Guía docente. Experto en Metodología en Investigación Biotecnológica (Título Propio asociado a Biotecnología)

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1 Guía docente DATOS DE IDENTIFICACIÓN Titulación: Experto en Metodología en Investigación Biotecnológica (Título Propio asociado a Biotecnología) Facultad/Escuela: Ciencias Biosanitarias Asignatura: Tecnologías de Apoyo a la Investigación Tipo: Propia Obligatoria Créditos ECTS: 4 Curso: 2 Código: Periodo docente: Cuarto semestre Tipo de enseñanza: Presencial Idioma: Castellano Total de horas de dedicación del alumno: 100 DESCRIPCIÓN DE LA ASIGNATURA Esta asignatura pretende proporcionar al alumno una visión cercana de algunas de las tecnologías de apoyo a la investigación disponibles hoy en día en los Centros de Investigación. Tecnologías como la secuenciación Sanger automática de ácidos nucleicos, las nuevas tecnologías de secuenciación masiva, la PCR en tiempo real, los microarrays, citometría de flujo, HPLC...Todas estas técnicas se realizan hoy en día en laboratorios o servicios de apoyo a la investigación dotados de la infraestructura adecuada para ofrecer al investigador plataformas modernas de alta productividad en las que desarrollar parte de sus proyectos de investigación. COMPETENCIAS. Conocer las bases teóricas y fundamentos de las siguientes técnicas: Secuenciación Sanger de ácidos nucleicos Secuenciación masiva de ácidos nucleicos Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) PCR en tiempo real Microarrays de DNA, citometría de flujo, HPLC II. Conocer las aplicaciones y utilidades de: Secuenciación Sanger de ácidos nucleicos Secuenciación masiva de ácidos nucleicos Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Página 1

2 PCR en tiempo real Microarrays de DNA, citometría de flujo, HPLC III. Aprender a realizar en el laboratorio: Una reacción de secuencia Un ensayo de Real time para análisis de expresión génica IV. Aprender a analizar e interpretar: Los resultados de una reacción de secuencia Los resultados de un ensayo de expresión génica relativa mediante real time PCR Los resultados básicos de un análisis de expresión génica con microarrays de DNA V. Aprender a manejar software para: Análisis de secuencias como Gene Jockey (alineamientos, traducción, localización de enzimas de restricción...) Diseño de sondas Taqman para expresión génica con el software Primer Express Comparación de perfiles genéticos de AFLPs con Gene Mapper VI. Profundizar mediante el estudio y la exposición pública de publicaciones científicas en las aplicaciones de las técnicas estudiadas. DISTRIBUCIÓN DE LOS TIEMPOS DE TRABAJO ACTIVIDAD PRESENCIAL ACTIVIDAD NO PRESENCIAL 40 horas 60 horas OBJETIVO Esta asignatura pretende proporcionar al alumno una visión cercana de algunas de las tecnologías de apoyo a la investigación disponibles hoy en día en los Centros de Investigación. Tecnologías como la secuenciación Sanger automática de acidos nucleicos, las nuevas tecnologías de secuenciación masiva, la PCR en tiempo real, los microarrays, la citometría de flijo o el HPLC...Todas estas técnicas se realizan hoy en día en laboratorios o servicios de apoyo a la investigación dotados de la infraestructura adecuada para ofrecer al investigador plataformas modernas de alta productividad en las que desarrollar parte de sus proyectos de investigación. La asignatura proporcionará al alumno los fundamentos teóricos básicos que subyacen a estas tecnologías y le orientará sobre las innumerables aplicaciones de las mismas. Así mismo, el alumno podrá acercarse de una forma práctica al uso de las mismas realizando una breve estancia práctica en laboratorios que llevan a cabo estas técnicas de forma rutinaria La asignatura consta de la siguientes partes: 1. CLASES EXPOSITIVAS (VER TEMARIO TEORICO) 2. CLASES PRÁCTICAS EN LOS LABORATORIOS DE LA UFV /(VER CONTENIDO DE LA PRÁCTICA) 3. VISITA GUIADA AL LABORATORIO DE GENOMICA DEL IIBM Los objetivos que se pretenden alcanzar con cada tema TEORICO que el profesor impartirá durante el curso se describen en el temario teórico de la asignatura. RESULTADOS DE APRENDIZAJE TEMA 1. La PCR y PCR en tiempo real TEMA 1.1. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Entender cuales son los fundamentos de una reacción de PCR Comprender cómo empezó a desarrollarse la técnica de PCR. Conocer a los protagonistas de esta historia Entender cuales son los elementos necesarios en toda reacción de PCR y sus características Conocer el equipamiento necesario para realizar este tipo de reacciones Conocer algunas de las innumerables aplicaciones de la técnica de PCR: transcripción reversa, clonaje de genes, marcaje de sondas, mutagénesis dirigida, PCR in situ, screening y diagnóstico de patologías, detección de patógenos, medicina forense, estudios de paternidad, identificación de especies... TEMA 1.2. La PCR en tiempo real. Otras aplicaciones de los equipos de real time: HRM Página 2

3 Entender cuales son los fundamentos de una reacción de PCR en tiempo real Comprender conceptos cómo Ct, umbral, eficiencia, referencia pasiva, señal normalizada, gen endógeno, muestra control... Conocer los distintos abordajes disponibles para los ensayos de real time: Sybr green, HRM dyes, LNA probes, Taqman probes, Molecular beacons... Conocer el equipamiento necesario para realizar este tipo de reacciones Conocer algunas de las aplicaciones de la técnica de PCR en tiempo real: cuantificación absoluta, cuantificación relativa, discriminación alélica... Entender el método de los Cts comparativos para cuantificación relativa y cuando puede utilizarse Conocer qué son las TLDAs o tarjetas microfluídicas, su utilidad y ventajas Entender el significado de la nomenclatura de las sondas Taqman Aprender cómo puedo buscar la sonda Taqman que necesito para analizar la expresión de mi gen Entender que son las MIQ Entender que es el HRM, cómo funciona, aplicaciones... TEMA 2. La secuenciación de ácidos nucleícos TEMA 2.1. Los inicios de las técnicas de secuenciación Entender qué son los oligonucleótidos Aprender cómo se lleva a cabo la síntesis de oligos en fase líquida o sobre soporte sólido Conocer algunas utilidades en Biología Molecular de los oligonucleótidos sintéticos Entender el papel de los oligos como primers para secuenciación. Relación con la polaridad del ADN. Diseño de primers para secuenciación Entender en qué consiste la secuenciación química de Maxam y Gilbert Entender en qué consiste la secuenciación enzimática de Sanger Conocer las ventajas y desventajas de cada una de ellas y su productividad Entender cómo se secuenciaba inicialmente empleando marcajes radiactivos Conocer el equipamiento disponible cuando comenzaron las técnicas de secuenciación manual TEMA 2.2. La secuenciación automática fluorescente. La pirosecuenciación. El inicio de la era de la secuenciación de genomas Entender en qué consiste la secuenciación fluorescente y cómo pudieron inicialmente automatizarse las técnicas de secuenciación Comprender cuales fueron las ventajas y desventajas inicialmente de la utilización de terminadores o primers marcados fluorescentemente Conocer cómo funcionaron inicialmente los equipos de secuenciación en gel semiautomáticos Entender las diferencias entre equipos semiautomáticos y equipos capilares automáticos Conocer cómo la mayor productividad de estas nuevas tecnologías permitió abordar proyectos de secuenciación cada vez más complejos. Profundizar en cómo funciona un equipo de secuenciación capilar Aprender qué requisitos deben cumplir las muestras que vamos a secuenciar y los oligonucleótidos que emplearemos en el proceso de secuenciación Entender qué es la pirosecuenciación y cuales son sus aplicaciones Entender la pirosecuenciación como base para algunas plataformas de secuenciación masiva Estudiar brevemente cómo varían en la naturaleza los tamaños de los genomas de los diferentes organismos y cómo es, a grandes rasgos, su organización interna Comprender cómo se inicia el abordaje de la secuenciación de genomas Conocer qué genomas fueron los primeros secuenciados, por qué y para qué. Conocer conceptos como genoma mínimo, genomas artificiales... TEMA 2.3. Otras aplicaciones de los equipos de secuenciación automática: genotipado y variación genómica; epigenética Entender cómo los equipos de secuenciación automática son en realidad analizadores genómicos útiles para muchas más aplicaciones Entender qué son los AFLPs y cual es su utilidad