IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POTENCIALMENTE PRODUCTORAS DE AMINAS BIÓGENAS AISLADAS DE QUESO BLANCO VENEZOLANO. Alba Lorena Benavides Sierra

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1 i UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y NUTRICIÓN MAESTRIA EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POTENCIALMENTE PRODUCTORAS DE AMINAS BIÓGENAS AISLADAS DE QUESO BLANCO VENEZOLANO Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por Alba Lorena Benavides Sierra como requisito parcial para optar al grado académico de Magister en Ciencia de los Alimentos Con la asesoría de la prof. M.Sc. Jhoana Colina Abril 2010

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5 v A lo mágico que fue contemplar la belleza de lo invisible

6 vi AGRADECIMIENTOS Quiero dejar por escrito mi agradecimiento sincero a, Inés Reverón por abrirme las puertas de un mundo finitamente pequeño e infinitamente mágico, por enseñarme a entenderlo como una cuestión de Fe. A Jhoana Colina por ser el rostro constante en todo este tiempo, por su dedicación, paciencia y por regalarme mucho de su tranquilidad. Al Decanato de Estudios de Postgrado por el financiamiento de este trabajo sin el cual NADA hubiese sido posible. A mi gran compañera en este viaje amuleto y buena estrella de cuanta cosa emprendo. A todos aquellos que me dieron el mejor regalo, porque ese g y ese ml fue vital para mi. A quienes desde la distancia me regalaron fuerza, porque el volverlos a ver fue el motivo perfecto para seguir.

7 vii UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y NUTRICIÓN MAESTRÍA EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POTENCIALMENTE PRODUCTORAS DE AMINAS BIÓGENAS AISLADAS DE QUESO BLANCO VENEZOLANO RESUMEN Por: Benavides Sierra Alba Lorena Carnet No.: Tutor: Jhoana Colina Abril de 2010 La microbiota de quesos frescos esta compuesta por una diversidad de bacterias que incluye especies que se han relacionado con enfermedades alimentarias. Este trabajo se planteó como objetivo la identificación de bacterias potencialmente productoras de aminas biógenas aisladas de queso blanco fresco tipo Guayanés, Guayamano, Mozzarella, Búfala, Cabra y Cuajada elaborados en Venezuela en dos periodos de tiempo. A partir de 175 aislados obtenidos, se seleccionó el grupo de trabajo, el cual fue identificado mediante los sistemas bioquímicos multitest miniatura Api 20E, Api Staph, Api 20Strep y Api 50CHL. La microbiota identificada fue presuntiva de: Escherichia coli 1, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus, Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia y Lactobacillus fructivorans. Se determinó la capacidad para descarboxilar los aminoácidos histidina, tirosina y ornitina a diecinueve bacterias pertenecientes a cinco grupos de microorganismos comúnmente relacionados con la producción de aminas biógenas. Los aislados identificados como E. faecalis (6), E. faecium (1), S. sciuri (1) y S. xylosus (1) produjeron tiramina cuando se suplementó el caldo de cultivo con el precursor, tanto en la prueba de descarboxilación de aminoácidos como en cromatografía en capa fina (TLC). Dos de los tres aislados identificados como E. coli 1 produjeron putrescina a partir de ornitina, mientras que el aislado restante y Lactobacillus fructivorans no descarboxilaron ninguno de los tres aminoácidos evaluados. Adicionalmente no se evidenció la producción de histamina en ninguna de las bacterias evaluadas. La producción de aminas fue determinada en muestras de queso inoculadas, observando producción de tiramina en la segunda semana de almacenamiento a 25 C en el aislado E. faecalis e, y a partir de la tercera semana para los demás aislados evaluados, aunque con bandas de menor intensidad. No fue posible establecer la producción de putrescina ni de histamina en ninguno de los aislados bacterianos evaluados (11) bajo ninguna de las temperaturas estudiadas. Finalmente de las 19 bacterias seleccionadas Enterococcus faecalis representó el 32%, E.coli 1 y Pseudomonas fluorescens el 16%, Staphylococcus sciuri el 10,5% y el 21,5% restante estuvo integrado por Burkholderia cepacia, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus y Lactobacillus fructivorans, el 80% de estos aislados resultó positivo a la producción de tiramina por la prueba de descarboxilación de aminoácidos mientras que solo el 47% lo fue por TLC. La tiramina fue la única amina biógena detectada en los quesos inoculados artificialmente. Palabras clave: Queso blanco fresco, aminas biógenas, TLC.

8 viii ÍNDICE GENERAL Pág. APROBACIÓN DEL JURADO...ii VEREDICTO....iii DEDICATORIA.....v AGRADECIMIENTOS....vi RESUMEN... vii ÍNDICE GENERAL... viii ÍNDICE DE TABLAS... xiii ÍNDICE DE FIGURAS...xv LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS... xvii INTRODUCCIÓN...1 CAPITULO I OBJETIVOS Objetivo general Objetivos específicos...4 CAPITULO II MARCO TEÓRICO Queso Queso blanco fresco Factores que afectan el crecimiento de microorganismos en queso Aminas biógenas Formación de aminas biógenas Microorganismos productores de aminas biógenas...14

9 ix Toxicidad de las aminas biógenas Histamina Tiramina Putrescina Detección de microorganismos productores de AB Identificación de microorganismos Prueba bioquímica de descarboxilación de aminoácidos Cromatografía en capa fina (TLC) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Cromatografía líquida de alta presión (HPLC)...33 CAPITULO III METODOLOGÍA Enumeración y aislamiento de las bacterias presentes en seis tipos de queso blanco fresco Obtención y preparación de la muestra Inoculación de la muestra Recuento de los grupos de microorganismos bajo estudio Aislamiento de bacterias Identificación de los aislados Pruebas orientativas Pruebas bioquímicas multitest miniatura Evaluación preliminar de parámetros físicos y químicos Actividad de agua (a w ) Concentración de cloruros. Método volumétrico ph...44

