, se dejron incundo en solución incudor (2.5 M sodium-succinte hexhydrte, 4 mg ml -1 nitro lue tetrzolium, 5 mm MgCl 2 y.2 M Tris-HCl, ph 7.) 37ºC durnte hors. Trnscurrido este tiempo se eliminó l solución incudor, l ríces se lvron y se curieron con hipoclorito sódico de cloro ctivo 3% (v/v), tempertur miente durnte 15-2 min., psdos los cules se eliminó el hipoclorito y se lvron ls ríces nuevmente. Ls ríces se conservron en ácido láctico durnte no más de 2 semns Fosfts lclin (ALP) Revel ls estructurs fúngics MA ctivs (Tissernt et l., 1993). Ls ríces recién cortds y depositds en ño de hielo, se dejron incundo en solución 21

33 II. Mteril y Métodos incudor (1mg ml -1 slt fst lue RR, 1 mg ml -1 α-nftil PO 4,.5 mg ml -1 Cl 2 Mg nhidro,.8 mg ml -1 Cl 2 Mn 4H 2 O y.5 M Tris ácido cítrico, ph 9.2) 37ºC durnte hors. Trnscurrido este tiempo se eliminó l solución incudor, se lvron ls ríces y se dejron cuierts con hipoclorito sódico de cloro ctivo 1% (v/v), tempertur miente durnte 15-2 min., psdos los cules se eliminó el hipoclorito y se lvron ls ríces nuevmente. Ls ríces se conservron en ácido láctico durnte no más de un pr de semns Cuntificción de l colonizción micorrícic El grdo de colonizción micorrícic se midió usndo el método de Giovnnetti y Mosse (198). Cundo er necesri un evlución ms exhustiv del desrrollo del hongo en l ríz de l plnt se siguió el método de Trouvelot et l (1986). Pr ello, se colocn en portojetos frgmentos elegidos l zr de proximdmente 1 cm. de ríz y se cuntificn los prámetros de l micorrizción, signndo cd frgmento un número de 5 en función del nivel de infección por el hongo, sí como un vlor de A A3 con se l riquez de rúsculos del frgmento estudido. Con posterioridd, un progrm informático clcul l frecuenci (F), intensidd en l ríz totl (M), riquez rusculr en l ríz totl (A), intensidd en el segmento evludo (m) y riquez rusculr de l colonizción en el segmento evludo ().Se expres en %. Además se cuntificó el número de vesículs en cd segmento evludo Longitud del micelio extrrdicl El micelio, se consider l estructur más importnte pr el cumplimiento de l función de l micorriz en cunto cptción de nutrientes y gu. Pr su determinción, se utilizó dos metodologís descrits en los ensyos correspondientes, un propuest por Jones y Mollison (1948) y otr propuest por Miller et l. (1992), con lguns modificciones, se tomó 1 g de suelo, se gitó vigorosmente con gu durnte 3 seg., se colocó inmeditmente en un mtrz y se dejó sedimentr durnte 1 min., posteriormente, se tomó un lícuot de 1 ml y se colocó en un filtro de nitrocelulos con tmño de poro de.2 µm, cudriculdo, situdo en un equipo de filtrción. Un vez secos los filtros se dicionó uns gots de solución.5% zul tripán en ácido láctico (p/v) y se dejó 5 min. tempertur miente. Los filtros se montron sore portojetos y se oservron l microscopio. Pr su cuntificción, uno de los oculres poseí un retícul de 1x1 línes. Se colocó l cudrícul de form que l retícul se posicionr dentro de un de ls áres rectngulres definids por l líne del filtro y se contron ls intersecciones entre hifs y l retícul del oculr, tnto en sentido horizontl como verticl. Este procedimiento se repite un mínimo de 2 veces por muestr. Se clculó l longitud totl del l retícul y el áre totl nlizd, y se otuvo l longitud de micelio presente en l superficie nlizd del filtro, utilizndo l fórmul de Newmn (1966) pr el cálculo de longitudes con se l número de intersecciones con 22

34 II. Mteril y Métodos un sistem culquier de línes de longitud conocid. L longitud viene definid por l siguiente ecución: Longitud de hifs = π.a.n 2 H. Fctor de dilución. Fctor de peso seco Donde, π es , A el áre de l circunferenci, N el número de intersecciones y H el lrgo de l retícul Cultivo monoxénico Previmente, se relizó un ensyo en condiciones de inverndero pr evlur l intercción G. intrrdices Smith & Schenck (DAOM , Biosystemtic Reserch Center, Ottw, Cndá), desrrolldo en condiciones in vitro (cultivo monoxénico), con isldos utóctonos de l Sierr de Bz. Pr el estlecimiento del cultivo monoxénico en sistem icomprtimentdo, se utilizó Glomus intrrdices Smith & Schenck (DAOM , Biosystemtic Reserch Center, Ottw, Cndá) crecido en ríces de znhori (Ducus crot). El medio de cultivo se estleció en medio M con scros (1 g L -1 ) como fuente de crono en un comprtimiento y medio M sin fuente de crono en el otro comprtimiento (Bgo y Cno, 25). Su composición es l siguiente: 1.21 mm C (NO 3 ) 2, 21.8 mm N-FeEDTA, 4.51 µm KI, 1% solución de mcroelementos,.1% solución de microelementos, 1% vitmins, 1% scros y.35% phytgel. ph 5.5 con NOH. Solución de Mcroelementos: 29.6 mm MgSO 4, 7.9 mm KNO 3, 8.7 mm KCl,.35 mm KH 2 PO 4, 1.4 NH 2 PO 4 y 14 mm NSO 4. Solución de Microelementos: 3.3 mm MnCl 2.4H 2, 9.2 mm ZnSO 4.7H 2, 24.3 mm H 3 BO 3, 5 mm CuSO 4, 1 µm N 2 MoO 4. Vitmins: 4 mm glicin, 29.6 µm hidrocloruro de timin, 49 µm hidrocloruro de piridoxin,.4 mm ácido nicotínico y 27.7 mm mio-inositol. Se esterilizó en utoclve 12ºC durnte 2 min Mteril cterino Aislmiento de cteris prtir de suelo rizosférico Pr el islmiento de ls cteri, se siguió el método descrito por Ponchon & Trdieux (1962). Se procedió tomr 1 grmo de suelo rizosférico, se seleccionó quel que est socido ms íntimmente l ríz de l plnt crecid en condiciones nturles, y se trnsfirió tuos que contenín 9 ml de solución slin l,85% estéril. Los tuos se gitron por un periodo de 2 min., trs el cul se relizron dilusiones 23

35 II. Mteril y Métodos serids en condiciones de esterilidd. Se tomron ls diluciones 1-4, 1-5, 1-6 y 1-7 y se semrron.2 ml en medio de cultivo Agr-Agu (15g L -1 ) y NB (Nutrient Broth, Oxid, 8g L -1, suplementdo con gr l 1.6%). Un vez semrds ls plcs, se incuron 28ºC durnte dos dís. Se seleccionron en función de su undnci reltiv, 2 cteris crecids en el medio NB y 1 en medio Agr-Agu. L composición de los medios utilizdos es l siguiente, Composición NB PD Extrcto de crne 3 g Extrcto ptt 4 g Pepton de geltin 5 g Glucos 2 g ph: 6,8 +/- 2 ph: 7 utoclvr 121ºC durnte 2 min. El número de uniddes formdors de coloni (ufc) presentes de form nturl, resultntes, se refirió grmo de suelo seco. L cteri crecid en Agr-Agu, fue crecid posteriormente en medio de cultivo PD (Potto dextrose, 24 g L -1, suplementdo con gr l 1.6%). En los ensyos posteriores, ls ufc se refirieron de cuerdo l sustrto utilizdo, se descriió en cd uno de los ensyos Extrcción de ácidos nucleicos, PCR y crcterizción moleculr (Identificción de cteris) Ls 3 cteris islds, fueron crecids 2 en medio NB y 1 en PD, 28 ºC por 24 hors. Pr l extrcción de ADN se utilizó el kit DNesy plnt Mini (Qigen), siguiendo ls instrucciones del fricnte. L identificción de los isldos cterinos, se relizó medinte secuencición del ADN que codific l suunidd riosómic 16S rdna. L mplificción por PCR se llevó co utilizndo oligonucleótidos universles de cteris GM3F y GM4R (Muyzer et l., 1995) que permite l mplificción de csi l totlidd del gen. L mplificción se relizó medinte PCR, usndo proximdmente 1-2 ng de ADN cterino, en un volumen finl de 3 μl. L mezcl de rección contení:,2 M de cd primer, 2 μm dntp s, Tmpón de PCR 1X (Ephedorff, Hmurg Germny) suplementdo con 1.5 mm MgCl 2 y 1U de Tg DNA Polymerse (Ephendorff). Se incluyeron controles negtivos en tods ls mplificciones de PCR pr detectr l presenci de posiles contminntes en los rectivos. Ls mplificciones se relizron en un termocicldor (Pekín Elmer). Un grdiente de tempertur de l PCR entre 42 y 58ºC fue relizdo pr determinr l tempertur óptim de unión (TGrdient, BIOMETRA). Se utilizó el siguiente progrm: en primer lugr, l mezcl de rección se incuó 94ºC por 5 min., pr desnturlizr el ADN molde. Posteriormente, se relizron ls 24

