INTRODUCCIÓN AL DIAGNOSTICO VIROLOGICO

Transcripción

1 INTRODUCCIÓN AL DIAGNOSTICO VIROLOGICO Curso de Infectología y Maestría en Microbiología Clínica, UCA, 2013 Dra Guadalupe Carballal Laboratorio de Virología Clínica, CEMIC

2 Para que sirve el Diagnóstico Virológico?

3 Es el diagnóstico de CERTEZA El cuadro clínico no permite la certeza El diagnóstico virológico sirve para: diagnóstico de infección actual o pasada del paciente pronóstico situación epidemiológica ejemplos

4 Procedimientos diagnósticos de acuerdo a lo que detectan... Directos: * citopatología: lesiones: anatomia patológica * agente infeccioso: Aislamiento in vivo o in vitro * antígeno: inmunoensayos * partícula viral: microscopia electronica * genoma: métodos moleculares Indirectos o serológicos : anticuerpos

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6 Cómo puede detectarse infección pasada o presente?... En suero o plasma ; con Métodos Indirectos o serológicos Pasada: Deteccion de estado inmune (status inmune): Ig G específica en muestra única Presente: Ig M específica o Seroconversión para Ig G en 2 muestras pareadas

7 Valor de la Serología en el siglo XXI Estado inmune: Rubéola, CMV, Hepatitis A y B Diagnóstico: HIV ½, HTLV ½, Hepatitis A, B, y C Epstein Barr Parvovirus HIV 1/2, HTLV Fiebre Hemorrágica Argentina, Hantavirus, muchos arbovirus (Dengue, West Nile, etc

8 Técnicas Serológicas Actuales Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Enzimoinmunoensayos ( ELISA, MEIA) Aglutinación de partículas de latex, gelatina o glób rojos En desuso Fijación de Complemento. RIAM Casos especiales Neutralización in vivo o in vitro: vacunas Inhibición de Hemoaglutinación ( IHA): Influenza Métodos de confirmación Western blot (HIV, HTLV) LIA, RIBA (Hepatitis C)

9 Para que sirve la serología? Estado inmune para Rubeola, CMV, Hepatitis A y B Diagnóstico de Hepatitis virales A, B, y C Diagnóstico de Epstein Barr virus Diagnóstico de Parvovirus Diagnóstico de HIV, HTLV Diagnóstico de FHA, arbovirus ( Dengue, West Nile, etc )

10 TECNICAS DE INMUNOMARCACION

11 DETECCION DE ANTICUERPOS POR ELISA

12 INTERFERENCIA POR FACTORES REUMATOIDEOS

13 DIAGNOSTICOS DIRECTOS

14 Muestras para diagnóstico directo Respiratorias: Aspirado nasofaríngeo (ANF) Hisopado nasofaringeo( HNF), otras Lesion cutánea o mucosa: hisopados de lesiones Sangre,suero orina LCR heces Biopsias, autopsias

15 Obtención de la muestra: esencial! Antes de los 3 días del inicio del cuadro Aspirado nasofaringeo * Hisopados nasal/faríngeo combinado Hisopado nasofaríngeo Hisopado nasal Aspirado traqueal LBA Biopsia Muestras respiratorias

16 HISOPADOS NASOFARINGEOS

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18 Métodos Directos Clásicos-1 Histopatología Con tinciones histológicas: HE, otras Inclusiones intranucleares o citoplasmáticas en tejidos infectados Ej: CMV, Herpes, Adenovirus, Rabia, Virus BK, Viruela, etc Baja sensibilidad de la histopatología si las lesiones son focales

19 Inclusión intranuclear por Citomegalovirus: Ojo de Buho

20 iopsia renal, H & E. Nefritis intersticial por poliomavirus(virus BK). Infiltrado intersticial a redominio de linfocitos. Notar la inclusión intranuclear grande anfófila con anillo de cromatina enso periférico en el núcleo de la célula tubular. CEMIC, 2007 Gentileza de Dr Iotti