10 x Acidez Evaluación de la capacidad de producción de aminas biógenas de los aislados bacterianos Prueba de descarboxilación de aminoácidos Cromatografía de capa fina (TLC) Determinación de la capacidad de producción de aminas biógenas en muestras de queso blanco fresco bajo condiciones específicas de almacenamiento Pasteurización de muestras de queso Inoculación de las bacterias Almacenamiento Extracción de aminas Análisis estadístico...48 CAPITULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN Grupos de microorganismos presentes en el queso blanco fresco Identificación de los aislados Características físicas y químicas exhibidas por los quesos bajo estudio Determinación de la actividad de agua (a w ) Determinación del contenido de cloruros Determinación de ph Determinación de acidez Evaluación de la capacidad de producción de aminas biógenas por los aislados bacterianos Determinación de la descarboxilación de aminoácidos mediante siembra en medios de cultivo líquidos...70

11 xi Evaluación de la capacidad de producir aminas biógenas por cromatografía en capa fina (TLC) Determinación de la capacidad de producción de aminas biógenas de los aislados en queso blanco bajo condiciones específicas de almacenamiento...78 CAPITULO V CONCLUSIONES...83 CAPITULO VI RECOMENDACIONES...84 CAPITULO VII REFERENCIAS...85 CAPITULO VIII APÉNDICE Apéndice A.I. Resumen recuento microbiano en seis tipos de queso en dos periodos de tiempo APÉNDICE A.II. ANOVA multifactorial y prueba de rangos múltiples de Duncan de los factores tipo de queso y periodo en el recuento de cinco grupos de microorganismos APÉNDICE A.III. Características morfológicas utilizadas en la elaboración del dendograma APÉNDICE A.IV Resultados pruebas bioquímicas miniaturizadas Api APÉNDICE A.V Parámetros físicos y químicos de seis tipos de queso APÉNDICE A.VI. ANOVA de una sola vía y prueba de mínima diferencia significativa (LSD) para parámetros físicos y químicos APÉNDICE A.VII. TLC producción de aminas biógenas por aislados crecidos en medios suplementados con aminoácidos APÉNDICE A.VIII. Pruebas bioquímicas tomadas como referencia para la elaboración de dendogramas

12 xii 8.9 APÉNDICE A.IX. Determinación del volumen a inocular en muestras de queso destinadas a almacenamiento APÉNDICE A.X. Determinación aminas biógenas en el alimento

13 Tabla ÍNDICE DE TABLAS xiii Pág. 2.1 Composición del queso blanco fresco Requisitos fisicoquímicos del queso blanco Criterios microbiológicos para queso blanco fresco Microorganismos productores de aminas biógenas Aislados productores de aminas biógenas por la prueba de descarboxilación de aminoácidos Aislados productores aminas biógenas por cromatografía en capa fina Parámetros utilizados en la inoculación de muestras de queso sometidas a almacenamiento Resultados positivos a la producción de aminas de muestras en almacenamiento Resumen recuento microbiano de queso guayanés ufc/g Resumen recuento microbiano de queso guayamano ufc/g Resumen recuento microbiano de queso de búfala ufc/g Resumen recuento microbiano de queso mozzarella ufc/g Resumen recuento microbiano de queso de cabra ufc/g Resumen recuento microbiano de queso-cuajada ufc/g Análisis de varianza para el recuento de Pseudomonas en los seis tipos de queso Análisis de varianza para el recuento de coliformes en los seis tipos de queso Análisis de varianza para el recuento de Enterococcus en los seis tipos de queso Análisis de varianza para el recuento de Staphylococcus en los seis tipos de queso Análisis de varianza para el recuento de BAL en los seis tipos de queso Características morfológicas de 175 aislados provenientes de cinco medios de cultivo diferenciales...108

14 xiv 8.13 Resumen de los parámetros físicos y químicos de seis muestras de queso Anova de una vía para la determinación de a w Anova de una vía para la determinación de cloruros Anova de una vía para la determinación de ph Anova de una vía para la determinación de acidez Pruebas bioquímicas tomadas como referencia para la elaboración del dendograma de Enterobacterias y Pseudomonas sp Pruebas bioquímicas tomadas como referencia para la elaboración del dendograma del género Staphylococcus sp Pruebas bioquímicas tomadas como referencia para la elaboración del dendograma de Enterococcus sp...131

15 Figura ÍNDICE DE FIGURAS xv Pág. 2.1 Principales aminas biógenas Histamina Tiramina Putrescina Desarrollo de una cromatografía en capa fina Morfología macroscópica de las colonias microbianas Microorganismos presentes en quesos blancos frescos Gráficos de interacción del tipo de queso y periodo sobre el recuento en Log (ufc/g) de los grupos de microorganismos evaluados Dendograma porcentaje de similitud de 175 aislados bacterianos respecto a sus características morfológicas macroscópicas observadas sobre medios de cultivo diferenciales Similitud entre los aislados pertenecientes a las Enterobacterias y otros bacilos Gram negativos Dendograma para el género Staphylococcus sp. con 26 cepas de referencia Dendograma para el género Enterococcus sp. con 21 cepas de referencia Actividad de agua (a w ) de seis tipos de queso blanco fresco Contenido de cloruros (%) de seis tipos de queso blanco fresco Valor de ph de seis tipos de queso blanco fresco Medida de la acidez (% de ácido láctico) de seis tipos de queso blanco fresco Prueba de descarboxilación de aminoácidos Separación de los patrones de histamina, tiramina y putrescina por TLC Determinación de aminas biógenas producidas por aislados bacterianos mediante TLC. 76

16 xvi 8.1 Resultados identificación de aislados mediante galerías Api 20E Resultados identificación de aislados mediante galerías Api Staph Resultados identificación de aislados mediante galerías Api Strep Resultados identificación de aislados mediante galerías Api 50CH Resultados de TLC de los sobrenadantes de aislados crecidos en caldo infusión cerebro corazón (ICC) Resultados de TLC de los sobrenadantes de aislados crecidos en caldo infusión cerebro corazón (ICC) Resultados de TLC de los sobrenadantes de aislados crecidos en caldo nutritivo Resultados de TLC de los sobrenadantes de aislados crecidos en caldo nutritivo Cálculos para la determinación del volumen de suspensión bacteriana a inocular TLC de muestras en almacenamiento a 6, 25 y 35 C, semana 1, 2, 3 y

