Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia

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1 Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia PROFESOR PATROCINANTE: Dr. Rafael Burgos A. INSTITUTO : Farmacología y Morfofisiología FACULTAD : Ciencias Veterinarias PROFESOR CO-PATROCINANTE: Dra. Evelyn Jara F. INSTITUTO : Laboratorio de Inmunología y Genética Molecular FACULTAD : Ciencias Biológicas Pontificia Universidad Católica de Chile DELFINIDINA DISMINUYE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EXTRACELULAR A TRAVÉS DE LA ACTIVACIÓN DE ERK 1/2 EN CÉLULAS HT-29" Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico. MARTINA VALERIA CÁRDENAS CALDERÓN VALDIVIA-CHILE 2013

2 ii Nada se aprende sin un poco de trabajo (Santa Teresa de Jesús) Para mi mamá, papá y hermana.

3 iii AGRADECIMIENTOS Agradezco en primer lugar al Dr. Rafael Burgos por aceptarme en su laboratorio y permitir que desarrolle tan interesante trabajo de tesis, que no solo me permitió adquirir importantes conocimientos en el área de investigación, sino también conocer y trabajar con personas que aportaron mucho en mi última etapa formativa como químico farmacéutico. Muchas gracias también a la Dra. María Angélica Hidalgo por su ayuda en el desarrollo de esta tesis, sus consejos y apoyo en el trabajo diario de laboratorio. En forma especial agradezco a la Dra. Evelyn Jara por su constante ayuda, por su paciencia, por su consideración en cada falla y error que cometí, por cada conocimiento y optimismo entregado cada día. A todas las personas que trabajan en el laboratorio, les agradezco de corazón la ayuda entregada, los momentos de diversión, las conversaciones amenas, el apoyo que me entregaron para desarrollar los experimentos y por contagiarme con el espíritu científico. Quiero agradecer de forma especial a Jorge y Andrea por el apoyo entregado en el trabajo de laboratorio y por el pequeño equipo que muchas veces formamos para avanzar en nuestros respectivos temas de tesis. A mis amigos Alejandro, Javier, Selene, Melissa, gato, pame gracias por el apoyo entregado en los años de duración de mis estudios, gracias por el cariño entregado cada día, gracias por la preocupación y los momentos de diversión y esparcimiento. También quiero agradecer a quienes alegraron mis días como

4 iv estudiante y se ganaron un pedacito de mi corazón, Jana, Valeria, Dany Flores y Carolina Coloma. A ti querida Lichi, quien desde el cielo me ha cuidado y dado la fuerza para sobreponerme a toda adversidad. Agradezco a mi mamá por su inagotable amor, paciencia, consejos y sonrisas. Eres mi ejemplo de lucha y superación, el pilar de mi vida. A mi papá muchas gracias por su amor y paciencia. Paulina, además de ser mi hermana eres mi amiga, gracias por tu sinceridad y consejos, eres quien siempre me ha comprendido, te amo infinitamente. Mami, papi, hermana los amo mucho. Gracias a quienes contribuyeron de una u otra forma en el desarrollo de este trabajo, y a quienes formaron parte de este maravilloso viaje para la obtención del título de químico farmacéutico. Esta tesis fue financiada por el Proyecto INNOVA CORFO 12IDL

5 v ÍNDICE DE CONTENIDOS Página 1. RESUMEN 1 SUMMARY 2 2. INTRODUCCIÓN Diabetes Fármacos hipoglicemiantes orales Aristotelia chilensis Antocianinas Vía de señalización MAPK MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Material biológico Reactivos químicos. 18 Equipos MÉTODOS Cultivo de la línea celular de adenocarcinoma de colon humano HT-29 21

6 vi Extracción de proteínas totales Separación electroforética de proteínas Electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa Detección inmunológica (Western blot) Determinación del efecto del inhibidor UO126 en células estimuladas con delfinidina Determinación de la fosforilación de ERK1/2 por citometría de flujo Método enzimático de Glucosa Oxidasa/Peroxidasa (GOD/PAP) Análisis estadístico RESULTADOS Viabilidad celular de la línea HT-29 estimuladas con extracto de maqui y delfinidina Determinación de apoptosis en células HT-29 estimuladas con extracto de A. chilensis y delfinidina Efecto del Extracto de A. chilensis y Delfinidina en la fosforilación de ERK 1/2 en células HT Efecto de Delfinidina en la vía MAPK ERK 1/2 en células HT Determinación de la concentración de glucosa en células HT-29 estimuladas con Delfinidina 45

7 vii 4.6 Determinación de la participación de la vía MAPK ERK 1/2 en la disminución de la concentración de glucosa extracelular en células HT-29 estimuladas con Delfinidina DISCUSIÓN BIBLIOGRAFÍA 60

8 viii ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1: Esquema de insulina... 3 Figura 2: La vía de señalización de la insulina y su deterioro en la resistencia a la insulina... 5 Figura 3: Estructura y sustituyentes de las antocianinas Figura 4. Efecto del extracto de maqui sobre la viabilidad celular Figura 5. Efecto de Delfinidina sobre la viabilidad celular Figura 6. Ensayo de apoptosis a células HT-29 estimuladas con extracto de maqui Figura 7. Análisis de apoptosis en células HT-29 estimuladas con delfinidina 50 µm a diferentes tiempos Figura 8. Determinación de la fosforilación de ERK 1/2 por medio de citometría de flujo en células HT-29 estimuladas con extracto de maqui Figura 9. Cinética de fosforilación de ERK 1/2 en células HT-29 estimuladas con 50 µg/ml de extracto de maqui Figura 10. Cinética de fosforilación de ERK 1/2 en presencia de Delfinidina 50 µm Figura 11. Análisis de western blot para la fosforilación de ERK 1/2 en células HT-29 estimuladas con delfinidina a tiempo fijo Figura 12. Efecto de delfinidina en la vía de señalización MAPK ERK 1/2, en presencia del inhibidor UO Figura 13. Análisis del efecto de delfinidina en la vía de señalización MAPK ERK 1/2, en presencia del inhibidor UO126, a través de citometría de flujo

9 ix Figura 14. Cinética de variación en la concentración de glucosa extracelular en células HT-29 estimuladas con Delfinidina 50 µm Figura 15. Efecto de delfinidina en la captación de glucosa extracelular, en presencia del inhibidor UO Anexo 1. Análisis de western blot para la fosforilación de ERK 1/2 en presencia de extracto de maqui Anexo 2. Cinética de fosforilación para tratamientos con Extracto de maqui 0.5 µg/ml y 5 µg/ml Anexo 3. Determinación de la fosforilación de ERK 1/2 por medio de citometría de flujo en células HT-29 estimuladas con delfinidina... 58

10 x LISTA DE ABREVIATURAS BSA DM DMSO DTT EDTA EGTA ERK FBS Albúmina sérica de bovino Diabetes Mellitus Dimetilsulfóxido Ditiotreitol Ácido etilendiamino tetracético Ácido etilenglicol tetracético Quinasa regulada por señal extracelular Suero bovino fetal GLP-1 Péptido similar al glucagón tipo 1 GLUT-4 Transportador facilitativo de hexosa tipo 4 IRS-1 Receptor de sustrato de insulina 1 MAPK MEK MTT Proteína quinasa activada por mitógenos MAPK quinasa Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5 Difeniltetrazol NaF NaVO4 PBS PMSF Rpm Fluoruro de Sodio Ortovanadato de sodio Tampón fosfato salino Fluoruro de fenilmetilsulfonilo Revoluciones por minuto

11 xi SDS SDS-PAGE Dodecil sulfato de sodio Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturantes TBS TEMED Tris Tritón X-100 Tampón tris salino N,N,N,N -tetrametilendiamina Tris-(hidroximetil)-aminometano Octil fenoxi polietoxietanol

12 1 1. RESUMEN Aristotelia chilensis (maqui) es una planta que crece en la zona central y sur de Chile, así como en el suroeste de Argentina. Es una fuente rica en antocianinas, las que aparte de otorgar color a los frutos, también tendría importantes beneficios para la salud como: reducción de la enfermedad coronaria, efectos anticancerígenos, antitumorales, antiinflamatoria y antidiabética. Si bien hay varios estudios que sugieren el rol antidiabético del maqui, particularmente de las antocianinas, los mecanismos moleculares involucrados son desconocidos. En este trabajo se estudió el efecto de delfinidina y del extracto de maqui sobre la fosforilación de ERK 1/2 la cual juega un rol en la homeostasis de glucosa y el efecto tóxico de ambos, además de la variación de la concentración de glucosa extracelular inducido por delfinidina, utilizando como modelo celular la línea HT-29. A través del ensayo de reducción de MTT y citometría de flujo se determinó el efecto no tóxico de delfinidina y extracto de maqui. Por medio de western blot y citometría de flujo se demostró que delfinidina y extracto de maqui aumentan la fosforilación de ERK 1/2, finalmente, utilizando el método enzimático GOD/PAP se determinó el aumento de la concentración de glucosa extracelular inducido por delfinidina. Por lo tanto, el extracto de maqui y delfinidina podrían contribuir al mantenimiento del control de la glucosa debido a su efecto directo sobre células intestinales.

