Senescencia acelerada y transplante renal
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- Gloria María Rosario Sosa Rico
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1 Senescencia acelerada y transplante renal Autores: Giordani María Cora, Imperiali Nora, Groppa Silvia, Mombelli César, Zabala Natalia, Rosa Diez Guillermo.
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3 SENESCENCIA ACELERADA Y TRASPLANTE RENAL Autores: Giordani María Cora., Imperiali Nora., Groppa Silvia., Mombelli César, Zabala Natalia., Rosa Diez Guillermo. Servicio de Nefrología. Sección de Trasplante Renal. Hospital Italiano de Buenos Aires. Contacto: Dra. Cora Giordani Servicio de Nefrologia del Hospital Italiano de Buenos Aires Perón 4190, C.A.B.A (1181) Tel maria.giordani@hospitalitaliano.org.ar
4 RESUMEN Introducción: La pérdida del injerto a largo plazo constituye uno de los desafíos actuales para la transplantologia. El efecto que tiene la edad del donante y la senescencia celular (SCS) sobre dicha pérdida han sido descriptos. El envejecimiento o SCS describe un fenómeno, en el cual, las células somáticas todavía viables y metabólicamente activas son incapaces de reentrar en ciclo celular.dos vías inductoras de SCS telomero dependiente y telomero independiente activan ciclinas inhibitorias del ciclo celular p21 y p16 ink 4ª respectivamente conduciendo al arresto celular, convirtiéndolos más susceptibles a la injuria renal aguda. Objetivo Evaluar la expresión de p16 ink 4a en biopsias (Bx) de injertos renales y correlacionarlo con, la función renal, lesiones en la histología y variables clínicas con impacto en la sobrevida del injerto. Material y métodos Se evaluaron todos los pacientes (pts) con transplante renal(tx) de donante vivo(dv) o cadavérico(dc) en el Hospital Italiano durante 2013 y Todos recibieron triple esquema inmunosupresor deltisona,tacrolimus y micofenolato. Se analizaron datos del: a) donante (D): Dv o Dc,edad en años,sexo, donantes con criterio expandido(dex), b) receptor(r): edad, sexo, sensibilizado y miss match Hla (MMHla) C)Tx : tiempo de isquemia en horas (Tif hs ),inducción (I), retardo de la función del injerto (Rfi), rechazo agudo (RA), función renal : Creatinina sérica(cr) en mg%, proteinuria en gr /24 hs, al mes, 6, 12 y 24 meses post Tx y perdida del injerto(pi). Las Bx se categorizaron según BANFF 2013 y se realizó inmunohistoquimica con método de peroxidasa anti peroxidasa sistema automatizado Ventana BENCHMARK - XT para p16 INK4a. Analisis Estadístico Resultados 62 pts y sus Bx iniciales por disfunción fueron analizadas. Edad del R:45.3 a, 23 mujeres, Dc:27(43.5%), Edad D 62a (19-73), 31mujeres, DEx n:12 (20%), Tif 18.9hs, el 80% de los Dc presentaron Rfi. MM Hla : 4-5 en mas del 80% pts.todos los pts recibieron I:23 con anti-cd25 y 39 Timoglobulina. Se diagnóstico RA por Bx en 21pts(4 humorales (H).Todas las PI(n:4) salvo una por RAH fueron por muerte del paciente. Del total de Bx : 54 (87%) fueron biopsias tempranas antes de los 3 meses post Tx. Inmunohistoquimica
5 positiva p16 INK4a. en 31 Bx (50%), fibrosis y atrofia IFTA en 35 (56.5%), Fibrosis miointimal en vasos (FMV) 42(67%), inflamación de la microcirculación en 33 (53%), toxicidad aguda por ICN en 8, ninguna Bx con rechazo crónico. En el análisis univariado usando Bx + p16 INK4a como variable dependiente se observó una diferencia estadisticamente significativa en: edad D: 48± 13 vs 37± 13 a p= , mayor proporción de D masculinos 63% vs 36% p=0.03, los DEx tuvieron Bx + p16 INK4a en 30 vs 6% p= , y la cr a 6 y 12 m fue mayor: 1.43 vs 1.67 p=0.03 y 1.39 vs 1.66 p=0.02. Respecto de los hallazgos en la histología solo la presencia de FMV fue significativo: 47% vs 17% p= No se encontró diferencia significativa con cr mes, proteinuria mes, 6, 12, y 24 meses, RA, Ifta. En el análisis multivariado ninguna variable fue estadísticamente significativa. Conclusiones Los donantes renales de mayor edad y con criterio expandido desarrollan una histología anormal, más susceptible al estrés del transplante aunque no más inmunogénica y aumentan la expresión de marcador de senescencia para p16 INK4a imponiéndole limites a la capacidad de reparar tejidos comprometiendo la sobrevida a largo plazo de los injertos.
