CO-RECEPTORES, CITOCINAS Y QUIMIOCINAS EN LA INFECCIÓN POR EL VIH

Transcripción

1 CO-RECEPTORES, CITOCINAS Y QUIMIOCINAS EN LA INFECCIÓN POR EL VIH Silvio Arango-Jaramillo D.V.M., M. Sc., Ph.D. Departamento de Microbiología Molecular e Inmunología. Universidad de Johns Hopkins. Baltimore, MD., USA. El objetivo de esta presentación está centrado en establecer un puente entre los sectores básico, clínico, epidemiológico, de salud pública, social, humanístico y, en fin, integral, que permita conceptualizar algunos de los más recientes avances en la lucha contra el VIH. Así mismo, compartir mis experiencias investigativas y académicas en este campo en la Universidad de Johns Hopkins durante los últimos tres años, de una manera sencilla y clara para todos los sectores y aun para aquellas personas que apenas se inician en el trabajo relacionado con el Sida. Una de las principales razones para profundizar en estos temas, sin confundir o aburrir a los participantes, está dada por la necesidad de enfrentar esta problemática con las armas que nos proporciona el método científico y por consiguiente con un enfoque no empírico. Cada uno de estos avances en investigación tiende a abrir las puertas para desarrollos y aplicaciones prácticas, en las diversas áreas, en el proceso de la búsqueda de soluciones lógicas. Por esto debe uno estar familiarizado con dichos progresos, incluyendo la terminología especializada que se va construyendo a su alrededor. Conociendo de manera integral y racionalmente profunda estos aspectos tratados acá, estaremos en mejor capacidad de producir nuestras propias ideas e hipótesis de solución de problemas y en circunstancias ideales para intercambiar conocimientos, opiniones y resultados con otros grupos, a cualquier nivel. Así optimizaremos nuestras opciones de éxito en nuestro campo específico. El casos concreto del ingreso del VIH a la célula no parece ser tan simple como alguien desprevenido pudiera imaginar. Basándonos en los experimentos más recientes podemos determinar, según la metodología disponible hoy, cómo el proceso de infección resulta de una compleja interacción entre moléculas de la superficie de la envoltura viral y receptores y coreceptores en la superficie celular. Casi cada caso de infección puede estar influenciado por factores y circunstancias diferentes, por tanto, no podemos generalizar y extrapolar, de buenas a primeras, cualquiera de las informaciones que recibamos provenientes de experimentos y ensayos logrados por cualquiera de los grupos de investigación. Puede haber variaciones enormes en las cepas virales, produciendo comportamientos radicalmente diferentes en cuanto al proceso de infección y así mismo habrá diferencias genéticas y no genéticas en la superficie celular, las cuales podrán ser determinantes para que el virus ingrese o no y aun que su ingreso permita o no su replicación y expansión en el organismo. Por consiguiente, uno de los mensajes primordiales de esta presentación va orientado en el sentido de actuar con gran cautela y no emitir un juicio definitivo cuando se está frente a un

2 caso, paciente o grupo poblacional con alto riesgo de contraer el virus, o ya infectado o clínicamente definido como enfermo, sin antes disponer de una serie de informaciones muy detalladas sobre las circunstancias que rodean la situación. Las generalizaciones al respecto son muy riesgosas y los distintos patrones para cada caso pueden conducir a enfoques diferentes de solución. Los dos grandes avances, en cuanto al VIH y al Sida, logrados el año anterior fueron los sorprendentes resultados terapéuticos obtenidos cuando se utilizaron inhibidores de la proteasa en combinación con los agentes bloqueadores de la transcriptasa reversa, y en segundo lugar, los importantes hallazgos referentes a quimiocinas y co-receptores, que presentaron un nuevo panorama de mecanismos moleculares de interacción entre el virus y la membrana celular durante el primer paso del ciclo de la infección viral. A