13 2 SUMMARY Aristotelia chilensis (maqui berry) is a plant that grows in central and southern Chile as well as southwestern Argentina. It is a rich source of anthocyanins, which apart from giving color to its fruits, It would also have important health benefits as: reduced risk of coronary heart disease, anticarcinogen and antitumoral activity, anti-inflammatory and antidiabetic effects. Even though exists numerous studies suggesting the antidiabetic rol of maqui berry, particularly delphinidin, the molecular mechanisms involved are unknown yet. In this study we examined the effect of both delphinidin and maqui extract upon ERK 1/2 protein phosphorylation that play a role in glucose homeostasis and its toxic effect, also the changes of extracellular glucose concentration induced by delphinidin, using a HT-29 line cell culture. Through MTT assay and flow cytometry we determined the non-toxic effect of both delphinidin and maqui extract. Western blot and flow cytometry techniques demonstrated that both compounds increases the phosphorylation of ERK 1/2, finally, using GOD/PAP method we determined the increases of extracellular glucose concentration induced by delphinidin. Therefore, both delphinidin and maqui extract could contribute at maintenance of glucose control due to the direct effect upon intestinal cells.

14 3 2. INTRODUCCIÓN 2.1 Diabetes. La diabetes mellitus (DM) es un desorden metabólico que resulta en una deficiencia en la secreción de insulina, su acción a nivel celular o ambas (Bastaki, 2005). Insulina es una hormona polipeptídica secretada por las células β de los islotes de Langerhans del páncreas. Es un polipéptido con un peso molecular de alrededor de 6000 Dalton, formada por 2 cadenas de aminoácidos A y B unidas por 2 puentes disúlfuro. Cada cadena A y B consta de 21 y 30 aminoácidos respectivamente (Figura 1) (Kokil et al., 2010). Figura 1: Esquema de insulina (Jesús Florez, 1997) La resistencia a insulina es un estado en que las concentraciones requeridas para entregar una respuesta son más altas que las normales (Mlinar et al., 2006). La causa más común es la obesidad, a pesar de que la resistencia a insulina primaria también es posible en un individuo con peso normal. El exceso de tejido adiposo abdominal ha mostrado un incremento en la liberación de ácidos grasos libres que

15 4 afectan directamente la vía de señalización de insulina, disminuyendo el consumo de glucosa en músculo, conduciendo a una exagerada síntesis de triglicéridos e induciendo gluconeogénesis en el hígado (Mlinar et al., 2006). La hiperinsulinemia que acompaña a la resistencia a insulina está implicada en el desarrollo de muchos estados patológicos, como hipertensión e hiperandrogenemia. La resistencia a insulina es el punto de partida para el síndrome metabólico y está a menudo asociado con el síndrome de ovario poliquístico y polidistrofias (Mlinar et al., 2006). Como se ha mencionado anteriormente, la resistencia a insulina se relaciona con la aparición de la diabetes, aún cuando el conocimiento de los mecanismos moleculares de resistencia a insulina es todavía incompleto, se han descrito anomalías de la señalización de insulina. En los tejidos periféricos, incluidos el músculo esquelético y el hígado, en condiciones normales, la insulina inicia su acción uniéndose a su receptor específico de la superficie celular, el receptor de insulina (IR) (Madonna et al., 2012).

16 5 Figura 2: La vía de señalización de la insulina y su deterioro en la resistencia a la insulina. (Madonna et al., 2012) La interacción entre las proteínas IRS-1 y PI3K determina la activación de Akt, que desempeña un papel crucial en el mecanismo de acción de la insulina para la translocación de GLUT-4, el transporte de glucosa y la activación de la óxido nítrico (NO) sintasa (vía de señalización metabólica). En cambio, los efectos no metabólicos, proliferativos, mitógenos y proinflamatorios de la insulina se producen mediante la activación de Ras (principalmente a través de Shc (proteína homóloga del colágeno) y, en menor grado, de proteínas IRS), la Raf y las MAPK (vía de señalización de crecimiento) (Figura 2) (Madonna et al., 2012) La deficiencia de insulina conduce a una hiperglicemia crónica con alteración en el metabolismo de grasas, carbohidratos y proteínas (Bastaki, 2005). A medida que la enfermedad progresa, el daño tisular o vascular conduce a graves complicaciones como retinopatía, neuropatía, nefropatía, complicaciones cardiovasculares y

17 6 ulceraciones (Bastaki, 2005). En general, se clasifica en Diabetes Mellitus tipo 1, tipo 2 y diabetes gestacional la que se asocia principalmente al embarazo (Patel et al., 2012). La Diabetes Mellitus tipo 1 es causada por una destrucción autoinmune de las células β pancreáticas las que secretan insulina involucrando principalmente a dos importantes clases de linfocitos: CD8 y CD4 (Kokil et al., 2010). La directa interacción entre linfocitos CD8 y el autoantígeno de las células β resulta en la destrucción de éstas. Esto involucra procesos destructivos crónicos que persisten por muchos años culminando con fallas en la secreción de insulina. Este proceso autoinmune es en gran parte debido a factores genéticos y ambientales (Kokil et al., 2010). La diabetes mellitus tipo 2 resulta de la incapacidad de las células β para aumentar la secreción de insulina suficiente como para compensar la resistencia a la insulina en tejidos periféricos (Schäfer et al., 2011). Eventualmente, las células β van disminuyendo su efectividad, resultando en una secreción insuficiente de insulina para mantener un control de la glicemia (Fonseca, 2006). Además, la hiperglicemia puede tener un efecto tóxico directo sobre las células β: niveles de glucosa constantemente elevados pueden resultar en una desdiferenciación de células β o en apoptosis de estas células sin un incremento compensatorio en la proliferación (Fonseca, 2006). Este tipo de diabetes abarca principalmente a individuos que tienen resistencia a insulina y por lo general tienen deficiencia relativa en vez de una deficiencia absoluta (Kokil et al., 2010). Con el tiempo, decrece la producción de insulina, y el paciente puede llegar a un punto donde la insulina requerida es insuficiente (Kokil et al., 2010). También se ha descrito cambios en otras hormonas asociadas a la patogenia de la diabetes tipo 2 como una

18 7 disminución en la secreción de la incretina GLP-1 lo cual contribuye a una reducción en la secreción de insulina y a una hiperglicemia (Tahrani et al., 2011). Debido a los variados y progresivos cambios fisiopatológicos asociados con la diabetes tipo 2, se hacen necesarios diferentes compuestos farmacológicos para las distintas etapas de la enfermedad que sean un complemento en los cambios en el estilo de vida los cuales pueden ser efectivos pero a menudo resultan difíciles de mantener (Tahrani et al., 2011). 2.2 Fármacos hipoglicemiantes orales La dieta y ejercicio siguen siendo los pilares del tratamiento, sin embargo la terapia farmacológica es con frecuencia muy necesaria. El inadecuado control glicémico con un solo agente podría llevar a la adición de un segundo hipoglicemiante oral (Harrigan et al., 2001). Hoy en día existe una amplia gama de hipoglicemiantes orales para tratar la diabetes tipo 2. Las principales clases son heterogéneas en sus modos de acción, perfiles de seguridad y tolerabilidad (Krentz et al., 2005). Estas clases incluyen agentes que estimulan la secreción de insulina (sulfonilureas y secretagogos de rápida acción), sensibilizadores de insulina (biguanidas y tiazolidinedionas), inhibidores de la alfaglucosidasa (Acarbosa, Miglitol, Voglibosa) e Incretinas. (Bösenberg et al., 2008). Además de agentes hipoglicémicos orales, existen medicamentos de administración parenteral: insulina y análogos de insulina (Kokil et al., 2010).

19 8 Los análogos de insulina diseñados para tratar las deficiencias de insulina humana se encuentran disponibles para pacientes con diabetes tipo I, para simular más fisiológicamente la liberación endógena de insulina observada en individuos sanos (Kokil et al., 2010). Las Biguanidas, en particular Metformina, es usualmente preferido por sobre otros hipoglicemiantes orales como primera línea de tratamiento en la diabetes tipo 2. La decisión particular sobre qué agente utilizar se basa en variables como eficacia, costo, potenciales efectos secundarios, efectos sobre el peso, comorbilidad, hipoglicemia, riesgos y preferencias del paciente (Tschöpe et al., 2013). Este fármaco fue introducido como antidiabético hace ya varios años, se encontró que disminuye los niveles de glucosa en pacientes con DM tipo 2 facilitando la utilización de glucosa en el músculo esquelético y reduciendo la producción de glucosa hepática. (Kefas et al., 2004). Recientes estudios han reportado que Metformina incrementa ligeramente la absorción intestinal de glucosa a través de la inducción de una redistribución de los transportadores de glucosa en la membrana de borde en cepillo de los enterocitos de ratas a través del control de AMPK. (Sakar et al., 2010). Induce una rápida regulación de dos de los principales transportadores de glucosa intestinales; SGLT-1 y GLUT2, a través de una rápida fosforilación de AMPK. Además, se ha descrito que el intestino delgado es el mayor sitio de acumulación y acción de biguanidas, particularmente Metformina. (Sakar et al., 2010). La terapia farmacológica para el tratamiento de la diabetes tipo 2 resulta ser bastante adecuada en un principio, ya que existe una respuesta hipoglicemiante eficaz,