6 Introducción Antecedentes La sobrevida del injerto renal a largo plazo es uno de los mayores desafíos para la trasplantología actual. Dicha perdida está determinada por factores de origen tanto Inmunológico como no Inmunológico. Dentro de este último grupo la edad del donante constituye un factor determinante. El envejecimiento o Senescencia (SCS) describe un fenómeno, en el cual, las células somáticas todavía viables y metabólicamente activas son incapaces de reentrar en ciclo celular. Han sido descriptas dos vías inductoras de senescencia :una telómero dependiente en la cual el acortamiento de los telómeros determina activación de inhibidores de kinasas de ciclinas del ciclo celular como la p21, denominada senescencia replicativa y una segunda vía telómero independiente en la cual distintos tipos de estrés celular (oxidativo, metabólico) activan inhibidores de kinasas de ciclinas del ciclo celular como p16 INK4a generando senescencia acelerada. Los mecanismos por los cuales la senescencia impacta en la supervivencia del injerto no están claramente establecidos. Debido a que el injerto renal se encuentra permanentemente sometido a injurias repetidas como isquemia de reperfusión, isquemia fría, rechazo agudo,toxicidad por drogas entre otras, la expresión de p16 INK4a en tejido renal muestra la activación de la vía telómero-independiente generando incapacidad para regenerar y reparar tejidos con aumento de la fibrosis intersticial y atrofia tubular con pérdida acelerada del injerto. Objetivo Evaluar la asociación de la expresión de p16 INK4a, marcador biológico de senescencia acelerada, en biopsias de injertos renales con el deterioro de la función renal, desarrollo de lesiones en la histología y distintas variables clínicas con reconocido impacto en la sobrevida del injerto. Material y Métodos Pacientes con trasplante renal (Txr) en el Hospital Italiano durante 2013 y 2014 con triple esquema inmunosupresor. Se analizaron características : A) del donante (D): vivo Dv o cadavérico Dc, edad en años, sexo, donantes con criterio expandido (DEx) según criterios definidos por UNOS (donantes vivos o cadavéricos > de 60 años o donantes cadavéricos entre años con 2 de los siguientes criterios hipertensión arterial, accidente cerebrovascular hemorrágico, o creatinina pre-ablación >1.5mg% B) receptor(r): edad, sexo, sensibilizado y miss match HLA (MM HLA) C)Tx : tiempo de isquemia fría en horas (Tif hs ),inducción (I), retardo de la función del injerto (Rfi), rechazo agudo (RA), función renal
7 : Creatinina sérica(cr) en mg%, proteinuria en gr /24 hs, a los 6, 12 y 24 meses post -Tx y perdida del injerto(pi). Las biopsias se clasificaron por BANFF 2013 y se realizó marcación de la p16 INK4a, por inmunohistoquímica con método de peroxidasa anti peroxidasa sistema automatizado ventana de BENCHMARK-XT. Las variables continuas se expresaron en mediana y desvío estándar o mediana y rango, y las categóricas en frecuencia y proporciones. Se realizó un análisis univariado considerando la p16 INK4a positiva o no para las distintas variables de la biopsia. Se utilizo Ttest para las variables continuas paramétricas y Wilocoxon test para las no paramétricas. Chi2 para las variables categóricas. Se considero significativo un valor de p menor 0,05. Considerando las variables estadísticamente significativas y de relevancia clínica se realizó modelo multivariado de regresión logística. Resultados De un total de 62 biopsias renales tempranas (< tres meses post Tx) por disfunción analizadas en 62 receptores de trasplante renal, se obtuvo tinción positiva para p16ink4a en 31 de ellas (50%). La edad y sexo de donante y receptor fue : 62,58 14,41(19-73) años,31 hombres y 45,32 14,21 (20-73) años,39 hombres respectivamente. De todos los donantes 27 fueron cadavéricos (43. 