continuación nos concentraremos en el análisis de este segundo punto, con algún detalle, con la idea de clarificar al máximo la información más reciente sobre este tema. Hasta mediados de 1996 no había claridad sobre los posibles co-receptores, o co-factores, necesarios para permitir la fusión entre la envoltura del virus y la membrana celular durante el primer paso del proceso de infección de los linfocitos CD4. Aunque se conocía que el VIH-1 requería de la expresión de la glicoproteína CD4 en la superficie de la membrana celular, a la cual se unía la glicoproteína 120 (gp120) de la envoltura viral, varios estudios sugerían que esto no era suficiente. Trabajos de los grupos de Maddon P.J. et al. en la Universidad de Columbia, el Instituto de Investigación de Cáncer, de Londres, y el CDC, más los de Page K.A., Landau N.R. y Littman D.R., entonces en la Universidad de California, en San Francisco, mostraban que aunque células humanas que expresaban un gen CD4 transfectado eran permisivas para la entrada del virus, las células de ratón que expresaban el gen CD4 humano no lo eran. Esto hacía suponer que uno o más co-receptores o co-factores específicos de especie eran requeridos, además del CD4, para la infección celular por el VIH-1. Un artículo que causó gran agitación fue el presentado en Science, Vol. 262, del 24 de diciembre de 1993, por un grupo del Instituto Pasteur, de París, en donde se describía un cofactor o co-receptor para el ingreso del VIH a las células CD4+. Se trataba de una peptidasa, conocida como CD26, pero los hallazgos no pudieron ser replicados extensamente en otros laboratorios y poco a poco se extinguió la prueba de esa hipótesis sobre la existencia de coreceptores. Estudios posteriores demostraron que cepas virales adaptadas para crecer en líneas celulares T transformadas (cepas T trópicas) podían infectar células primarias T, pero no monocitos primarios o macrófagos. En contraste, muchas cepas virales primarias infectaban monocitos, macrófagos y células primarias T, pero no líneas celulares T transformadas. Esta diferencia en tropismo era además una consecuencia de diferencias específicas de secuencia en la subunidad gp120 de la envoltura proteica viral Env, sugiriendo múltiples co-receptores o cofactores tipo específico de célula, los cuales podrían requerirse para el ingreso del virus, además de la glicoproteína CD4. Investigaciones previamente realizadas por el grupo de Levy J.A. et al., en la Universidad de California, San Francisco, con la demostración de un factor de tipo no citotóxico de resistencia al virus, presente en algunos sobrenadantes de cultivos de células CD8+ e identificado como factores antivirales celulares CD8+ (CAFs), han venido mostrando el intrincado panorama que rodea este primer paso del proceso de infección de las células por el

3 VIH. Así mismo, invita a considerar la posibilidad que varios mediadores de la respuesta inmune celular pudieran estar comprometidos en el proceso como competidores del virus por los co-receptores o co-factores para la infección. Sin embargo, la producción de CAF es alta en asintomáticos y decrece con el progreso hacia el Sida, mientras que algunas citocinas o quimiocinas no muestran tal cinética cuando se comparan los sobrevivientes de largo término y aquellos pacientes en donde el progreso hacia el Sida es vertiginoso. Hay que tener en cuenta que el mismo grupo ha observado también que las células CD8+ derivadas de algunos voluntarios seronegativos tienen actividad supresora del virus, pero sólo en la llamada prueba endógena, principalmente con cepas no inductoras de sincicio (NSI) y no en la prueba de infección aguda con cepas inductoras de sincicio (SI). De forma somera recordemos algunos conceptos relacionados con la naturaleza de las citocinas y quimiocinas. Las citocinas, o clásicos mediadores solubles de la respuesta inmunitaria de tipo no anticuerpo o de base celular, desempeñan también otras funciones no directamente relacionadas con la maquinaria