20 9 pero con el trascurso de los años la respuesta disminuye debido a la progresión de la enfermedad que conlleva a una disminución en la producción de insulina endógena, deterioro progresivo de la función de la célula beta, por lo que el temprano control intensivo de la hiperglicemia, el uso de hipoglicemiantes orales no secretagogos, y el uso de estimulantes de incretina (que en modelos animales han demostrado inhibir la apoptosis de las células beta y permitir la regeneración de éstas) enlentecerían el deterioro de la célula beta. Es por este motivo que se hace necesario investigar nuevas moléculas para el tratamiento de la enfermedad, que no conduzcan en el largo plazo a una deficiencia absoluta en la secreción de insulina por parte de las células beta. Recientemente, el interés por compuestos bioactivos presentes especialmente en vegetales, ha promovido el desarrollo de investigaciones en este campo (Gironés et al., 2012). Han cobrado mucha vigencia los denominados berries, que conforman un grupo de frutos de color rojo, violáceo, morado, con alto contenido de polifenoles. Entre ellos destacan los arándanos, las frambuesas, las uvas y el maqui (Alonso, 2012). 2.3 Aristotelia chilensis Aristotelia chilensis, comúnmente conocida como maqui berry, es una planta presente en la zona central y sur de Chile, así como en el suroeste de Argentina (Suwalsky et al., 2008). Perteneciente a la familia Elaeocarpaceae, alcanza una altura de 4 a 5 metros y sus frutos son bayas pequeñas de 5 mm, de color negro brillante o azuladas (Alonso, 2012). Recientemente, investigaciones científicas han demostrado que estos frutos tienen un potente efecto antioxidante in vitro, actividades antiaterogénicas y cardioprotectoras, efectos inhibitorios de inflamación y adipogénesis

21 10 ambos in vitro (Gironés et al., 2012). La infusión de las hojas de A. chilensis se han utilizado en la medicina herbaria tradicional para tratar dolores de garganta, dolores renales, úlceras estomacales, diversos trastornos digestivos, fiebre, cicatrices, y como un agente antiinflamatorio (Suwalsky et al., 2008). Esta planta es una fuente rica de compuestos fenólicos con capacidad antioxidante, entre los cuales los más importantes son las antocianinas (Suwalsky et al., 2008). 2.4 Antocianinas Las antocianinas son compuestos naturales que otorgan color a frutas, vegetales y plantas. Adicionalmente, las antocianinas también tendrían importantes beneficios para la salud como por ejemplo efectos anticancerígenos, antitumorales y antiinflamatorios. (Kong et al., 2003). Las antocianinas son un subgrupo perteneciente a la gran familia de flavonoides. Por medio de la técnica de HPLC se ha podido detectar los tipos de antocianinas presentes en un extracto de A.chilensis. Las concentraciones medidas (expresadas como equivalentes de delfinidina 3-glucósido) de las diferentes antocianinas identificadas en las frutas son de un 73% de derivados de delfinidina predominando sobre los derivados de cianidina, con delfinidina 3-sambubiósido-5-glucósido como la mayor antocianina (34% del total de antocianinas), el promedio total de contenido de antocianinas es /- 0.4 mg/100 g de fruta fresca ( /- 0.6 mg/100 g de fruta seca) (Escribano-Bailón et al., 2006). En relación a su estructura, las antocianinas se encuentran compuestas por dos anillos aromáticos A y B, unidos por una cadena de 3 carbonos. Variaciones

22 11 estructurales del anillo B, resultan en los distintos tipos de antocianinas que se conocen (Garzón, 2008). El grupo hidroxilo de la posición 3 siempre se encuentra glicosilado, otorgándole cierta estabilidad y solubilidad (Figura 3). Dependiendo de los sustituyentes en el anillo A y B van a ser los diferentes compuestos con diversos colores que se obtendrán. Las diferencias entre las antocianinas se encuentra en el número de grupos hidroxilos en la molécula, el grado de metilación de estos grupos hidroxilo, la naturaleza y número de azúcares unidos a la molécula, la posición de la unión, la naturaleza y el número de grupos alifáticos y ácidos aromáticos unidos a los azúcares en la molécula (Mazza et al., 1993). Cuando la aglicona (antocianidina) es glicosilada, se conoce como antocianina. Los efectos de glicosilación y acilación afectan las propiedades físicas y químicas de las antocianinas pues modifican el tamaño molecular y la polaridad de la molécula. La glicosilación incrementa la solubilidad en agua, mientras que la acilación la disminuye. La forma aglicona de las antocianinas raramente es encontrada en la naturaleza por su pobre estabilidad. La glicosilación otorga estabilidad a las antocianinas (He et al., 2010).

23 12 Figura 3: Estructura y sustituyentes de las antocianinas (Durst y Wrostad, 2001) El interés por las antocianinas y antocianidinas se ha incrementado notablemente debido a las importantes propiedades terapéuticas y farmacológicas que se han descubierto. Éstas incluyen: reducción de la enfermedad coronaria, efectos anticancerígenos, antitumorales, antiinflamatorios y antidiabéticos (Garzón, 2008). En relación a este efecto, existen reportes que muestran que la administración de algunas antocianinas, en particular delfinidina 3-sambubiósido-5-glucósido mejora los niveles de glucosa en ayunas y la tolerancia a ésta en ratones obesos alimentados con una dieta rica en grasas (Rojo et al., 2012). En este mismo trabajo, se demostró que esta molécula era capaz de disminuir la producción de glucosa por parte del hígado en ratones con obesidad (Rojo et al., 2012). Variados experimentos han observado el efecto antidiabético de las antocianinas, que son atribuidas a múltiples y simultáneos efectos de estos compuestos bioactivos, incluyendo reducción de la glucosa sanguínea, prevención en la producción de radicales libres, incremento de secreción de insulina y mejora en la resistencia a ésta (Soriano et al., 2012). Sin embargo, estudios en humanos saludables no diabéticos,

24 13 revelaron que las antocianinas no alterarían la glucosa sanguínea o las concentraciones de insulina en plasma, tal vez porque se requiere la presencia de un síndrome metabólico preexistente para que estos compuestos tengan una acción efectiva (Soriano et al., 2012). A pesar de los efectos anteriormente descritos, un tema controversial es la biodisponibilidad que presentan estas moléculas. Los datos farmacocinéticos de las antocianinas, muestran que éstas tienen una baja concentración en plasma, debido a su baja absorción, alta metabolización y rápida eliminación (Manach et al., 2005). Por varios años, estudios reportaron un número muy bajo de absorción de las antocianinas después de la administración oral, del orden de 0,004% a 0,1% de lo ingerido (Welch et al., 2008). La baja biodisponibilidad que poseen las antocianinas podría deberse a su estructura química, inestabilidad a ph neutro, metabolismo de la microflora del colon, metabolismo en mucosa intestinal e hígado, lo que resulta en la degradación de la molécula (Soriano et al., 2012). Entonces, Cómo es posible que las antocianinas puedan tener efectos beneficiosos sobre el metabolismo de la glucosa si éstas son escasamente absorbidas hacia el torrente sanguíneo?. Una posible explicación a esta interrogante, es que estas moléculas puedan ejercer sus efectos directamente sobre el sistema gastrointestinal, superficie con la cual las antocianinas se encuentran en contacto directo al ser ingeridas. En el tracto gastrointestinal, la glucosa sirve como una señal para la activación de numerosos eventos regulatorios. La presencia de glucosa en el lumen intestinal provoca un número de cambios en la función gastrointestinal

25 14 incluyendo inhibición del vaciado gástrico e ingesta de alimentos y estimula la secreción intestinal y pancreática. Además, la presencia de glucosa tiene efectos sobre las células epiteliales, incluyendo regulación de proteínas transportadoras expresadas por los enterocitos (Raybould, 2007). A nivel intestinal, existe una fuerte regulación de la homeostasis de glucosa que involucra a las vías de señalización MAPK y AMPK. De hecho, una desregulación en éstas vías que son esenciales para la homeostasis de glucosa, a menudo resulta en obesidad y diabetes (Schultze et al., 2012). Es por esto que estas vías podrían ser atractivos blancos terapéuticos. Sin embargo, a excepción de Metformina, que se considera que actúa mediante activación de AMPK, no hay aún otro tratamiento desarrollado que tenga como blanco estas proteínas quinasas (Schultze et al., 2012). En un estudio realizado en ratones con diabetes tipo 2, se evaluó el efecto del extracto de arándano que contiene gran cantidad de antocianinas, el cual mostró que aminora la hiperglicemia y aumenta la sensibilidad de insulina activando AMPK. Además, reduce significativamente la concentración de glucosa en sangre y aumenta la sensibilidad de insulina. (Takikawa et al., 2010). Por otra parte, ha sido demostrado que la activación de AMPK resulta en la inhibición de glucosa hepática in vitro e in vivo (Viollet et al., 2009).

26 Vía de señalización MAPK La vía de señalización ERK 1/2 se encuentra involucrada en la homeostasis de glucosa. La cascada de señalización de ERK es una vía MAPK central que desempeña un rol en la regulación de diversos procesos celulares como la proliferación, diferenciación, desarrollo, aprendizaje, supervivencia y también apoptosis (Shaul et al., 2007). La cascada ERK es un componente de señalización central, compuesta de proteínas quinasas que secuencialmente fosforilan y se activan unas con otras. Es estimulada por una gran variedad de señales extracelulares y, como una consecuencia, regula distintos e incluso opuestos procesos celulares como transcripción, traducción, proliferación, diferenciación y apoptosis. La capacidad de esta cascada para iniciar y regular los diferentes procesos plantea la interrogante sobre cómo es determinada su especificidad (Shaul et al., 2007). La transmisión de señales vía esta cascada es usualmente iniciada por activación de una pequeña proteína G, la cual es seguida por una activación secuencial de muchos grupos de proteínas quinasas citoplasmáticas (Shaul et al., 2007). Fisiológicamente, esta vía es requerida para el desarrollo del sistema inmune, homeostasis y activación de antígeno, formación de la memoria, desarrollo del corazón y la respuesta a muchas hormonas, factores de crecimiento e insulina. Alteraciones en la vía de señalización de ERK 1/2 son conocidas por un amplio rango de patologías incluyendo variados tipos de cáncer, diabetes, infecciones virales, y enfermedades cardiovasculares (Ramos, 2008).