17 xvii LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS ANOVA Análisis de varianza DNA Ácido desoxirribonucleico ARNr Ácido ribonucleico ribosomal a w ATP AB Å BAL CAD cm NaCl CaCl 2 TLC HPLC GC ρ DAO Ec CE ELISA SPM SPD Rf Actividad de agua Adenosin trifosfato Aminas biógenas Angstrom Bacterias ácido lácticas Cadaverina Centímetro Cloruro de sodio Cloruro de calcio Cromatografía en capa fina Cromatografía líquida de alta presión Cromatografía de gases Densidad Diaminaoxidasa Ecuación Electroforesis capilar Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas Espermina Espermidina Factor de retención C Grados centígrados g Gramos HDC Histidina descarboxilasa HI Histamina h Hora IgE Inmunoglobulina E

18 xviii Kg Kilogramos LDC Lisina descarboxilasa L Litro ± Más o menos µl Microlitros mg Miligramos mm Milimolar ml Mililitro mm Milímetros MPa Milipascales Min Minutos M Molar MAO Monoaminaoxidasa nm Nanómetros N 2 N NMP ODC bp ppm per H 2 O 2 PLP Nitrógeno Normalidad Número más probable Ornitina descarboxilasa Pares de base Partes por millón Persona Peróxido de hidrógeno Piridoxal fosfato % Porcentaje (1:1) Proporción uno a uno PUT Putrescina PCR Reacción en cadena de la polimerasa p/p Relación peso a peso v/v Relación volumen a volumen rpm Revoluciones por minuto s Segundos TY Tiramina

19 xix TDC TR UV ufc Tirosina descarboxilasa Triptamina Ultravioleta Unidades formadoras de colonia

20 1 INTRODUCCIÓN Según la cámara Venezolana de Industrias Lácteas (CAVILAC) la producción de leche nacional para el año 2008 se situó en 1.266,03 L, de los cuales el 63,1% fue destinado a la fabricación de queso, distribuyéndose de la siguiente forma: 28,9% para la producción de queso industrial, 17,1% para la elaboración de queso semi industrial y 17,1% para la producción de queso artesanal. Cabe destacar que los quesos de la industria informal (semi industrial y artesanal) representan la mitad de los quesos que se expenden en el país(cavilac, 2008); muchos de estos se caracterizan por poseer esquemas de fabricación empíricos, no estandarizados y en algunos casos por no contar con las normas higiénicosanitarias para su procesamiento; además, porque el cultivo iniciador no adicionado, está conformado por una microbiota mixta no caracterizada ni identificada, que en algunos casos se ha relacionado con enfermedades alimentarias (Alvarado et al., 2007). Las asociaciones más frecuentemente encontradas son las de quesos blancos artesanales con Staphylococcus aureus (Ríos y Novoa, 1999; Miro y Ríos, 1999); Escherichia coli, Salmonella spp y Listeria monocytogenes (Miro y Ríos, 1999; Araújo et al., 2002; Leuschnner et al., 2002; Roche, 2004). El uso de materia prima de baja calidad, junto con la presencia de condiciones sanitarias inapropiadas durante el proceso, así como de una deficiente refrigeración en el producto terminado, contribuyen a la proliferación bacteriana (Márquez y García, 2007; Valladares y Faría, 2005) y por lo tanto a la formación de compuestos derivados de su metabolismo, tales como ácidos grasos, esteres, alcoholes, y compuestos nitrogenados como aminas biógenas (AB) (Zoecklein et al., 2001). Las aminas biógenas son bases orgánicas producidas principalmente por descarboxilación microbiana de aminoácidos específicos que se encuentran en forma libre (Silla-Santos, 1996). Las AB se encuentran en gran número en los alimentos y su concentración varía ampliamente;

21 2 las más comunes son las monoaminas histamina (HI), tiramina (TY) y triptamina (TR) y las diaminas putrescina (PUT) y cadaverina (CAD). Estas son formadas a partir de los aminoácidos histidina, tirosina, triptófano, ornitina y lisina respectivamente (Landete et al., 2007b). Existen además poliaminas, como la espermina (SPM) y espermidina (SPD) que son derivadas únicamente de la putrescina. Los alimentos que probablemente contienen los niveles más altos de estos compuestos son los productos lácteos, pescado y sus derivados, carne y sus derivados, vegetales fermentados, productos de la soya, y bebidas alcohólicas como el vino y la cerveza (Landete et al., 2007c), también pueden formarse en bajas concentraciones en alimentos no fermentados tales como frutas, vegetales, carne, leche y pescado, así como también durante el almacenamiento y el procesamiento de alimentos con calor (Önal, 2007). El interés del estudio de las AB en relación con los alimentos surgió en los años 60 a raíz de las crisis hipertensivas graves causadas por la interacción entre alimentos ricos en aminas (tiramina en queso) y los medicamentos inhibidores de la mono-aminooxidasa, utilizados básicamente como antidepresivos. Desde entonces, las AB como tiramina e histamina se han considerado microcomponentes de los alimentos, indeseables por su potencial efecto negativo sobre la salud del consumidor, sin embargo los niveles permitidos en alimentos solo han sido reportados para tiramina ( mg/kg), histamina (100 mg/kg) y feniletilamina (30 mg/kg) (Ten et al., 1990; Stratton et al., 1991). Adicionalmente se han enmarcado en el ámbito de la seguridad alimentaria (Bover et al., 2005). La presencia de cepas con la capacidad de producir aminas biógenas es la primera condición para la generación y acumulación de estas sustancias en un alimento. Se ha señalado que diferentes grupos de microorganismos pueden ser potenciales formadores de aminas biógenas, entre estos se incluyen los géneros: Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Enterobacter, Enterococcus, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus y Leuconostoc (Pintado et al., 2008). Por lo anterior, aparte del efecto tóxico, las aminas biógenas pueden ser consideradas como indicadores del nivel de contaminación microbiológica de un alimento.