36 II. Mteril y Métodos extensiones utilizndo un progrm que consistí en 35 ciclos de 94ºC por 2s (desnturlizción), 46ºC por 2s (unión), y 1 min. A 72ºC (extensión), finlmente pr completr l extensión, un ciclo de 72ºC por 5 min. Los productos de l PCR fueron seprdos medinte electroforesis en gel de gros (.8%) 1V durnte 1h, usndo TAE 1X como tmpón de electrodo. L purificción de ls nds cortds fue hech usndo el Kit Gel Extrction (Qigen) siguiendo ls instrucciones del fricnte. Los productos de l PCR 2.1 purificdos, fueron clondos usndo el kit TA Cloning (Invitrogen) siguiendo ls instrucciones del fricnte. Diez clones insertdos dieron positivos (colonis lncs) y fueron nlizdos por ARDRA pr determinr l pttern de l secuenci 16S rdna usndo ls enzims Alu I (Roche) nd Rs I (New Englnd). Ls pttern de restricción fueron seprds en un gel de gros (2%). L secuencición del ADNr 16S, se hizo usndo los primers pr PCR 2.1 vector M13 hci delnte y M13 contrrio. Se llevo co por el servicio de secuencición del Instituto de Prsitologí y Biomedicin López Neyr. El nálisis de l homologí de ls secuenci de ADNr 16S correspondiente cd isldo cterino, se relizó medinte el progrm CHROMAS, disponile universlmente en los servidores NCBI, encontrndo: Bcteri 1, crecid en medio NB: Primer GM3F: Pseudomons plecoglossicid strin S2, 98% identities Primer GM4R: Pseudomons plecoglossicid strin R18, 95% identities Bcteri 2, crecid en medio NB: Primer GM3F: Pseudomons putid strin BCNU171, 97% identities Primer GM4R: Pseudomons putid strin S16, 96% identities Bcteri 3, crecid en medio PD: Primer GM3F: Bcillus megterium strin MO31, 97% identities Primer GM4R: Bcillus megterium isolte CECRIio 4, 98% identities Inoculción de cteris Además de ls inoculciones relizds con los isldos utóctonos, se relizron inoculciones con Rhizoium sp. (isldo utóctono de l Sierr de Bz, no identificdo), su plicción se indic en cd ensyo. Fue crecido en medio Ty (Beringer, 1974) medio rico en nitrógeno, su composición es l siguiente: Tripton Extrcto de levdur 5 g 3 g Suplementdo con gr 15 g Autoclvdo 12ºC durnte 2 min. CCl 2.2H 2 O,9 g Tods ls inoculciones relizron plicndo 1 ml del inoculnte sore l rdícul de cd plnt, (en cso de que estuviern germinds) o directmente sore l semill, l densidd de cd inóculo plicdo se indic en cd ensyo. 25

37 II. Mteril y Métodos Conservción de ls ceps cterins Ls ceps descrits nteriormente, se conservron -8ºC en glicerol l 15%. Pr ello se cultivn en medio líquido selectivo hst el finl de l fse de crecimiento exponencil (cultivo 16h). 2. Determinciones fisiológics de ls plnts 2.1. Producción de ioms En el momento de l cosech, se determinó el peso fresco de prte ére y ríz. El peso seco se midió después de secrlo en un horno 75ºC durnte 48h Cuntificción de nódulos En el momento de l cosech, ls ríces fueron lvds y extendids sore un plc petri con gu pr cuntificr el número de nódulos presentes en ells Longitud de ríz L longitud de l muestr de ríz teñid con zul tripán, se otuvo utilizndo el sistem DIAS DT de nálisis digitl de imágenes siguiendo ls indicciones del fricnte (Delt-T Devices 1991). Pr otener l longitud totl de l ríz, se tomó un sumuestr y se relizó un ponderción con el peso totl de ríz de cuerdo l siguiente ecución: L = Lp x RT. 1. fps Rp PM Donde, L es l longitud totl de ríz por 1 g de sustrto, Lp es l longitud prcil de l ríz teñid, otenid por el sistem DIAS DT, RT es el peso fresco de l ríz totl, RP es el peso fresco de l sumuestr usd pr l tinción, PM es el peso de l muestr de sustrto extrído y pfs es el fctor de humedd de l muestr colectd Contenido hídrico El contenido hídrico se uso pr determinr el contenido de gu en l prte ére de l plnt en el momento de l cosech. El contenido hídrico, fue clculdo medinte l siguiente expresión: peso fresco - peso seco CH = x 1 peso seco L concentrción de nutrientes, fueron relizd por el lortorio de nálisis químico, de l Estción Experimentl del Zidín (CSIC) Grnd. 26

38 II. Mteril y Métodos 3. Determinciones ioquímics y enzimátics 3.1. Determinciones ioquímics Aundnci nturl de 13 C L determinción de 13 C fue relizdo en un espectrofotómetro de ms, por el Servicio de Análisis de Isótopos Estles de L Estción Experimentl del Zidín (CSIC) Grnd Concentrción de nutrientes Ls concentrciones de N y P, fueron determinds por colorimetrí previo trtmiento de ls muestrs (digestión con ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno en microonds ierto), (Mingornce, 22). L concentrción de K, fue determind por fotometri de llm previo trtmiento de ls muestrs (digestión con ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno en microonds ierto), (Lchic et l. 1973) Determinción del AIA Cd cultivo se centrifugó 1 rpm durnte 1 min. Se tomron lícuots de 3 ml del sorendnte y se hicieron reccionr con 2 ml del rectivo de Slper (2 ml cloruro férrico.5 M y 98 ml de ácido perclórico l 37%), se dejron 3 min. de incución en l oscuridd tº miente. (Wöhler, 1997). L sorción de l mezcl de rección fue medid posteriormente 535 nm en un espectro Shimdzu UV-163. L concentrción de AIA se determinó prtir de un curv ptrón elordo con concentrciones conocids de est uxin y vlords del mismo modo que ls muestr prolem, Se expresó en ug.ml Glomlin Se determinó l cntidd de glomlin fácilmente extrctle de cuerdo con el procedimiento descrito por Wright y Updhyy (1996), con lguns modificciones. Se tmizó un muestr de suelo en tmices de serie Tyles de 2 y 1 mm de luz, y se tomron.5 g de l frcción contenid sore el tmiz de 1 mm de luz, l cul fue depositd en tuos de plástico de rosc de 15 ml de cpcidd. Se ñdieron 4 ml de solución extrctle (2 mm citrto sódico (C 6 H 5 NO 7 ), ph 7. y se gitó vigorosmente. Seguidmente l muestr fue llevd l utoclve 121ºC durnte 3 min. Posteriormente, se centrifugó 1g durnte 5 min., se recogió el sorendnte, l que se le determinó el volumen. L cuntificción de l proteín extríd se relizó utilizndo el método de Brdford (1976). Pr esto, 7 ul de gu se le gregron 2 ul de rectivo BioRd Protein Assy (BioRd Lortories), se gitó l mezcl y se dejó que desrrollr el color durnte 1 min. L concentrción de glomlin en l muestr se determinó en el espectro un λ de 595 nm. se determinó prtir de un curv ptrón elordo con concentrciones conocids de est uxin y vlords del mismo modo que ls muestr prolem. Se utilizó un curv ptrón de lúmin ovin (BSA) pr otener un rngo 27

39 II. Mteril y Métodos de concentrciones comprendido entre y 2 µg BSA ml -1. El color desrrolldo es estle durnte un hor proximdmente. Se expresó en ug.ml Actividdes enzimátics en el suelo Los métodos de detección de ls diferentes enzims que se descrien continución se relizron sore muestrs de suelo rizosférico previmente iredo pr eliminr el exceso de humedd si l huier y conservdos 4ºC hst su utilizción. Pr cd determinción se ñdieron controles que permitieron deducir l descomposición no enzimátic del suelo, vlor que se le restrá l otenido pr cd prolem. L concentrción del producto de l hidrólisis enzimátic se determinó leyendo l densidd óptic, l longitud de ond que posteriormente se señl pr cd ctividd, comprndo los resultdos con los otenidos por un curv ptrón de concentrciones conocids. Tods ls determinciones se relizron por triplicdo. Ls uniddes medinte ls cules se expresn los vlores están referids l peso seco de ls muestrs Actividd deshidrogens A 1 g de suelo se le dicionó.2 ml de INT (iodofenil-3-p-nitrofenil-5 tetrzolium cloruro) l.4% (p/v). Posteriormente se incuó durnte 2 hors 25ºC en oscuridd. Trnscurrido este tiempo el producto de l rección INTF (Iodonitrotetrzolium formzán) se extrjo con un mezcl de ceton:tetrcloroetileno (1:5) y se midió l sornci en espectrofotómetro λ de 49 nm. Este método surge como un cominción de dos métodos nteriores (Benefield et l., 1977; Trevors, 1984). Los resultdos se expresn como µg INTF g -1 h Actividd fosfts A 1 g de suelo se le dicionó.5 ml de p-nitrofenilfosfto.115 M y 2 ml de tmpón mleto.1m ph 6.5. Posteriormente se incuó durnte 2 hors 37ºC en oscuridd. Trnscurrido este tiempo el producto de l rección PNP (p-nitrofenol) con NOH.5 M y CCl 2.5M y se midió l sornci en espectrofotómetro λ de 398 nm. Los resultdos se expresn como µg PNP g -1 h Actividd glucosids A.1 g de suelo se le dicionó.5 ml de sustrto PNG (4-nitrofenil β- glucopirnoside).5m y 2 ml de tmpón mleto.1m ph 6.5. Posteriormente se incuó durnte 2 hors 37ºC en oscuridd. Trnscurrido este tiempo el producto de l rección PNP (p-nitrofenol) se extrjo con NOH.5 M y CCl 2.5M y se midió l sornci en espectrofotómetro λ de 398 nm. Los resultdos se expresn como µg PNP g -1 h