inmunológica. A ellas pertenecen las linfocinas y las monocinas, designadas así para determinar el tipo de célula productora. Ejemplos clásicos de citocinas son los interferones, las interleucinas, el factor de necrosis tumoral, etc. Con respecto a las quimiocinas, éstas son citocinas quimiotácticas, liberadas por una gran variedad de células para atraer macrófagos, células T, eosinófilos, basófilos y neutrófilos a los sitios de inflamación. Hay dos clases de quimiocinas: las alfa o CXC y las beta o CC, dependiendo de si las dos primeras cisteínas están separadas por un aminoácido o si se encuentran adyacentes, respectivamente. Ejemplos de alfa o CXC quimiocinas son la interleucina 8 o IL-8, la proteína 2 activadora de neutrófilos NAP-2, la proteína que activa el crecimiento estimulatorio del melanoma o MGSA, etc. Las quimiocinas de este tipo actúan primariamente sobre neutrófilos. Las quimiocinas beta o CC son, entre otras: RANTES (Regulation upon Activation Normal T Expressed and Secreted), MIP-1 alfa y MIP-1 beta (Migration Inhibitory Protein), el MCP-1, 2 and 3 (Monocyte Chemotactic Protein), la eotaxina, etc. Las beta quimiocinas actúan principalmente sobre macrófagos, eosinófilos y basófilos. Las quimiocinas tienen receptores específicos en la superficie celular, la mayoría de los cuales pertenecen a la familia de las proteínas de siete dominios transmembranales, asociadas a proteína G. Esa proteína G es un compuesto trimérico que reside en la membrana celular y la cual se une a nucleótidos de guanina. Cuando se unen a sus receptores, las quimiocinas transducen una señal hacia el interior de la célula. Dicha señal produce, entre otras cosas, el incremento de la concentración de calcio intracelular y el desencadenamiento de reacciones biológicas que, por ejemplo, pueden permitir la fusión de la membrana celular con la envoltura del VIH y el posterior ingreso del virus a la célula. Algo bien interesante y coincidencial, tal vez, es que dichos receptores para las quimiocinas son considerados ahora como los co-receptores o cofactores para la interacción de la gp120 con el CD4 en el primer paso del ciclo de la infección celular por el virus. O sea que las quimiocinas entrarían a competir con el virus por dichos co-receptores o receptores. Una publicación que estimuló intensos estudios al respecto de los co-receptores, citocinas y quimiocinas fue la presentada en Science, Vol. 270, 1811 de 1995, por Fiorenza Cocchi et al. en el grupo de Paolo Lusso y Robert Gallo, del nuevo Instituto de Virología Humana de la Universidad de Maryland, en Baltimore, y el Instituto Científico San Rafael, en Milán. Esta

4 investigación presentó a las beta o C-C quimiocinas: RANTES (Regulation upon Activation Normal T Expressed and Secreted), MIP-1 alfa y MIP-1 beta (Migration Inhibitory Protein), como los componentes más importantes de la actividad soluble anti VIH, presente y liberada tanto por células CD8+ primarias como inmortalizadas. Esta acción inhibitoria antiviral por parte de estas quimiocinas se aplica al caso de las cepas trópicas para macrófagos o cepas primarias, pero no para aquellas trópicas para células T. Aún hay gran controversia sobre si el o los factores de resistencia encontrados por el grupo de Levy J.A. et al. están compuestos por quimiocinas o son parcial o totalmente diferentes. A renglón seguido apareció la publicación de Paxton W.A. et al. y el grupo de Koup R.A., del Centro de Investigación en Sida de la Fundación Aaron Diamond, entonces en New York University y ahora en Rockefeller University. Juntamente con el Instituto Nacional de Cáncer de USA, la Universidad de Columbia, la Universidad de California, San Francisco, el Centro Hospital San Lucas-Roosevelt, de Nueva York, y la Universidad de Northwestern, en Chicago, propusieron que linfocitos CD4+ de personas de un grupo de alto riesgo para infección por VIH eran relativamente resistentes al reto o descarga viral in vitro y que dicha resistencia derivaba de