Chlamydia pneumoniae-igg-selisa medac. Castellano 430-TMB-VPS/011110
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- María Soledad Ferreyra Quintana
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1 Chlamydia pneumoniaeiggselisa medac Castellano TMBVPS/011110
2 FABRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUCION medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstrasse 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103 / Fax: ++49/ 4103 / DIRECCION DE PEDIDOS Tel.: ++49/ 4103 / Fax: ++49/ 4103 / TMBVPS/011110
3 Chlamydia pneumoniaeiggselisa medac Enzimoinmunoensayo para la detección de anticuerpos IgG frente a Chlamydia pneumoniae Cat. no.: 430TMB PARA USO EXCLUSIVO DE DIAGNOSTICO IN VITRO INTRODUCCION La chlamydia es una bacteria patógena gram negativa. Su ciclo de vida es obligatoriamente intracelular en la superficie de las mucosas, células endoteliales, células del músculo liso y de acuerdo con hallazgos recientes en ciertas estructuras tisulares del sistema nervioso central. Dependen de fosfatos ricos en energía de sus células huésped convirtiéndose, por lo tanto, en parásitos energéticos. El género Chlamydia comprende cuatro especies: C. pneumoniae, C. trachomatis, C. psittaci, y C. pecorum. C. pneumoniae y C. trachomatis son patógenos humanos obligados y C. psittaci es patógena en humanos y en una variedad de especies animales. Hasta el momento C. pecorum ha sido aislada únicamente a partir de muestras de animales. Las infecciones por C. pneumoniae tienen incidencia en todo el mundo. Los síntomas de la enfermedad, además de ser similares a los de la gripe, incluyen sinusitis, faringitis, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, pneumonía y artritis reactiva. C. pneumoniae está implicada en infecciones asmáticas, sarcoidosis, cancer de pulmón, arterioesclerosis, infarto agudo de miocardio, apoplejía cerebral, esclerosis múltiple y finalmente se está investigando su implicación en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. De acuerdo con Grayston y Saikku (1989), que fueron los primeros en describir esta especie de chlamydia, casi toda la población sufre infecciones y reinfecciones por C. pneumoniae a lo largo de toda su vida. Los síntomas débiles y/o difusos en las infecciones por C. pneumoniae, dificultan su detección e infecciones no detectadas pueden cursar de forma crónica produciendo graves secuelas. El diagnóstico de las infecciones por C. pneumoniae se basa en el aislamiento del patógeno de cultivos celulares, en la detección directa del antígeno, en los test de amplificación de ácidos nucleicos y en la serología. El aislamiento del patógeno a partir de los 430TMBVPS/
4 cultivos celulares normalmente necesita varios pasos consecutivos, esto significa un proceso más largo, restringido a laboratorios especializados y solamente con éxito en raras ocasiones. Los ensayos de inmunofluorescencia directa (IFA) y de enzimoinmunoanálisis para el antígeno (EIA), no han sido ampliamente utilizados, y se ha publicado que tienen baja sensibilidad y especificidad. Para la detección de anticuerpos específicos de especie, la microinmunofluorescencia (MIF) ha sido considerada como el gold standard. La MIF es laboriosa, subjetiva, y requiere mucha experiencia. Este sistema de análisis no está estandarizado; la utilización de diferentes antígenos y diferentes criterios de cutoff para infecciones pasadas y recientes o para infecciones actuales, ocasiona variaciones significativas de laboratorio a laboratorio. Chlamydia pneumoniaeselisa medac utiliza un antígeno altamente purificado y específico. La detección de anticuerpos de IgM, IgA e IgG permite la valoración del estadío de la infección y el seguimiento tras el tratamiento. Chlamydia pneumoniaeselisa medac engloba los requerimientos para la estandarización, objetividad, reproducibilidad y automatización en la rutina del laboratorio. 430TMBVPS/