27 16 La señalización de insulina y sus propiedades han sido ampliamente estudiadas. Insulina es capaz de activar las vías de señalización MAPK (ERK 1/2, p38, JNK). Por otra parte, estudios en ratas diabéticas han demostrado que la modulación específica de la vía de señalización de las quinasas puede mejorar efectivamente la homeostasis de glucosa y proteger contra obesidad, resistencia adquirida a insulina y diabetes (Schultze et al., 2012). Un estudia indicó que las antocianidinas, especialmente delfinidina, es capaz de disminuir los niveles de glicemia en ratas diabéticas (Jara et al., 2012). El tratamiento con extracto de maqui rico en delfinidina, produjo una reducción significativa de la concentración basal de glucosa en suero en ratas diabéticas después de 4 meses de tratamiento (Jara et al., 2012). En este mismo estudio, se demostró que el extracto de maqui redujo significativamente la glucosa en sangre en pacientes con intolerancia a la glucosa postprandrial. Sin embargo, los mecanismos moleculares involucrados son desconocidos. Este estudio se centrará en el efecto de delfinidina y un extracto de maqui (A. chilensis) rico en antocianidinas, particularmente delfinidina, sobre la fosforilación de ERK 1/2 la cual tiene un rol en el control de glucosa a nivel intestinal. Para ello se utilizará como modelo de estudio la línea celular HT-29, la cual deriva de células de adenocarcinoma de colon humano.

28 17 Con estos antecedentes se plantea la siguiente hipótesis de trabajo: Delfinidina y Extracto de A. chilensis fosforilan ERK 1/2, proteína que tendría un rol en la disminución de glucosa extracelular en células HT-29 Objetivo general: Evaluar el efecto del extracto de maqui (Aristotelia chilensis) y delfinidina sobre la fosforilación de la proteína ERK 1/2, y la variación en la concentración de glucosa extracelular inducido por delfinidina, en células HT-29. Objetivos específicos: 1. Evaluar el efecto del extracto de maqui (Aristotelia chilensis) y delfinidina sobre la viabilidad celular por medio de la técnica de reducción de MTT y citometría de flujo. 2. Determinar el efecto del extracto de maqui (Aristotelia chilensis) y delfinidina en la fosforilación de ERK 1/2 a través de western blot y citometría de flujo en células HT Evaluar el efecto de delfinidina sobre la concentración de glucosa extracelular a través del método enzimático GOD/PAP en células HT Evaluar la participación de la proteína ERK 1/2 en la disminución de la concentración de glucosa extracelular inducido por delfinidina a través del método enzimático GOD/PAP.

29 18 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 MATERIALES Material biológico La línea celular HT-29 de adenocarcinoma colorectal humano se obtuvo de ATCC código HTB Reactivos químicos. De Cell Signalling (Beverly, MA, USA) se obtuvieron los siguientes anticuerpos: fosfo- Erk 1/2 y Control isotipo conejo. De Santa Cruz Biotechonology (Santa Cruz, CA, USA) se obtuvieron los siguientes anticuerpos: ERK 1 (C16), anti-conejo IgG-peroxidasa, anti-ratón IgG-peroxidasa. De Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: DMSO, Tween-20, MTT, Paraformaldehido, Rojo Ponceau S, albúmina de suero de bovino (BSA), β-actina, RNAsa De Molecular Probes (USA) se obtuvo: Ioduro de Propidio De Merck (Darmstadt, Germany) se obtuvieron los siguientes reactivos: Fluoruro de Sodio (NaF), Azul de Bromofenol, Metanol grado HPLC, D-glucosa. De Extrasynthese (Lyon, Francia) se obtuvo: Delfinidina. (>98%).

30 19 De Gibco Laboratories Life Technology, Inc. (Rockeville, MD, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: Tripsina-EDTA, penicilina, estreptomicina, medio de cultivo RPMI 1640 e Insulina. De AMRESCO (USA) se obtuvo: TEMED De Thermo Scientific (USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: Membranas de nitrocelulosa, ECL Western Blotting Substrate. De Invitrogen (Grand Island, NY, USA) se obtuvo: Anticuerpo Anti IgG de conejo conjugado a Alexa 488. De Calbiochem (La Jolla, CA, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: Inhibidor U0126, Betamercaptoetanol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), Ortovanadato de Sodio (NaVO 4 ) De Roche Diagnostic (Indianápolis, IN, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: leupeptin, pepstatin, aprotinin. De Winkler (Santiago, Chile) se obtuvieron los siguientes reactivos: Reactivo de Bradford, Metanol técnico, NaCl, EGTA, EDTA, Acrilamida-Bisacrilamida, Glicerol, Dimetilformamida De United Status Biological (Swampcott, MA, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: Tris, Glicina, SDS. De Hyclone (Logan, UT, USA) se obtuvo: Suero Bovino Fetal De Promega (USA) se obtuvo: Triton X-100.

31 20 De Jamarca M.R (Santiago, Chile) se obtuvieron los siguientes reactivos: Revelador y Fijador fotográfico De Advantec (Japón) se obtuvo: Papel Filtro De New England Biolabs (USA) se obtuvo: Estándar de peso molecular (7-175 kda) De Indena Spa (Italia) se obtuvo: Extracto de Maqui (35% antocianinas totales y un 25% de delfinidinas totales). De Wiener Lab (Argentina) se obtuvo: Kit de detección glucosa (GOD/PAP). Equipos. Los equipos utilizados fueron: Centrífuga Eppendorf 5702, Centrífuga Hettich Mikro 220, Agitador magnético Merck, sistema de electroforesis Mini Protean III y sistema de transferencia Mini Trans Blot de BioRad, Incubador CO 2 SANYO, Baño Termoregulado Memmert, Balanza analítica Scientech, Cámara de Neubauer, Microscopio de Epifluorescencia Olympus CKX41, Cámara de flujo laminar Esco, citómetro de flujo FACSCanto II (Becton Dickinson), VariosKan (Thermo Scientific), sonicador Misonix Microson XL.

32 MÉTODOS Cultivo de la línea celular de adenocarcinoma de colon humano HT-29 Se utilizó como modelo la línea celular HT-29 obtenida desde ATCC. Las células HT-29 fueron mantenidas en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina al 1% y a temperatura de 37 ºC en un ambiente de CO 2 al 5% Evaluación de la viabilidad celular a través del ensayo de reducción de MTT Muchos ensayos biológicos requieren medir la supervivencia y/o proliferación celular, esto puede lograrse por varios métodos, para esto se desarrolló un ensayo colorimétrico rápido, versátil y cuantitativo, basado en una sal de tetrazolio MTT, el cual mide sólo células vivientes y puede medirse espectrofotométricamente leyendo la absorbancia entre nm (Mosmann, 1993). Este método está basado en la capacidad de las enzimas mitocondriales de las células viables de transformar la sal de tetrazolio MTT en cristales de formazán. Se evaluó el efecto del extracto de maqui a concentraciones de: 0.5, 5, 50, 500 y 1000 µg/ml, y delfinidina 10, 50 y 100 µm, a tiempos de 2, 4, 8, 24 y 48 horas para ambos estímulos sobre la viabilidad celular. Para ello, se sembraron células en RPMI 1640 suplementadas con 10% de FBS y 1% penicilina/estreptomicina por pocillo en placas de 96, siendo éstas tratadas con los estímulos correspondientes. A

33 22 continuación, se preparó una solución de MTT a una concentración de 2 mg/ml, de la cual se incorporaron 10 µl en cada pocillo de la placa. Las células fueron incubadas a 37 C. Los cristales de formazán formados, se disolvieron por la adición de 100 µl de dimetilformamida al 50% con SDS al 20%. El color desarrollado se leyó a una longitud de onda de 570 nm utilizando el equipo VariosKan (Thermo Scientific). Para eliminar las posibles interferencias que pudieron presentarse debido a la coloración del extracto de maqui y delfinidina, se determinó la absorbancia de ambas a 570 nm, la cual fue restada de cada uno de los experimentos Determinación de apoptosis (método Sub-G1) Para determinar si delfinidina o el extracto de maqui inducen muerte por apoptosis, las células fueron tratadas con los estímulos correspondientes durante 2, 24 y 48 horas para delfinidina 50 μm y 24 y 48 horas para el extracto de maqui a concentraciones de 0.5, 5, 50, 500 y 1000 μg/ml. A continuación, las células fueron recolectadas y centrifugadas a 400 g por 5 minutos, resuspendidas en paraformaldehido al 4% y fijadas durante 10 minutos a 37 C. Posteriormente, se enfriaron en hielo por 1 minuto, centrifugadas a 400 g por 5 minutos y resuspendidas en metanol al 90% (en PBS). Posteriormente, las células fueron centrifugadas a 400 g por 5 minutos y permeabilizadas con etanol al 70% (en PBS) a 4 C por 1 hora como mínimo, se agregó RNAasa con concentración 0,5mg/ml por tubo a temperatura ambiente, luego de 30 minutos son marcadas con Ioduro de Propidio (10 mg/ml). La

