TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: DETERMINACIÓN DE FENILALANINA PARA PESQUISA NEONATAL DE FENILCETONURIA Y DE GALACTOSA PARA PESQUISA NEONATAL DE GALACTOSEMIA Objetivos: Dra. Mariana Ferramola - Definir lo que es un Programa de Pesquisa Neonatal en los Programas de Prevención de la salud. - Conocer los requisitos que debe cumplir un error congénito del metabolismo para ser objeto de estudio por parte de un Programa de Detección Neonatal. - Conocer el fundamento de las reacciones estándar de determinación de fenilalanina usado para pesquisa neonatal de fenilcetonúricos. Introducción La Detección Neonatal de Errores Congénitos del Metabolismo conocida también como Screening o Pesquisa Neonatal, constituye una de las herramientas más contundentes que ha desarrollado la Profilaxis Pediátrica Moderna. La Detección Neonatal de Errores Congénitos del Metabolismo consiste en la búsqueda de desórdenes difíciles de reconocer clínicamente en el neonato, sobre una muestra no seleccionada de la población. Por esta razón, resulta de fundamental importancia en aquellas enfermedades que carecen de síntomas específicos tempranos, que producen daño severo e irreversible, y que son pasibles de tratamiento. En países desarrollados, la Pesquisa Neonatal forma parte esencial de los Programas de Prevención de la salud. Las estrategias con que se ejecutan los mismos, varían de un país a otro; sin embargo, en todos los casos se plantea un objetivo común, que es la identificación y prevención de desórdenes de la salud que pueden conducir a problemas potencialmente catastróficos. De ésta manera, hablar de Pesquisa Neonatal es equivalente a hablar de Medicina Preventiva. El éxito de un programa de screening se basa en la disponibilidad de métodos bioquímicos adecuados y en la correcta información y concientización de la población en general, y en particular de padres, pediatras, médicos especialistas, bioquímicos, asistentes sociales, nutricionistas, enfermeras y autoridades competentes. Para que un Error Congénito del Metabolismo sea objeto de estudio por parte de un Programa de Detección Neonatal, debe cumplir con los siguientes requisitos: 1) Causar daños graves e irreversibles. 2) Carecer de signos clínicos en el período neonatal. 3) Poseer un tratamiento efectivo ante la instalación precoz 4) Poseer una incidencia suficientemente alta para justificar su investigación. 5) Existir un conocimiento acabado del curso clínico de la enfermedad. 6) Contar con métodos bioquímicos de diagnóstico y confirmación sensibles, específicos, sencillos y de bajo costo. 7) Contar con un sistema adecuado de recolección, transporte y almacenamiento de muestras. Hasta la fecha, se han descrito más de 4000 Errores Congénitos del Metabolismo, Área de Química Biológica 104
de los cuales aproximadamente 70 conducen a un daño cerebral leve o severo, disponiendo 50 de ellos de tratamiento efectivo. Estos últimos resultan clínicamente importantes, si su incidencia también lo es. En la siguiente tabla, se presenta la frecuencia con que se presenta cada una de las enfermedades incluídas en el programa de pesquisa neonatal. Enfermedad Frecuencia Hipotiroidismo congénito 1: 3000 Fenilcetonuria 1:10.000-14.000 Galactosemia 1: 60.000 Hiperplasia Adrenal Congénita 1: 12.000 Fibrosis Quística 1: 2.500 Deficiencia de Biotinidasa 1: 45.000 Resulta un tema de continua discusión por parte de los especialistas, si se justifica desde el punto de vista médico, social y económico, la implementación de un Programa de Detección Neonatal en aquellos errores congénitos del metabolismo donde no existe un tratamiento efectivo. Sin embargo, en estos casos, la utilización de los mismos tiene implicancias relacionadas con el cuidado general de los pacientes, consideraciones pronósticos y consejo genético. Existen Errores Congénitos del