LA CLONACION EN MAMIFEROS Y SUS PERSPECTIVAS PARA LA SALUD HUMANA
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- Nieves Gómez Méndez
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1 BIOLOGIA DEL DESARROLLO LA CLONACION EN MAMIFEROS Y SUS PERSPECTIVAS PARA LA SALUD HUMANA El conocimiento derivado de la experimentación científica no siempre es difundido entre la sociedad de la mejor manera en cuanto a su disponibilidad para todas las personas que puedan ser beneficiadas o afectadas, y especialmente entre aquellas que deben tomar decisiones privadas o publicas con relación a dicho conocimiento. Como un perfecto ejemplo de tal limitación se encuentra la clonación, un adelanto que tan solo con su mención despierta toda clase de ideas absurdas en las personas comunes, todo esto debido a que la gente no comprende claramente en que consiste y las posibilidades que esta técnica puede traer. Qué es la clonación? El término clon es empleado en muchos contextos dentro de la investigación biológica, pero en su sentido más simple y estricto hace referencia a la copia genética precisa de una molécula, célula, planta, animal o ser humano. Las copias idénticas de organismos completos son comunes en el campo de la agricultura donde no se denominan clones sino variedades y la facilidad que existe para regenerar una planta completa a partir de una pequeña muestra de tejido es un ejemplo de que este concepto de clon no es extraño (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003) En los vertebrados también se dan de manera natural los clones aunque en una manera más limitada; los gemelos surgen a partir de la separación de un embrión temprano resultando individuos genéticamente idénticos derivados de un mismo cigoto (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003) De manera artificial la clonación de animales puede ser dividida en separación de blastómeros y transferencia nuclear de células somáticas, la primera involucra la división del embrión en desarrollo poco después de la fertilización cuando está compuesto de dos a ocho blastómeros, cada uno de los cuales es totipotente y por lo tanto capaz de originar un nuevo organismo. La otra aproximación consiste en el aislamiento de núcleos de células somáticas y su posterior implantación en un oocito anucleado (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003) Procedimientos a seguir en la clonación Por lo general, el primer paso del proceso de clonación involucra la colecta de células somáticas del animal a ser clonado, por ejemplo en reses se emplean células de fibroblastos, ováricas, mamarias, musculares, de oviducto y uterinas; luego de la colecta estas se pueden emplear inmediatamente o después de un cultivo a largo plazo. El uso de células en quiescencia puede mejorar la habilidad de los embriones clonados para implantarse debidamente (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003, Nagy et al 1993, Wang & Zhou 2003, Xuemei et al 2003) El siguiente paso requiere la remoción del DNA materno del oocito que se encuentra en metafase II por medio de microherramientas aproximadamente 18 horas después de la siembra en medio de maduración, el cual puede contener citocalasina B como inhibidor microtubular para prevenir la lisis. Esto induce el relajamiento del citoplasma permitiendo la remoción mecánica de 10 15% del citoplasma que contiene el DNA materno, lo cual posteriormente es confirmado con la tinción de Hoechst y transiluminación ultravioleta (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003, Nagy et al 1993, Wang & Zhou 2003, Xuemei et al 2003) El próximo paso es la inserción del núcleo somático en el citoplasma del oocito para construir el equivalente a un embrión unicelular. En la mayoría de las especies de granja esto se logra por medio de la fusión inducida eléctricamente, luego de la implantación perivitelina con microherramientas, alineando la célula somática y el 1