40 II. Mteril y Métodos 4. Análisis estdísticos Los resultdos de tods ls gráfics y tls presentds en est Tesis Doctorl se sometieron un ANOVA. Cundo se detectron diferencis significtivs como consecuenci de los trtmientos plicdos, se procedió clculr ests medinte el test de rngo múltiple de Duncn o Fisher un nivel de significción P <.5. Especificndo cul se h usdo en cd uno de los nálisis relizdos. 5. Presentción de los experimentos Los cpítulos específicos decididos fueron los siguientes, 1. Evlución generl de los isldos utóctonos (hongos AM y cteris) de l Sierr de Bz crcterístics y mecnismos de tolernci condiciones dverss 2. Contriución de seis isldos de hongos formdores de micorrízs rusculres (MA) l cptción de gu en plnts de Lctuc stiv L. jo condiciones de estrés hídrico 3. Tolernci l sequí y ctividdes ntioxidntes en plnts de lvnd colonizds por especies de Glomus utóctons tolerntes o sensiles l sequí 4. Un cep utócton tolernte l sequí de Glomus intrrdices socid con un cteri utócton en el mejormiento del trnsporte de gu y desrrollo de l ríz en Retm spherocrp 5. Efectos opuestos de un cep de Bcillus megterium en el crecimiento de ls plnts de Lctuc stiv dependiendo del hongo micorrícico rusculr co- inoculdo: spectos fisiológicos y ioquímicos 6. Intercciones entre el hongo MA Glomus intrrdices y dos isldos cterinos utóctonos de ecosistems mediterráneos: un estudio en cultivo dixénico 29

41 Cpítulo 1 Cpítulo 1 Evlución generl de los isldos utóctonos (hongos AM y cteris) de l Sierr de Bz crcterístics y mecnismos de tolernci condiciones dverss Este cpítulo se divide en 3 sucpitulos, como sigue: 1.1. Evlución de l ctividd de los hongos MA utóctonos que resultn más eficientes en condiciones de limitd disponiilidd hídric Estudio de l cpcidd de los microorgnismos de vid lire utóctonos (cteris) pr l producción de metolitos secundrios relciondos con su ctividd jo condiciones de estrés Evlución de l intercción de los isldos utóctonos (hongos MA y cteris) y estudio de los mecnismos fisiológicos y ioquímicos relciondos con su ctividd de protección de ls plnts jo condiciones de limitción hídric. Cd uno de estos tres sucpitulos, se irá desglosndo en ensyos complementrios relizdos pr otener un mpli informción que clrifique los resultdos otenidos, pues el resultdo de cd ensyo d pie l ejecución del siguiente. Además, l totlidd de estos resultdos, justific l ejecución de los ensyos que conformn los siguientes cpítulos de l presente tesis doctorl, que hn ddo lugr pulicciones científics en revists de crácter interncionl. 35

42 Cpítulo Evlución de l ctividd de los hongos MA utóctonos que resultn más eficientes en condiciones de limitd disponiilidd hídric Evlución de l efectividd de los hongos MA utóctonos isldos prtir de suelo rizosférico de l Sierr de Bz Mteril y Métodos: Se utilizron plnts leguminoss (Trifolium repens L.), crecids en microcosmos jo condiciones de inverndero y nivel hídrico controldo l 75% c.c. El sustrto usdo fue un mezcl de suelo:ren, en proporción de 5:2 (v/v). El suelo (de l Sierr de Bz) y l ren, reciieron el trtmiento indicdo en M. y M., ( ). Los hongos MA utóctonos, selecciondos como los más frecuentes y undntes en l Sierr de Bz fueron: G. constrictum, G. clroideum, G. corontum y G.mossee. Pr l inoculción, se utilizron 1 g de inóculo de cd hongo MA (M. y M., ). Todos los trtmientos, reciieron un inoculción de Rhizoium sp. (isldo utóctono de l Sierr de Bz, no identificdo), (M. y M., ) se plicó 1ml de l suspensión cterin (1 8 ufc plnt -1 ) en el momento de l siemr. Los trtmientos no micorrizdos reciieron 2 ml de un filtrdo del inóculo, pr reincorporr l microiot exent de propágulos de micorriz Determinciones: Medinte cortes sucesivos (4) lo lrgo de 24 meses, se determinó l efectividd de estos isldos fúngicos sore l producción de ioms vegetl (M. y M., 2.1.) Resultdos: Desde el 1º corte, hy efecto positivo de l colonizción MA por cd un de ests especies fúngics utóctons. Es de destcr el distinto comportmiento de estos endofitos utóctonos lo lrgo del tiempo. G. clroideum disminuye su efectividd reltiv en los sucesivos cortes (prticulrmente 3º y 4º) mientrs que en el 1º fue el más efectivo. Concomitntemente con G. constrictum resultó ser el endofito más efectivo, incrementó un 597% l ioms vegetl corte 1 corte 2 corte 3 corte 4 Totl (mg) % Testigo G.constrictum G.clroideum G.corontum G.mossee Tl 1. Cosechs sucesivs. Peso seco prte ére de plnts de Tréol (mg) 36

43 Cpítulo Conclusiones generles del sucpítulo 1.1.: Glomus constrictum, se consider el hongo MA utóctono más eficiente en cunto l producción de ioms. G. mossee, se consider el hongo MA utóctono menos eficiente en cunto l producción de ioms. 37

44 Cpítulo Estudio de l cpcidd de los microorgnismos de vid lire utóctonos (cteris) pr l producción de metolitos secundrios relciondos con su ctividd jo condiciones de estrés Selección de ls cteris ms representtivs en suelo (Bz) rizosférico, y evlución de su vitlidd y ctividd niveles crecientes de estrés osmótico (inducido con PEG) Evlución de l efectividd de los isldos cterinos utóctonos, jo condiciones de estrés hídrico: Ensyo en microcosmos sore el desrrollo vegetl Determinción si ls cteris islds son exclusivmente rizosférics o son cpces de desrrollrse endofíticmente Nivel de tolernci y dptción l estrés osmótico (vlordo en términos de ufc ml -1 y prolin) de ls especies utóctons islds frente un PGPR usd como de referenci (B. thuringiensis). 38

45 Cpítulo Selección de ls cteris ms representtivs en suelo (Bz) rizosférico, y evlución de su vitlidd y ctividd niveles crecientes de estrés osmótico (inducido con PEG) Mteril y Métodos: Cd un de ls ceps utóctons islds, P. plecoglossicid, P. putid y B. megterium, se crecieron en 15 ml de medio de cultivo (M. y M., ) líquido, jo condiciones de esterilidd y concentrciones crecientes de PEG (, 2, 4 y 6%), en gitción 15 rpm y 28ºC de tempertur por un periodo de 24 hors. Los cultivos se crecieron hst lcnzr l fse estcionri, un densidd óptic de 4.5 (1 8 ufc ml -1 ) Determinciones: Curvs de crecimiento concentrciones crecientes de PEG: Medinte diluciones serids, (M. y M., ). Se expresó como ufc ml -1. Producción de proteíns: Se determinó por el método de Brdford (1976), sdo en l unión de zul rillnte de Coomssie G-25 ls proteíns. El cálculo de l concentrción de proteíns se relizó por comprción con un curv ptrón de serolumin ovin (Sigm). Se expresó en ug ml -1. Producción de Ácido Indol Acético (AIA): Cd cultivo se centrifugó 1 rpm durnte 1 min. Se tomron lícuots de 3 ml del sorendnte y se hicieron reccionr con 2 ml del rectivo de Slper (M. y M., x.x). Se expresó en µg AIA µg proteín Resultdos: P. plecoglossicid, disminuye su crecimiento medid que ument l concentrción de PEG en el medio, llegndo inhiirse (ver foto) en concentrciones de 4 y 6% de PEG, P. putid disminuye grdulmente (hst un 5%) medid que increment l concentrción de PEG y B. megterium, crece mejor en concentrciones crecientes de PEG (2 y 4%). Así pues, B. megterium, increment un 33% cundo crece con 2% PEG y es cpz de crecer un concentrción de 6% de PEG, inhiiéndose solo un 16.7% su crecimiento, est concentrción de PEG. 39

46 Cpítulo 1 Curvs de crecimiento concentrciones crecientes de PEG: P. plecoglossicid: PEG % 4 % 6 % 9 ufc ml -1 2 ufc ml -1 ufc ml -1 P. putid: PEG % 2 % 4 % 6 % 9 ufc ml -1 8 ufc ml -1 5 ufc ml -1 4 ufc ml -1 B. megterium: PEG % 2 % 4 % 6 % 6 ufc ml -1 9 ufc ml -1 7 ufc ml -1 5 ufc ml -1 Foto. Número de colonis en plcs medinte diluciones serids en concentrciones crecientes de PEG (, 2, 4 y 6%) de los isldos utóctonos En cunto l producción de AIA, P. putid y B. megterium incrementn l secreción de AIA cundo están sometids un nivel jo de PEG (2%), luego l secreción empiez disminuir pero no se inhie con ls concentrciones lts (4, 6%). 4

