G.G. Meynell y Elinor Meynell. TEORIA Y PRACTICA EN BACTERIOLOGÍA EXPERIMENTAL. Medios no definidos basados en hidrolizados de proteínas:

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1 G.G. Meynell y Elinor Meynell. TEORIA Y PRACTICA EN BACTERIOLOGÍA EXPERIMENTAL. Medios no definidos basados en hidrolizados de proteínas: Contienen una mezcla de los productos de ruptura de las proteínas hidrolizadas como la caseína o el músculo de mamífero. Los principales métodos de hidrólisis son: a) la hidrólisis ácida, generalmente con HCl, que se destina a la preparación de hidrolizados completos de proteínas parcialmente purificadas como la caseína o la gelatina; y b) hidrólisis enzimática por pepsina, pancreatina, tripsina o papaína, que se agrega a preparaciones crudas o parcialmente purificadas, como estómago picado de cerdo o extracto pancreático (Cole & Onslow, 1916). La digestión enzimática conduce a hidrolizados parciales, conocidos como peptonas o triptonas, que generalmente dan un mejor crecimiento que los hidrolizados completos o las mezclas de aminoácidos. El método de preparación es más suave porque presuntamente son preservados los factores de crecimiento hábiles; ya que algunos microorganismos crecen mejor en medios con pequeños péptidos, posiblemente porque pueden ser asimilados cuando los correspondientes aminoácidos, no. ( ver Leach & Snell, 1960). El grado de hidrólisis de las preparaciones comerciales está indicado en los análisis publicados por la distribución del N 2 entre las diversas clases de productos de ruptura de las proteínas, como las proteosas primarias y secundarias, y las peptonas, definidas por su solubilidad en agua, SO 4 (NH 4 ) 2, etc. Las proteosa- peptonas están menos hidrolizadas que las peptonas. Se determina el contenido de N 2 total y los contenidos de aminoácidos nitrogenados, por el método de Kjeldahl y por titulación con formol respectivamente. Los distintos tipos de digeridos a menudo difieren marcadamente, especialmente cuando son usados en medios líquidos. El crecimiento exponencial a menudo no ocurre en su rango máximo, y la curva de crecimiento puede consistir en series de porciones lineales de pendiente decreciente, indicando agotamiento sucesivo de diversos nutrientes. Esto puede ser solucionado por la adición de glucosa y el incremento de la aireación, aunque la formación de espuma es una seria dificultad. Sobre medios sólidos, las diferencias son menos importantes. Así, en un conteo viable, el número de colonias es a menudo el mismo, sin embargo el diámetro de las mismas puede diferir. Algunos medios comerciales son preparados para dar un ph

2 correcto cuando se disuelven en agua. Aunque otros no, por lo que debe controlarse en cada caso ya que las soluciones son a menudo ácidas. Digeridos de CASEINA La Caseína es obtenida del caseinógeno de la leche por precipitación ácida, dando hidrolizados contaminados con factores de crecimiento. Ambos hidrolizados, tanto los ácidos como los enzimáticos, son usados como fuentes de aminoácidos y péptidos. También se venden algunos preparados libres de vitaminas, pero a pesar de eso, algunos autores los purifican antes de su uso. Hidrolizado ácido de caseína: La caseína es calentada con HCl fuerte antes de ser completamente hidrolizada en sus aminoácidos constituyentes: por ej.: 200g de caseína pueden ser autoclavados con 280 ml de HCl- 6N. por 45 a 120ºC o un reflujo con HCL -1N por 18 hs. Hay una destrucción completa el triptofano, una pérdida severa de cisterna, y pérdidas menores de serina y treonina. El hidrolizado es inicialmente negro profundo, y los pasos siguientes de preparación incluyen decoloración y remoción de los cloruros aportados por el HCL. Un método involucra la destilación del HCl residual, precipitación del Cl como PbCl 2 que también decolora la solución, y la remoción del PB +3 con SBa y SO 4 H 2. El método de purificación, especialmente el que usa carbón, puede alterar considerablemente las propiedades del hidrolizado ( ver Barton- Wright, 1952). Así, Ford, Perry y Briggs (1958) removieron vitaminas residuales de 50 g de un hidrolizado libre de vitaminas, previamente disuelto en 700 ml de agua y ajustado a ph 3.8 con ácido acético, adicionando 10g. de carbón activado, agitando dirante 1 hora, y filtrando ( por ej. por succión a través de un papel Whatman nro.50). El filtrado fue tratado con OHK 10N hasta ph 6.5, tratado después con carbón y nuevamente filtrado. El volumen final del filtrado fue llevado a 1 litro con agua destilada. Hidrolizado enzimático de caseína: Hay hidrolizados parciales con teniendo proporciones variables de pequeños péptidos y aminoácidos, incluyendo triptofano. El ph habitual para la hidrólisis por papaína está entre 5 y 7, y para el extracto pancreático alrededor de 8.0. Los digeridos enzimáticos libres e vitaminas, descriptos por Roberts y Snell (1946) están hechos con pancreatina (ej. USP o BP). Gradualmente se adiciona 120g de caseína libre de vitaminas a una solución de NaHCO % p/v, hasta que la caseína esté completamente disuelta. Luego se agrega 600 mg de pancreatina suspendida en ml de agua y suficiente tolueno libre de