5 PRINCIPIO DEL ENSAYO La placa está recubierta con un antígeno altamente purificado de C. Pneumoniae. Los anticuerpos específicos de C. pneumoniae presentes en las muestras, se unen al antígeno. Anticuerpos anti IgG humana conjugados con peroxidasa se unen a los anticuerpos IgG (P = peroxidasa). Incubación con el substrato TMB(*). La reacción, se para por la adición de ácido sulfúrico. La absorbancia se lee fotométricamente. Ventajas del ensayo Elevada sensibilidad y especificidad. Las tiras de la microplaca contienen pocillos separables, permitiendo un uso eficiente del test. 430TMBVPS/
6 COMPONENTES DEL KIT Cat. no.: 430TMB 1. MTP Microplaca: 12 x 8 pocillos, identificados en color rosa, (con el soporte y el desecante, sellado al vacío en bolsa de aluminio), divisibles, formau, recubiertos con antígeno específico de C. pneumoniae y FCS, lista para usar. 2. CONTROL Control negativo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano, listo para usar, teñido en azul, conteniendo NBCS, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 3. CONTROL + Control positivo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano, listo para usar, teñido en azul, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 4. WB Solución de lavado: 1 botella con 100 ml de PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, conteniendo ProClin TM BACDIL Diluyente de la muestra: 1 botella con 110 ml de PBS/Tween/NBCS, ph 7,0 7,2, listo para usar, teñido en azul, conteniendo ProClin TM CON Conjugado: 4 viales, cada uno con 4,5 ml de inmunoglobulina de cabra anti IgG humana conjugado con peroxidasa (HRP), listo para usar, teñidos en verde, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 7. TMB TMBsubstrato: 1 vial con 10 ml, listo para usar. 8. STOP Solución de parada: 2 viales, cada uno con 11 ml de ácido sulfúrico 0,5 M (H 2 SO 4 ), listo para usar. 430TMBVPS/
7 1. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Material/Reactivo Estado Almacenamiento Estabilidad Kit sin abrir C hasta la fecha de caducidad Microplaca abierto C en 12 semanas bolsa con desecante Controles abierto C 12 semanas Solución de lavado diluida C 12 semanas Diluyente de la muestra abierto C 12 semanas Conjugado abierto C 12 semanas TMBsubstrato abierto C 12 semanas Solución de parada abierto C hasta la fecha de caducidad No utilizar estos reactivos después de la fecha de caducidad. 2. REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN 2.1. Agua bidestilada. La utilización de agua desionizada puede alterar el procedimiento de la técnica Micropipetas ajustables Contenedores de cristal o de plástico limpios para la dilución de la solución de lavado y de las muestras Sistemas apropiados para el lavado de la microplaca (e.j. pipeta multicanal o lavador de ELISA) Incubador de 37 C Lector de microplaca con filtros para 450 nm y nm. 3. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Antes de comenzar con el procedimiento de la técnica, todos los componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente. Calcular el número de pocillos que se necesiten Microplaca La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el desecante cada vez que se separen pocillos. El almacenamiento y la estabilidad de los pocillos se indican en punto TMBVPS/
8 3.2 Solución de lavado Mezclar un volumen de solución de lavado (10x) con 9 volúmenes de agua bidestilada (p. ej., 50 ml de solución de lavado (10x) con 450 ml de agua). Para 8 pocillos, se requieren 10 ml de solución de lavado diluída. Si se observan cristales en la solución de lavado (10x), deberan de disolverse por calentamiento (max. a 37 C), y/o agitación a temperatura ambiente. No mezclar los reactivos específicos del ensayo procedentes de diferentes lotes del kit (microplaca, controles, conjugado). En contraste con esto, el diluyente de la muestra, el tampón de lavado, el substratotmb y la solución de parada, son en general reactivos que pueden intercambiarse en todos los kits de medac para Chlamydia y Mycoplasma por ELISA. En general, no se recomienda la utilización de reactivos procedentes de otros fabricantes. Solamente se obtienen resultados válidos y reproducibles si se realiza el ensayo ajustándose fielmente al protocolo. 