altos niveles de producción de beta quimiocinas. La naturaleza de los co-receptores requeridos para la entrada del VIH a la célula sólo comenzó a establecerse luego del trabajo pionero publicado al mes siguiente en Science, Vol. 272 del 10 de mayo de 1996, por Feng Y. et al., del grupo de Berger E.A. en el NIH, quienes identificaron el primer co-factor para el ingreso del VIH a las células CD4+ y lo denominaron fusina, un receptor para quimiocinas de tipo alfa o CXC, previamente conocido como LESTR (Leukocyte-Expressed Seven Transmembrane-domain Receptor), hoy bautizado CXCR4. Por consiguiente este co-factor parece ser sólo para cepas TCLA (T-Cell Line Adapted) o adaptadas a células T o cepas S.I. (inductoras de sincicio). El gen para fusina está localizado en el cromosoma dos. En junio de 1996, cinco grupos (Paxton W.A., Koup R.A., Landau N.R. y Littman D.R. en la Fundación Aaron Diamond de la Universidad Rockefeller y del Instituto Skirball del Howard Hughes Medical Institute de la Univesidad de Nueva York, Sutton R. et al. en la Universidad de Stanford, en California, Peiper S.C. y Scalal T.J. de la Universidad de Louiville, en Kentucky, el DNAX Institute, en Palo Alto, California, Progenics Pharmaceuthical Inc., de Nueva York, Sodrosky J. et al., en el Dana-Farber Cancer Institute, el Departamento de Biología del Cáncer de la Universidad de Harvard, y el Beth Israel Hospital, Doms, R.W. en la Universidad de Pennsylvania, Samson M. en la Universidad Libre de Bruselas, Bélgica, y Berger E.A. et al. en el NIH en Bethesda, Maryland) identifican casi simultáneamente otro coreceptor para la entrada del VIH. Esta vez se trata de un receptor para beta quimiocinas o CC quimiocinas, el denominado CCR5, que sólo parece actuar en los casos de infección por cepas con tropismo para macrófagos o cepas NSI (no inductoras de sincicio). Hoy ya se conoce de la existencia de cepas con tropismo dual, o sea que pueden infectar tanto células T como macrófagos, utilizando ambos co-receptores. Los grupos de Springer T.A. et al., en el Instituto de Cáncer Dana-Farber, y el de Sodroski J. et al., del Instituto de Biología del Cáncer en la Universidad de Harvard, simultáneamente, con los grupos de Moser B., de la Universidad de Berna, en Suiza, y el de Arenzana- Seisdedos F. et al., en el Instituto Pasteur, de París, y el de Clark-Lewis I. et al., en la Universidad de British Columbia, en Vancuver, Canadá, publicaron simultáneamente el

5 hallazgo de un ligante para el receptor CXCR4 o fusina o LESTR, uno de los co-receptores para cepas VIH trópicas de linfocitos. Se trata de la alfa quimiocina o CXC quimiocina SDF-1 (stromal cell-derived factor 1). En agosto de 1996 el grupo de Landau N.R., Koup R.A. y Paxton W.A. et al., en la Fundación Aaron Diamond de la Universidad Rockefeller, junto con Berlex Biosciences, en California, la Unidad de Neurogenética Molecular del Massachusetts General Hospital, en Charleston, y la Escuela de Medicina del Monte Sinaí, en Nueva York, describen casos de resistencia in vitro a la infección por virus primario trópico para macrófagos, como debidos a mutaciones homocigóticas en el co-receptor CCR-5. El alelo defectuoso contiene una deleción interna de 32 pares de bases. La proteína codificada está severamente truncada y no puede ser localizada en la superficie celular, fallando así la interacción gp120 y CD4. Personas heterocigotas para esta característica se describen con relativa frecuencia. El grupo de Parmentier M. et al., en la Universidad Libre de Bruselas, la Facultad de Medicina Veterinaria, de Lieja, el Laboratorio de Referencia de Sida, de Bélgica, los hospitales Cochin y Debre, de París, la Universidad Nagoya, de Japón, y la Universidad de Pennsylvania, en Philadelphia, publicaron resultados similares y confirmativos de la mutación en el alelo CCR- 5 y la frecuencia de ésta en diferentes poblaciones. Los hallazgos indican entre un 15 a 20% de heterocigotos en población caucásica con un 1% de homocigotos. La