5%) y 12 de ellos (20%) fueron donantes con criterio expandido. El Tiempo de isquema fría fue de 18.9 hs en promedio, y el 80% de los donantes cadavericos (22/27) presentaron retardo de la función del injerto. El Miss Match HLA fue 4-5 en más del 80% de los pacientes (pts.). Aunque solo 5 receptores fueron hipersensibilizados ( PRA> 80%), todos los pacientes recibieron esquema de Inmunosupresión de inducción : 39 con anticuerpos policlonales (Thymoglobulina) y 23 con Anticuerpos monoclonales anti CD25 (Simulect ) y todos los pacientes recibieron triple esquema inmunosupresor con metilprednisolona IV y mg/kg días 0,1 y 2 y luego prednisona 0.5 mg/kg hasta llegar a 8 mg al tercer mes post Tx, tacrolimus y acido micofenólico. Se diagnosticó Rechazo agudo (RA) por biopsia en 21pts (4 humorales (H).Todas las PI(n:4) salvo una por RAH fueron por muerte del paciente con injerto funcionante siendo la causa más frecuente la infecciosa. En el análisis histológico de las biopsias tempranas por disfunción se observó : fibrosis intersticial y atrofia tubular( IFTA) en 35 de 62Bx (56.5%),Fibrosis miointimal en vasos (FMIV) en 42 de 62 Bx (67%), inflamación de la microcirculación IM (capilaritis y / o glomerulitis de mononucleares ) en 33 de 62 (53%), toxicidad aguda por ICN solo en 8 biopsias. Si bien el análisis se realizó en biopsias tempranas (< de tres meses) ninguna de ellas presentaba lesiones características rechazo crónico del injerto (glomerulopatía crónica).
8 La tinción por inmunohistoquímica para p16ink4a fue considerada positiva o negativa.el análisis se realizó contando cada 10 campos de gran aumento, se evaluará positividad de p16ink4a como porcentaje de positividad nuclear y citoplasmática en células de túbulos renales, glomérulos, intersticio y arterias.el 50 % de las biopsias analizadas fue positiva para p16, Grafico En el análisis univariado usando las biopsias + p16ink4a como variable dependiente se observó una diferencia estadisticamente significativa en :edad del donante: 48± 13 vs 37± 13 a p= , mayor proporción de D masculinos 63% vs 36% p=0.03, los DEx tuvieron Bx + p16ink4a en 30 vs 6% p= , y la creatinina sérica a 6 y 12 m fue mayor 1.43mg% vs 1.67mg% p=0.03 y 1.39 mg% vs 1.66 mg% p=0.02 respectivamente. Respecto de los hallazgos en la histología solo la presencia de FMIV fue significativo: 47% vs 17% p= No se encontró diferencia significativa con creatinina al mes, con la proteinuria mes, 6, 12,y 24 meses, rechazo agudo. En el análisis multivariado ninguna variable fue estadísticamente significativa. Discusión Luego de la introducción de los inhibidores de la calcineurina (ciclosporina -tacrolimus), la sobrevida a corto plazo (al año) del injerto renal mejoró drámaticamente gracias a la disminución de la tasa de rechazo agudo, sin embargo dicha mejoría en las tasas de rechazo agudo no se tradujeron en una mejoría en la sobrevida a largo plazo. La principal causa de pérdida del injerto a largo plazo sigue siendo la muerte del paciente con injerto funcionante seguida por causa de origen inmunológico, rechazo crónico del injerto. La edad del donante constituye el factor de riesgo No inmunológico más importante para la pérdida alejada del injerto. El Hayflick limit descubierto por Hayflick L. determina que todas las células somáticas en cultivo presentan un número limitado de divisiones celulares luego del cual entran en arresto celular o senescencia. El envejecimiento o senescencia (SCS) describe un fenómeno, en el cual, las células somáticas todavía viables y metabólicamente activas son incapaces de reentrar en ciclo celular perdiendo su capacidad para reparar y regenerar tejidos. Dos vías inductoras de senescencia :una telómero dependiente en la cual el acortamiento de los telómeros determina activación de inhibidores de kinasas de ciclinas del ciclo celular como la p21, denominada senescencia replicativa y una segunda vía telómero independiente en la cual distintos tipos de estrés celular (oxidativo, metabólico) activan inhibidores de kinasas de ciclinas del ciclo celular como p16 INK4a generando senescencia acelerada. Ambas vías, telomero dependiente e independiente coexisten e interactúan entre si en el injerto renal. Los riñones provenientes de donantes añosos SCS replicativa presentan al igual que los riñones nativos envejecidos mayor susceptibilidad a la injuria renal aguda.