34 23 población Sub-G1, correspondiente a células apoptóticas, se determinó a través de citometría de flujo utilizando el citómetro de flujo FACSCanto II (Becton Dickinson) Extracción de proteínas totales Las células HT-29 en cultivo fueron preincubadas en medio RPMI 1640 en ausencia de FBS durante 4 horas. A continuación, las células HT-29 se trataron con extracto de maqui 0.5, 5, 50, 500 y 1000 µg/ml durante 240 minutos o delfinidina 50 µm a tiempos de 5, 15, 30, 45, 90, 120 y 240 minutos. Después de los tratamientos, las células fueron lisadas en 100 µl de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mm ph 7,4, EDTA 50 mm, EGTA 1 mm, inhibidores de proteasas [leupeptin, aprotinin, pepstatin] 10 μg/ml, NaF 25 mm, NaVO 4 2 mm, PMSF 0,1 mm, DTT 25 mm y Tritón X-100 1,5%) y mantenidas en hielo por 30 minutos. Luego, los lisados se centrifugaron a g durante 20 minutos, a 4 ºC. Las proteínas totales se cuantificaron a través del método de Bradford y fueron utilizadas para realizar ensayos de western blot Separación electroforética de proteínas Las proteínas totales fueron separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% en el sistema Mini Protean III (BioRad, USA). El gel separador y espaciador se prepararon a partir de una solución de acrilamida:bisacrilamida al 30:0,8%. El gel separador se preparó a una concentración final de poliacrilamida de 3,8% conteniendo 1,5 M de Tris (ph 8,8); 0,4 % de SDS, 3% de persulfato de amonio 1X y 0.1% TEMED. Mientras tanto, el gel espaciador fue preparado a una concentración final de poliacrilamida de 3,8% conteniendo 0,5 M de Tris (ph 6,8); 0,4 % de SDS, 10%

35 24 persulfato de amonio y 0.1% TEMED. Las muestras se cargaron en el gel y la electroforesis se realizó a 80 V por 2 horas en tampón 25 mm Tris (ph 8,3), 190 mm glicina y 0,1 % SDS. Para realizar el análisis de western blot, los geles fueron electrotransferidos a membranas de nitrocelulosa Electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa Ya acabada la electroforesis, las muestras se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa (0,45 micrones de poro). Para esto, sobre una esponja embebida en tampón de transferencia (25 mm Tris [ph 8,3], 190 mm glicina, 0,1% SDS y 20% de metanol), se depositó secuencialmente: Una esponja,1 trozo de papel Whatman nº 1, 1 membrana de nitrocelulosa, el gel utilizado para transferir, 1 trozo de papel Whatman nº 1 y finalmente otra esponja. El sándwich fue llevado a una cámara de electrotransferencia la que contenía el tampón antes mencionado y se aplicó una intensidad de corriente de 200 ma por 2 horas Detección inmunológica (Western blot) Para el análisis de western blot, las membranas se incubaron con 10 ml de solución de bloqueo TBS-Tween 20 (TBS 1X: NaCl 140 mm, Tris 50 mm, 0.3% Tween) a temperatura ambiente por 1 hora. Después, las membranas fueron incubadas con 5 ml de solución de bloqueo conteniendo el anticuerpo contra p-erk 1/2 en una dilución de 1:2000, e incubadas toda la noche a 4 ºC bajo agitación constante. A la mañana siguiente, las membranas se lavaron tres veces en TBS-Tween-20 (0,3% Tween-20 en TBS 1X) a temperatura ambiente, durante 10 minutos. Las membranas fueron incubadas a temperatura ambiente por 2 horas con 5 ml de solución de bloqueo

36 25 conteniendo un anticuerpo secundario en una dilución de 1:2000. Finalmente, las membranas se lavaron tres veces con TBS-Tween-20 durante 10 minutos cada vez y reveladas utilizando un método de quimioluminiscencia (ECL). Para el control de carga, los anticuerpos fueron removidos desde la membrana con solución stripping (100 mm 2- mercaptoetanol, 2 % SDS, 62.5 mm Tris-HCl, ph 6.7). Las membranas se incubaron con un anticuerpo contra ERK 1/2 total, el cual fue detectado de la forma antes descrita. Finalmente, se realizó un análisis densitométrico de las señales obtenidas con cada anticuerpo utilizando el programa Image J 1.44 (NIH, USA) Determinación del efecto del inhibidor UO126 en células estimuladas con delfinidina. Para determinar la participación de la vía de señalización ERK 1/2 en la variación de la concentración de glucosa extracelular y la fosforilación de la proteína ERK 1/2 inducido por delfinidina, las células fueron tratadas con un inhibidor específico para esta vía, UO126, a una concentración final de 10µM (Yip-Schneider et al., 2009), 30 minutos antes de agregar delfinidina Determinación de la fosforilación de ERK1/2 por citometría de flujo Las células HT-29 en cultivo fueron tratadas con extracto de maqui a un tiempo de 240 minutos a concentraciones de: 0.5, 5, 50, 500 y 1000 µg/ml. Otras fueron estimuladas con delfinidina 50 µm a tiempos de: 5, 15, 30, 45, 90, 120 y 240 minutos. Luego, las células se colectaron por centrifugación a 400 g por 5 minutos,

37 26 resuspendidas en paraformaldehido al 4% y fijadas durante 10 minutos a 37 C. Posteriormente, las células se enfriaron en hielo por 1 minuto, centrifugadas a 400 g por 5 minutos y se agregó metanol al 90% (en PBS) para su permeabilización durante 30 minutos. A continuación, las células fueron lavadas 2 veces con PBS 1X (500 µl por vez) y resuspendidas en 100 µl del mismo. Las células se incubaron con el anticuerpo anti-p-erk1/2 durante 1 h a 4 C, posteriormente lavadas 2 veces con PBS 1X. Las células fueron resuspendidas en 300 µl de PBS 1X y marcadas con Alexa 488 durante 1h, en oscuridad y en hielo. Finalmente, las células se lavaron y resuspendieron en 400 µl de PBS 1X, y la intensidad de fluorescencia se detectó a través de citometría de flujo utilizando para ello el citómetro de flujo FACSCanto II (Becton Dickinson) Método enzimático de Glucosa Oxidasa/Peroxidasa (GOD/PAP) Para determinar las variaciones en la concentración de glucosa presente en el medio extracelular al estimular las células con Delfinidina 50µM, se utilizó el método enzimático de glucosa oxidasa/peroxidasa (GOD/PAP) a través de un kit de glicemia enzimática. Este método se fundamenta en la siguiente reacción: GOD Glucosa + O 2 + H 2 O ácido glucónico + H 2 O 2 POD 2 H 2 O AF + 4-hidroxibenzoato quinonimina roja Fundamentalmente, la reacción consiste en la oxidación de glucosa por la enzima glucosa oxidasa, con la liberación de peróxido de hidrógeno. Posteriormente reacciona con 4-hidroxibenzoato y 4amino fenazona en presencia de una peroxidasa, dando una quinonimina roja, siendo proporcional a la cantidad de glucosa presente en la muestra.

38 27 Se evaluó el efecto de delfinidina sobre la concentración de glucosa a través del método de GOD/PAP, utilizando un kit enzimático (Wiener Lab) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Para ello, las células HT-29 fueron tratadas con delfinidina 50 µm a tiempos de 2, 24 y 48 horas. Transcurrido el tiempo, se tomaron muestras de sobrenadante luego de realizado los tratamientos. Para determinar la concentración de glucosa, primero se cuantificaron los valores de absorbancia a 505 nm para cada tratamiento y posteriormente utilizando una curva de estándares de concentración conocida de D-glucosa se obtuvieron los valores para las concentraciones desconocidas. Cada experimento fue realizado en duplicado para así obtener valores más exactos Análisis estadístico. Los resultados fueron expresados como promedio ± error estándar de tres o más experimentos independientes. El análisis de los datos se efectuó utilizando el análisis de varianza (ANDEVA) y un test de comparación múltiples de Dunnet, utilizando un nivel de significancia del 5%. Todos los análisis fueron realizados con el software GraphPad Prism versión 5.00 para Windows, (San Diego California, USA).

39 28 4. RESULTADOS 4.1 Viabilidad celular de la línea HT-29 estimuladas con extracto de maqui y delfinidina A través del ensayo de MTT se analizó el efecto del extracto de maqui y delfinidina sobre la viabilidad celular en la línea HT-29. Las células permanecieron con medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina y los respectivos estímulos, procedimiento que se encuentra descrito en materiales y métodos. Se realizaron tratamientos con extracto de maqui a diferentes concentraciones: 0.5, 5, 50, 500 y 1000 µg/ml, y tiempos de 2, 4, 8, 24 y 48 horas, mostrándose los resultados obtenidos en la figura 4. Se observa un aumento estadísticamente significativo (p<0.001) en la absorbancia para las concentraciones 500 y 1000 µg/ml que corresponden a tratamientos realizados durante 2 y 4 horas. Mientras que a las 48 horas es posible observar una tendencia a la disminución de la absorbancia para las dos concentraciones más altas.

40 29 Figura 4. Efecto del extracto de maqui sobre la viabilidad celular. Las células HT-29 fueron estimuladas con extracto de maqui a diferentes concentraciones (0.5, 5, 50, 500, 1000 µg/ml) y tiempos (2, 4, 8, 24, 48 horas), en placas de 96 pocillos, midiéndose absorbancia a 570 nm. Las células control (C) son aquellas que permanecieron sin

41 30 estímulo durante todo el tiempo de los tratamientos. Cada gráfico corresponde a la concentración con su respectiva absorbancia. Gráficos de viabilidad celular a un tiempo de 2, 4, 8, 24 y 48 horas, los datos representan la media de 3 experimentos independientes ± e.e. (n=3). *** p< Para analizar el efecto de delfinidina sobre la viabilidad, las células fueron estimuladas con diferentes concentraciones de delfinidina (10, 50 y 100 µm) y tiempos (2, 4, 8, 24 y 48 horas). Los resultados obtenidos en estos experimentos se muestran en la figura 5, donde se puede abstraer que para los tiempos 2, 4 y 8 horas hay un aumento en la absorbancia, observándose cambios estadísticamente significativos (p<0.05, p<0.01, p<0.001). Mientras que a las 48 horas se observa una tendencia a la disminución de la absorbancia.