Entender qué son los estudios de quimerismo y cual es su utilidad Entender qué es el análisis de ISSRs y cual es su utilidad Entender qué es el análisis de microsatélites y cual es su utilidad Entender que es el análisis de RFLPs y cual es su utilidad Entender que es el genotipado de SNPs y cual es su utilidad Entender qué es el análisis de SSCP y cual es su utilidad Entender qué son los análisis de metilación de ADN y cual es su utilidad Entender qué son los análisis de MSMSA y cual es su utilidad TEMA 2.4. La nueva generación de secuenciadores automáticos (NGS). El futuro Entender el salto cuantitativo y cualitativo que supone el desarrollo de las técnicas de NGS. Página 3

4 Conocer las nuevas plataformas de secuenciación masiva disponibles en el mercado. Ventajas y desventajas de cada una de ellas Analizar la productividad actual de las técnicas de NGS Comprender el fundamento de la secuenciación en cada una de ellas Entender las diferentes aplicaciones y utilidades de las nuevas plataformas Entender cual es el futuro que se vislumbra en relación con la tecnología de secuenciación masiva TEMA 2.5. Hitos en la secuenciación del ADN Recorrer los principales hitos que se han producido en la carrera contra reloj de la secuenciación de ácidos nucleicos Hacer hincapié en cómo se ha podido avanzar de forma tan espectacular en este camino Conocer a los protagonistas más importantes de esta fascinante historia Conocer algunos de los proyectos actualmente en marcha derivados de la secuenciación de genomas como el proyecto ENCODE Entender conceptos como metagenómica, genómica funcional... Entender que es la genómica sintética, la síntesis artificial y el trasplante de genomas TEMA 2.6. Herramientas en red para la manipulación de secuencias. Bases de datos. Saber localizar en red información sobre el ADN y sus componentes, el código genético y su uso por diferentes especies, fórmulas útiles para calcular concentraciones... Saber localizar y utilizar herramientas diponibles en red para editar secuencias, traducirlas, alinearlas, localizar sitios de restricción, oligos para PCR o Real-time... Entender qué es una base de datos Conocer cuales son las bases de datos de secuenciación más útiles TEMA 3. Los microarrays de DNA TEMA 3.1. Introducción a la Tecnología de microarrays de DNA. Plataformas de microarrays de DNA. Conocer qué es un microarray de DNA y comprender la base de su funcionamiento. Conocer las técnicas precursoras de la tecnología de microarrays de DNA. Entender los conceptos de sonda y diana. Entender la importancia y las aportaciones de esta técnica a los estudios genómicos globales. Conocer las fases de un proceso de análisis con microarrays de DNA. Conocer de forma global las aplicaciones de la técnica. Conocer los tipos de sondas utilizados en la fabricación de microarrays. Conocer y diferenciar los sistemas de fabricación de microarrays custom, de oligonucleótidos de alta densidad, y bead arrays. TEMA 3.2 Los microarrays de DNA en análisis de expresión génica. Conocer y comprender los pasos de un experimento de análisis de expresión génica con microarrays. Conocer como comprobar la calidad de la muestra a analizar. Conocer los distintos tipos de marcaje de muestras: Directo e indirecto, con amplificaión lineal (de Eberwine), marcaje para procariotas o marcaje no enzimático. Conocer el proceso de hibridación, las condiciones de la misma y el equipamiento disponible. Repasar el concepto de fluorescencia y conocer las características de los fluoróforos más habituales. Conocer el proceso de escaneado de microarrays y el equipamiento necesario. Conocer los sistemas de extracción de datos numéricos, la normalización y el filtrado de datos. Aprender a identificar genes diferencialmente expresados. Conocer técnicas y softwares para el agrupamiento de datos y el análisis funcional Conocer la aplicación de la tecnología de microarrays en estudios de Genómica Funcional. Estudiar ejemplos de análisis con microarrays de respuestas transcripcionales globales. Conocer aplicaciones de la tecnología de microarrays en estudios de patologías y en desarrollo de fármacos. TEMA 3.3. Microarrays de DNA en estudios de genotipado. Entender la complejidad del análisis