22 3 Debido a la importancia de las aminas biógenas durante las últimas tres décadas, se han desarrollado métodos para la detección directa de estos compuestos, así como también de las bacterias que los producen. Los métodos más simples se basan en el crecimiento de los microorganismos en medios de cultivo diferenciales que indican la presencia de la amina por un incremento del ph. Existen además métodos enzimáticos, específicos para bacterias productoras de histamina, basados en la producción de peróxido de hidrógeno por la acción de la enzima oxidasa sobre la histamina (Sumner y Taylor, 1989). Técnicas cromatográficas como cromatografía en capa fina (por sus siglas en inglés TLC) (García et al., 2005) y cromatografía líquida de alta presión (por sus siglas en inglés HPLC), también han sido aplicadas en la identificación y cuantificación de AB (González et al., 1998; Leitão et al., 2005; Loret et al., 2005; Contreras et al., 2007; Landete et al., 2007a). Más recientemente se ha extendido el uso de métodos moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés PCR) para la detección temprana y rápida de bacterias productoras de aminas biógenas, mediante la identificación de los genes que codifican la capacidad de descarboxilar aminoácidos (De las Rivas et al., 2006; Landeta et al., 2007; De las Rivas et al., 2007; Chen et al., 2008). El estudio de la microbiota productora de aminas biógenas se realiza casi exclusivamente en quesos madurados. Se sabe muy poco del comportamiento de la microbiota presente en quesos blancos frescos en relación a la producción de aminas, por lo que este estudio pretende identificar algunas de las bacterias presentes en estos quesos y evaluar su efecto potencial frente a la producción de tres de las aminas más referenciadas (histamina, tiramina y putrescina).

23 4 CAPITULO I 1. OBJETIVOS 1.1 Objetivo general Identificar bacterias potencialmente productoras de aminas biógenas aisladas de queso blanco fresco venezolano. 1.2 Objetivos específicos Enumerar y aislar grupos bacterianos e identificar los aislados seleccionados por medio de sistemas bioquímicos multitest miniaturizados Establecer y medir preliminarmente los parámetros físicos y químicos de los quesos, y correlacionarlos con la presencia de las bacterias aisladas Evaluar la capacidad de producción de aminas biógenas de los aislados bacterianos seleccionados, por el método bioquímico de descarboxilación de aminoácidos y por cromatografía en capa fina (TLC) Determinar la capacidad de producción de aminas biógenas de los aislados seleccionados en muestras de queso blanco fresco bajo condiciones específicas de almacenamiento.

24 5 CAPITULO II 2. MARCO TEÓRICO 2.1 Queso El queso es el producto que resulta de la precipitación de las caseínas, que deja como residuo el suero de leche, los pasos fundamentales en su elaboración incluyen la coagulación de la leche, cortado del coágulo, eliminación del suero, salado, prensado y maduración en el caso de que exista. Se conoce una gran variedad de quesos en el mundo, las diferencias que existen con relación a su textura, aroma, sabor, entre otras, se deben fundamentalmente a variaciones en el método de fabricación en cuanto a: a) tipo de leche utilizada (vaca, oveja, cabra, búfala, etc.), b) calidad de la leche (pasteurizada, cruda), c) relación de la concentración grasa/proteína, d) tipo de microorganismo y enzimas añadidas, e) velocidad e intensidad del desarrollo de la acidez, f) uso y concentración de la renina, g) grado y forma de deshidratación del coágulo, h) cantidad y forma de adición de la sal, i) forma y tamaño del queso, j) condiciones de maduración (temperatura, humedad, etc.), k) tratamientos superficiales del queso (encerado), l) perforaciones en el queso para permitir la entrada de aire, y m) adición de enzimas o microorganismos para efectuar la maduración (Badui, 1999). Si se parte de leche pasteurizada y homogenizada, el primer paso es su acondicionamiento a 35 C con el fin de que el inóculo empleado crezca favorablemente. Los microorganismos empleados varían según el tipo de queso, pero entre los más comunes destacan Streptococcus lactis, S. cremoris, Lactobacillus lactis y L. bulgaricus, que se añaden normalmente a una concentración de 1% v/v; sin embargo, en quesos elaborados con leche cruda es la microbiota silvestre la que domina el proceso fermentativo y a la que se debe en gran parte la diversidad de características sensoriales propias de los diferentes tipos de queso fresco (Bouton et al., 2009). Luego de adicionado el inóculo se permite que actúe por un periodo de minutos en este lapso se transforma la lactosa en ácido láctico, lo que aumenta la acidez de la leche en 0,01 a 0,02% y reduce el ph a 5,5. Bajo estas condiciones se adiciona la renina cuya actividad

25 6 enzimática durante 30 minutos provoca la coagulación de la leche mediante un fenómeno que se efectúa en dos pasos: a) hidrólisis de la κ caseína en para-κ-caseína y el macropéptido, que trae consigo la pérdida del sistema de estabilización de las caseínas, y b) la formación del coágulo que se favorece por la presencia de los iones calcio propios de la leche. El coágulo obtenido se corta longitudinal y transversalmente con liras metálicas con el objeto de concentrar los sólidos; cuanto más pequeños sean los cubos formados mayor será el desuerado, lo cual es deseable en quesos con bajo contenido de humedad, la agitación lenta y el calentamiento aceleran el proceso, ya que además se favorece una generación extra de ácido láctico que ocasiona que las micelas se unan más estrechamente para integrar una estructura tridimensional continua de caseínas en la que quedan atrapadas las gotas o partículas de grasa y algo de suero. Posteriormente el suero se elimina y al sólido restante se le añade sal, que contribuye además del sabor a detener la producción de ácido láctico, a continuación se coloca en moldes y por efecto de presión se continúa con el desuerado hasta alcanzar la humedad deseada. Si el queso ha de ser sometido a maduración es trasladado a un cuarto con humedad relativa y temperatura controlada que propician las condiciones ideales para que los microorganismos y enzimas lleven a cabo las transformaciones de textura, aroma y sabor buscadas (Badui, 1999) Queso blanco fresco La definición para queso blanco, según la Norma Venezolana COVENIN 3821:2003, establece que es el producto elaborado a base de leche pasteurizada, entera, parcialmente descremada, o la mezcla pasteurizada de leche fresca entera con sólidos totales de leche o derivados lácteos, adicionada o no de fermentos lácticos, sometida a la acción de cuajo u otros coagulantes aprobados por la autoridad sanitaria competente, que después del escurrido parcial del suero da origen a un producto sólido. El cual se entiende como fresco, si esta listo para el consumo poco después de su fabricación. En la Tabla 2.1 se presenta la composición general del queso blanco fresco. La complejidad del queso fresco en cuanto a su composición y su elevada actividad de agua lo convierten en uno de los alimentos naturales donde proliferan fácilmente la mayor parte de los microorganismos (Banwart G, 1995), más aún, si este es fabricado con leche cruda y con un