4. MUESTRAS 4.1. El ensayo es apropiado para muestras de suero pero no para plasma No se necesita pretratamiento del suero, como p. ej. inactivación. Sin embargo, no debería estar contaminado con microorganismos ni contener glóbulos rojos Los sueros deben diluirse 1:50 con el diluyente de la muestra. 5.A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA 5.1. Cortar la bolsa de aluminio por la parte superior del cierre en cremallera y extraer el número de pocillos de la microplaca que se requieran (ver 3.1.). Los pocillos de la microplaca están listos para usar y no necesitan prelavado Pipetear 50 µl del diluyente de la muestra en el pocillo A1 como blanco (ver 6.A.), y 50 µl del control negativo en duplicado, del control positivo y de las muestras diluídas de los pacientes para determinaciones en simple. Si es necesario, los pocillos de la microplaca pueden almacenarse en una cámara húmeda hasta 30 minutos a temperatura ambiente antes del inicio de la técnica. 430TMBVPS/
9 5.3. Incubar los pocillos de la microplaca durante 60 min (± 5 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o alternativamente cubrir la placa con un adhesivo. 5.4 Transcurrido el tiempo de incubación, lavar tres veces cada uno de los pocillos de la microplaca con 200 µl de solución de lavado por pocillo. Verificar que todos los pocillos estén rellenos. Después del ciclo de lavado, sacudir la microplaca en papel secante. No dejar secar los pocillos! Proceder inmediatamente! 5.5. Añadir el conjugado (teñido en verde) a cada pocillo. Si el ensayo se realiza manualmente, pipetear 50 µl del conjugado a cada pocillo. Tener en cuenta: Cuando se trabaja con aparatos automatizados, se deben pipetear 60 µl de conjugado a cada pocillo debido a la alta evaporación que se produce en las cámaras de incubación de estos procesadores. Durante la evaluación del test se confirmó la posibilidad de su automatización. Sin embargo, se recomienda verificar la compatibilidad del test con los aparatos utilizados en el laboratorio Incubar nuevamente durante 60 min (± 5 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o alternativamente cubrir la placa con un adhesivo Transcurrido el tiempo de incubación, lavar nuevamente los pocillos de la microplaca (ver 5.4.) Añadir 50 µl de TMBsubstrato a cada pocillo e incubar en oscuridad durante 30 min (± 2 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o cubierta con un adhesivo en oscuridad. Las muestra positivas viran a azul La reacción se para añadiendo 100 µl de solución de parada a cada pocillo. Las muestras positivas viran a amarillo. Limpiar los pocillos de la microplaca por debajo antes de la lectura fotométrica y asegurarse de que no haya burbujas en el interior de los pocillos. La lectura debe realizarse en los 15 minutos siguientes a la adición de la solución de parada. 430TMBVPS/
10 5.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA Diluyente de la muestra Control negativo Control positivo Muestra Blanco (A1) 50 µl Control negativo 50 µl Control positivo 50 µl Muestra 50 µl Incubar durante 60 min a 37 C, lavar 3 x con 200 µl solución de lavado Conjugado 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Incubar durante 60 min a 37 C, lavar 3 x con 200 µl solución de lavado. TMBsubstrato 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Incubar durante 30 min a 37 o C en oscuridad Solución de parada 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer fotométricamente a 450 nm (ref nm) *) Procedimiento manual/automático (ver 5.5.) 6.A. CALCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION) Leer los valores de la D.O. a 450 nm (longitud de onda de referencia nm). Restar el valor del blanco (pocillo A1) de todos los demás valores de la D.O. El valor de la D.O. del blanco, debe de ser menor de 0,100. La media del valor de la D.O. del control negativo tiene que ser menor que 0,100. El valor de la D.O. del control positivo, tiene que ser superior a 0,800. Cutoff = la media de los valores de la D.O. del control negativo + 0,380 Zona dudosa = cutoff ± 10 % Repetir el ensayo si los resultados no cumplen con las especificaciones. 430TMBVPS/