de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) mediante técnicas de hibridación y conocer los abordajes para solucionarlo. Conocer y comprender los ensayos enzimáticos utilizados en la detección de SNPs y su aplicación en análisis con microarrays de DNA. Conocer distintas plataformas de microarrays para genotipado, sus diferencias y los campos de aplicación. Conocer el diseño y uso de microarrays para el análisis de variaciones de número de copia. TEMA 3.4. Otras aplicaciones. Revisar el concepto de splicing alternativo, conocer los exon-arrays y su aplicación. Conocer los tiling-arrays y su utilidad en estudios de unión DNA-proteína. Conocer y comprender el proceso ChIp on chip Conocer los el análisis de expresión de micrornas con microarrays. A continuación se desglosan los objetivos que se pretenden alcanzar con la PRACTICA que durante 4.5 horas los Página 4

5 alumnos realizarán en el laboratorio de Genómica. Por cada clase se formarán 4 grupos de 8 ó 9 alumnos. Con objeto de no alterar la dinámica diaria del laboratorio cada grupo se dividirá en el laboratorio en dos grupos de 4 ó 5 alumnos cada uno que trabajaran por separado (PARTE A Y B). Ambos grupos harán todo el ejercicio práctico previsto en el laboratorio pero por separado. PARTE A (2 horas) Los alumnos prepararan las reacciones de secuencia de muestras pertenecientes a individuos sanos o afectos de galactosemia, cargaran estas reacciones en el equipo de secuenciación, programaran el equipo de secuenciación, analizarán los resultados obtenidos localizando las mutaciones... PARTE B (2.5 horas) Los alumnos aprenderan a manejar un software tipo como es Gene Jockey para alinear unas secuencias problema, traducirlas, localizar ORFS, sitios para enzimas de restricción... Los alumnos aprenderan a diseñar una sonda Taqman para analizar la expresión de un gen concreto en mrna extraido de vesícula ótica de pollo. Los alumnos compararan los perfiles genéticos de dos muestras problema de AFLPS utilizando el software Gene Mapper TEMARIO EMA 1. La PCR y PCR en tiempo real TEMA 1.1 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) TEMA 1.2 La PCR en tiempo real. Otras aplicaciones de los equipos de real time. HRM TEMA 2. La secuenciación de ácidos nucleícos TEMA 2.1 Los inicios de las técnicas de secuenciación TEMA 2.2 La secuenciación automática fluorescente. La pirosecuenciación. El inicio de la era de la secuenciación de genomas TEMA 2.3 Otras aplicaciones de los equipos de secuenciación automática: variación genómica; epigenética TEMA 2.4 La nueva generación de secuenciadores automáticos. El futuro TEMA 2.5 Hitos en la secuenciación del ADN TEMA 2.6 Herramientas en red para a manipulación de secuencias. Bases de datos. genotipado y TEMA 3. Los microarrays de DNA TEMA 3.1 Introducción a la tecnología de microarrays de DNA. Plataformas de microarrays de DNA. TEMA 3.2 Microarrays de DNA en análisis de expresión génica. TEMA 3.3. Microarrays de DNA en estudios de genotipado. TEMA 3.4. Otras aplicaciones. TEMA 4. La citometría de flujo TEMA 4.1. Introducción TEMA 4.2. Aplicaciones. Los alumnos dispondran de equipos de citometría con los cuales llevar a cabo el estudio de diferentes tipos de muestras TEMA 5. HPLC TEMA 5.1. Introducción TEMA 5.2 Aplicaciones METODOLOGÍA/ACTIVIDADES DE ENSEÑANZA-APRENDIZAJE OTAL HORAS TEORIA/ ALUMNO: 27 horas TOTAL HORAS VISITA GUIADA/ ALUMNO: 2 horas TOTAL HORAS PRACTICAS LABO/ ALUMNO: 8 horas TEMA 1. La PCR y PCR en tiempo real TEMA 1.1. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 1 1/2 horas TEMA 1.2. La PCR en tiempo real. Otras aplicaciones..3 horas TEMA 2. La secuenciación de ácidos nucleícos TEMA 2.1. Los inicios de las técnicas de secuenciación. 1 hora Página 5