26 7 deficiente sistema de higiene, como lo es, el caso de muchos de los quesos frescos artesanales elaborados en Venezuela. Por esta razón existen diferentes requerimientos fisicoquímicos y microbiológicos que éstos deben cumplir al momento de ser expendidos (Tabla 2.2 y 2.3). Tabla 2.1 Composición del queso blanco fresco. Composición Contenido por cada 100g Calorías 100 Proteínas 6,8 g Lípidos 7,1 g Carbohidratos 5,7 g Calcio 210 mg Sodio 1200 mg Fuente: Banwart G, 1995 La contaminación de queso fresco industrial se produce principalmente durante los procesos de distribución y despacho, momento en el cual existe una gran manipulación del producto, mientras que en quesos frescos artesanales esta puede darse en el ordeño. Cuando la leche no es sometida al proceso de pasteurización, se permite la propagación de una gran variedad de especies contaminantes patógenas o no, pertenecientes principalmente a los géneros Escherichia, Staphylococcus, Salmonella, Listeria y Enterococcus entre otros (Ferrer et al., 1991; Llanca, 2007; Márquez y García, 2007; Chaves y Arias, 2009). Tabla 2.2 Requisitos fisicoquímicos del queso blanco. Fuente: COVENIN 3821:2003.

27 Tabla 2.3 Criterios microbiológicos para queso blanco fresco (a nivel de planta y centros de distribución pertenecientes a la empresa). 8 Fuente: COVENIN 3821:2003 López (1992), indicó que los quesos criollos son los alimentos que más frecuentemente han sido reportados como responsables de intoxicaciones alimentarias (35,3%) en el país, siendo S. aureus el principal agente etiológico. Afirmando además, que esta situación se presenta principalmente debido a la mayor producción de quesos criollos a nivel de fincas (cerca de un 50%), sin un control sanitario efectivo, sumado a una cadena de comercialización con grandes deficiencias en la refrigeración. Ortiz et al. (1993), estudiaron la incidencia de Listeria monocytogenes en queso blanco, queso pasteurizado, Guayanés y de Mano; así como en otros productos lácteos, reportando la presencia de Listeria spp. presuntiva en todos los productos, e identificando la presencia de una cepa de Listeria monocytogenes en el queso blanco llanero. Según Díaz y González (2001), entre 1993 y el año 2000, en América ocurrieron 191 brotes por intoxicación estafilocócica con afectados y 2 muertes. De estos brotes, 48

28 9 correspondieron a Venezuela, y en 40 de ellos el queso fue el alimento involucrado, afectando a un gran número de personas. Citti et al. (1999), reportaron la presencia de Listeria monocytogenes, en 2 muestras de queso blanco duro criollo tipo "llanero", lo que evidencia el riesgo implícito en el consumo de este tipo de alimentos. En Venezuela, el queso blanco fresco es uno de los alimentos de mayor consumo, encontrándose una cantidad importante del producto comercializado en el mercado, procedente de pequeños productores, según cifras de Fedeagro el consumo de queso en Venezuela para el año 2007 fue de 1,4 Kg/per/año para queso de finca, y de 4,7 Kg/per/año para queso industrial (Fedeagro, 2010) Factores que afectan el crecimiento de microorganismos en queso El metabolismo y la multiplicación de los microorganismos están condicionados por varios factores como disponibilidad de nutrientes, disponibilidad de agua, ph, presencia de agentes inhibidores y temperatura, entre otros. Disponibilidad de nutrientes, los microorganismos requieren para su supervivencia principalmente agua, una fuente de energía, una fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. Siendo los mohos los microorganismos de menores requerimientos, seguidos por las levaduras, las bacterias Gram negativas y las bacterias Gram positivas. Como fuente de energía los microorganismos contaminantes de alimentos generalmente utilizan azúcares, alcoholes y aminoácidos, y algunos pocos microorganismos son capaces de utilizar carbohidratos complejos, como almidón y celulosa. La fuente primaria de nitrógeno de la gran mayoría de microorganismos son los aminoácidos y algunos, pueden requerir vitamina B en bajas cantidades. a w, la disponibilidad de agua es un factor importante que en la naturaleza determina el crecimiento de todos los organismos. La mayoría de los alimentos frescos poseen valores de a w de alrededor de 0,99, y en general las bacterias contaminantes no crecen a a w menores a 0,91. Se sabe que las bacterias requieren mayores valores de a w para el crecimiento que los hongos, a la vez, que las bacterias Gram negativas tienen mayores requerimientos que las Gram positivas. Se ha observado que existe cierta relación entre la a w, la temperatura y la

29 10 nutrición: 1) a cualquier temperatura, la habilidad de los microorganismos para crecer se ve disminuida si la a w disminuye, 2) el rango de a w al que crecen los microorganismos se hace mayor a la temperatura óptima de crecimiento, 3) la presencia de nutrientes incrementa el rango de actividad de agua a la que los microorganismos pueden sobrevivir (Jay, 2000). La disponibilidad de agua no sólo es función del contenido de agua que está presente en un medio, es decir, de la humedad de determinado ambiente, sino que también depende de la concentración de los solutos, como sales, azúcares y otras sustancias que pueden estar presentes, debido a que las sustancias disueltas tienen cierta afinidad por ésta que impide que esté disponible para los microorganismos (Madigan et al., 2006). NaCl, el efecto general de la disminución de la a w por debajo del óptimo mediante la adición de solutos, es lograr incrementar la longitud de la fase de crecimiento logarítmico y disminuir la tasa de crecimiento, y el tamaño final de la población. Con respecto a los compuestos específicos usados para disminuir la a w estos están directamente relacionados con los sistemas de absorción y desorción. En un estudio comparativo del efecto del NaCl y el glicerol, sobre el poder de inhibición de bacterias a una misma a w, se pudo comprobar que el glicerol presentó mayor inhibición que el NaCl en bacterias relativamente tolerables a la sal, pero menos inhibición sobre especies sensibles a la sal (Jay, 2000). En otro estudio la germinación de esporas de Bacillus y Clostridium presentó una fuerte inhibición cuando la a w fue controlada con NaCl o CaCl 2, y la misma fue menor cuando se usó glucosa y sorbitol, y mucho menor cuando se uso glicerol, etilenglicol y urea (Jay, 2000). ph, todos los microorganismos poseen un rango de ph dentro del cual es posible su crecimiento y normalmente poseen un ph óptimo bien definido. Se ha establecido que la mayoría de los microorganismos crecen mejor a valores de ph cercanos a 7,0 (6,6 a 7,5). Con respecto a los valores de ph mínimos y máximos de crecimiento, se sabe que estos dependen de otros parámetros de crecimiento. Se ha reportado que el ph mínimo de ciertos Lactobacillus depende del tipo de ácido presente, ácidos como el cítrico, fosfórico y tartárico parecen permiten el crecimiento a un ph menor que el reportado para los ácidos acético y láctico, en cuanto a la concentración de sales, para Alcaligenes faecalis se ha evidenciado crecimiento en un mayor rango de ph en presencia de NaCl 0,2 M que en ausencia de NaCl o en presencia de 0,2 M de citrato de sodio, mientras que para E. coli, se ha reportado que