Metabolismo tales como las Hemoglobinopatías y Talasemias donde sólo se recomienda el screening neonatal masivo de acuerdo a los grupos étnicos que constituyen la población y otros como las Hiperlipidemias y Distrofia Muscular Duchenne donde sólo está indicado el screening selectivo. Uno de cada 3000 recién nacidos llega a la vida con hipotiroidismo, uno de cada 10.000 bebes nace con fenilcetonuria y uno cada 2.500 con fibrosis quística. Se trata, en el caso de las dos primeras, de enfermedades congénitas que, si no son detectadas y tratadas a tiempo, pueden generar severos daños cerebrales y provocar discapacidad mental. Ambas enfermedades pueden diagnosticarse mediante el análisis de una gota de sangre del talón del recién nacido y ser tratadas con dietas o una medicación permanente que harán que esas personas lleven una vida completamente normal. La fibrosis quística es una enfermedad que se determina en laboratorio mediante la prueba del sudor, cuya correcta realización requiere de la toma de ciertas precauciones. Desde 1986 la pesquisa neonatal de la fenilcetonuria es obligatoria en nuestro país por la ley 23.413, por su parte la ley 23.874 incorporó la investigación del hipotiroidismo congénito y en enero de 1995 al sancionarse la ley 24.438 se incorporó la Pesquisa de Fibrosis Quística al recién nacido. El Poder Ejecutivo reglamentó las dos primeras normas a través del Decreto 1316/94 y dispuso que la toma de muestra para la detección precoz de Fenilcetonuria e Hipotiroidismo congénito en los niños recién nacidos deberá realizarse en un plazo no mayor de los siete (7) días de producido el nacimiento y que no sea anterior a las veinticuatro (24) horas de iniciarse la alimentación láctea. La referida norma reglamentaria también fijó que los jefes de servicio, los médicos obstetras, los médicos neonatólogos y las parteras y profesionales especializados encargados de atender al recién nacido serán los responsables de la realización de las pruebas de rastreo y, además, que las referidas pruebas deberán considerarse como pruebas de rutina tanto por parte de los establecimientos privados o estatales como por Área de Química Biológica 105
obras sociales o seguros médicos. Sin embargo, no es obligación del Estado la cobertura integral del tratamiento médico y nutricional que finalmente impedirá las deficiencias mentales e incapacidades en el niño. Por lo tanto, en rigor, la Argentina no cuenta con un programa integral de pesquisa, ya que solamente diagnostica las enfermedades mencionadas. De este modo, el test de detección del hipotiroidismo y de la fenilcetonuria y el test del sudor para la fibrosis quística apenas tienen un valor estadístico. Según la Academia Americana de Pediatría, un programa de pesquisa neonatal no es un mero análisis bioquímico, sino un programa integrado por varios componentes para la sistemática detección y tratamiento de todos los pacientes afectados. Este programa debería comprender la educación de los padres y pediatras sobre la pesquisa; la pronta ubicación y el seguimiento del individuo con las citadas enfermedades; la educación, el consejo genético y el apoyo psicológico de las familias con niños afectados; el manejo y el tratamiento adecuado de los pacientes y la evaluación sistemática de la evolución. El hipotiroidismo congénito es una enfermedad hereditaria que se produce por el desarrollo anormal o por la ausencia de la glándula tiroides del bebe. Esta glándula es la encargada de producir una hormona, cuya falta en las primeras semanas de vida genera la aparición de retardo mental. Pero si se repone desde temprano la hormona tiroides faltante, el niño crecerá normalmente. La fenilcetonuria es una enfermedad debida a la incapacidad del organismo para metabolizar un aminoácido: fenilalanina, que se encuentra en las proteínas de los alimentos. Al no ser