42 31 48 Horas Figura 5. Efecto de Delfinidina sobre la viabilidad celular. Las células HT-29 fueron estimuladas con delfinidina a diferentes concentraciones (10, 50 y 100 µm) y tiempos (2, 4, 8, 24, 48 horas), en placas de 96 pocillos, midiéndose absorbancia a 570 nm.

43 32 Cada gráfico corresponde a la concentración con su respectiva absorbancia. Las células control (C) corresponden a aquellas que permanecieron sin estímulo durante los diferentes tiempos de los experimentos. Gráficos de viabilidad celular a tiempo de 2, 4, 8, 24 y 48 horas, los datos representan la media de 3 experimentos independientes ± e.e. (n=3). * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.

44 Determinación de apoptosis en células HT-29 estimuladas con extracto de A. chilensis y delfinidina La apoptosis se midió por el método Sub-G1 que permite detectar apoptosis con un solo fluorocromo, Ioduro de Propidio, de acuerdo a lo descrito con detalle en materiales y métodos. Las células HT-29 fueron estimuladas con extracto de maqui a distintas concentraciones (0.5, 5, 50, 500 y 1000 µg/ml) a tiempos de 24 y 48 horas, los cuales fueron escogidos en base a los resultados mostrados en la figura 4, donde se aprecia una disminución en la absorbancia a las 48 horas. Además del extracto de maqui, se estudió el efecto de delfinidina sobre las células HT-29 a una concentración de 50 µm. Los tiempos de 2, 24 y 48 horas, fueron escogidos en relación a los resultados obtenidos en la figura 5, observándose que a las 2 horas hay un aumento en la absorbancia y a 48 horas hay una tendencia a las disminución de ésta, por lo que se medió apoptosis para determinar si esto se relaciona con la disminución de células viables.

45 34 Figura 6. Ensayo de apoptosis a células HT-29 estimuladas con extracto de maqui. Las células HT-29 fueron estimuladas con extracto de maqui a distintas

46 % Células en SubG1 35 concentraciones (0.5, 5, 50, 500 y 1000 µg/ml) a tiempos de 24 y 48 horas. Posteriormente se midió apoptosis a través de citometría de flujo, mediante marcaje con Ioduro de Propidio. Cada gráfico corresponde a la concentración del estímulo con el porcentaje de células en subg1. El control corresponde a células sin estímulo. Gráficos de la determinación de apoptosis a tiempos de 24 y 48 horas, los datos representan la media de 3 experimentos independientes ± e.e. (n=3). ** p<0.01 para 24 horas y la media de 4 experimentos independientes ± e.e. (n=4) para 48 horas. En la figura 7 se observa el efecto del tratamiento con delfinidina 50 µm a tiempos de 2, 24 y 48 horas, sobre el porcentaje de células subg Células tratadas con Delfinidina 50 µm 2 horas 24 horas 48 horas 5 0 C D C D C D Figura 7. Análisis de apoptosis en células HT-29 tratadas con delfinidina 50 µm a diferentes tiempos. Las células HT-29 se trataron con 50 µm de delfinidina (D) a tiempos de 2, 24 y 48 horas. Las células control (C) permanecieron sin estímulo durante el tiempo de los experimentos. Gráfico de la determinación de apoptosis a tiempos de 2, 24 y 48 horas a una concentración fija de 50 µm. Los datos representan la media de 3 experimentos independientes ± e.e. (n=3).

47 Efecto del Extracto de A. chilensis y Delfinidina en la fosforilación de ERK 1/2 en células HT-29. Se evaluó el efecto de A. chilensis y Delfinidina en la fosforilación de la proteína ERK 1/2, a través del método de western blot y citometría de flujo. Para esto, las células HT-29 permanecieron preincubadas 4 horas con RPMI 1640 en ausencia de FBS, luego se agregaron los estímulos correspondientes (extracto de maqui o delfinidina), a diferentes concentraciones y tiempos. Posteriormente se procedió a realizar western blot o citometría de flujo, previamente descritos en materiales y métodos. En la figura 8, se puede apreciar la citometría de flujo para la fosforilación de ERK 1/2, estimulándose las células HT-29 con extracto de maqui a diferentes concentraciones (0.5, 5, 50, 500, 1000 µg/ml) a un tiempo de 240 minutos. El control (C) corresponde a células sin estímulo durante 240 minutos. El western blot realizado con los mismos estímulos no resultó ser concluyente, por lo que se presenta en el Anexo 1.

48 p-erk 1/2 Alexa C 0, Extracto de Maqui Concentración ( g/ml) Figura 8. Determinación de la fosforilación de ERK 1/2 por medio de citometría de flujo en células HT-29 estimuladas con extracto de maqui. Las células HT-29 fueron estimuladas con extracto de maqui a diferentes concentraciones 0.5, 5, 50, 500, 1000 µg/ml a un tiempo fijo de 240 minutos. Se presenta el gráfico de barras correspondiente a las distintas concentraciones, y un histograma de intensidad de fluorescencia derivada de la citometría de flujo representativa para el control y la concentración de 50 µg/ml. Los datos representan la media de 4 experimentos independientes ± e.e. (n=4).

49 p-erk1/2/erk 1 38 En la figura 9 se muestra la cinética de fosforilación de ERK 1/2 a concentración de extracto de maqui de 50 µg/ml y diferentes tiempos: 30, 60 y 90 minutos. Las células control permanecieron sin estímulo, solo con RPMI 1640 durante 90 minutos, para el control de carga se utilizó ERK 1. También se realizaron tratamientos con concentraciones menores de extracto de maqui a estos tiempos, resultados que son mostrados en el Anexo 2. p-erk 1/2 ERK C minutos * ** * C Tiempo (min) Figura 9. Cinética de fosforilación de ERK 1/2 en células HT-29 estimuladas con 50 µg/ml de extracto de maqui. Las células fueron estimuladas extracto de maqui a tiempos de 30, 60 y 90 minutos. Las células control corresponden a células sin estímulo durante 90 minutos. Se presenta el gráfico de la cinética de fosforilación de ERK 1/2 a concentración fija con su respectivo western blot representativo. Cada gráfico de barras corresponde a la razón, a partir del análisis densitométrico, de la señal de p-erk 1/2 / ERK 1. Los datos representan la media de 4 experimentos independientes ± e.e. (n=4) para cada gráfico. * p<0.05, ** p<0.01.

50 39 La figura 10 corresponde a una cinética de fosforilación de ERK 1/2 en presencia de delfinidina 50 µm. Las células fueron estimuladas a tiempos: 5, 15, 30, 45, 90, 120 y 240 minutos, como control se utilizaron células sin estímulo, conteniendo el vehículo de éste (0.05% de DMSO) durante 240 minutos. Como control positivo, las células fueron estimuladas con insulina a una concentración de 150 nm durante 30 minutos (Babia et al., 1989). Se observaron cambios estadísticamente significativos (p<0.001) para insulina y los tiempos 5 y 120 minutos. Para la citometría de flujo realizada a las células tratadas con la misma concentración e iguales tiempos que el western blot, los resultados no fueron concluyentes pues no muestran grandes diferencias en la fosforilación, viéndose un gráfico relativamente parejo (Anexo 3).

51 p-erk1/2/ -Actina 40 p-erk 1/2 β-actina C Ins *** *** 1.0 *** C Ins Delfinidina 50 M Tiempo (min) Figura 10. Cinética de fosforilación de ERK 1/2 en presencia de Delfinidina 50 µm. Las células HT-29 fueron estimuladas con delfinidina 50 µm, a diferentes tiempos (5, 15, 30, 45, 90, 120, 240 minutos). Por su parte, las células control permanecieron con 0.05% de DMSO durante 240 minutos. El control positivo corresponde a células HT-29 estimuladas sólo con insulina 150 nm durante 30 minutos. Se presenta el gráfico de la cinética de fosforilación de ERK 1/2 a concentración fija con su respectivo western blot representativo. Cada gráfico de barras corresponde a la razón, a partir del análisis densitométrico, de la señal de p-erk1/2 / β-actina. Los datos representan la media de 4 experimentos independientes ± e.e. (n=4), *** p<0.001.

52 p-erk1/2/erk 1 41 En la figura 11, se muestra la fosforilación de ERK 1/2 a 120 minutos utilizando diferentes concentraciones de delfinidina como estímulo (10, 50 y 100 µm), en este caso las células control (C) son aquellas que contienen el vehículo del estímulo (0.05% de DMSO) durante 120 minutos y como control de carga se utilizó ERK 1. Se observaron cambios estadísticamente significativos (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001) para las concentraciones 10, 50 y 100 µm, respectivamente *** p-erk 1/ * ** ERK C Concentración (um) C µm Figura 11. Análisis de western blot para la fosforilación de ERK 1/2 en células HT- 29 estimuladas con delfinidina a tiempo fijo. Las células HT-29 fueron estimuladas con Delfinidina a diferentes concentraciones (10, 50, 100 µm) a un tiempo de 120 minutos. Por su parte, las células control se mantuvieron con el vehículo del estímulo 0.05% de DMSO durante 120 minutos. Se presenta el gráfico de la cinética de fosforilación de ERK 1/2 a 120 minutos con su respectivo western blot representativo. Cada gráfico de barras corresponde a la razón, a partir del análisis densitométrico, de la señal de p-erk1/2/erk1. Los datos representan la media de 4 experimentos independientes ± e.e. (n=4). * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.