3 sulfuros para formar en la superficie una lámina que actúe como desinfectante. Incubar por 48 hs a 37ºC. El tolueno, luego es removido por el vapor fluente del autoclave por Enfriar el digerido a temperatura ambiente, ajustar el ph a 6.0 adicionándole 7 ml de ácido acético glacial, filtrar luego por succión. Adicionar 60 g de carbón activado, agitar por 30 y nuevamente filtrar un filtro Filter- Cel, si fuera necesario. Adicionar 75ml de ácido acético glacial al filtrado, para darle un ph 3.8 y mezclar 24 de carbón activado. Después de 30 agitando, filtrar para retirar el carbón. Pasar ml de agua a través del residuo obtenido de cada filtración y hacer un pool del digerido a granel, el cual es finalmente diluído a 2.4 l. Esto corresponde a 50mg de caseína/ml de digerido, y el digerido es descartado cuando están presentes por lo menos 40 mg/ml de sólidos. Para un digerido crudo, el método se interrumpe después de la remoción del tolueno. Digeridos de músculo: Las enzimas proteolíticas más comúnmente usadas son la tripsina, derivada de páncreas de mamífero, y la papaína, del fruto de la papaya. La digestión tríptica se hace frecuentemente por el método de Hartley s (1922), o por la modificación de Pope & Smith (1932), usando un extracto pancreático preparado de acuerdo a Cole & Onslow (1916). A pesar de que este método es extremadamente efectivo, es dificultoso cuando el extracto es hecho con páncreas fresco de cerdo y la digestión lleva más tiempo que la de la papaína. Otras preparaciones de tripsina, incluyendo la enzima purificada, no conducen a un desarrollo satisfactorio en el medio. La preparación de la farmacopea, Liq. Tripsina Co, B.P., contiene glicerol, lo cual puede ser un inconveniente. La papaína es considerablemente más fácil de trabajar debido a su alta estabilidad térmica y su indiferencia al ph. La digestión puede ser hecha rápidamente a temperaturas superiores a 60ºC y ph entre 6 y 8, mientras que la tripsina es rápidamente inactivada aún a 50 ºC y el ph debe ser mantenido en 8.0. Numerosos métodos de digestión papaínica han sido publicados, pero como se describe más abajo, han probado ser satisfactorios usando polvo de papaína comprado comercialmente, y no requieren grandes volúmenes de líquido para ser llevados a altas temperaturas. En todos los métodos es habitual que después de la digestión, se leve a ebullición a ph 5.0, para flocular la proteína no digerida, que

4 luego es filtrada, y ajustado el ph a e hirviendo por 30 ( o autoclavando a 121ºC por 15 ) para remover los fosfatos que precipitan durante el subsiguiente autoclavado a ph 7.4. Sin embargo, se remueven otros compuestos además de las proteínas y los fosfatos, incluyendo hematina ( Herbert 1949) y significativas cantidades de cationes. El calentamiento a ph alto se ha usado para bajar la concentración de hierro del hidrolizado de caseína (Mueler & Miller,1941), y las deficiencias en Mn y Mg (<10-6 M) halladas en algunos medios presumiblemente pueden provenir de este método ( Webb, 1948; Weinberg, 1955). Hay una pérdida frecuente de timina. Algunos agar nutritivos han sido adicionados con ClNa al 0.5%, p/v, sin embargo ésto es sólo necesario, para prevenir la hemólisis en los medios en los que se agrega sangre para preparar el agar sangre ( Cruikshank, 1965). Omitiendo el ClNa completamente es el camino más simple para detener el desarrollo de Proteus: si esto falla, se puede ensayar con ClNa al 4% p/v (Koper, 1962). Todos los digeridos de músculo probablemente contienen carbohidratos fermentables, inicialmente, como los preparados a partir de soja, sin embargo éstos son removidos en las peptonas compradas para tests de fermentación. El método tradicional para remover azúcares es, incubar el caldo filtrado con levadura fresca, por ejemplo 60g. de levadura de panadería con 60 l. de caldo a ph 7.0 por una hora a 30ºC (Pope&Smith, 1932). El caldo digerido papaínico de Hartley normalmente no necesita ser bufferado, mientras que no sean agregados azúcares como la glucosa u otros. La curva de titulación es aproximadamente lineal entre phs de 5 a 8, y la capacidad de bufferado es igual a un buffer de Sörenson 0.05M a ph 6.8. Caldo digerido papaínico: Mezclar 2.2 Kg de carne picada con 1 l. de agua en un recipiente, + 4ml de OHNa 10N. (40% p/v). Suspender 2g. de polvo de papaína (ej. BDH) en 50 ml de agua, ya sea poniendo el polvo en un mortero y mezclando con gotas de agua con el pilón, o dispersando el polvo con un homogeniezador eléctrico. Adicionar la mezcla de papaína a la carne picada y agitar bien. Calentar a 60ºC. Transferir el macerado a 37ºC por 4 hs, agitando ocasionalmente. Luego agitar el ph a 5.0 por adición de HCl o 10 ml de ácido acético glacial, hervir por 5, filtrar en caliente por gravedad en un filtro de papel grueso ( por ej. Hyduro 904 hecho por J.Barcham Green Ltd, Maistone, Kent). Llevar el filtrado al volumen original con agua destilada. Ajustar el ph a 8.5 con

