Bioconversión de car-3-eno por una dioxigenasa de Pleurotus sapidus

Transcripción

1 UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA MAESTRÍA EN CIENCIAS DE PRODUCTOS NATURALES Y ALIMENTOS Bioconversión de car-3-eno por una dioxigenasa de Pleurotus sapidus Lehnert N., Krings U., Sydes D., Wittig M. y Berger R. G. PRESENTA NANCY GIRÓN CRUZ Huajuapan de León, Oax., Noviembre 2012

2 CONTENIDO 1. Introducción 2. Relevancia 3. Materiales y Métodos 4. Resultados 5. Discusiones 6. Conclusión 2

3 Bohlmann, J.; Keeling, C.I. Plant Journal ,

4 Pinnus roxburghii Pinnus logifolia Especies Juniper Aspergillus niger (+)-Car-3-eno Car-3-eno Mycobacterium smegmatis Pinnus silvestris (-)-Car-3-eno Nicotiana tabacum Catharanthus roseus Pattekhan, H. H.; Varadaraj, M. C.;Keshava, N.; Divakar, S. Biotechnol. Tech , Prema, B. R.; Bhattacharyya, P. K. Appl. Microbiol ,

5 Car-3-eno Regio y estéreo selectividad Dioxigenasa P. sapidus Fraatz, M. A.; Riemer, S. J. L.; Stöber, R.; Kaspera, R.; Nimtz, M.; Berger, R. G.; Zorn, H. J. Mol. Catal ,

6 Reactivos Hongo (+)-Car-3 -eno Mezcla azeotrótica pentano/éter etílico (1:1.12) Pleurotus sapidus (DSMZ 8266), Braunschweig BHT Onken, J.; Berger, R. G. J. Biotechnol ,

7 Crecimiento de P. sapidus Homogenización P. sapidus 1 cm ml glucosa/l-asparagina/ levadura 24 C y 150 rpm 7

8 Micelio homogeneizado Biomasa Centrifugación 500 mg micelio, 1 ml HEPES 200 mm (ph 5.5, glicerol 5%) Homogenización 2 min y rpm en hielo HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazinyl)-ethansulfonic acid) 8

9 Bioconversión 500 mg micelio 300 mg/l (+)-car-3-eno 1mL HEPES Incubación 4 h a 24 C Homogeneización 150 rpm 3 veces mezcla azeotrópica pentano/éter etílico (1:1.2) Na 2 SO 4 Fase orgánica concentro a aprox. 1 ml Adición 60 μg BHT Análisis TLC y HRGC-MS NaBH 4 9

10 Síntesis de carenonas y carenoles Cromatografía Flash Car-3-en-5-ona (+)-Car-3-eno Agitación 4 h a 25 C 12 ml Benceno 4 mmol 70% tert-butil hidroperóxido 4 mmol dicromato de piridinio Car-3-en-2-ona Car-3-en-4-ona Proporción 2.3:1.3:1.0 Chidambaram, N.; Chandrasekaran, S. J. Org. Chem , Columna: 20 cm x 1.5 ml Carenonas: pentano/éter etílico (9:1, 3:1 y éter etílico puro, cada 200 ml) Fracciones se concentraron con CDCl 3 10

11 Cromatografía de gases preparativa Sistema de inyección frío CIS 3 Sistema conmutador multi columna II Automuestreador Pre-columna (5 m x 0.53 mm x 2 μm) conectada a una columna preparativa (25 m x 0.53 mm x 2 μm) Gas acarreador Hidrógeno con flujo 8.9 ml/min a 100 C Detector ionización de flama (230 C) Programa de temperatura: 40 C (3 min) a 200 C con 3 C/min y 240 C a 10 C/min por 5 min 11

12 Cromatografía de gases de alta resolución (HRGC)/ Cromatografía de gases de alta resolución espectrometría de masas (HRGC-MS) HRGC 1 μl muestra concentrada Cuantificación BHT Columna capilar sílica (30 m x 0.32 mm x 0.25 μm espesor ) Gas acarreador: Hidrógeno (40 cm/s), Helio (38 cm/s) Detector ionización de flama (230 C) Programa de temperatura: 40 C (3 min) a 200 C a velocidad 3 C/min y 240 C con 10 C/min, mantuvo por 5 min MS: interfaz (230 C), fuente de iones (200 C), cuadrupolo (100 C), ionización (70 ev) HRGC - MS 12

13 Cromatografía de capa fina TLC Fase móvil mezcla azeotrópica pentano/éter etílico Placas se secaron y tiñeron (0.5 g anís aldehído, 10 ml ác. acético glacial, 85 ml metanol, 5 ml ác. sulfúrico conc.) Hidroperóxidos reactivo de Huber Reactivo Huber: 3.0 g α-naftol, 150 ml metanol, 1350 ml H 2 O, 0.5 g K 2 S 2 O 5, 20 ml ác. acético, 0.5 g FeSO 4 7H 2 O, 2.2 g 2- [(4-amino-3-metilfenyl) etilamino]etil sulfato Huber, W.; Fröhlke, E. Chromatographia , van der Heide, R. F. J. Chromatographia ,

14 Resonancia Magnética Nuclear NMR 1 H a 500 MHz 13 C a 125 MHz Muestras se disolvieron en CDCl 3 14

15 RMN y EM Productos mayoritarios Car-3-en-5-ona 25.3 mg/l Car-3-en-2-ona 5.4 mg/l Car-3-en-4-ona 7.3 mg/l 15

16 α-felandren-8-ol 16

17 Cromatografía de capa fina Car-3-eno Car-3-en-5-ona Car-3-en-2-ona Car-3-en-4-ona 17

18 18

19 19

20 Dioxigenasa de P. sapidus cataliza la regio- y estéreo-selectividad Preferencia por una posición alílica Dioxigenasa no requiere de la presencia de un cofactor-redox No hay un control total del proceso de bioconversión 20

21 GRACIAS POR SU ATENCIÓN 21