2 huevo entre dos electrodos. La efectividad de la electrofusión depende del contacto permanente de las membranas de ambas células luego de la formación de poros debido a la corriente eléctrica; en algunos casos este procedimiento es suficiente para iniciar el desarrollo. En cuestión de minutos de la introducción del núcleo en el oocito se rompe la membrana nuclear y la cromatina se condesa (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003, Nagy et al 1993, Wang & Zhou 2003, Xuemei et al 2003) Sin importar el método empleado, el reto mas grande de los protocolos es la simulación de la acción del espermatozoide luego de la fertilización; para ello los embriones pueden ser transferidos a oviductos ligados de hembras receptoras o cultivados en una incubadora por el tiempo necesario para que se forme una mórula. El desarrollo de los embriones clonados es dependiente de la implantación en hembras receptoras, por ejemplo, en reses aproximadamente la mitad de los embriones individuales transferidos resultarán en un embarazo luego de 21 días confirmado por latidos cardiacos, aunque pocos completaran su desarrollo a termino (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003, Nagy et al 1993, Wang & Zhou 2003, Xuemei et al 2003) Clonación terapéutica y clonación reproductiva La clonación terapéutica consiste en tomar un óvulo al que se le extrae el núcleo y se reemplaza por el de otra célula somática tomada de la piel de una persona que padezca, por ejemplo, problemas cardíacos. Una vez ambas partes se fusionan, empieza a formarse un embrión con la información genética del enfermo del corazón. Al cabo de cinco o seis días se abre para extraer sus células pluripotentes que son la materia prima para generar cualquier tejido La clonación reproductiva es la que más polémica genera, pues el embrión logrado no se disecciona sino que se implanta en un útero donde debe continuar con su desarrollo hasta convertirse en un individuo ya formado. 2
3 Figura 1. Clonación terapéutica. 3
4 Figura 2. Clonación reproductiva. Para ambos tipos de clonación el óvulo reconstruido generado por medio de trasplantación nuclear es estimulado para que empiece a dividirse; si esto es exitoso numerosas divisiones celulares secuenciales pueden dar lugar a un embrión de preimplantación conocido como blastocisto que está compuesto por 64 a 200 células. En esta etapa los procedimientos empleados para la clonación reproductiva y para la trasplantación nuclear para producir células madre se diferencian completamente. En la clonación reproductiva un blastocisto formado por trasplantación nuclear es implantado en un útero donde comienza la formación del feto. Cualquier animal producido de esta manera tendrá los mismos genes nucleares que las células adultas usadas para producirlo y cuando el núcleo de varias células somáticas de un único animal son transferidas a una serie de óvulos, todos los animales que nacen serán los clones (Charo 2001) Aunque estos clones serán físicamente muy similares, los animales no serán físicamente ni comportamentalmente idénticos debido a varios factores que incluyen sus diferentes ambientes uterinos y postnatales. En la trasplantación nuclear para producir células madre las células son aisladas de un blastocisto de 4 a 6 días luego del procedimiento y las células son empleadas para producir una línea de células madre para más estudios y aplicaciones clínicas. Ni el blastocisto ni las células madre son implantadas en un útero 4
5 (Charo 2001) Historia de la clonación En 1997 cuando Wilmut y sus colegas anunciaron el nacimiento del primer clon de un animal adulto se demostró que la clonación por transferencia nuclear era posible en contra de todas las predicciones anteriores, de manera que ahora se han reportado experimentos exitosos en vacas, ratones, cerdos, cabras, gatos y conejos. Sin embargo, el primer éxito se logro con anfibios reportado solo hasta 1952, treinta y un años después se anunció la clonación del primer clon de ratón. Es importante tener en cuenta que estos éxitos anteriores a Dolly involucraban la utilización de células pluri o totipotentes derivadas de embriones (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003, Wang & Zhou 2003, Xuemei et al 2003) La complejidad y poco conocimiento que se tiene acerca de la reprogramación del núcleo somático por parte del ooplasma se refleja en la ineficiencia generalizada de los intentos por producir crías vivas, como Dolly que resulto de 277 intentos o sea una eficiencia del 0.03%. (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003, Nagy et al 1993, Wang & Zhou 2003, Xuemei et al 2003) 1996 Cinco ovejas nacieron a partir de células de la masa celular interna como donadores de núcleo Investigadores del Instituto Roslin de Escocia anunacian la clonación de la oveja Dolly la cual se originó por transferencia nuclear somática a partir de células de glándulas mamarias y oocitos no fertilizados. La ratona Cumulina fue creada usando