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22 Métodos directos- 2 Microscopía electrónica Detecta partículas virales y su mofología Diferencia las diferentes familias pero no virus de la misma familia Es rápido, pero no se emplea de rutina por Ej: su alto costo y baja sensibilidad ya que depende de la concentración viral en la muestra. Diagnostico virus productores de diarrea en M Fecal Diferenciar en forma rápida viruela de varicela en vesículas Estudios de investigación en patogenia

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26 Métodos Directos 3: Aislamiento in vivo en animales de experimentación Huevos embrionados Ratones lactantes o adultos Cobayos, conejos, primates Observación de lesiones, enfermedad y/o muerte Utilidad: Antes para diagnóstico Ahora: estudios de patogenia viral y producción de algunas vacunas (ej Influenza en huevos)

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28 Ratones lactantes

29 ratones

30 Cobayo muerto por Virus Junín

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32 Huevo embrionado inoculado con virus

33 Acción citopática en membrana de huevo embrionado

34 Desventajas del Aislamiento en animales Alto costo de mantenimiento de bioterios Complejidad Bioseguridad Necesidad de animales libres de patógenos

35 Métodos directos- 4 Aislamiento in vitro: CULTIVOS CELULARES Gold standard del diagnóstico para los virus cultivables

36 Qué es un cultivo celular?

37 Tipos de cultivos celulares Primarios: prepucio humano (CMV) Cultivo de células diploides:mrc-5, WI- 38 Líneas celulares contínuas: HEP-2, VERO, LLC- MK2-, MDCK, BHK, etc (ver bibliografía )

38 ACP: Sincicio por virus Sincicial Respiratorio

39 CULTIVOS CELULARES DE USO FRECUENTE Y VIRUS QUE DETECTAN Primario Riñón de mono Influenza, Parainfluenza, Enterovirus Riñón de conejo Herpes simplex Riñón de embrión humano Adenovirus, Enterovirus Fibroblastos de prepucio de recién nacido Citomegalovirus Diploide Pulmón humano fetal: MRC-5 Continuos Carcinoma de laringe: Hep-2 Riñón de perro: MDCK Carcinoma de pulmón: A-549 Riñón de primate LLC-MK2 Citomegalovirus; Varicela, Herpes Rhinovirus; Enterovirus Adenovirus, Respiratorio Sincicial Respiratorio Sincicial; Adenovirus Herpes, Enterovirus Influenza Adenovirus, Herpes simplex; Enterovirus Parainfluenza, Metapneumovirus

40 Requerimientos para un laboratorio de Aislamiento en cultivo celular Equipamiento Bioseguridad Eliminación de material infeccioso en condiciones adecuadas Personal altamente entrenado Alto costo

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42 Flujo laminar de seguridad biológica

43 Conservación de virus y células en tanques de Nitrógeno Líquido

44 Microscopio invertido para observación de cultivos celulares

45 RMK FLU PARA RHINO HS V ENTERO RS V MRC-5 CMV HS V VZV ADV ENTERO AGMK RUBEOLA Ais lamiento en Cultivos celulares A549 HS V ADV VZV RS V HS V hmpv FLU HEP-2 LLC-MK2 MDCK + Identific ac ión por IF, HA Dra. G. Carballal, CEMIC 2003 Ej de diferentes líneas celulares para aislamiento viral

46 Acción citopática: ACP

47 ACP

48 Cultivo de celulas de origen epitelial: sin ACP

49 Diferentes tipos de cultivo En tubos, botellas o policubetas: monocapas celulares: detección de ACP mas identificación por IF u otros métodos En Shell vial ( cultivo rápido): resultado en hrs: detección de antígenos virales tempranos antes de la aparición de ACP. Ej: CMV

50 CITOMEGALOVIRUS: AISLAMIENTO Cultivo de fibroblastos de prepucio humano CULTIVO CONVENCIONAL: semanas SHELL VIAL O CULTIVO RÁPIDO: 1-2 dias

51 Ventajas del cultivo celular Es el gold standard del diagnóstico para virus cultivables Permite obtener la cepa viral para tipificación, estudios genómicos o de resistencia a antivirales Permite el diagnóstico de certeza de infección actual : Ej: aislar CMV de sangre o tejidos (no de orina o fauces); aislar virus respiratorios, etc.