30 11 cuando el contenido de sal excede su valor óptimo el rango de ph para su crecimiento se hace menor. Con respecto a la temperatura el ph de un sustrato parece acidificarse aun más cuando la temperatura aumenta (Jay, 2000). Cuando se considera para cada organismo particular el requerimiento de un ph específico para el crecimiento, hay que tener en cuenta que el ph óptimo representa solo el ph del medio extracelular, el ph intracelular debe permanecer próximo a la neutralidad, debido a que la cantidad de iones hidrógeno existentes en el medio pueden inducir la desnaturalización de proteínas, así como la alteración de moléculas iónicas celulares que son sensibles al ácido o al álcali (Madigan et al., 2006). Temperatura, es el parámetro más importante que afecta la descomposición de un alimento, debido al efecto que esta tiene sobre el incremento de la población de microorganismos, y sobre los factores que de esta se derivan, tales como la producción de aminas biógenas. Se ha reportado que el uso de temperaturas de alrededor de 5 C o menos, es recomendable para disminuir la formación de estos compuestos (Izquierdo et al., 2004). Individualmente y como grupo, los microorganismos crecen en un amplio rango de temperaturas que los ha clasificado en tres grupos ampliamente conocidos (psicrótrofos, mesófilos y termófilos) (Jay, 2000). Agentes inhibidores, la estabilidad de algunos alimentos frente a la contaminación por microorganismos es debida a la presencia de ciertas sustancias naturales que se ha demostrado que tienen actividad antimicrobiana, en la leche de vaca se ha considerado como sustancias antimicrobianas a la lactoferrina, conglutinina y el sistema lactoperoxidasa, adicionalmente, la caseína de la leche y algunos ácidos grasos libres han mostrado actividad antimicrobiana bajo ciertas condiciones (Jay, 2000). 2.2 Aminas biógenas Bajo el nombre de aminas biógenas se engloban diferentes sustancias que tienen en común la presencia de como mínimo un grupo amino, así como un origen biológico y una actividad fisiológica en animales, plantas y microorganismos. Teniendo en cuenta esta amplia distribución, en general se distinguen dos grandes grupos de aminas biológicamente activas (Bardócz, 1995), las poliaminas naturales, que se forman durante los procesos metabólicos celulares de la mayoría de seres vivos por lo que su presencia en los alimentos se considera de origen endógeno, dentro de las que se encuentran las poliaminas espermina y espermidina, así

31 12 como su precursora la putrescina, y las aminas biógenas propiamente dichas, que se forman por la acción de enzimas de origen microbiano. En este grupo se incluyen aminas de estructura aromática como la histamina, la tiramina, la feniletilamina y la triptamina, y las aminas de estructura alifática como la putrescina, la cadaverina y la agmatina Formación de aminas biógenas Existen ciertos aminoácidos y sus derivados, que aunque no se encuentran formando parte de las proteínas, son muy importantes a nivel bioquímico (histidina y tirosina entre otros), estos y los demás aminoácidos excepto la prolina tienen como denominador común un grupo carboxilo libre y un grupo amino libre e insustituido en el átomo de carbono α (Lehninger et al, 2005). Por medio del proceso de descarboxilación, las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar el grupo carboxílico final de los aminoácidos, formando aminas o diaminas y dióxido de carbono (MacFaddin, 1976; Straub et al., 1995). Adicional al proceso de descarboxilación, las aminas se pueden generar mediante aminación y transaminación de aldehídos y cetonas (Silla-Santos, 1996). Ec (2.1) Ls reacciones de descarboxilación podrían ser utilizadas por la célula para la obtención de energía y para el control del ph (Abe et al., 1996; Konings et al., 1995). La descarboxilación de un aminoácido en el citoplasma y el transporte de la amina formada al exterior de la célula supondrían, de forma indirecta, la expulsión de un protón al exterior, lo que permitiría controlar el ph intracelular. Además, el transporte de aminas generaría un gradiente electroquímico que podría ser utilizado por la célula para el transporte de nutrientes o para generar ATP a través de la F1F0 ATPasa. Este sistema de descarboxilación podría favorecer el crecimiento en ambientes ácidos (Konings et al., 1995). Por lo que se propone que las enzimas descarboxilasas que participan en el proceso, son formadas por la célula únicamente, cuando esta se encuentra en un medio ambiente ácido y en presencia de un sustrato específico.