11 6.B. EVALUACION DE LOS RESULTADOS 6.B.1. CUALITATIVO Resultado D.O. < zona dudosa D.O. del Cutoff ± 10 % D.O. > zona dudosa Evaluación negativo dudosa positivo 6.B.2. SEMICUANTITATIVO Indice Cutoff: D.O. muestra Evaluación D.O. Cutoff < 0,9 negativo 0,9 1,1 dudosa > 1,1 positivo Las muestras con valores de la D.O. dentro de la zona dudosa, deberían ensayarse nuevamente junto con otra muestra reciente tomada 14 días después, con el objeto de determinar un cambio en el título. Los resultados deberían interpretarse en relación con IgG e IgM y los datos clínicos y el resto de parámetros del diagnóstico. Concentraciones elevadas de hemoglobina, bilirrubina y de lípidos en el suero, no influyen en los resultados. En casos puntuales, no pueden excluirse reacciones cruzadas con anticuerpos antinucleares, anticuerpos heterófilos y anticuerpos frente a C. trachomatis y C. psittaci. 430TMBVPS/
12 6.C. INTERPRETACIÓN ESPECÍFICA DE IgM/IgA/IgG Resultados posibles IgM IgA IgG COI* COI COI >1,1 <0,9 <0,9 + >1,1 >1,1 <0,9 + + >1,1 <0,9 >1,1 + + >1,1 >1,1 >1, <0,9 >1,1 >1,1 + + <0,9 <0,9 >1,1 + <0,9 >1,1 <0,9 + <0,9 <0,9 <0,9 * CutoffIndex Interpretación 1. Indicación serológica de un estado de infección temprana o de estimulación policlonal de células B. Volver a testar IgM, IgA and IgG después de 14 días. 2. Indicación serológica de infección aguda. Volver a testar IgG después 14 días. 3. Indicación serológica de infección aguda. 4. Indicación serológica de infección aguda. 5. Indicación serológica de infección actual 1. Volver a testar IgA e IgG después de 14 días. 6. Indicación serológica de infección pasada. En caso de sospecha clínica volver a testar después de 14 días los anticuerpos IgA e IgG. 7. Indicación serológica de estado temprano de infección o sólo, persistencia de la IgA 2. Volver a testar IgM, IgA e IgG después de 14 días. 8. No existe indicación serológica de infección actual o pasada 3. En caso de sospecha clínica volver a testar en 14 días los anticuerpos IgM, IgA e IgG. Comentarios: Los resultados en el límite de rango podrían indicar comienzos o disminución de la infección. Volver a testar después de 14 días es recomendable. 430TMBVPS/
13 1 2 Una infección actual podría prevalecer por: Infección crónica con patógenos persistentes: El valor COI de los anticuerpos permanence constante tras varias semanas. Infección aguda: El valor COI de los anticuerpos aumenta considerablemente Alta concentración de IgG: Una infección aguda no puede ser excluída. De acuerdo con Grayston et al. (1989), MIF IgG título 1:512 indica una infección aguda. En casos individuales pueden persistir anticuerpos IgA en solitario. Este fenómeno inmunologico aparece en distintas infecciones bacterianas. La relevancia clínica no es apreciable. 3 En caso de infecciones agudas frescas de C. pneumoniae los anticuerpos en serología podrían ser negativos a pesar de los síntomas clinicos y de la detección positiva de antígeno. Si se detecta una prueba serológica de antígeno positivo o si se quiere hacer un seguimiento, recomendamos testar la muestra después de 14 días para la seroconversión. 430TMBVPS/
14 7. CARACTERISTICAS DEL ENSAYO Durante la evaluación en el diagnóstico, se determinaron las siguientes características del ensayo. 7.A. ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD Se investigaron sueros de pacientes sin síntomas de infección respiratoria para la determinación de la especificidad. No se detectaron anticuerpos frente a C. pneumoniae por MIF. Se investigaron sueros de pacientes con sospecha de infección respiratoria para la determinación de la sensibilidad. Se detectaron anticuerpos frente a C. pneumoniae por MIF en todos los sueros. Grupo de Pacientes Especifidad IgA IgG Pacientes sin infección respiratoria; no se detectaron anticuerpos frente a C. pneumoniae por MIF. 93 % (n=86) 95 % (n=42) Grupo de Pacientes Sensibilidad IgA IgG Pacientes con infección respiratoria; se detectan anticuerpos frente a C. pneumoniae en todos los casos por MIF. 95 % (n=74) 99 % (n=117) 430TMBVPS/