células de cúmulo utilizando transferencuia nuclear somática; cinco terneros transgénicos nacieron a partir de transferencia nuclear de fibloblastos transformados; ocho terneron clonados nacieron a partir de un único donador. Las primeras cabras clonadas; se encontró un acortamiento significativo de los telómeros en ovejas clonadas comparadas con sus homólogos naturales; el DNA mitocondrial encontrado en ovejas clonadas provenía del oocito; una variedad de anormalidades se notaron en las crías resultantes de la transferencia nuclear. Se publicaron los primeros reportes exitosos de transferencia nuclear somática en cerdos; experimentos en ratones mostraron que los clones tenían gran variación en la expresión de diversos genes; el DNA mitocondrial encontrado en reces clonadas mostró proporciones iguales entre donador y receptor; las longitudes de los telómeros en reces clonadas estaban restaurados luego de la tansferencia nuclear somática. Se crearon corderos con deleciones genéticas programadas utilizando la transferencia nuclear; se crearon los cerdos transgénicos clonados; trabajos con embriones bovinos demostraron variaciones significativas en el grado de metilación entre blastocistos clonados lo cual podría indicar una reprogramación epigenética incompleta. En Febrero los científicos de la Universidad de A and M de Texas anuncian la clonación de un gato al que llaman Copia al Carbón; en Abril el Presidente Bush pide prohibir todas las formas de clonación humana en su país; en Diciembre la Secta de los Raelianos dice haber clonado una niña aunque el mundo científico es escéptico ante la noticia. En Enero los Raelianos de Holanda informan del nacimiento de un segundo bebé clonado np confirmado científicamente; en Febrero Dolly es sacrificada debido a una grave enfermedad pulmonar; en Abril científicos norteamericanos anuncian el nacimiento de dos ejemplares de Banteng, clonados de células de un macho que había muerto en 1980; en Agosto un grupo de científicos Italianos comunican el nacimiento de la yegua Prometea cuyo embrión se obtuvo a partir de células extraídas de su propia madre; en Agosto biólogos Chinos crean embriones híbridos de humnano y conejo pàra obtener células madre; en Noviembre la ONU pospuso por dos años cualquier decisión sobre una futura convención internacional que prohiba la clonación humana con fines reproductivos; en Diciembre la firma Advance Cell Technology dice haber cultivado un embrión humano hasta la fase de 16 células. 5
6 2004 En Enero un polémico experto en técnicas de fertilidad Panos Zavos asegura en Londres haber implantado dos semanas antes un embrión humano clonado en el útero de una mujer de 35 años; en Febrero científicos Coreanos encabezados por Moon Shin Young anuncian la clonación de 30 embriones humanos. Tabla 1. Historia sobre la clonación somática en animales. Situación actual, retos y aplicaciones futuras de la clonación A pesar de todos los adelantos y promesas que tiene la clonación animal, hay que recordar que la eficiencia de estos procedimientos tanto en implantación como en el desarrollo del animal clonado son poco alentadoras. En cuanto esto, factores relacionados con los protocolos seguidos pueden causar la baja eficiencia del proceso. Primero, la construcción de los embriones clonados requiere mucha micromanipulación y exposición a sustancias nocivas. Segundo, la enucleación de un oocito involucra la remoción física del 5 15% del ooplasma y su confirmación por medio de la exposición a rayos UV que alteran la integridad membranal, la síntesis de proteínas y la actividad mitocondrial. Tercero, la inserción de un núcleo de una célula somática en un oocito involucra generalmente la fusión inducida por electricidad o microinyección que causan ciertos niveles de lisis. Cuarto, la iniciación del desarrollo de los embriones involucra la exposición a químicos nocivos. Quinto, los embriones resultantes son alimentados en un ambiente relativamente hostil hasta su trasplantación a las madres receptoras. Por ejemplo, la producción in vitro de embriones esta asociada con alteraciones en la expresión génica que resulta en abortos, sobrepeso, crecimiento anormal y un incremento en la mortalidad (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003, Nagy et al 1993, Wang & Zhou 2003, Xuemei et al 2003) En cuanto a las aplicaciones en reproducción humana, actualmente esto es considerado inseguro debido a que no hay razones que puedan sugerir