32 13 La descarboxilación de aminoácidos y la subsecuente generación de aminas biógenas sólo es posible si se cumple cada uno de los siguientes factores: 1) presencia de las bacterias o enzimas necesarias con actividad proteolítica y descarboxilante de aminoácidos, 2) disponibilidad de aminoácidos libres, 3) presencia del cofactor, 4) existencia de un medio ambiente adecuado en el producto que favorezca el crecimiento microbiano en relación al ph, temperatura, concentración de sal, actividad de agua, y 5) existencia de compuestos potenciadores tales como diaminas. Cualquiera de estos factores pueden verse afectados si se llevan a cabo procesos de catabolismo de las aminas producidas (Chander et al., 1989; Santos et al., 2003). Dentro de las aminas biógenas más conocidas se encuentran la histamina, tiramina, putrescina y cadaverina (Figura 2.1). La histamina es el producto de la descarboxilación de la histidina catalizada específicamente por la enzima histidina descarboxilasa (HDC) de la cual se distinguen dos familias: la HDC dependiente de la piridoxal fosfato, encontrada principalmente en bacterias Gram negativas asociadas a la descomposición de productos de pescado; y la HDC piruvato dependiente, presente en bacterias Gram positivas y especialmente en bacterias ácido lácticas (BAL), implicadas en la descomposición de alimentos fermentados (Landete et al., 2007b). Figura 2.1 Principales aminas biógenas (Önal A. 2007). La tiramina, es generada bajo la acción de la enzima tirosina descarboxilasa (TDC), la cual utiliza solamente piridoxal fosfato como cofactor y es producida exclusivamente por bacterias Gram positivas. Por su parte la putrescina es el resultado de la acción de la ornitina

33 14 descarboxilasa (ODC) sobre su sustrato específico y se trata de una enzima piridoxal fosfato dependiente, mientras la cadaverina es derivada de la descarboxilación del aminoácido lisina, reacción catalizada por la enzima lisina descarboxilasa (LDC) presente tanto en bacterias Gram positivas como Gram negativas (Landete et al., 2007b) Microorganismos productores de aminas biógenas La presencia de una AB en un alimento, o lo que es equivalente la presencia de enzimas descarboxilasas implicadas en la síntesis de AB, se trata de una característica cepa-específica y no de la especie del microorganismo. Requiere de la expresión de al menos dos genes: el que codifica la enzima que cataliza la descarboxilación del aminoácido correspondiente, y el que codifica una proteína transportadora implicada en el intercambio aminoácido/ab. Dicha condición puede darse tanto en bacterias Gram positivas como en Gram negativas y pueden encontrarse en especies de diversos géneros como Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Escherichia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Pseudomonas, Micrococcus, Kocuria, Morganella, Vibrio (Fernández y Álvarez, 2005) e incluso en bacterias ácido lácticas (BAL) pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Carnobacterium y Lactococcus (Jay, 2000). En alimentos no fermentados las responsables de la síntesis de AB son bacterias contaminantes, principalmente Gram negativas. Mientras que en los alimentos y bebidas fermentadas en los que intervienen las BAL (vino, sidra, productos lácteos, vegetales, embutidos, entre otros) además de los microorganismos contaminantes, la actividad descarboxilante puede estar asociada a las bacterias que forman parte del cultivo iniciador y de la microbiota secundaria. Al parecer existe un incremento en la actividad descarboxilante en la etapa estacionaria de desarrollo microbiano, generado quizás debido a la ausencia de carbohidratos fermentables, lo cual hace que las bacterias ácido lácticas descarboxilen los aminoácidos libres como una fuente alternativa de energía metabólica en medios pobres en nutrientes (Fernández y Álvarez, 2005; Landete, 2005). En la Tabla 2.4 se presentan las AB más conocidas y los principales microorganismos que han sido asociados a su producción en productos tan variados como vino, cerveza, queso, atún, derivados de la soya y productos cárnicos.

34 Tabla 2.4 Microorganismos productores de aminas biógenas. 15

35 16 En productos de pescado la presencia de aminas biógenas es aún mayor que en productos lácteos, se reportan niveles de histamina del orden de 160,8 mg/100 g en muestras de bollos rellenos de atún que poseen altos recuentos de Escherichia coli (Chen et al., 2008). En productos similares se han hallado niveles superiores a 50 mg/100 g de histamina, y concentraciones de solo 8,5 mg/100 g de putrescina, triptamina, feniletilamina, espermina, espermidina, tiramina y agmantina, las cuales están relacionadas con la presencia de Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Staphylococcus xylosus, Staphylococcus sciuri, Bacillus thuringiensis, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae en dichas muestras (Hsu et al., 2009). Kung et al. (2008), reportan que cepas de Staphylococcus carnosus provenientes de productos a base de pescado elaborados en Taiwan, son capaces de producir alrededor de 10,2 ppm de histamina cuando han sido inoculadas en caldo soya tripticasa suplementado al 1% con L-histidina. Mohamed et al. (2009), estudiaron los cambios en el contenido de aminoácidos y de aminas biógenas en pescado salado fermentado de Egipto, durante la etapa de maduración (20 días) y almacenamiento (40-60 días) encontrando que la concentración total de aminoácidos libres se incrementó de 8 a 72 g/kg después de 60 días de almacenamiento y el contenido total de aminas biógenas varió de 84 a 1633 mg/kg durante el periodo investigado. Cadaverina fue la amina detectada en la mayoría de las muestras ( mg/kg) mientras que histamina solo excedió el rango de tolerancia luego de 60 días de almacenamiento (211 mg/kg). En vinos de fruta donde se identificaron especies de Bacillus pumilus, Bacillus sp., Acetobacter pasteurianus y Zygoascus hellenicus var. hellenicus se encontraron valores inferiores a 5,2 mg/l para putrescina, cadaverina, triptamina, feniletilamina, espermina, espermidina, histamina, tiramina y agmantina (Chang et al., 2009). Landete et al. (2007c), sugieren que la producción de histamina, tiramina y feniletilamina en vinos es debida principalmente a la presencia de bacterias ácido lácticas y no a la de bacterias acéticas y levaduras. En vinos con altas cantidades de tiramina y feniletilamina se observó la presencia de Lactobacillus brevis o Lactobacillus hilgardii siendo el principal productor de tiramina Lactobacillus brevis. Un estudio de Rosi et al. (2009), indica que la habilidad de especies como Oenococcus oeni de producir histamina y tiramina en vinos producidos con fermentación maloláctica depende de la