53 Efecto de Delfinidina en la vía MAPK ERK 1/2 en células HT-29. Para determinar si delfinidina era capaz de fosforilar a ERK 1/2 al inhibir la vía MAPK ERK 1/2, se utilizaron las técnicas de western blot y citometría de flujo. Se analizó la fosforilación de la vía ERK 1/2 en presencia de delfinidina 50 µm y el inhibidor UO126. Para esto, las células permanecieron 4 horas en medio RPMI 1640 en ausencia de FBS, y posteriormente se realizaron los procedimientos correspondientes a cada experimento, detallados en materiales y métodos. Se estudió sólo el efecto de delfinidina y no del extracto de maqui ya que esta molécula es la principal antocianidina presente en el extracto de maqui que se utilizó en los experimentos anteriores y es de especial interés por su posible propiedad antidiabética y que resultaría eficaz como un nuevo fármaco para el control de la glicemia. El inhibidor fue preincubado durante 30 minutos y posteriormente se agregó el estímulo, en este caso delfinidina 50 µm durante un tiempo de 2 horas, el cual fue escogido por ser el tiempo en el cual se vio mayor fosforilación en la cinética realizada anteriormente (Figura 10). En la figura 12, se puede apreciar un aumento estadísticamente significativo (p<0.05) en la fosforilación de ERK 1/2 en las células HT-29 estimuladas con Delfinidina 50 µm. Mientras que las células con inhibidor más delfinidina presentan una baja fosforilación con respecto al control, así como también las células sólo con inhibidor, los cuales resultaron ser cambios no significativos.

54 43 En la figura 13, se aprecian resultados preliminares obtenidos para la citometría de flujo, dando valores relativamente similares, con una tendencia al desplazamiento de la señal para las células tratadas con delfinidina más inhibidor. p-erk 1/2 ERK 1 DMSO Delfinidina (50µM) UO126 (10 µm) Figura 12. Efecto de delfinidina en la vía de señalización MAPK ERK 1/2, en presencia del inhibidor UO126. Las células HT-29 fueron tratadas con inhibidor (10µM) durante 30 minutos y posteriormente estimuladas con delfinidina 50 μm durante 2 horas. Las células control corresponden a las que contienen 0.05% de DMSO, permaneciendo con este vehículo durante 2 horas. Para el control de carga se utilizó ERK 1. Se presenta el gráfico de la cinética de fosforilación de ERK 1/2 con su

55 p-erk 1/2 Alexa respectivo western blot representativo. Cada gráfico de barras corresponde a la razón, a partir del análisis densitométrico, de la señal de p-erk1/2 / Erk1. Los datos representan la media de 3 experimentos independientes ± e.e. (n=3). * p< DMSO Delfinidina (50µM) UO126 (10 µm)

56 45 Figura 13. Análisis del efecto de delfinidina en la vía de señalización MAPK ERK 1/2, en presencia del inhibidor UO126, a través de citometría de flujo. Las células HT-29 fueron preincubadas con inhibidor (10 µm) durante 30 minutos y posteriormente estimuladas con delfinidina 50 μm durante 2 horas. Las células control corresponden a las que se les agregó 0.05% de DMSO, las cuales permanecieron con este vehículo durante 2 horas. Se presenta el gráfico de barras correspondiente a los diferentes estímulos, y un histograma de intensidad de fluorescencia derivada de la citometría de flujo representativa para cada tratamiento. Cada gráfico de barras corresponde a la intensidad relativa de la señal. Los datos representan la media de 2 experimentos independientes ± e.e. (n=2). 4.5 Determinación de la concentración de glucosa en células HT-29 estimuladas con Delfinidina Para determinar la concentración de glucosa extracelular, se utilizó la curva de estándares conocidos de D-glucosa (Blanco, 125, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 4000mg/L). Cabe destacar que el medio RPMI 1640 utilizado para el medio de cultivo de las células HT-29 tiene una concentración de D-glucosa de 2000mg/L, por esto mismo la curva de estándares incluye este valor para así establecer de una forma más precisa los valores para cada tratamiento, además se midió la absorbancia del medio RPMI 1640 sin suplementar con FBS que es utilizado en el medio de cultivo celular. Las células HT-29 mantenidas en medio RPMI 1640 suplementadas con 10% de FBS fueron estimuladas con Delfinidina 50 µm a tiempos de 2, 24 y 48 horas.

57 D-glucosa (mg/l) 46 En la figura 14, se aprecia una tendencia a la disminución en la concentración de D-glucosa del sobrenadante, mostrando que a las 24 y 48 horas posiblemente se ha captado o consumido toda la glucosa presente en el medio, ya que la concentración de glucosa en el medio es muy baja RPMI * Tiempo (horas) DMSO Delfinidina (50 µm) Figura 14. Cinética de variación en la concentración de glucosa extracelular en células HT-29 estimuladas con Delfinidina 50 µm. A tiempo 0 se tomaron muestras de sobrenadante sin haber realizado tratamiento y otra muestra de sobrenadante a este mismo tiempo conteniendo el vehículo del estímulo correspondiente a 0.05% de DMSO. Para los tiempos 2, 24 y 48 horas se tomaron muestras distintas de sobrenadante, una conteniendo el vehículo del estímulo, 0.05% de DMSO, y otras estimuladas con Delfinidina 50µM. Las barras representan el promedio de 4 experimentos independientes ± e.e. * p<0.05

58 Determinación de la participación de la vía MAPK ERK 1/2 en la disminución de la concentración de glucosa extracelular en células HT-29 estimuladas con Delfinidina. Para determinar la participación de la vía MAPK ERK 1/2 en la variación de la concentración de glucosa extracelular al ser las células estimuladas con delfinidina 50 µm, se utilizó el método de glucosa oxidasa/peroxidasa (GOD/PAP) descrita con detalle en materiales y métodos. Se realizaron los tratamientos a un tiempo de 2 horas, escogido por ser el tiempo en el cual la concentración de D-glucosa es mayor, por lo tanto la célula puede continuar consumiendo desde el medio de cultivo (figura 14). Se utilizó el inhibidor UO126, preincubado durante 30 minutos y estimulado durante 2 horas. Además de determinar la concentración de D-glucosa presente en el medio, se analizaron las células, las cuales fueron lisadas en 100 µl de tampón de lisis y posteriormente sonicadas. Finalmente, se realizó la determinación de la concentración de D-glucosa con el mismo procedimiento de los sobrenadantes. Se puede apreciar en la figura 15, que delfinidina aumenta la concentración de glucosa extracelular luego de 2 horas de tratamiento, mientras que los tratamientos realizados sólo con inhibidor, y delfinidina más UO126 presentan una tendencia al aumento en la concentración de glucosa extracelular, sin existir gran diferencia entre los dos tratamientos.

59 D-glucosa (mg/l) 48 Concentración de glucosa en sobrenadante * Tiempo 0 Tiempo 2 horas DMSO Delfinidina UO Concentración de glucosa en células sonicadas DMSO Delfinidina UO Figura 15. Efecto de delfinidina en la concentración de glucosa extracelular, en presencia del inhibidor UO126. Las células HT-29 fueron tratadas con inhibidor y/o delfinidina, graficándose tanto los sobrenadantes recolectados así como las células que

60 49 posteriormente fueron sonicadas. En primer lugar se aprecia el gráfico de los sobrenadantes recolectados a tiempo 0 y 2 horas. Posteriormente el gráfico de células lisadas y posteriormente sonicadas. Las barras representan el promedio de 4 experimentos independientes ± e.e. * p<0.05

61 50 5. DISCUSIÓN En los últimos años, se ha incrementando el interés por compuestos bioactivos presentes en vegetales, lo que ha promovido el desarrollo de investigaciones en este campo. Los nutracéuticos conforman un grupo heterogéneo de alimentos, que además de cumplir con su rol nutricional, revelan efectos beneficiosos para la salud humana. Entre estos alimentos destaca el maqui, cuyos frutos han demostrado poseer una importante variedad de efectos biológicos: analgésicos, antiinflamatorios, antidiabéticos y antioxidantes (Alonso, 2012). En este trabajo se utilizó como modelo de estudio la línea celular HT-29, células de adenocarcinoma colorectal de colon humano, por ser un modelo de células intestinal utilizado para estudiar absorción de glucosa. En una primera etapa se evaluó el efecto de delfinidina y el extracto de maqui sobre la viabilidad celular y apoptosis, para determinar la toxicidad de estos compuestos sobre las células. El extracto de maqui produjo un aumento significativo de la absorbancia, lo que nos indica mayor cantidad de células viables, a los tiempos de 2 y 4 horas y de la población SubG1 a la concentración de 1000 µg/ml para las 24 horas de tratamiento. En cuanto a delfinidina, ésta produjo un aumento significativo de la absorbancia a 2, 4 y 8 horas de tratamiento, y a las 48 horas se observó una tendencia a la disminución, mientras que en la población SubG1 no se observaron cambios significativos.