15 7.B. PRECISION Muestra Variación intraensayo Muestra Variación interensayo (n = 11) Media DS CV (%) n Media DS CV (%) D.O. D.O. CN 0,032 0, CN 0,035 0, CB 0,772 0, CB 0,824 0,073 9 CP 1,990 0, CP 2,133 0,149 7 N 1 1,951 0, N 3 1,655 0,140 8 N 2 0,731 0, N 4 1,027 0,087 8 CN = control negativo; CB = control intermedio (no se incluye en el kit);cp = control positivo ADVERTENCIAS GENERALES SOBRE LA MANIPULACION Para evitar contaminaciones entre muestras, no intercambiar los viales y los tapones de muestras diferentes. Los reactivos deben cerrarse herméticamente, inmediatamente después de utilizarse para evitar la evaporación y contaminaciones microbianas. Tras su utilización, los reactivos deben almacenarse como se ha indicado para garantizar su vida media. Tras su utilización, todos los componentes del kit deberían guardarse en su envase original; con objeto de evitar intercambiarlos con reactivos de otro tipo de ensayos o de otros lotes (ver punto 3). INFORMACION SOBRE SEGURIDAD E HIGIENE Debe cumplirse la normativa sobre seguridad e higiene en el trabajo de cada país. Los reactivos de origen humano han sido testados y se ha encontrado que son negativos para Ag HBs, para anticuerpos frente a VIH1/2 y para VHC. A pesar de ello, está altamente recomendado que estos materiales así como aquellos de origen animal (ver contenido del kit) sean siempre manipulados como potencialmente infeccioso y utilizados con todas las precauciones necesarias. CONSIDERACIONES SOBRE ELIMINACION DE LOS RESIDUOS Los residuos químicos y de las preparaciones se consideran en general como material peligroso. La eliminación de estos residuos está regulada a través de las leyes nacionales y regionales y de sus normativas. Contactar con las autoridades locales o con las compañías de gestión homologadas, que aconsejarán del modo en el que se deben eliminar los residuos peligrosos. Fecha de revisión: TMBVPS/
16 BIBLIOGRAFIA Balin, B.J., Gérard, H.C., Arking, E.J., Appelt, D.M., Branigan, P.J., Abrams, J.T., WhittumHudson, J.A., Hudson, A.P.: Identification and localization of Chlamydia pneumoniae in the Alzheimer s brain. Med. Microbiol. Immunol. 187, 2342 (1998). Christiansen, G., Boesen, T., Hjerno, K., Daugaard, L., Mygind, P., Madsen, A.S., Knudsen, K., Falk, E., Birkelund, S.: Molecular biology of Chlamydia pneumoniae surface proteins and their role in immunopathogenicity. Am. Heart J. 138, (1999). Danesh, J., Collins, R., Peto, R.: Chronic infections and coronary heart disease: is there a link? Lancet 350, (1997). Elkind, M.S., Lin, I.F., Grayston, J.T., Sacco, R.L.: Chlamydia pneumoniae and the risk of first ischemic stroke. The Northern Manhattan stroke study. Stroke 31, (2000). Gérard, H.C., Schumacher, H.R., ElGabalawy, H., GoldbachManksy, R., Hudson, A.P.: Chlamydia pneumoniae present in the human synovium are viable and metabolically active. Microb. Pathog. 29, 1724 (2000). Grayston, J.T.: Epidemiology of Chlamydia pneumoniae (TWAR). In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the Third Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, September, (1996). Grayston, J.T., Aldous, M.B., Easton, A., Wang, S.P., Kuo C.C., Campbell, L.A., Altman, J.: Evidence that Chlamydia pneumoniae causes pneumonia and bronchitis. J. Infect. Dis. 168, (1993). Gupta, S., Leatham, E.W., Carrington, D., Mendall, M.A., Kaski, J.C., Camm, A.J.: Elevated Chlamydia pneumoniae antibodies, cardiovascular events, and azithromycin in male survivors of myocardial infarction. Circulation 96, (1997). Gurfinkel, E., Bozovich, G., Daroca, A., Beck, E., Mautner, B.: Randomised trial of roxithromycin in nonqwave coronary syndromes: ROXIS pilot study. Lancet 350, (1997). Hahn, D.L., Peeling, R.W., Dillon, E., McDonald, R., Saikku, P.: Serologic markers for C. pneumoniae in asthma. Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, (2000). Hunter, S.F., Hafler, D.A.: Ubiquitous pathogens: Links between infection and autoimmunity in MS? Neurology 55, (2000). Kuo, C. C., Jackson, L.A., Campbell, L.A., Grayston, J.T.: Chlamydia pneumoniae(twar). Clin. Microbiol. Rev. 8, (1995). LayhSchmitt, G., Bendl, C., Hildt, U., DongSi, T., Jüttler, E., Schnitzler, P., GrondGinsbach, C., Grau, A.J.: Evidence for infection 430TMBVPS/
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