6 TEMA 2.2. La secuenciación automática fluorescente...1 1/2 horas TEMA 2.3. Otras aplicaciones de los equipos de secuenciación.1/2 hora TEMA 2.4 La nueva generación de secuenciadores automáticos. 1 1/2 horas TEMA 2.5. Hitos en la secuenciación del ADN.1 1/2 horas TEMA 2.6. Herramientas. Bases de datos. 1 1/2 horas TEMA 3. Los microarrays de DNA TEMA 3.1 Introducción a la tecnología de microarrays de DNA. 2 horas TEMA 3.2 Microarrays de DNA en análisis de expresión génica. 2 horas TEMA 3.3. Microarrays de DNA en estudios de genotipado. 1/2 horas TEMA 3.4. Otras aplicaciones. 1/2 hora TEMA 4. La citometría de flujo. 4 horas TEMA 4.1. Introducción TEMA 4.2. Aplicaciones. Los alumnos dispondran de equipos de citometría con los cuales llevar a cabo el estudio de diferentes tipos de muestras TEMA 5. HPLC. 3 horas TEMA 5.1. Introducción TEMA 5.2 Aplicaciones SISTEMA DE EVALUACIÓN DEL APRENDIZAJE Los alumnos deberán realizar 8 horas de prácticas en los laboratorios de la UFV Al comienzo del curso el profesor entregará a los alumnos una lista con los grupos de prácticas y las fechas correspondientes para las mismas. No se admitirán cambios en los grupos ni en las fechas. Las prácticas son obligatorias y aquellos alumnos que no las realicen suspenderán la asignatura. Además del contenido teórico impartido en la asignatura los alumnos deberán leer una serie de publicaciones cuyo contenido será materia de examen. El profesor proporcionará a los alumnos las referencias de estas publicaciones. Las preguntas sobre las mismas serán preguntas de tipo general. Cada profesor de cada parte de la asignatura evaluará a sus alumnos como crea conveniente. Los resultados se ponderaran de cara a la nota final de la asignatura Examen de la parte de Secuenciación y Real time: Preguntas tipo test sobre la materia impartida durante el curso incluidas las publicaciones que el profesor indique que son materia de examen y la práctica del laboratorio Puntuación máxima: 7 puntos Preguntas correctas: 0.2 puntos Preguntas erróneas: 0.05 puntos Preguntas prácticas. Puntuación máxima 3 puntos Calificación del examen (por ley): Suspenso: de 0 a 4,9 Aprobado: de 5 a 6,9 Notable: de 7 a 8.9 Sobresaliente: de 9 a 10 El profesor tendrá en cuenta de cara a la nota final la participación y comportamiento en clase, asistencia, actitud en las prácticas de laboratorio, evaluación de la práctica... BIBLIOGRAFÍA Bibliografía básica Next generation sequence analysis for mitochondrial disorders (579) Vasta V, Ng SB, Turner EH, Shendure J, Hahn SH. Página 6

7 Genome Med Oct 23;1(10):100. DNA sequencing: bench to bedside and beyond (574) Hutchison CA 3rd. Nucleic Acids Res. 2007;35(18): Sequencing technologies - the next generation (571) Metzker ML. Nat Rev Genet Jan;11(1): Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome (570) Giaever G et al Nature Jul 25;418(6896): Unlocking the secrets of the genome (569) Celniker SE et al Nature Jun 18;459(7249): Analysis of genetic inheritance in a family quartet by WG sequencing (567) Roach JC et al Science Apr 30;328(5978): Multiple personal genomes await (562) Venter JC. Nature Apr 1;464(7289): Cell biology forum: Genome-wide view of mitosis (564) Swedlow JR, Cotta-Ramusino C, Elledge SJ. Nature Apr 1;464(7289): Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome (563) Gibson DG... and Venter JC. Science Jul 2;329(5987):52-6. Next-generation DNA sequencing (547) Shendure J, Ji H. Nat Biotechnol Oct;26(10): The microbial ocean from genomes to biomes (544) DeLong EF. Nature May 14;459(7244): The versatile worm: genetic and genomic resources for Caenorhabditis elegans research (541) Antoshechkin I, Sternberg PW. Nat Rev Genet Jul;8(7): The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments (578) Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. Clin Chem Apr;55(4): Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes (577) Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. Genome Biol Jun 18;3(7) Design and optimization of reverse-transcription quantitative PCR experiments (576) Tichopad A, Kitchen R, Riedmaier I, Becker C, Ståhlberg A, Kubista M. Clin Chem Oct;55(10): Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method (573) Schmittgen TD, Livak KJ. Nat Protoc. 2008; 3(6): Navigating gene expression using microarrays - a technology review Schulze A, Downward J. Nat Cell Biol Aug;3(8):E Review. Applications of DNA microarrays in Biology Stoughton R.B. Annu. Rev. Biochem :53 82 DNA Microarrays Bier FF, von Nickisch-Rosenegk M, Ehrentreich-Förster E, Reiss E, Henkel J, Strehlow R, Andresen D. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2008;109: Página 7

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