metabolizada, el exceso de fenilalanina se acumula en los tejidos, especialmente en el sistema nervioso del bebe, provocando graves lesiones neurológicas. La detección precoz hace posible su corrección mediante la administración de por vida de una dieta adecuada, evitando así un daño irreversible. El tratamiento se basa en el reemplazo de la leche del recién nacido por otros alimentos que no contengan fenilalanina. La galactosemia, la hiperplasia suprarrenal congénita y la deficiencia de biotinidasa son también enfermedades hereditarias que han sido incorporadas a la pesquisa neonatal obligatoria que debe hacerse en nuestro país. La prevención de cualquiera de estas enfermedades será siempre más económica que los costos derivados de su falta de atención. Por tal motivo es importante generar conciencia en la sociedad y en las autoridades sobre la importancia de que se cree un programa integral que contemple no sólo la identificación de estas enfermedades en todo recién nacido, sino también la ayuda necesaria al grupo familiar del niño afectado para hacer frente a un tratamiento que, en muchos casos, no puede ser afrontado por los padres. De esta manera, actualmente hay la ley 26.279 establece seis enfermedades congénitas que son diagnosticadas obligatoriamente por pesquisa neonatal: 1) Fenilcetonuria. 2) Hipotiroidismo congénito. 3) Fibrosis Quística. 4) Galactosemia. 5) Hiperplasia suprarrenal congénita. 6) Deficiencia de Biotinidasa. Determinación de Fenilalanina para Pesquisa Neonatal de Fenilcetonuria La fenilalanina (phe), Figura 1, es un aminoácido esencial en tejidos de mamíferos. Fisiológicamente, el camino más importante de metabolización es a través de la hidroxilación a tirosina. Esta es una reacción irreversible que requiere de oxígeno Área de Química Biológica 106
molecular, NADH y de Tetrahidrobiopterina (BH4), estando limitada a hígado, riñón y páncreas. Figura 1. Estructura de fenilalanina. La fenilcetonuria (PKU) es una enfermedad genética, que se transmite de modo autosómico recesivo. Hay dos tipos principales de PKU: Fenilcetonuria clásica: se produce por deficiencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa. Es la más frecuente. Fenilcetonuria no clásica: en ella hay deficiencia del cofactor BH4. Puede producirse por deficiencia de síntesis de BH2, o por deficiencia de la enzima regeneradora de BH4, la dihidrobiopterina reductasa. Existen rutas alternativas para el metabolismo de fenilalanina. La más conocida es la transaminación con α-cetoglutarato, produciendo ácido fenilpirúvico y otros compuestos (ácido fenilláctico, ácido fenilacético y fenilcetilglutamina). Estos productos se acumulan en sangre y aparecen en la transpiración y la orina. La presencia de fenilcetonas en orina originó la denominación de fenilcetonuria. El ácido fenilacético es el responsable del olor característico a ratón que se percibe en la orina y la transpiración de estos pacientes. En realidad no se producen metabolitos anormales, sino metabolitos normales en cantidades anormales (elevadas). Cuadro clínico: En esta enfermedad, el cerebro es el órgano críticamente afectado. Las causas sugeridas para la disfunción cerebral son: Defectuosa mielinización. Deterioro en la síntesis de neurotransmisores, con una disminución de la concentración de catecolaminas. Otros síntomas son: Escasa pigmentación de pelos, piel, y ojos, por depresión de la síntesis de melanina. La orina y piel de los pacientes tiene un característico olor a ratón. Los pacientes no tratados mueren en forma precoz. Área de Química Biológica 107