47 Cpítulo 1 Es de destcr que B. megterium sintetiz myor cntidd de proteíns medid que l concentrción de PEG ument. µg AIA µg proteín -1 % PEG P.plecoglossicid P. putid B. megterium,5,4 1,4 2,4,6 1,2 4,4,9 1,5 6,2 1,4 1,8 Tl 1.2. Efecto de concentrciones crecientes de PEG (, 2, 4, 6%) sore l producción de µg AIA µg proteín -1 de los isldos cterinos utóctonos Conclusiones: Los isldos utóctonos Pseudoms putid y Bcillus megterium, en condiciones de estrés osmótico tienen cpcidd de producir metolitos secundrios estimuldores del desrrollo vegetl como es el AIA Evlución de l efectividd de los isldos cterinos utóctonos, jo condiciones de estrés hídrico: Ensyo en microcosmos sore el desrrollo vegetl Mteril y Métodos: Se utilizron plnts leguminoss (Trifolium repens L.), crecids en microcosmos jo condiciones de inverndero y nivel hídrico controldo l 75% c.c. El sustrto usdo fue un mezcl de suelo:ren, en proporción de 5:2 (v/v). El suelo (de l Sierr de Bz) y l ren, reciieron el trtmiento indicdo en M. y M. ( ). L inoculción de los isldos cterinos utóctonos P. plecoglossicid, P. putid y B. megterium fue hech con 1ml de l suspensión cterin (1 8 ufc plnt -1 ) en el momento de l siemr y ocho dís después. Todos los trtmientos, reciieron un inoculción de Rhizoium sp. (isldo utóctono de l Sierr de Bz, no identificdo), (M. y M., ) se plicó 1ml de l suspensión cterin (1 8 ufc plnt -1 ) en el momento de l siemr. Los trtmientos no inoculdos reciieron 2 ml de un filtrdo del inóculo de hongos MA pr reincorporr l microiot del suelo, y su vez 2 ml de los inóculos cterinos utoclvdos Determinciones: Medinte cortes sucesivos lo lrgo de 24 meses, se determinó l efectividd de estos isldos sore l producción de ioms (M. y M., 2.1.). 41

48 Cpítulo Resultdos: L inoculción de todos los microorgnismos selecciondos ejerció un efecto positivo en el crecimiento de ls plnts en condiciones de estrés hídrico. El isldo más efectivo fue l cteri P. putid, que incrementó en un 238% l producción de ioms vegetl. Hst el 2º corte (12 meses después de l siemr) no mostró su efectividd. El efecto de culquier de los inóculos microinos fue más pronuncido en l 4ª cosech. corte 1 corte 2 corte 3 corte 4 Totl (mg % Testigo P. plecoglossicid P. putid B. megterium Tl1.3. Cosechs sucesivs. Peso seco prte ére de plnts de Tréol (mg) Conclusiones: L cteri utócton Pseudoms putid, se consider el isldo ms eficiente respecto l producción de ioms Determinción si ls cteris islds son exclusivmente rizosférics o son cpces de desrrollrse endofíticmente Mteril y Métodos: Los inóculos cterinos utóctonos (5 ml), P. plecoglossicid, P. putid y B. megterium, se crecieron hst lcnzr l fse estcionri, un densidd óptic de 4.5 (1 8 ufc ml -1 ) pr llevr co l inoculción de míz. Ls semills de míz, previmente germindo (M. y M ) se sumergieron (5 plnts, por cd cteri) durnte 1 hor en l respectiv suspensión cterin (P. plecoglossicid, P. putid, B. megterium y medio MS sin cteri). Posteriormente, ls semills fueron colocds en tuos FALCON conteniendo vermiculit fin (4 ml), donde se dicionron 25 ml de MS (sin scros y sin fitgel) jo condiciones de esterilidd (M. y M ). Los tuos se colocron en un cámr 24ºC y con un fotoperiodo de luz, oscuridd de 16h/8h y se regron periódicmente, hst los 15 dís que duró el ensyo.. 42

49 Cpítulo Determinciones: Peso fresco y seco de ioms vegetl (M. y M., 2.1.) Contenido hídrico en prte ére (M. y M., 2.2.) Crecimiento cterino (ufc ml -1 ) en rizosfer y endorizosfer: En l rizosfer, pr seprr ls cteris del mteril vegetl y del prticuldo se relizó un vortex de 2 min. l ríz y se tomron inmeditmente 1 µl pr hcer diluciones serids. (M. y M., ). Se expresron en ufc g ríz + vermiculit -1. Pr determinr ls cteris presentes en l endorizosfer, ls ríces se sumergieron en lejí 1% durnte 5 min. Se hicieron vrios enjugues con gu destild estéril, luego se mcerron en un mortero y se tomron 1 µl pr hcer diluciones serids. Se expresron en ufc ml Resultdos: L producción de ioms de ls plnts inoculds en prte ére, presentó un incremento significtivo, respecto ls plnts no inoculds L producción de ioms en ríz, presentó un incremento significtivo en ls plnts inoculds con P. putid y B. megterium. P. seco P. ére (mg) P. seco Ríz (mg) P. plecoglossicid P. putid B. megterium - P. plecoglossicid P. putid B. megterium Fig 1.1. Producción de ioms de plnts inoculds con isldos utóctonos de l Sierr de Bz (Grnd) Respecto l contenido hídrico en prte ére, tods ls plnts inoculds con ls cteris utóctons presentn un incremento significtivo respecto ls no inoculds. 65 Contenido hídrico P. plecoglossicid P. putid B. megterium Fíg 1.2. Contenido hídrico en prte ére de plnts de míz inoculdo con isldos cterinos utóctonos de l Sierr de Bz (Grnd) 43

50 Cpítulo 1 Al determinr el número de ufc g ríz+vermiculit -1 en rizosfer y endorizosfer, ls cteris Pseudomons se uicn en l prte superficil de l ríz; mientrs que l cteri B. megterium se encuentr tnto por fuer de l ríz como en su interior. Dich cteri es rizosféric y endofític. P. plecoglossicide P.putid B-megterium rizosfer 8,6 8,6 8, endorizosfer,, 6, Tl1.4. Crecimiento cterino en rizosfer (ufc g ríz+vermiculit -1 ) y en endorizosfer (ufc ml -1 ) en plnts de míz inoculdo con isldos utóctonos de l Sierr de Bz (Grnd) Conclusiones: Ls plnts inoculds con los isldos cterinos utóctonos, especilmente con P. putid y B. megterium producen un myor ioms de prte ére y de ríz. Tods ls cteris ensyds umentn en contenido hídrico en ls plnts inoculds en usenci de limitción hídric, lo que repercute en un myor producción de ioms y mejor estdo fisiológico. Se puede considerr un mecnismo iológico de grn utilidd como estrtegi de dptción vegetl ls limitciones hídrics propis de l zon semiárid selecciond Cd uno de los isldos present un estrtegi de colonizción diferente. Dos de ellos solo colonizn l rizosfer y uno es tmién colonizdor de l endorizosfer Nivel de tolernci y dptción l estrés osmótico (vlordo en términos de ufc ml -1 y prolin) de ls especies utóctons islds frente un PGPR usd como de referenci (B. thuringiensis) Mteril y Métodos: Se utilizó B. thuringiensis (cteri isld de un zon árid de l provinci de Alicnte) como cteri de referenci, por su comprod ctividd PGPR en ensyos previos y por tener un lugr de procedenci y dptción l limitción hídric similr los isldos utóctonos usdos en este estudio). En condiciones in vitro, cd un de ls cteris, tnto utóctons como de referenci, se crecieron en 15 ml de medio de cultivo (M. y M., ), jo condiciones de esterilidd en gitción 15 rpm, 28ºC de tempertur y concentrciones crecientes de slinidd,.15,.3 y.6 M de NCl, por un periodo de 24 hors. Cundo los cultivos lcnzron un crecimiento myor de 1 8 ufc ml Determinciones: Se hicieron ls siguientes determinciones: 44

51 Cpítulo 1 Curvs de crecimiento: Medinte diluciones serids, (M. y M., x.). Se determinn ls ufc ml -1 ls 12 y 24 h de crecimiento. Determinción de Prolin: Considerd como un minoácido osmoproctector (Nolte et l., 1997), se determinó por colorimetrí (Btes et l., 1973) en el extrcto cterino otenido. Preprción del extrcto cterino: Siguiendo el protocolo de Belgrder et l, Con lguns modificciones, Se centrifugó cd cultivo cterino 1 rpm durnte 1 min. El sorendnte se elimin y el pellet se resuspendió en 4 ml de uffer de lisis (1 mm EDTA, 5 mm NCl ph 6,9) y lisozim 1 mg m -1 l (Sigm), se dejo incundo 3ºC durnte 9 min. A continución se centrifugó 3 rpm durnte 1 min. y el sorendnte se centrifugó de nuevo 14 rpm durnte 25 min. El sorendnte finl otenido se mntuvo en hielo o se conservó -2ºC hst su utilizción Se tomron lícuots de 1 ml del extrcto cterino correspondiente y se hizo reccionr con 1 ml de ninhidrin ácid (se prepr clentndo 1.25 g de ninhidric en 2 ml de ácido fosfórico 6M y 3 ml de ácido cético glcil; l mezcl resultnte, se conserv 4ºC durnte no más de 24 hors) y 1 ml de cético glcil durnte 1 hor 1ºC. L rección se detuvo introduciendo los tuos en ño de hielo. L mezcl de rección se extre con 2 ml de tolueno, gitndo vigorosmente durnte 2 seg. El cromóforo otenido, hor en el tolueno, se dej tempertur miente y se mide l sornci 53 nm, utilizndo tolueno como lnco. L concentrción de prolin se determin prtir de un curv ptrón elord con concentrciones conocids de este minoácido y vlords del mismo modo que ls muestrs prolem Resultdos: L cteri de referenci utilizd (B. thuringiensis) fue más sensile ls concentrciones crecientes de sl que ls cteris utóctons. L cteri más tolernte lts concentrciones de slinidd es B. megterium. 45