mutación no fue encontrada en algunos grupos de japoneses y otros tantos de algunas regiones de Africa. Recientemente los grupos de Hoxie J.A. y Doms R.W. et al., de la Universidad de Pennsylvania, y los de Landau N.R. et al., en la Fundación Aaron Diamond, en la Universidad Rockefeller, al igual que investigadores del Instituto de Cáncer de Londres, en los laboratorios Chester Beatty, el University College, de Londres, y de la Compañía Glaxo-Wellcome, en Ginebra, Suiza, publicaron un trabajo en el cual implican a CXCR4 o Fusina como el coreceptor para VIH-2. En nuestros grupos de la Universidad de Johns Hopkins, en Baltimore (Schwartz D.H. et al., Clements-Mann M.L. et al., Siliciano R. et al.), hemos venido trabajando tanto con citocinas como con quimiocinas. Uno de nuestros proyectos se basa en las teorías de Clerici M. y Shearer G.M. En ellas se describen dos perfiles de citocinas: el Th1, o celular, y el Th2, o humoral. Los pacientes VIH positivos, durante su progreso hacia el sida, presentan un perfil dominante Th2. Este perfil puede facilitar la replicación viral y suprimir la respuesta celular del sistema inmune. De allí surgió la inquietud en el sentido que las vacunas VIH inclinaran el perfil de Th1 a Th2 en pacientes seropositivos. Otro temor ha residido en la posibilidad que en los vacunados no infectados la vacuna facilite el desarrollo del perfil Th2. Por tanto, se diseñó un estudio para resolver tales inquietudes. Para ello analizamos sobrenadantes de cultivos de células sanguíneas mononucleares periféricas, obtenidas de voluntarios vacunados y no vacunados y sometidos a estimulación con anticuerpos monoclonales anti-cd3 o con diversos antígenos típicos productores de linfoproliferación, así como también con diferentes antígenos tipo env del VIH. En resumen, no encontramos una desviación del perfil de citocinas de Th1 a Th2 ocasionado por la vacunación experimental. Es decir, los resultados sugieren que las vacunas analizadas no presentaban tal peligro. La citocina marcadora para perfil Th1 utilizada fue el interferón gama y para el Th2 fueron la interleukina 4 y la 10. En cuanto a quimiocinas, hemos estudiado la producción in vitro de RANTES, MIP-1 alfa y MIP-1 beta; buscamos correlacionar ésta con el fenotipo de resistencia al propio virus

6 endógeno o al de la descarga in vitro o virus exógeno, encontrando que solamente los niveles de RANTES fueron significativamente más altos en sobrenadantes de cultivos resistentes. Sin embargo, dichos cultivos no se tornaron susceptibles a la infección cuando se bloquearon las beta quimiocinas con anticuerpos monoclonales neutralizantes. Por otra parte, la adición de las mismas beta quimiocinas no produjo supresión del virus endógeno o exógeno en estas células de pacientes VIH positivos. La extracción de los linfocitos T CD8 positivos no produjo reducción en la producción de beta quimiocinas, pero redujo marcadamente la frecuencia de cultivos resistentes tanto al virus endógeno como al exógeno. Entre personas recién infectadas, aproximadamente la mitad exhibieron un cambio de fenotipo, de susceptible antes de la infección a resistente después de la infección. Esto sugiere que la producción de quimiocinas genéticamente predeterminada o la expresión alélica de los co-receptores no son los componentes principales de este fenómeno de resistencia. Finalmente las células mononucleares sanguíneas periféricas sin CD8 positivas, de dos voluntarios, fueron resistentes a la descarga in vitro con el virus MN (trópico de células T) pero no con el virus BaL (trópico para macrófagos), sugiriendo la posibilidad que estas personas presenten variaciones genéticas o mutaciones en el co-receptor CXCR4 o fusina. Las implicaciones clínicas, epidemiológicas, terapéuticas, etc., de los recientes hallazgos en el área de los co-receptores, citocinas y quimiocinas pueden resumirse de la manera siguiente: la evidencia experimental sugiere que cada caso sea considerado como único y que la generalización