Diagnóstico: El diagnóstico bioquímico de la enfermedad se basa principalmente en la detección del aumento de la concentración de fenilalanina en sangre y otros fluidos corporales, como también de compuestos provenientes de su metabolización. Tratamiento: El tratamiento temprano previene el desorden cerebral irreversible, y consiste en la ingesta de una dieta pobre en fenilalanina, con cierta cantidad extra de tirosina y otros nutrientes. Esto mantiene los niveles de fenilalanina en plasma dentro de valores no tóxicos. Es importante que el tratamiento dietario comience dentro del primer mes de vida y que continúe durante la niñez y hasta la adolescencia. DETERMINACIÓN DE FENILALANINA EN MUESTRAS DE SANGRE DE NEONATOS Se realizará la determinación cuantitativa de fenilalanina en manchas de sangre neonatal, como una pesquisa o screening de neonatos para detectar niveles elevados de fenilalanina. Se utilizará el kit ImmuChem Phenyalanine Microwell Enzyme Assay (PHE-MW EA). Las gotas de sangre obtenidas por punción del talón del recién nacido, son recogidas en un papel de filtro Schleicher and Schuell (S&S) N 903. Se recomienda que se recoja en un círculo de un diámetro de 16 mm. Principio del Test: El kit de FENILALANINANILALANINE NEONATAL mw ha sido desarrollado para screening de neonatos con elevados niveles de fenilalanina. El ImmuChem PHE- MW EA es un ensayo enzimático el cual consiste en una extracción ácida de la fenilalanina, contenida en una mancha de sangre de 5 mm. Una única mancha es extraída en el fondo de una placa con membrana semiporosa especial. Luego de la extracción, los 96 extractos son transferidos a una micro-placa convencional, por medio de una bomba de vacío. Luego se añade un buffer neutralizador (Buffer de carbonato de sodio), seguido de la adición de reactivo que contiene la enzima. Esto rápidamente oxida la fenilalanina a fenilpiruvato, reduce NAD+ a NADH. El NADH reduce un producto incoloro a un producto final coloreado que tiene una absorción máxima a 570 nm (figura 2). La absorbancia leída es directamente proporcional a la cantidad de fenilalanina en la muestra. Componentes del kit y almacenamiento: 1. Placas de reacción. Conservar a temperatura ambiente o entre 2 y 8 ºC. 2. Tarjeta conteniendo 5 niveles de Estándares de FENILALANINA/GAL en manchas de sangre entera (mg/dl). Conservar a 20 ºC. 3. Tarjeta conteniendo 3 niveles de controles de FENILALANINA/GAL en manchas de sangre. Conservar a 20 ºC. 4. Solución de extracción Ácido tricloroacético (TCA). Almacenar entre 2 y 8 ºC. 5. Solución de neutralización. Conservar entre 2 y 8 ºC. 6. Reactivos A y B. Almacenar a 20 ºC. Área de Química Biológica 108
Química Biológica Patológica 2015 Licenciatura en Bioquímica Figura 2. Esquema de la reacción producida durante el ensayo de determinación de fenilalanina en manchas de sangre Toma de muestra: Se sugiere trabajar con una muestra de una mancha de sangre recogida sobre un papel de filtro Schleicher y Schuell #903, obtenida por adhesión al talón. a) Asegúrese que la información requerida en la tarjeta de muestra ha sido completada, incluyendo el nombre del infante, fecha y hora de recolección. También indique pre, o post-término, el peso del neonato y el estado de la alimentación, y si el infante es o no gemelo. b) Recoja la sangre del talón del infante, usualmente entre las 24-72 hs post-parto. El tiempo óptimo de toma de muestra es de tres a cinco días post-parto. c) Lave el talón con agua y jabón, limpie con una gasa embebida en alcohol y permita secar al aire. d) Pinche el talón del infante con una lanceta estéril y limpie eliminando la primera gota de sangre. Permita la formación de otra gota de sangre de un volumen adecuado y deje caer la misma en la porción central del círculo preimpreso en la tarjeta de papel de filtro. Evite presionar el talón, pues esto puede causar hemólisis, y también diluir la muestra con fluido tisular. e) Ubique la tarjeta de papel de filtro horizontalmente sobre una superficie limpia y permita secar al aire, como mínimo durante 3 horas. f) La muestra debe conservarse entre 2 y 8 ºC en un ambiente desprovisto de humedad, protegido de la luz directa. En caso de conservaciones por largo tiempo, realizarlas a 20 ºC, en ambiente desprovisto de humedad. Área de Química Biológica 109