52 Cpítulo 1 1 B. thuringiensis mm 15 mm 1 P. plecoglossicid mm 15 mm Log u.f.c./ml mm 6 mm Log u.f.c./ml mm 6 mm hors después de inoculr hors después de inoculr 1 B. megterium mm 15 mm Log u.f.c./ml mm 6 mm hors después de inoculr Fig Crecimiento (ufc ml -1 ) de microorgnismos (utóctonos y de referenci) concentrciones crecientes de NCl (mm) Pr determinr el límite de tolernci l NCl de l cteri ms tolernte, se relizó l un cinétic de crecimiento utilizndo un concentrción de 3 M (5 veces ms lt que l superior usd en el ensyo nterior) Log u.f.c/ml ,5 5 7, hors después de inoculr B (M) B (3M) Fig Cinétic de crecimiento (ufc ml -1 ) de l cteri B. megterium sin y con 3M de NCl L cteri B. megterium, no es cpz de incrementr su crecimiento en 3M de NCl. Pero lo mntiene. Ello sugiere que toler es concentrción l menos durnte 12 hors; Lo que represent un grn tolernci l slinidd (usdo como índice de estrés osmótico), teniendo en cuent que l slinidd del mr es de.6 M. El incremento del estrés osmótico provoc un incremento en l síntesis de prolin en P. putid y B. megterium. B. megterium, produce l más lt y constnte concentrción de Prolin medid que ument el estrés osmótico. Ello explic su lt tolernci l estrés osmótico plicdo. 46

53 Cpítulo 1 NCl (mm) B. thuringiensis P. plecoglossicid P. putid B. megterium,9,9,6,1 1,5,6,1,14,3 3,1,5,11,16 Tl1.5. Producción de prolin (µg ml -1 ) de cd uno de los isldos cterinos Conclusiones: Ls cteris P. putid y B. megterium, son los isldos que más tolern l slinidd, ello es posilemente deido que l producción de Prolin por dichos isldos cterinos ument medid que increment l concentrción de NCl. Esto nos indic que mos microorgnismos presentn un decudo potencil pr resistir los estreses osmóticos mientles de l zon de estudio y evitn el dño celulr que ocsion el gente estresnte. 47

54 Cpítulo 1 Conclusiones generles del prtdo 1.2.: Pueden considerrse orgnismos PGPR, los isldos utóctonos Pseudoms putid y Bcillus megterium, y que en condiciones de estrés osmótico tienen cpcidd de producir metolitos secundrios estimuldores del desrrollo vegetl como es el AIA. Bcillus megterium, posee un myor cpcidd de osmodptción que el resto de los isldos cterinos. Ello permite su crecimiento elevd osmolridd en el medio posilemente motivdo por l síntesis de solutos comptiles, como l prolin. Así mismo, l tener un colonizción de tipo rizo y endorizosferic, supone un mecnismo iológico de grn utilidd como estrtegi de preservción nte ls limitciones hídrics propis de l zon semiárid selecciond. Tles comportmientos y crcterístics sugieren que se trt de l cteri más promisori, utilizr en los ensyos en los que se nliz ls ctividdes fisiológics y fisicoquímics que presentn ls plnts como respuest su inoculción (justificción pr el Cpítulo 4, de l presente tesis doctorl). 48

55 Cpítulo Evlución de l intercción de los isldos utóctonos (hongos MA y cteris) y estudio de los mecnismos fisiológicos y ioquímicos relciondos con su ctividd de protección de ls plnts jo condiciones de limitción hídric Evlución de l intercción hongos MA-cteris utóctonos en microcosmos. Un vez otenido los resultdos del prtdo 1.3.1, se relizó los siguientes ensyos: Evlución de l dinámic de infección de los isldos MA utóctonos G. constrictum y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Determinción de l intercción G. intrrdices proveniente de cultivo monoxénico (de colección) con microorgnismos isldos en l Sierr de Bz, en microcosmos Evlución de l dinámic de infección de los isldos MA utóctonos G. mossee y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Evlución de l dinámic de l infección de los isldos AM G. mossee utóctono y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Determinción de l cpcidd colonizdor del micelio producido por G. mossee (MA ó MR) y generdo jo l influenci del metolismo microino P. putid o B. megterium Determinción de l intercción direct (no medid por l plnt) entre los endofitos G. mossee (utóctono o de referenci (BEG 119) con B. megterium (l más tolernte l estrés osmótico y más eficiente (en términos de crecimiento). 49

56 Cpítulo Evlución de l dinámic de infección de los isldos MA utóctonos G. constrictum y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Evlución de l intercción hongos MA-cteris utóctonos en microcosmos Mteril y Métodos: Se utilizron plnts leguminoss (Trifolium repens L.), crecids en microcosmos jo condiciones de inverndero y nivel hídrico controldo l 75% c.c. El sustrto usdo fue un mezcl de suelo:ren, en proporción de 5:2 (v/v). El suelo (de l Sierr de Bz) y l ren, reciieron el trtmiento indicdo en M. y M., ( ). Los hongos MA utóctonos, selecciondos como los más frecuentes y undntes en l Sierr de Bz fueron: G. constrictum, G. clroideum, G. corontum y G.mossee. Pr l inoculción, se utilizron 1 g de inóculo de cd hongo MA (M. y M., ). L inoculción de los isldos cterinos utóctonos P. plecoglossicid, P. putid y B. megterium fue hech con 1ml de l suspensión cterin (1 8 ufc plnt -1 ) en el momento de l siemr y ocho dís después. Todos los trtmientos, reciieron un inoculción de Rhizoium sp. (isldo utóctono de l Sierr de Bz, no identificdo), (M. y M., ) se plicó 1ml de l suspensión cterin (1 8 ufc plnt -1 ) en el momento de l siemr. Los trtmientos no inoculdos reciieron 2 ml de un filtrdo del inóculo de hongos MA pr reincorporr l microiot del suelo, y su vez 2 ml de los inóculos cterinos utoclvdos Determinciones: Medinte cortes sucesivos lo lrgo de 24 meses, se determinó l efectividd de estos isldos sore l producción de ioms vegetl (M. y M., 2.1.) Resultdos: L dole inoculción fue efectiv en todos los csos. Existen distintos rngos de comptiilidd funcionl dependiendo de los microorgnismos socidos: Ls cteris P. plecoglossicid y P. putid son más efectivs en socición con G. clroideum (el hongo menos efectivo). B.megterium fue el microorgnismo que más eficiente interccionó con culquier de los hongos AM socidos. Se confirm que G. constrictum es el hongo más efectivo y G. clroideum el menos, l efectividd de G. clroideum (l myor en el 1º corte) disminuye, comprtivmente con los otros 2 isldos fúngicos, en el 3º y 4º corte. 5

57 Cpítulo 1 Peso seco PA (mg) corte 4 corte 3 48% corte 2 24% corte 1 14% - P. plecoglossicid P. putid B. megterium G. constrictum Peso seco PA (mg) corte 4 corte 3 69% 75% 62% corte 2 corte 1 - P. plecoglossicid P. putid B. megterium G. clroideum Peso seco PA (g) corte 4 corte 3 corte 2 corte 1 41% 56% 95% Peso seco PA (g) corte 4 corte 3 corte 2 corte 1 24% 194% 121% P. plecoglossicid P. putid B. megterium - P. plecoglossicid P. putid B. megterium G. corontum G. mossee Fig Peso seco cortes sucesivos PA (mg) Conclusiones: Ls intercciones de G. constrictum y G. mossee con B. megterium, son ls más eficientes (95% y 121%, respectivmente) incrementndo l producción de ioms vegetl. L intercción con G. mossee con P. putid, es l más eficiente (194%) incrementndo l producción de ioms vegetl. 51

58 Cpítulo Evlución de l dinámic de infección de los isldos MA utóctonos G. constrictum y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Mteril y Métodos: Se utilizó como plnt modelo Lechug (Lctuc stiv vr. Romn). L lechug, creció en mesocosmos jo condiciones controlds de esterilidd l 75% y 1% c.c, el sustrto usdo fue un mezcl de suelo (Zidín):ren, en proporción de 1:1 (v/v). El suelo y l ren reciieron el trtmiento indicdo en el prtdo Mteriles y Métodos generles. L inoculción del hongo MA utóctono y de los isldos cterinos (de referenci y utóctono) se efectuó como se descriió en el prtdo de Mteriles y Métodos generles. Se utilizron 8 repeticiones/ trtmiento. El ensyo tuvo un durción de 5 dís (6 semns) y un estrés de 14 dís. Análisis estdístico de Fisher s protected LSD Determinciones: Relción R/PA Suministro de gu (Ver M. y M., prtdo x.x.) Contenido hídrico reltivo (CHR): Deido que el peso seco puede experimentr cmios dirios y estcionles, ls determinciones comprtivs del contenido hídrico sds en el peso seco no son stisfctoris. Un form de eliminr estos prolems consiste en expresr el contenido hídrico sore l se del contenido hídrico plen turgenci, es decir, l peso turgente (Pt), psndo denominrse CHR (Boyer, 1995). Se plicó l siguiente fórmul, donde El Pt se otiene trs incur los tejidos de l plnt en gu destild y tempertur miente durnte 2-3 hors. Peso fresco - Peso seco CHR (%) = * 1 Peso totl - Peso seco Trnspirción estomátic: El dí de l cosech se curió l superficie de ls mcets con ppel luminio l inicio del fotoperiodo pr evitr l evporción. Ls mcets se pesron l inicio del fotoperiodo (peso inicil, pi) y ls seis hors después (peso finl, pf). Así, l trnspirción totl (E T ) se expresó como g H 2 O plnt -1 h -1 y se clculó medinte l siguiente fórmul, E T = (pi-pf) 6 Porcentje de micorrizción (M. y M., prtdo x.x.) Uniddes formdors de coloni (ufc ml -1 ) (M. y M., prtdo x.x.) Aundnci nturl del crono ( 13 C) (M. y M., prtdo x.x.) Contenido de N, P y K en prte ére (M. y M., prtdo x.x.) 52