5 OHNa 10N, hervir 30 o autoclavar a 121ºC por 10, para precipitar los fosfatos, filtrar en caliente por papel de mismo grado. Llevar a ph 7.5, distribuir, y autoclavar a 121ºC por 5. El caldo es innecesariamente concentrado para algunos usos, por lo que debe diluirse al ½ o 1/3 con agua destilada antes de la esterilización. La rutina puede ser interrumpida en dos puntos. La mezcla de carne, álcali y papaína puede ser dejada a 4ºC toda la noche y calentada a 60ºC a la mañana siguiente. El filtrado a ph 5.0 puede ser guardado seguramente, a 4ºC por 4 días, si es saturado con cloroformo (CHCl 3 ). Agar digerido: Se prepara por adición de agar al caldo filtrado a ph 5.0, dándole un ph de 8.5 con OHNa, y autoclavando por 15 a 121ºC, para disolver el agar y precipitar los fosfatos. Cuando se lo retira del autoclave el medio es agitado bien para dispersar el agar y finalmente clarificado pasándolo por pulpa de papel. El filtrado es ajustado a ph 7.4, distribuído y esterilizado por autoclavado a 12ºC- 15. Preparación de las placas de agar nutritivo: Las botellas de agar nutritivo de stock son fundidas por inmersión en agua hirviendo, vapor o autoclave. Antes que el agar fundido sea puesto en las placas debe ser enfriado a 50-60ºC para dsiminuir el agua de condensación que se formará cuando se lo disponga en las placas. Las burbujas que queden serán removidas por flameo de la superficie del agar con un Bunsen. Si las placas se necesitan para el mismo día, requerirán un secado a 37ºC por 1-2 hs, con las tapas removidas e invertidas; pero si van a ser guardadas para stock, las pérdidas por contaminación y desecación se previenen dejándolas toda una noche, cerradas, a 37ºC, y luego guardarlas en bolsas de polietileno cerradas. Las placas para ser usadas para conteos de colonias en superficie, deberán ser colocadas sobre una superficie horizontal. Sin embargo la falla más común en todas las clases de placas es la de usar muy poco medio de cultivo. Por esto es mejor usar medio de más que de menos, pero por ej 35 ml para una placa de 9 cm, es demasiado. Fórmulas basadas en productos comerciales: Agua peptonada o agua peptona: Peptona 10 g ClNa 5g Agua destilada 1000 ml

6 Disolver la peptona y la sal, ajustar ph a 7.4, y esterilizar por autoclave. Para el Agar peptona, se dobla la cantidad de peptona y se adiciona1.5% de agar en polvo. Los fosfatos no precipitan usualmente en los medios sólidos y líquidos si se usa agua destilada, pero se pueden evitar por filtración. El agua peptona sola da un crecimiento pobre, en relación al los caldos de digeridos papaínicos o trípticos, por ej., el conteo de un cultivo no aireado de una noche de Salmonella typhimurium es aprox. 2x10 8 /ml comparado con 1.5x10 9 /ml en caldo. Caldo extracto de carne: Peptona 10g. Extracto de carne 10 g. ClNa 5 g. Agua destilada 1000ml. El extracto de carne contiene suficiente Calcio como para precipitar los fosfatos cuando se autoclave con la peptona a ph 7.4. El medio, que es inicialmente ácido, sin embargo necesita ser autoclavado a 121ºC por 15 a ph 8.5 para precipitar los fosfatos, que son filtrados previamente al autoclavado final. El medio sólido se hace con el agregado de agar. Medio extracto de levadura triptona: Una de las fórmulas más usadas es: caldo L, con adición de Ca M para permitir la adsorción del fago P1 sin precipitación de fosfatos. Triptona 10 g. Extracto de levadura 5 g. ClNa 5 g. Glucosa 1 g. Agua destilada 1000 ml. El ph debe ser 7.0. La glucosa se adiciona en solución estéril al 20% p/v antes de autoclavar el medio. Para el Agar L, el medio se solidifica por adición de 12g. de agar por litro, y la glucosa se adiciona al medio fundido antes de disponerlo en las placas.

7 Stock % p/v Factor de dilución Requerido %( p / v ) ug /ml Fig.2.1 Nomograma de factores de dilución para soluciones stock. Cátedra de Inmunología IIºParte gmg