Protocolo de ensayo: 1- Para los estándares, controles y muestras: Corte con sacabocados una mancha de sangre. En el caso de las muestras, elegir aquellas manchas que hayan impregnado la tarjeta también hasta la parte posterior. Pueden realizarse algunos estándares y controles por duplicado, como prueba de reproducibilidad. 2- Añada 100 µl de solución de extracción de fenilalanina (TCA) a cada pocillo. 3- Coloque la placa en un agitador durante 60 minutos. 4- Tome 90 µl de cada extracto y transfieralo al pocillo correspondiente de una nueva placa. 5- Añada 50 µl de solución de neutralización a cada pocillo y agite suavemente durante 10 segundos. 6- Coloque 100 µl de reactivo A-B (previamente combinados, en partes iguales), a cada pocillo y agite la placa suavemente durante 10 segundos. 7- Incube 45 minutos a temperatura ambiente. 8- Lea en espectrofotómetro a 550 570 nm. El producto final es estable durante 10 minutos, por lo que la lectura deberá efectuarse dentro de este lapso de tiempo. 9- Cálculo de resultados: Realice una gráfica de absorbancia vs. concentración, con los valores obtenidos de los estándares, para así extrapolar los datos de las muestras. Lea las muestras de los pacientes directamente de la curva como mg/dl de fenilalanina en sangre entera. Valores de referencia: Neonatos (24-48 hs): 0.6 3.6 mg/dl de fenilalanina en sangre entera. Cut off: Valores inferiores a 2.8 mg/dl se consideran como valor negativo. Aquellas concentraciones comprendidas entre 2.8 y 3.6 mg/dl son valores dudosos que deberán ser confirmados en suero. Factores que afectan los valores normales: a) Recién nacidos: en pacientes afectados por PKU, las concentraciones de fenilalanina comienzan a aumentar progresivamente en las primeras 6-12 horas después del nacimiento. Para identificar claramente los niveles elevados de fenilalanina es recomendable que el muestreo se efectúe después de las 24 horas del nacimiento. b) Período de validez de la muestra: las muestras de manchas de sangre son estables por más de 6 meses bajo condiciones apropiadas de conservación. Una vez recogida la muestra debe ser secada completamente. c) Dieta del recién nacido: Una dieta conteniendo proteína, tal como leche de pecho o leche sintética, es requerida para la acumulación de fenilalanina y subsecuente identificación de PKU en neonatos. Limitaciones del procedimiento: Variaciones demográficas, peso del neonato, edad, prematurez y gemelos, puede afectar las concentraciones de fenilalanina. El laboratorio deberá estar enterado de todos estos factores. Los principales factores interferentes en la determinación son la tetraciclina y el ácido ascórbico, los cuales producen un aumento de la lectura. Hay factores que modifican el valor de fenilalanina, como ser: hematocrito, humedad del papel. Por ello se sugiere la recolección uniforme de las muestras Área de Química Biológica 110
DETERMINACIÓN DE GALACTOSA EN MUESTRAS DE SANGRE DE NEONATOS Se realizará la determinación cuantitativa de galactosa total (galactosa y galactosa- 1-P) en manchas de sangre neonatal, como una pesquisa o screening de neonatos para detectar niveles elevados de galactosa. Se utilizará el kit ImmuChem Galactose Microwell Enzyme Assay (GAL-MW EA). Las gotas de sangre obtenidas por punción del talón del recién nacido, son recogidas en un papel de filtro Schleicher and Schuell (S&S) N 903. Se recomienda que se recoja en un círculo de un diámetro de 16 mm. Principio del test La determinación consiste en un ensayo enzimático rápido para la cuantificación de galactosa total en manchas de sangre entera, recogidas sobre papel de filtro. Primeramente, galactosa y galactosa-1-p son extraídas en