59 Cpítulo Resultdos: Relción R/PA: Ls plnts inoculds con G. constrictum + B. megterium jo condiciones de sequí, presentn l myor relción ríz/prte ére, con diferenci significtiv frente los demás trtmientos. Trnspircion (mg cm -2 h -1 ) % 75% B. thur B. meg G.cons G.cons+B. thur G.cons+B.meg Fig Relción R/PA Suministro de gu: En ls plnts sin estrés hídrico, los trtmientos de ls co-inoculciones con G. constrictum+b. thuringiensis y G. constrictum+b. megterium, necesitron un menor suministro hídrico dirio, con diferenci significtiv frente los demás trtmientos. Bjo condiciones de estrés hídrico, ls plnts inoculds con G. constrictum solo o en intercción con B. megterium, necesitron un menor suministro de gu (ml) por dí, con un diferenci significtiv frente los demás trtmientos. 6, 1% 75% suministro gu dí-1 (ml) 5, 4, 3, 2, de d e c de c e 1,, B. thur B. meg G.cons G.cons+B. thur G.cons+B.meg Fig Suministro de gu ml dí -1 Contenido hídrico reltivo: Ls plnts inoculds con B. megterium sin estrés hídrico, presentron el myor CHR, seguids de los trtmientos inoculdos con G. constrictum + B. megterium respecto los demás trtmientos jo condiciones de estrés. Ls plnts inoculds con B. thuringiensis, presentron el menor CHR, y se solo en intercción con G. constrictum respecto los demás trtmientos jo condiciones de estrés. 53

60 Cpítulo 1 CHR (%) c c 1% 75% 7 6 B. thur B. meg G.cons G.cons+B. thur G.cons+B.meg Fig Contenido hídrico reltivo (%) Trnspirción estomátic: No se oservó diferenci significtiv en cunto l trnspirción estomátic entre los trtmientos sin estrés y jo estrés. Trnspircion (mg cm -2 h -1 ) % 75% B. thur B. meg G.cons G.cons+B. thur G.cons+B.meg Fig Trnspirción estomátic Porcentje de micorrizción: Ls plnts inoculds con G. cons+b.meg incrementron de form significtiv l intensidd de micorrizción (%M) y producción de rusculos (%A) jo condiciones de estrés hídrico, respecto los demás trtmientos. Así mismo, los trtmientos G. cons+b.thur y G. cons+b.meg, incrementron significtivmente l producción de rusculos en el segmento evludo (%) jo condiciones de estrés hídrico, frente los demás trtmientos. Fig colinizción (%) %M % c.c. 75 % c.c. c d cd cd %m % c.c. 75 % c.c %A % G.cons c.c. G.cons+B. thur G.cons+Bmeg 75 % c.c. c c c c % G.cons G.cons+B. thur G.cons+Bmeg 1 % c.c. 75 % c.c. c 15 2 c 1 5 G.cons G.cons+B. thur G.cons+Bmeg 54 1 G.cons G.cons+B. thur G.cons+Bmeg

61 Cpítulo 1 ufc gss -1 : Los trtmientos sometidos sequí, pero inoculdos con B. megterium presentron el myor número de este microorgnismos en suelo rizosférico (ufc gss -1 ), seguido de ls plnts inoculds con G. cons + B.thur. L limitción hídric en el medio fvoreció, en todos los csos el mntenimiento del microorgnismo inoculdo % c.c. 75 % c.c. 6 6 Log u.f.c ml c c c c B. thur B. meg Cons+B.thur Cons+B.meg Fig ufc gss -1 Aundnci nturl del crono ( 13 C): Ls plnts crecids jo sequí, pero inoculds con B. megterium solo o en intercción con G. constrictum, muestrn ms contenidos de 13 C que nos indicn que son plnts menos estresds. Trtmientos 13 C 1 % c.c. 75 % c.c. B. thur -3,5 cd -29,9 B. meg -3,4 cd -29,5 G.cons -3,7 d -29,9 G.cons+B. thur -3,6 cd -3, c G.cons+B.meg -3,7 cd -29,7 Tl1.6. Aundnci nturl de 13 C Contenido de N, P y K en prte ére: Ls plnts inoculds con B. thuringiensis, y crecids sin estrés hídrico, presentn incrementos significtivos de l concentrción de N (%) en prte ére. Mientrs que ls plnts inoculds con G. constrictum+b. thuringiensis en condiciones de sequí, son ls que presentn un menor concentrción de dicho elemento. Ls plnts inoculds con G. constrictum+b. megterium sin estrés hídrico, presentn un incremento significtivo de l concentrción de N (%) en prte ére, respecto l vlor otenido en dicho trtmiento con limitción hidric. Ls plnts inoculds con B. thuringiensis y B. megterium sin estrés y B. megterium con estrés son ls que menos % N tienen. Curiosmente, ls plnts inoculds con B. thuringiensis y no sometids estrés hídrico son ls que menos %N tienen. 55

62 Cpítulo 1 L dole inoculción de G. constrictum + B. megterium fue prticulrmente efectiv incrementndo %P en situción de no limitción hídric. L inoculción de mos Bcillus (thuringiensis y megterium) fue muy efectiv incrementndo l concentrción de K en situción de sequí. 2,5 1 % c.c. 75 % c.c.,25 1 % c.c. 75 % c.c. 2,,2 c %N 1,5 1, c c c c c c c %P,15,1 c c c c c c,5,5, B. thur B. meg G. cons G. cons+b. thur G. cons+b. meg, B. thur B. meg G. cons G. cons+b. thur G. cons+b. meg 7, 6, 5, 1 % c.c. 75 % c.c. c c %K 4, 3, d cd 2, 1,, B. thur B. meg G. cons G. cons+b. thur G. cons+b. meg Fig Contenido de N, P y K en prte ére (%) Conclusiones: Los isldos G. constrictum y B. megterium contriuyen l uso más eficiente del gu en ls plnts jo condiciones de estrés hídrico. El requerir menor suministro de gu dirio, incrementr el CHR en ls plnts e incrementr l relción R/PA (form prte de los mecnismos de resistenci de ls plnts pr contrrrestr ls condiciones dverss), sin lterr l trnspirción estomátic, se ve reflejdo en l undnci nturl de 13 C y el contenido de K en prte ére de ls plnts. Además, tl ctividd se puede relcionr con el myor porcentje de micorrizción en cunto l intensidd (%M) y l producción de rusculos (%A), jo condiciones de sequí; en cunto l lt cpcidd colonizdor medid como ufc ml -1, l intercción G.cons+B.thur puede estr hciendo un efecto de sumidero y tomndo los nutrientes pr l cteri, lo que repercute en l j concentrción de nutrientes (N, P y K) en ls plnts y menor protección contr el estrés hídrico en ls plnts inoculds con estos microorgnismos. Conclusiones generles del prtdo : L intercción B. megterium que en ensyos nteriores er l ms efectiv (present myor comptiilidd) en socición con MA utócton que con otr MA de referenci. Los isldos G. constrictum y B. megterium contriuyen l uso más eficiente del gu en ls plnts jo condiciones de estrés hídrico. 56

63 Cpítulo 1 Se seleccion los isldos cterinos P. putid y B. megterium pr continur con el estudio de l intercción en l fse de cultivo in vitro de G. intrrdices. 57