36 17 cepa bacteriana y de la composición del vino que a su vez esta influenciada por la cepa de levadura usada en la fermentación, además, del tiempo de contacto bacteria-levadura una vez se ha completado la fermentación maloláctica. En productos tipo chorizo español se ha reportado que las aminas biógenas más frecuentemente encontradas son β-feniletilamina y tiramina, cuya producción se ha dado principalmente por Lactobacillus curvatus y Staphylococcus carnosus. En jamón la presencia de Serratia liquefaciens ha sido relacionada con la producción de putrescina, mientras que Staphylococcus lugdunensis se cita como productor de cadaverina. Solo ciertas cepas de Staphylococcus capitis han sido relacionadas con la producción de histamina (Landeta et al., 2007). En productos derivados de la soya los niveles de histamina, tiramina, triptamina, feniletilamina, putrescina, espermina, espermidina, cadaverina y agmantina producidos por Staphylococcus pasteuri y Bacillus subtilis son inferiores a 5 mg/100g (Tsai et al., 2007). Sin embargo, Gennaro et al. (2003), han reportado que existen ciertos microorganismos que poseen actividad catabólica frente a aminas como histamina (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Serratia flava, Clostridium feseri) y tiramina (Sarcina lutea, Aspergillus niger, Triechosporum spp), dicha capacidad para metabolizar estos compuestos, podría generar una disminución en los niveles de aminas biógenas en un alimento. En quesos, los estudios coinciden en que los factores que intervienen en la producción de AB son principalmente las condiciones de higiene, el tipo de materia prima utilizada y el uso o no de cultivo iniciador (Innocente et al., 2007; Pintado et al., 2008; Martuscelli et al., 2005; Öner et al., 2006; Gosetti et al., 2007; Komprda et al., 2007). Adicional a la producción de aminas biógenas en quesos, es relevante la presencia de microorganismos patógenos tales como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella spp. y Listeria spp. Los microorganismos descarboxilasa positivos presentes en queso pueden ser parte de la población natural de la leche usada en la elaboración de éste, o pueden ser introducidos por contaminación antes, durante o después del proceso.

37 18 Straub et al. (1995), han sugerido que varias especies de Lactobacillus (L. bulgaricus, L. casei y L. acidophilus) producen histamina en leche, mientras que cepas de Leuconostoc y Lactococcus solo son capaces de producir tiramina cuando la leche ha sido suplementada con el aminoácido precursor (González et al., 1998). Según Fernández et al. (2000), los cultivos iniciadores lácticos usados en la producción de queso pueden tener un papel importante en la producción de aminas biógenas. La producción de ácido es la principal manifestación de su crecimiento, seguida por la degradación de proteínas; estos hidrolizan las proteínas e incrementan los niveles de aminoácidos libres los cuales pueden usar para su crecimiento (Santos et al., 2003; Gennaro et al., 2003). Santos et al. (2003), estudiaron la formación de aminas en cultivos iniciadores usados ampliamente en la elaboración de queso (Lactococcus lactis subsp. cremoris y Lactococcus lactis subsp. lactis) a 20 y 32 C, encontrando que la acumulación de aminas biógenas durante la fermentación ocurre después de 6 y 12 h (histamina, tiramina y serotonina) y luego de 24 h (triptamina y 2- feniletilamina). Estos resultados coinciden con observaciones que sugieren que la formación de aminas biógenas ocurre en las fases avanzadas de la fermentación (Fernández et al., 2000). Con respecto al efecto de la temperatura los niveles de histamina acumulados a 18 y 24 h parecen ser mayores a 32 que a 20 C, de igual manera la tiramina solo es formada cuando la fermentación se realiza a 32 C (Santos et al., 2003). Bouton et al. (2009), estudiaron el efecto de las asociaciones de cultivos iniciadores compuestos por Lactobacillus mesófilos y Enterococcus usados en la elaboración de queso tipo suizo fabricado con leche de vaca microfiltrada y suplementada con Propionibacterium, encontrando que el patrón de crecimiento de los cultivos fue muy similar al observado en quesos elaborados con leche cruda. La presencia de Enterococcus afectó negativamente la supervivencia de cepas de Streptococcus, y no se detectaron aminas biógenas en los quesos al finalizar el proceso de maduración cuando Enterococcus estuvo presente. Por su parte Lanciotti et al. (2007), luego de evaluar el contenido de aminas biógenas durante la etapa de maduración de quesos elaborados con leche de vaca y leche de oveja sometidas a tratamiento de homogenización con 100 MPa encontraron que la microbiota presente y la concentración de aminas biógenas durante la maduración se ve significativamente influenciada por el tipo de leche usada y por el tratamiento de homogenización. La elevada presión de la

38 19 homogenización reduce significativamente la presencia de levaduras, Micrococcus y Lactobacillus en el proceso de maduración, a la vez que reduce el contenido de aminas biógenas en ambos quesos, efecto contrario al observado durante la elaboración de queso a altas temperaturas, las cuales al parecer potencian la producción de histamina; mientras que un incremento en la concentración de sal puede tener el efecto inverso (Santos et al., 2003). Se ha observado que además de bacterias ácido lácticas, especies de Enterobacteriaceae poseen la capacidad para producir histamina, tiramina, putrescina, cadaverina y 2- feniletilamina, mientras que Clostridium puede producir histamina, triptamina, y tiramina en quesos (Edwards y Sandini, 1981). En Venezuela solo existe un estudio en quesos madurados realizado por Contreras et al. (2007), el cual reporta que la amina biógena presente en mayor cantidad en quesos tipo Manchego, Brie y Parmesano elaborados en Venezuela es la putrescina, con un nivel máximo en queso Brie de 145,25 mg/l, mientras que los niveles de histamina reportados están en el orden de mg/l en los tres quesos Toxicidad de las aminas biógenas Desde un punto de vista biológico, las AB son moléculas con funciones fisiológicas esenciales para los seres vivos (Shalaby, 1996). Así, algunas aminas como la putrescina, parecen ser esenciales para el crecimiento, la transmisión nerviosa y la proliferación celular en organismos vivos, en plantas específicamente, la putrescina y algunas poliaminas como la espermina y espermidina están implicadas en diversos procesos celulares de respuesta al estrés y al envejecimiento, mientras que la histamina actúa como neurotransmisor y la tiramina es un intermediario de las rutas de biosíntesis de otros neurotransmisores (Ten et al., 1990). Sin embargo, las AB tienen efectos perjudiciales sobre la salud de los humanos ya que pueden producir náuseas, calor súbito, sudoración, dolor de cabeza e hiper o hipotensión Histamina La histamina o β-aminoetilimidazol, amina heterocíclica, es una molécula hidrófila compuesta de un anillo imidazol y un grupo amino unidos por dos grupos metileno (Figura 2.2)