62 51 Varios estudios relacionados a apoptosis en células HT-29 sometidas a tratamientos con antocianinas han mostrado que dietas ricas con estos compuestos pueden asociarse con la disminución del riesgo de muchas enfermedades crónicas incluidas el cáncer. Los efectos antiproliferativos más importantes se vieron al estimular células HT-29 con antocianinas (delfinidina 3-O-β-glucopiranósido (Dp-Glc), cianidina 3- O- β-galactopiranósido (Cy-Gal), cianidina 3-O-β-glucopiranósido (Cy- Glc), petunidina 3-O-β-glucopiranósido (Pt-Glc), peonidina 3-O-β- galactopiranósido (Pn-Gal), peonidina 3-O-β-glucopiranósido (Pn-Glc), malvidina 3-O-β-glucopiranósido (Mv-Glc), y peonidina 3-O-α-arabinopiranósido (Pn-Ara) viéndose que el crecimiento celular fue inhibido significativamente en más de un 50% para concentraciones de antocianinas entre µg/ml (Yi et al., 2005). En este mismo estudio se demostró que las antocianinas incrementan entre 2-7 veces la fragmentación del DNA, indicando inducción de apoptosis. Antocianinas (delfinidina y malvidina) inhiben crecimiento de células HT-29 a concentraciones de 25 a 100 µm (Marko et al., 2004). A nivel intestinal existe una regulación de glucosa, que involucra a dos importantes transportadores, SGLT1 y GLUT-2. Los enterocitos de la membrana de ribete en cepillo (BBM) son el sitio primario de la absorción de los azúcares de la dieta. (Ducroc et al., 2005). SGLT-1 es parte funcional del sistema periférico que censa glucosa exógena para mantener la homeostasis energética (Inigo et al., 2007). La glucosa es transportada a través de la membrana de borde en cepillo por medio del cotransportador de Na + /glucosa SGLT-1, mientras que la difusión facilitada está mediada por GLUT2 que proporciona la salida de glucosa desde los enterocitos a través de la membrana basolateral en el espacio extracelular (Gruzdkov et al., 2012). En un modelo

63 52 clásico, GLUT-2 tiene una localización exclusivamente basolateral, sin embargo, fue localizado por primera vez en la membrana apical en un modelo de rata diabética (Kellett et al., 2005). De acuerdo a recientes evidencias, el transportador GLUT-2 puede ser transitoriamente ubicado en la membrana apical de los enterocitos y así junto con SGLT-1 participar en el transporte de glucosa a través de esta membrana (Gruzdkov et al., 2012). La captación de GLUT-2 a la membrana de borde en cepillo es activada por el transporte de glucosa a través de SGLT-1 e implica también la vía de señalización MAPK (Kellet, 2001). Se evaluó el efecto del extracto de maqui y delfinidina en la fosforilación de ERK 1/2. Se determinó por medio de western blot que a la concentración de 50 µg/ml del extracto de maqui a un tiempo fijo de 240 minutos produce fosforilación de ERK 1/2. Por citometría de flujo se demostró que a esta concentración hubo fosforilación debido al desplazamiento de la señal, las otras concentraciones estudiadas mostraron fosforilación de la proteína sin ser significativos. A tiempos menores de 240 minutos se observó fosforilación por medio de western blot, a 30, 60 y 90 minutos, estimulando las células con extracto de maqui 0.5, 5 y 50 µg/ml. Dentro de esta misma línea, un estudio realizado con un concentrado del fruto de A. chilensis a una concentración de 50 ng/ml en células Caco-2, se observó un incremento en la fosforilación de ERK 1/2 para tratamientos realizados por 2 y 4 horas, viéndose un máximo efecto a las 4 horas (Ojeda et al., 2011). Por otra parte, al realizar una cinética de fosforilación con delfinidina 50 µm, se observó mayor intensidad de bandas en western blot para los tiempos 5 y 120 minutos.

64 53 Se escogió como mayor tiempo de fosforilación 120 minutos, y se analizaron distintas concentraciones de delfinidina (10, 50 y 100 µm) a este tiempo, viéndose que a 100 µm hay mayor intensidad de fosforilación. En relación a esto, existen estudios que señalan fosforilación de ERK 1/2 en células HT-29 estimuladas con Malvidina, una antocianidina presente en el vino tinto, por medio de western blot mostró una disminución significativa de ERK 1 y ERK 2 fosforilados para una concentración de hasta 5 µm de Malvidina después de 45 minutos de tratamiento. Sin embargo, un incremento en la concentración del compuesto (25, 50 y 100 µm) conduce a un aumento en la fosforilación (Fritz et al., 2006). La transducción de señales vía MAPK ERK 1/2 están involucradas en una multitud de vías y funciones celulares, en respuesta a una variedad de ligandos y estímulos celulares. El inapropiado funcionamiento de MAPKs han sido asociadas a cáncer hasta incluso algunas enfermedades inflamatorias, obesidad y diabetes (Lawrence et al., 2008). Recientes estudios en células Caco-2 y HT-29 sugieren que alteraciones en MAPKs (inhibición de ERK y estimulación de JNK) contribuyen a las vías de diferenciación y apoptosis en células intestinales. Las ERKs son activadas por MEK y se piensa que regulan crecimiento celular (Ding et al., 2001). Para determinar la activación de la vía MAPK ERK 1/2, se utilizó el inhibidor UO126 el cual es selectivo para MEK1 y MEK2, las cuales fosforilan ERK 1 y ERK2 (Favata et al., Xu et al., 1997). Se observó que delfinidina 50 µm no fosforila a ERK 1/2 estando las células en presencia del inhibidor, ya que al realizar los ensayos de western blot y citomería de flujo, es posible observar una tendencia a la fosforilación

65 54 pero resulta ser un cambio no significativo, delfinidina por sí sola produce fosforilación de ERK 1/2 por lo tanto, esta antocianidina estaría activando la vía de señalización de ERK 1/2. Con los antecedentes bibliográficos sobre la regulación intestinal de glucosa, se estudió el efecto de delfinidina en la concentración de glucosa extracelular, determinándose si la vía MAPK ERK 1/2 estaría participando en el aumento o disminución de la concentración de glucosa. Al estimular las células HT-29 con delfinidina 50 µm se observa una tendencia a la disminución de la concentración de glucosa extracelular a tiempos de 2, 24 y 48 horas, pero se observa que a los 2 últimos tiempos prácticamente no hay presencia de glucosa en el medio extracelular, lo que nos dice que posiblemente las células habrían captado o consumido toda la glucosa disponible en el medio de cultivo. A las 2 horas la concentración de glucosa en el medio extracelular aún es relativamente alta, por lo tanto a este tiempo se estudió el efecto del inhibidor en la concentración de glucosa extracelular, determinándose que las células al ser estimuladas sólo con delfinidina 50 µm produce un aumento en la concentración de glucosa extracelular y al estimular las células con delfinidina e inhibidor se aprecia una tendencia al aumento. En este trabajo hemos evaluado si Delfinidina, principal antocianidina presente en un extracto de maqui estandarizado, era capaz de disminuir la concentración de glucosa extracelular a través de la activación de ERK 1/2 en células HT-29. Con los datos presentados en este estudio, las células sometidas a tratamiento con delfinidina 50 µm aumentan la concentración de glucosa extracelular, y no estaría participando la

66 55 vía MAPK ERK 1/2 en este proceso, debido a que no se aprecia un aumento significativo en la concentración de glucosa en el medio de cultivo por delfinidina cuando esta vía es inhibida, resultando en valores similares a los obtenidos para las células estimuladas sólo con delfinidina. Se ha demostrado que delfinidina pura inhibe el transporte de glucosa (SGLT-1) en la mucosa de yeyuno de ratón (Jara et al., 2012). Por lo tanto, delfinidina tendría un efecto directo sobre las células epiteliales intestinales lo cual podría contribuir al mantenimiento del balance de glucosa.

67 p-erk1/2/ -Actina 56 Anexo 1. p- ERK 1/2 β-actina C 0, (µg/ml) C 0, Extracto de Maqui Concentración ( g/ml) Análisis de western blot para la fosforilación de ERK 1/2 en presencia de extracto de maqui. Las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de extracto de maqui: 0.5, 5, 50, 500, 1000 µg/ml a un tiempo de 240 minutos. Mientras tanto, las células control fueron mantenidas con RPMI 1640 en ausencia de FBS durante el tiempo que se realizaron los tratamientos (240 minutos). Se presenta el gráfico de la cinética de fosforilación de ERK 1/2 a 240 minutos con su respectivo western blot representativo. Cada gráfico de barras corresponde a la razón, a partir del análisis densitométrico, de la señal de p-erk1/2 / β-actina. Los datos representan la media de 3 experimentos independientes ± e.e. (n=3).

68 57 Anexo 2. Cinética de fosforilación para tratamientos con Extracto de maqui 0.5 µg/ml y 5 µg/ml. Las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de extracto de maqui a tiempos de 30, 60 y 90 minutos. Mientras tanto, las células control fueron mantenidas con RPMI 1640 en ausencia de FBS durante el tiempo que se realizaron los tratamientos (90 minutos). Se presenta el gráfico de la cinética de fosforilación de ERK 1/2 a 240 minutos con su respectivo western blot representativo. Cada gráfico de barras corresponde a la razón, a partir del análisis densitométrico, de la señal de p-erk1/2 / ERK 1. Los datos representan la media de 4 experimentos independientes ± e.e. (n=4). * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.

69 p-erk 1/2 Alexa Anexo C Ins Tiempo (min) Determinación de la fosforilación de ERK 1/2 por medio de citometría de flujo en células HT-29 estimuladas con delfinidina. Las células HT-29 fueron estimuladas con delfinidina 50µM a diferentes tiempos (5, 15, 30, 45, 90, 120, 240 minutos). Las células control se mantuvieron con el vehículo del estímulo, 0.05% de DMSO durante 240