medio ácido, y el extracto es neutralizado. Posteriormente, la galactosa es oxidada, causando la reducción del NAD +, a NADH. A su vez, el NADH causa la reducción de un compuesto incoloro, dando lugar a un producto coloreado que absorbe a 570 nm. La absorbancia leida es directamente proporcional a la cantidad de galactosa presente en la mancha de sangre entera, (fig. 3). Figura 3. Esquema de la reacción producida durante el ensayo de determinación de galactosa en manchas de sangre. AP: Fosfatasa alcalina; GDH: Galactosa deshidrogenasa. Componentes del kit y almacenamiento: 1. Placas de reacción. Conservar a temperatura ambiente o entre 2 y 8 ºC. 2. Tarjeta conteniendo 5 niveles de Estándares de PHE/GAL en manchas de sangre entera (mg/dl). Conservar a 20 ºC. 3. Tarjeta conteniendo 3 niveles de controles de PHEGAL en manchas de sangre. Conservar a 20 ºC. 4. Solución de extracción Ácido tricloroacético (TCA). Almacenar entre 2 y 8 ºC. Área de Química Biológica 111
5. Solución de neutralización de Galactosa. Conservar entre 2 y 8 ºC. 6. Reactivos A y B para determinación de galactosa. Almacenar a 20 ºC. Toma de muestra: La toma de muestra se realiza de la misma manera que para la determinación de Phe. Protocolo de ensayo: 1- Para los estándares, controles y muestras: Corte con sacabocados una mancha de sangre. En el caso de las muestras, elegir aquellas manchas que hayan impregnado la tarjeta también hasta la parte posterior. Procesar por duplicado, como prueba de reproducibilidad. Colocar en los pocillos y dejar dos vacíos para procesar los blancos. 2- Añada 120 µl de solución de extracción de galactosa (TCA) a cada pocillo. 3- Coloque la placa en un agitador durante 60 minutos. 4- Tome 90 µl de cada extracto y transfieralo al pocillo correspondiente de una nueva placa. 5- Añada 50 µl de solución de neutralización a cada pocillo y agite suavemente durante 10 segundos. 6- Incube 30 minutos a temperatura ambiente. 7- Coloque 100 µl de reactivo A-B (previamente combinados, en partes iguales), a cada pocillo y agite la placa suavemente durante 10 segundos. 8- Incube 30 minutos a temperatura ambiente. 9- Lea en espectrofotómetro a 550 570 nm. El producto final es estable durante 10 minutos, por lo que la lectura deberá efectuarse dentro de este lapso de tiempo. 9- Cálculo de resultados: Realice una gráfica de absorbancia vs. concentración, con los valores obtenidos de los estándares, para así extrapolar los datos de las muestras. Lea las muestras de los pacientes directamente de la curva como mg/dl de galactosa en sangre entera. Valores de referencia: Neonatos (24-48 hs): hasta 5 mg/dl de galactosa en sangre entera. Factores que afectan los valores normales: a) Edad del recién nacido: en pacientes afectados por galactosemia, las concentraciones de galactosa aumentan en las horas posteriores al nacimiento. Para diferenciar claramente los individuos afectados de los que no lo están, se recomienda que el muestreo se efectúe 24-48 hs después del nacimiento. b) Dieta del recién nacido: para facilitar la identificación de galactosemia en recién nacidos, se requiere administrar una dieta conteniendo lactosa. Limitaciones del procedimiento: Muestras de neonatos que reciben tetraciclina pueden dar ligeramente elevadas, y deben evaluarse mediante la utilización de técnicas alternativas. Hay factores que modifican el valor de galactosa, como ser: hematocrito, humedad del papel. Por ello se sugiere la recolección uniforme de las muestras. Los valores extrapolados por fuera del rango de los calibradores son aproximados, y deben informarse como valores menores al menor estándar o valores mayores al mayor estándar. Área de Química Biológica 112
Química Biológica Patológica 2015 Licenciatura en Bioquímica ANEXO 1-Tabla de Correlatividades del Curso de Química Biológica Patológica: Área de Química Biológica 113