que la clonación humana sea más eficiente que la clonación reproductiva en otros mamíferos. También se debe tener en cuenta que existen riesgos significativos para la madre asociados al llevar un feto más grande de lo normal y al embarazo anormal. La medicina regenerativa puede en un futuro involucrar la implantación de nuevo tejido en pacientes con órganos dañados o muertos, un obstáculo para el éxito de la trasplantación de cualquier célula, incluyendo células madre y sus derivados, está relacionada con el rechazo inmunitario a tejido foráneo. En los procedimientos actuales de trasplantación de células madre con medula ósea hay efectos graves asociados con los medicamentos inmunosupresores, de manera que para hacer una realidad la aplicabilidad de estos procedimientos en variadas condiciones, la técnica de la transferencia nuclear somática para animales transgénicos histocompatibles parece ser muy promisoria (Boisselier 2001, Charo 2001, Cross 2001, Wilmut 2001) El éxito en la clonación de animales adultos de oveja, res, cerdos y cabras confirma la utilidad de la transferencia nuclear de células somáticas para la expansión clonal de animales productores importantes en la agricultura. También existe un creciente interés por emplear esta técnica para restaurar especies amenazadas o extintas, como el reciente éxito en la clonación de Bos gaurus a partir de tejido colectado en los años 80. En cuanto a la investigación pura la transferencia nuclear puede resultar una herramienta para descubrir los componentes nucleares y citoplasmáticos involucrados en la perdida y desarrollo embrionario. Además, el uso de la transferencia nuclear incrementa la eficiencia de la producción de animales transgénicos en un 100%, los cuales son empleados como birreactores para la producción de fármacos o tal vez órganos para transplantes (Campbell et al 1996, Glick & Pasternak 2003, Nagy et al 1993, Wang & Zhou 2003, Xuemei et al 2003) Se debe tener en cuenta que la clonación puede crear células humanas clonadas pero no embriones completos más allá de determinados estadíos; puede ser utilizada para comprender mejor el desarrollo humano, para proveer recursos para terapias con células madre y para desarrollar nuevos tratamientos; tiene un amplio potencial de aplicación en enfermedades genéticas y degenerativas; presenta una oportunidad para obtener tejido de transplante perfectamente compatible para aliviar condiciones actualmente incurables y promueve el desarrollo de tecnologías cada vez más sofisticadas que presentan alternativas que no requieren óvulos, 6
7 células embrionarias o clonación celular (Charo 2001). Literatura citada Boisselier B, Clonaid, Bahamas. Reproductive Cloning In Humans. Taller: Scientific And Medical Aspects Of Human Cloning. National Academy Of Sciences, Washington, D.C., 2001 Aug 7. En Línea: Campbell, K.H., Mcwhir, J., Ritchie, W.A., & I. Wilmut. "Sheep Cloned By Nuclear Transfer From A Cultured Cell Line," Nature 380:64 66, Charo R. A., University Of Wisconsin, Madison. Regulation Of Cloning. Taller: Scientific And Medical Aspects Of Human Cloning. National Academy Of Sciences, Washington D.C., 2001 Aug 7. En Línea: Cross J, University Of Calgary, Alberta, Canada. Assisted Reproductive Technologies. Taller: Scientific And Medical Aspects Of Human Cloning. National Academy Of Sciences, Washington, D.C., 2001 Aug 7. En Línea: Glick, B. & Pasternak, J Molecular Biotechnology Principles And Applications Of Recombinant Dna. Asm Press, Inc. Usa. 761p. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow Newerley, W., & J.C. Roder. "Derivation Of Completely Cell Culture Derived Mice From Early Passage Embryonic Stem Cells," Proceedings Of The National Academy Of Sciences (Usa)90: , Wang, B. & Zhou, J. Specific Genetic Modifications Of Domestic Animals By Gene Targeting And Animal Cloning, Reproductive Biology And Endocrinology 1: 103, Wilmut I, Roslin Institute, Scotland. Application Of Animal Cloning Data To Human Cloning. Taller: Scientific And Medical Aspects Of Human Cloning. National Academy Of Sciences, Washington, D.C., 2001 Aug 7. En Línea: Wilmut, I., Schnieke, A.E., Mcwhir, J., Kind, A.J., & K.H. Campbell. "Viable Offspring Derived From Fetal And Adult Mammalian Cells," Nature 385: , Xuemei, L., Jouneau, A., Zhou, Q. & Bernard, J. Nuclear Transfer Progress And Quandaries, Reproductive Biology And Endocrinology 1: 84,
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