con respecto al proceso de infección puede resultar riesgosamente imprecisa. Esto dificulta la toma de decisiones con respecto no solamente a los pacientes individuales sino a aquellas con respecto a grupos poblacionales y las de política general de prevención y control. Así mismo, influye sobre el tipo de enfoque de seguimiento clínico y terapéutico que deba aplicarse para cada caso. Son ejemplos prácticos de los recientes cambios conceptuales introducidos, la descripción de Paxton et al., de cómo varias personas permanecen sin infectarse a pesar de repetidas exposiciones a través de contacto sexual con personas VIH positivas. Esta situación se debe a mutaciones en el co-receptor CCR-5. Resultados similares estamos obteniendo en nuestro grupo, en donde analizamos la resistencia in vitro a la descarga con virus trópicos para células T y macrófagos. Nuestro propósito es identificar individuos con posibles mutaciones en el receptor CXCR4, en cooperación con los grupos de Doms R.W. y Hoxie J.A. et al., en la Universidad de Pennsylvania. Con los hallazgos de los co-receptores CXCR4 y CCR-5 y otros tantos, más sus respectivas mutaciones, podemos explicar, al menos parcialmente, los fenómenos de resistencia a la infección por VIH. Esto ha desencadenado un enorme desarrollo por parte de laboratorios y diseñadores de medicamentos en el campo de la utilización de versiones modificadas de quimiocinas, las cuales puedan bloquear dichos co-receptores y evitar el ingreso del virus a la célula. Algunos se encaminan hacia la estructuración de vacunas que incrementen el nivel de ciertas quimiocinas para que éstas compitan con el VIH por los co-receptores. Un problema adicional surge de publicaciones que muestran como mientras ciertas beta quimiocinas pueden suprimir la multiplicación viral en células T, las mismas pueden estimular la replicación del VIH de cepas primarias en macrófagos.

7 Todos estos descubrimientos ofrecen también nuevos horizontes para el estudio de la patogénesis de esta enfermedad y podrían revertir hacia el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos y de novedosas vacunas. Concluyamos diciendo que sólo el trabajo integral y cooperativo entre los diversos grupos, sectores y aun países, podrá incrementar racionalmente la probabilidad de éxito frente a este intrincado problema, considerado como uno de los retos más grandes del sector salud en las dos últimas décadas de este siglo. REFERENCIAS COCCHI F. et al. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV suppressive factors produced by CD8+T cells. Science. Vol. 270: Dec FENG Y. et al. HIV-1 entry cofactor: Functional cdna cloning of a seven-transmembrane G protein-coupledreceptor. Science. Vol. 272: May DENG H. et al. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature. Vol. 381: June DRAGIC T. et al. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor C.C.- CKR-5. Nature. Vol. 381, 20 June pp CHOE H. et al. The beta chemokine receptors CCR-3 and CCR-5 facilitate infection by primary HIV-1 isolates. CELL. Vol. 85: June 28, ALKHLATIB G. et al. CC CKR-5: A RANTES, MIP-1 alpha, MIP-1 beta receptor as a fusin cofactor for macrophage-tropic HIV-1. Science. Vol. 272: June SMITHMAYEROVA H. et al. Chemokines and HIV replication. Nature. Vol. 382: August COHEN J. Receptors mutations help slow disease progression. Science. Vol. 273: Sept WAIN-HOBSON S. One on one meets two. Nature. Vol. 384: Nov OBERLIN E. et al. The CXC chemokine SDF-1 is the ligand for LESTR/fusin and prevents infection by T-cell line-adapted HIV-1. Nature. Vol August BLEUL C.C. et al. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. Vol. 382: August ENDRES M.J. CD4-independent infection by HIV-2 is mediated by fusin/cxcr-4. Cell. Vol. 87: Nov SCHWARTZ D.H. et al. Antigen specific shifts away from Th1 cy-tokine profile following HIV-1 envelope immunization of uninfected or HIV-1 infected individuals. Submitted for publication.

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