64 Cpítulo Determinción de l intercción G. intrrdices proveniente de cultivo monoxénico (de colección) con microorgnismos isldos en l Sierr de Bz, en microcosmos Pr nlizr l intercción de los isldos utóctonos de form direct se utilizó el sistem in vitro. Previmente, se relizó un ensyo en condiciones de inverndero pr evlur l intercción de dichos isldos con G. intrrdices Smith & Schenck (DAOM , Biosystemtic Reserch Center, Ottw, Cndá), desrrolldo en condiciones in vitro (cultivo monoxénico) Mteril y métodos: Se utilizron plnts leguminoss (Trifolium repens L.), crecids en mesocosmos jo condiciones de inverndero y nivel hídrico l 75% c.c. El sustrto usdo fue un mezcl de suelo:ren, en proporción de 5/2 (v/v). El suelo (de l Sierr de Bz) y l ren, reciieron el trtmiento indicdo en M. y M., ( ). Como hongo MA, se utilizó G. intrrdices Smith & Schenck (DAOM , Biosystemtic Reserch Center, Ottw, Cndá), suministrdo por el Dr. A. Bgo de l Estción Experimentl del Zidín (CSIC, Grnd), desrrolldo en condiciones in vitro (cultivo monoxénico), es decir, cultivo dole en plcs de Petri de un hongo micorrícico y ríces en condiciones de complet esterilidd, usndo como mteril vegetl ríces de znhori (Ducus crot) DC2 trnsformds con Agrocterium rhizogenes. El cultivo del hongo MA, se estleció en plcs de Petri i-comprtimentds, con el fin de otener zons en ls que solmente crecier el hongo, pr fcilitr l otención de cntiddes suficientes de ms fúngic sin interferenci de ls ríces hospeddors. El estlecimiento del cultivo se relizó siguiendo lo metodologí descrit por St-Arnud et l. (1996), con lguns modificciones (M. y M., x.x.), pr ello se ñdió en uno de los comprtimientos de l plc medio M, denomindo comprtimiento de l ríz (CR) y en el otro comprtimiento medio M sin scros (M-C), denomindo comprtimiento de ls hifs (CH), ls plcs se conservron 25 ºC en oscuridd, hst otener un estdo fisiológico optimo pr ser utilizdo como inóculo. El inóculo fúngico consistió en cuos (.5 cm 3 ) de medio, proveniente de el comprtimiento (CH) de l plc de monoxénico, conteniendo proximdmente 5 espors e hifs externs, fue diciondo 1 cuo por plnts l momento de l siemr. L inoculción de los isldos cterinos utóctonos P. plecoglossicid, P. putid y B. megterium fue hech con 1ml de l suspensión cterin (1 8 ufc plnt -1 ) en el momento de l siemr y ocho dís después. Los trtmientos no inoculdos reciieron 2 ml de un filtrdo del inóculo de hongos MA pr reincorporr l microiot del suelo, 2 ml de los inóculos cterinos utoclvdos. Se preprron 8 repeticiones por trtmiento. El ensyo tuvo un durción de 4 dís y el estrés hídrico se inició los 3 dís después del estlecimiento del ensyo. 58

65 Cpítulo Determinciones: Producción ioms vegetl (M. y M., prtdo 2.1.) Contenido hídrico (M. y M., prtdo x.x.) Porcentje hoj hidrtd/sec: L superficies de hoj sec se cuntific en un escl sujetiv, donde A: menos del 1% de hoj sec, B: entre el 1 y el 3% de hoj sec, C: entre el 3 y 5% de hoj sec, D: entre el 51-8% de hoj sec y E: entre el 8-1% de hoj sec Resultdos: Producción ioms vegetl: Se oserv un incremento significtivo en l producción de ioms de prte ére de ls plnts inoculds con G. intrrdices solo no siendo modificdo en intercción con los isldos cterinos utóctonos P. plecoglossicid o P. putid. En cunto l producción de ioms de ríz, hy un efecto positivo de ls plnts inoculds con G. intrrdices prticulrmente en socición con P. putid. A su vez, se oserv un efecto significtivo de este vlor en los trtmientos. 9 6 P. seco PA (mg) 6 3 P. seco Ríz (mg) 4 2 c testigo AM AM+P.pleg AM+P.put AM+B.meg testigo AM AM+P.pleg AM+P.put AM+B.meg Fíg Peso seco de Prte ére y Ríz de plnts de Trifolium repens L. crecids en condiciones de estrés hídrico (75% c.c.) Contenido hídrico: Ls plnts inoculds con G. intrrdices incrementn de form notle el contenido hídrico, y en socición con B. megterium, presentron l myor diferenci en cunto l contenido hídrico en prte ére frente l control. El vlor lcnzdo en plnts dolemente inoculds con G. intrrdices + B. megterium resultó ser ms de 4 veces l otenido en plnts controles. 5 Contenido hídrico PA c c testigo AM AM+P.pleg AM+P.put AM+B.meg Fig Contenido hídrico en prte ére 59

66 Cpítulo 1 Producción de hoj fresc/sec (%): Ls plnts inoculds con G. intrrdices y con P. putid o B. megterium presentron un incremento importnte en cunto l producción de hojs frescs frente los demás trtmientos. Trtmientos % hojs fresc Superficie de hojs sec (escl sujetiv) A B C D E Totl % Testigo AM AM+P.pleg AM+P.put AM+B.meg Tl 1.7. Hojs frescs (%) en plnts de Trifolium repens jo estrés hídrico l 75% c.c Conclusiones: L intercción de G. intrrdices con ls cteris utóctons es positiv en cunto l mntenimiento de un myor porcentje de hojs frescs. Tl efecto fué especilmente notle en ls plnts inoculds con G. intrrdices + B. megterium. Esto nos demuestr que ls intercciones microins fectn de form diferente no solo l producción de ioms, sino otros vlores fisiológicos vegetles que fueron potencidos por ls intercciones G. constrictum + B. megterium y G. intrrdices + P. putid. L intercción de G. intrrdices +B. megterium fvoreció el contenido hídrico en l prte ére de l plnt, lo que puede relcionrse con l cntidd de hojs verdes cuntificds en dicho trtmiento, sumiendo que est intercción gener un protección l plnt frente l estrés hídrico unque no se detecte un estimulción en l producción de ioms. En vist estos resultdos, seleccionmos los isldos cterinos P. putid y B. megterium pr continur con el estudio de l intercción en l fse de cultivo in vitro de G. intrrdices. Conclusiones generles del prtdo : Se seleccion los isldos cterinos P. putid y B. megterium pr continur con el estudio de l intercción en l fse de cultivo in vitro de G. intrrdices. 6

67 Cpítulo Evlución de l dinámic de infección de los isldos MA utóctonos G. mossee y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Evlución de l dinámic de l infección de los isldos AM, G. mossee utóctono y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds Teniendo en cuent que el hongo MA, G. mossee, es un hongo que se encuentr de form nturl undntemente en el suelo de l Sierr de Bz, que h sido usdo como inóculo en ensyos nteriores (Mrulnd et l. y otros) y resultó ser un especie ms sensile l estrés osmótico que G. intrrdices y otros isldos fúngicos ensydos y que siempre hn sido usdos pr incrementr l tolernci de ls plnts l estrés osmótico, h demostrdo un j eficienci pr tl fin. Concordnte con ests evidencis se h demostrdo que est especie induce los mecnismos que evitn el dño oxidtivo en menor nivel que G. intrrdices. Posilemente, el menor desrrollo de su micelio extrrdicl no cooper tn eficientemente como el de G. intrrdices cptr gu desde zons no disponiles l ríz (Ruiz-Lozno nd Azcón, 1996), Por ello se decidió hcer un estudio dicionl, donde se evluó l dinámic de l infección de los isldos MA utóctonos G. mossee y de referenci, en presenci y usenci de ls cteris P. putid y B. megterium utóctons seleccionds pr consttr si tles cteris logrn incrementr l eficienci de dicho endofito en condiciones de limitción hídric l que siempre resultó ser ms sensile que otros isldos Mteril y métodos: Se utilizron plnts leguminoss (Trifolium repens L.), crecids en mesocosmos jo condiciones de inverndero y nivel hídrico l 75% c.c. El sustrto usdo fue un mezcl de suelo:ren, en proporción de 5/2 (v/v). El suelo (de l Sierr de Bz) y l ren, reciieron el trtmiento indicdo en M. y M., ( ). Pr l inoculción de G. mossee utóctono de l Sierr de Bz y G. mossee de referenci, BEG 122-EE7 (Bnco de Glomles de l Estción Experimentl del Zidín). Se plicron 1 g de inóculo de cd hongo MA, en el momento de l siemr. L inoculción de los isldos cterinos utóctonos P. putid y B. megterium fue hech con 1ml de l suspensión cterin (1 8 ufc plnt -1 ) en el momento de l siemr y ocho dís después. Los trtmientos no inoculdos reciieron 2 ml de un filtrdo del inóculo de hongos MA pr reincorporr l microiot del suelo, y su vez 2 ml de los inóculos cterinos utoclvdos. Se preprron 6 repeticiones por trtmiento y medinte cortes sucesivos los 15, 3 y 6 dís se evluó el crecimiento vegetl. 61

68 Cpítulo Determinciones: Curv de infección de los HMA en l ríz en ls condiciones mientles de l zon elegid y l efectividd de ls cteris en el proceso infectivo de colonizción: Intensidd de colonizción (M%), Producción de rusculos (A%), Producción de vesículs, Arquitectur y Longitud de ríz (M. y M., prtdo x.x.) Evolución de ls u.f.c cterins en rizosfer/hifosfer (M. y M., prtdo x.x.) Resultdos: Nivel de micorrizción: Intensidd de colonizción (M%) y rusculr (A%) Ls plnts colonizds G. mossee utóctono, presentron myor %M y %A los 6 d.d.s. tnto solo como en intercción con los isldos cterinos utóctonos. L intercción de MA y MR con culquier de los isldos cterinos increment l colonizción y el número de rusculos. Siendo B. megterium l cteri más efectiv (lleg duplicr el desrrollo rdiculr los 6 dís y delnt l presenci de los mismos los 3 dís) %M P. putid B. megterium %A P. putid B. megterium MR MA MR MA MR MA MR MA Tiempo (dís) Tiempo (dís) Fíg Porcentje de micorrizción los 3 y 6 dís en plnts colonizds por MR o MA en usenci y presenci de cteris utóctons Producción de vesículs: L producción de vesículs, es myor tmién en ls plnts colonizds por MA+B. megterium que incrementó en un 15% este vlor. Nº vesiculs.ríz fresco ḡ d c d d - P. putid B. megterium MR MA Fíg Producción de vesículs (número) en ríces de tréol colonizdo por MR o MA en usenci y presenci de cteris utóctons 62