9 El arresto celular telómero independiente causado por diferentes injurias o stressors celulares también llamado (STASIS) stimulation and stress induced senescense-like arresto celular ha sido relacionado con el aumento o expresión de los niveles de p16 INK4a.. En el curso de un trasplante renal el injerto se encuentra sometido a distintos tipos de injuria como por ejemplo injuria de reperfusión, isquemia fría, rechazo agudo, toxicidad por inhibidores de la calcineurina y dependiendo de su edad biológica tendrá mayor o menor capacidad para responder y reparar tejidos frente a dichos procesos que determinaran la evolución a largo plazo del mismo. En este estudio retrospectivo se observó que el 50% (31 de 62) de las biopsias tempranas por disfunción (< tres meses post-tx ) analizadas presentaron tinción por inmunohistoquimica + p16 INK4a.. De todas las variables clínicas del donante, del receptor y del trasplante e histológicas anteriormente detalladas y analizadas en este trabajo la expresión de p16 fue más frecuente en donantes cadavéricos, mayores de edad 48± 13 vs 37± 13 años p= , mayor proporción de donantes masculinos 63% vs 36% p=0.03, los donantes con criterio expandido tuvieron Bx + p16ink4a en 30 vs 6% p= , y la creatinina sérica a 6 y 12 m fue mayor 1.43mg% vs 1.67mg% p=0.03 y 1.39 mg% vs 1.66 mg% p=0.02 respectivamente. Si bien existe una similitud entre la histología del riñón envejecido y la del riñón trasplantado con deterioro de la función renal en ambos hay un marcado incremento de la fibrosis intersticial y atrofia tubular, sólo la proliferación miointimal en vasos FMIV fue significativo: 47% vs 17% p= entre las biopsia con expresión de p16. En el resto de las variable analizadas no hubo diferencia significativa. Cabe mencionar que se trata de un estudio retrospectivo, y que no se cuenta con el análisis de biopsias a tiempo cero o basal para diferenciar si la expresión de ciclinas inhibitorias del ciclo celular de la edad del donanate o de las injurias repetidas a las cuales es sometido el injerto de la injuria a la cual ha sido sometido el injerto Trabajos prospectivos, con mayor número de pacientes donde se incluya la biopsia a tiempo cero serán importantes para evaluar como los distintos componentes de la senescencia ya sea replicativa o acelerada influyen en la sobrevida a largo plazo del injerto renal. Conclusiones: La expresión de p16 INK4a en el injerto renal, se asoció a mayor fibrosis miointimal y mayor creatinina a los 6 y 12 meses, particularmente en donantes añosos y con criterio expandido.
10 Bibliografía 1. R Schmitt, A Melk. New Insights on molecular Mechanisms of renal Aging,American Journal of Transplantation.2012; 12: Anette Melk, Bernhard M.W. Schmidt, Attapong Vongwiwatana, David Rayner and Philip F. Halloran. Increased Expression of Senescence Associated Cell Cycle Inhibitor p16ink4a. In Deteriorating Renal Transplants and Diseased Native Kidney, American Journal of Transplantation. 2005; 5: Liane M. McGlynn, Karen Stevenson, Kelly Lamb, Samer Zino, Michaela Brown, Alberto Prina, David Kingsmore and Paul G. Shiels. Cellular senescence in pretransplant renal biopsies predicts postoperative organ function, Aging Cell. 2009; 8: Archill B, Chkhotua et al. Up-regulation of cell cycle regulatory genes after renal ischemiareperfusion: differencial expression of p16ink4a., p21 and p27 cyclin dependent kinasa inhibitor genes depending on reperfusion time, Transplantation International. 2006; M Hass et al. Banff 2013 Meeting Report : Inclusion of C4d-Negative Antibody Mediated Rejection and Antibody-Associated arterial Lesions,, American Journal of Transplantation. 2014; 14: Ferlicot S, Durrbach A, Ba N, Desvaux D, Bedossa P, Paradis V. The role of replicative senescence in chronic allograft nephropathy. HumPathol 2003; 34:
11 Tablas Tabla 1. Análisis univariado de las variables clínicas e histológicas.
12 Gráfico 1. p16ink4a positiva en glomérulo. Gráfico 2. p16ink4a positiva en células tubulares renales.
13 Gráfico 3.. p16ink4a positiva en vasos renales.
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