69 Cpítulo 1 Arquitectur de ríces: Ls plnts inoculds con MA+P. putid presentn un myor producción de ríces tnto secundris como terciris. Mientrs que l inoculción con MR+B. megterium incrementó principlmente l producción de ríces secundris. 6 d.d.g. 6 d.d.g Producción ríces 2º Producción ríces 3º P. putid B. megterium - P. putid B. megterium - P. putid B. megterium - P. putid B. megterium MR MA MR MA Fíg Producción de ríces secundris y terciris en ríces inoculds con MA y MR de tréol en usenci y presenci de cteris utóctons Áre rdicl: El áre rdicl, present un myor desrrollo colonizd por G. mossee utóctono que de G. mossee de referenci. 8 Áre rdicl (cm) MR MA - P. putid B. megterium Fíg Áre rdicl de ríces de tréol en suelo de Bz (cm 2 ) Evolución lo lrgo del tiempo de ls u.f.c. en suelo rizosférico: Log u.f.c. (g ríz -1.gss -1 ) MR- MR+P. putid MR+B.megterium Tiempo (dís) Log u.f.c. (g ríz -1.gss -1 ) MA- MA+ P.putid MA+B. megterium Tiempo (dís) Fíg Evolución de ls polciones de (ufc) P. putid y B. megterium inoculds (P. putid y B. megterium) en intercción con G. mossee utóctono y/o de referenci en suelo de Bz nturl 63

70 Cpítulo Conclusiones: Se oserv como los 3 dís de l inoculción, ls polciones rizosféric de ls plnts inoculds con l MA present myor numero de u.f.c. que ls plnts inoculds con MR, siendo MA+P. putid l que present myor número de u.f.c. en el suelo En ls plnts inoculds con MA+P. putid se increment l producción de ríces tnto secundris como terciris y tmién presentn un incremento en el áre rdiculr Ls plnts inoculds con MR+B. megterium incrementron l producción de ríces secundris. Ls plnts inoculds con MA, presentron un myor infección desde los 3 d.d.s. Hy un myor producción de rusculos y vesículs en ls plnts inoculds con MA+B. megterium, especilmente los 6 d.d.s. No se puede estlecer correlción entre número de cteris estlecids en l rizosfer y el nivel de colonizción fúngic lcnzdo Determinción de l cpcidd colonizdor del micelio producido por G. mossee (MA ó MR) y generdo jo l influenci del metolismo microino P. putid o B. megterium Mteriles y métodos: El sistem experimentl que utiliz ls olss de my (<5 µm), permite evlur de form direct l ctividd colonizdor del micelio del hongo y el efecto de culquier gente sore dicho vlor. Se utilizó un leguminos (Trifolium repens L) y un nivel hídrico en el medio de 75% c.c. lo lrgo de todo el ensyo, pr evlur el efecto de l cpcidd colonizdor del micelio de G. mossee utóctono (MA) frente uno de referenci (MR) (EEZ) en presenci o no de los isldos cterinos: P. putid y B. megterium. Todos los trtmientos, reciieron un inoculción de Rhizoium sp. (isldo utóctono de l Sierr de Bz, no identificdo), (M. y M., ) se plicó 1ml de l suspensión cterin (1 8 ufc plnt -1 ) en el momento de l siemr. El sustrto fue suelo de l Sierr de Bz nturl + ren (5/2 v/v) con 6 repeticiones por trtmiento. Durción, 12 meses. Los trtmientos iológicos se plicron en el comprtimiento exterior (rodendo l ols) (HC) y psdo un tiempo. L posterior micorrizción se verific por los propágulos MA cpces de penetrr RC y conectr con l ríz. 64

71 Cpítulo Determinciones: Producción de ioms PA (M. y M., 2.1.) Are rdicl (M. y M., 2.1.) Producción de nódulos (nº) (M. y M. ) Porcentje de colonizción (TB) (M. y M. x.x) y vitlidd (SDH) (M. y M. x.x) Producción de micelio totl y vivo (M. y M., x.x.) Producción de Glomlin (M. y M., x.x.) Resultdos: Producción de ioms PA: Ls plnts inoculds con G. mossee utóctono incrementron de form significtiv l producción de áre rdicl. Producción ioms PA (mg) P. put B. meg - P. put B. meg - P. put B. meg Testigo MR MA Fíg Bioms PA (mg) Are rdicl: Ls plnts inoculds con G. mossee utóctono incrementron de form significtiv el áre rdicl, especilmente ls inoculds con B. megterium. 27, Longitud ríz (m) 18, 9,, - P. put B. meg - P. put B. meg - P. put B. meg Testigo MR MA Fíg Are rdicl (m) Número de nódulos: Los trtmientos inoculdos con G. mossee (utóctono) + B. megterium, incrementron significtivmente l producción de nódulos en l ríz. 65

72 Cpítulo 1 Nódulos (nº) B L - B L - B L Testigo MR MA Fíg Producción de nódulos (nº) Porcentje de colonizción (TB): Los trtmientos inoculdos con G. mossee (referenci) incrementron significtivmente l intensidd de micorrizción, (%M y %m) y l producción de rusculos (%A y %), tnto en l ríz complet como en el segmento evludo, en intercción con los isldos utóctonos (P. putid o B. megterium). Los trtmientos inoculdos con G. mossee (utóctono) + B. megterium, incrementron significtivmente l intensidd de micorrizción, (%M y %m) y l producción de rusculos (%A y %). %M %m P. put B. meg - P. put B. meg - P. put B. meg - P. put B. meg MR MA MR MA %A % P. put B. meg - P. put B. meg MR MA 2 - P. put B. meg - P. put B. meg MR MA Fíg Porcentje de colonizción (TB) Porcentje de vitlidd (SDH): En función de l longitud de ríz, l inoculción de ls cteris utóctons P. putid o B. megterium, incrementron el porcentje de vitlidd del hongo G. mossee tnto utóctono como de referenci, significtivmente frente los demás trtmientos, especilmente en l producción de rusculos del segmento evludo (%m). 66

73 Cpítulo 1 Longitud ríz (cm) 1,8 1,6 1,4 1,2 1,,8,6,4,2, Tréol olss tel (Vitlidd %M ) - B L - B L Longitud ríz (cm) Tréol olss tel (Vitlidd %m) - B L - B L MR Trtmientos MA MR Trtmientos MA Long ríz (cm) Tréol olss tel (Vitlidd %A) - B L - B L Longitud ríz (cm) Tréol olss tel (Vitlidd %) - B L - B L MR Trtmientos MA MR Trtmientos MA Fíg Porcentje de vitlidd (SDH) Producción de micelio totl y vivo: Ls intercciones en los trtmientos inoculdos con G. mossee con P. putid y B. megterium fue positiv, en cunto l cntidd de producción de micelio extrrdicl y l vitlidd del mismo. Micelio Totl ( m gss-1) P. put B. meg - P. put B. meg MR MA Micelio Vivo (m gss-1) 2 1,5 1,5 - P. put B. meg - P. put B. meg MR MA Fíg Producción de micelio totl Producción de Glomlin: En los trtmientos inoculdos con G. mossee utóctono, y se solo o en intercción con los isldos cterinos, l producción de glomlin se incrementó significtivmente respecto G. mossee de referenci. 2 Glomlin totl (mg gss -1 ) P. put B. meg - P. put B. meg MR MA 67

74 Cpítulo 1 Fíg Producción de Glomlin en el suelo (mg gss -1 ) Conclusiones: L intercción G. mossee utóctono + B. megterium es positiv, Estimul en el hongo su cpcidd de infección, y efectividd como simionte Determinción de l intercción direct (no medid por l plnt) entre los endofitos G. mossee (utóctono o de referenci (BEG 119) con B. megterium (l más tolernte l estrés osmótico y más eficiente (en términos de crecimiento) Mteril y Métodos: Se utilizron 2 niveles hídricos en el medio (8% c.c. y 1% c.c.), pr evlur el posile efecto del nivel de gu en l intercción entre los microorgnismos socidos. El sistem experimentl que utiliz ls ríces procedentes de un plnt similrmente distriuids entre dos comprtimentos. Ello permite determinr, l intercción de form direct, entre GmA ó GmR con B. megterium dos potenciles hídricos Determinciones: Producción de ioms rdiculr (M. y M., prtdo 2.1.) Porcentje de micorrizción (TB, SDH) (M. y M., prtdo x.x.) Micelio extrrdicl Totl y Glomlin (M. y M., prtdo x.x.) Eficienci Fotosintétic: Ls medids se relizron usndo un PEA (portle Plnt Efficiency Anlyzer (Hnstech Instruments, Norfolk, UK). Pr ello, un dí ntes de cosechr, se midió l fluorescenci en l cr dxil de l hoj correspondiente l segund hoj, siguiendo ls instrucciones del equipo, recogiéndose l fluorescenci emitid durnte un tiempo de 5 seg. Se expres como l proporción de l fluorescenci vrile fluorescenci máxim (Fv / Fm), si es myor.738 no hy dño en el fotosistem II. Actividdes enzimátics rizosférics (indictivos de l fertilidd del suelo) (M. y M., prtdo x.x.) * Actividd Deshidrogens (Relciond con l riquez microin) * Actividd Fosfts (Relciond con el ciclo de fósforo) * Actividd ß-Glucosids (Relciond con los contenidos de crono orgánico) Producción de AIA (Auxin promotor del crecimiento) (M. y M., prtdo x.x.) Resultdos: Producción de ioms rdiculr: L inoculción con G. mossee utóctono incrementó, en myor medid el desrrollo rdiculr, mos potenciles hídricos del medio. 68