52 DESVENTAJAS DEL CULTIVO Rápida Inactivación térmica de algunos virus: CMV, RSV: se requiere en envío inmediato de la muestra REFRIGERADA Alto costo, lento (CMV puede tardar hasta 1 mes en crecer...) Complejo Requiere: -Infraestructura para cultivos celulares -Bioseguridad (diferentes niveles dependiendo de la patogenicidad del virus) -Personal altamente entrenado

53 METODOS DIRECTOS 5 Métodos Rápidos: DETECCIÓN DE ANTIGENOS Muestras : hisopados, aspirados, BAL, biopsias, orina, etc Inmunofluorescencia directa o indirecta: debe contener células infectadas Enzimoinmunoensayos ( ELISAs) de diferente configuración: directos, sandwich, manuales, automatizados. Inmunomarcación en células o tejidos En suero: Hbs Ag, HIV (ELISA, MEIA)

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55 Ventajas de los métodos de detección de antígenos Rapido: horas La IF permite observar la calidad de la muestra Transporte menos estricto Escaso costo Equipos automatizados para ELISA

56 Ejemplos de Inmunofluorescencia directa (IF) o indirecta (IFI)

57 Virus Sincicial Respiratorio en Aspirado nasofaríngeo de niño con bronquiolitis

58 La IF permite apreciar la celularidad de la muestra Una ventaja de la IF

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61 Inmunofluorescencia indirecta mostrando núcleos pp65 positivos Dra Carballal, CEMIC Antigenemia pp65 para diagnóstico de CMV

62 Antigenemia pp 65: IF mostrando núcleos pp65 positivos en PMN de sangre periferica

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64 Celulas BHK persistentemente infectadas con virus JUNIN: IFI para Detección de anticuerpos, CEMIC, 1990

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66 Lesiones de Herpes Zoster Dolor leve (prurito o pinchazo) hasta severo. En 5 días, edema y enrojecimiento y grupos de vesículas claras que evolucionan a ampollas. La erupción de zoster es unilateral y nunca cruza la línea media. Lesiones similares a varicela, pero a diferencia de estas evolucionan menos rápidamente y aparecen en grupos en vez de vesículas aisladas. Pueden estar distruibuidas en parches o ser tan numerosas de formar bandas continuas.

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68 Obtención de la muestra correcta Elegir vesículas nuevas No costrosas o supuradas Romper la vesícula con hisopo Raspar la base de la vesícula con el hisopo para arrastrar células

69 Interpretación de la IF El antígeno debe ser intracelular y estar en la célula correcta Debe presentar la ubicación correcta de acuerdo al virus: intracitoplasmático o intranuclear Debe ser color verde manzana La morfología del antígeno debe ser la correcta para cada virus en particular Debe existir al menos 2 células positivas en la muestra

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71 El uso de controles positivos con células infectadas

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73 METODOS DIRECTOS 6 Métodos Rápidos: DETECCIÓN DE ANTIGENOS por Inmunocromatografía

74 Métodos rápidos: inmunocromatografía Rápidos Menor Sensibilidad No evaluan calidad de muestra Para períodos Epidemicos solamente

75 Met rápidos: Inmunocromatografía Ej: Influenza, RSV Ventajas: rápido, minutos Puede usarse en consultorios Desventajas: No evalúa la calidad de la muestra Baja sensibilidad, en períodos interepidemicos Caro

76 Métodos Directos- 7 Moleculares Detección de genes conservados del genoma Viral: ADN, ARN o ARN mensajero

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79 Muestras para métodos moleculares Cuales : Todas Sangre, suero, LCR, BAL, hisopados, biopsias, orina, semen, etc, etc. Algunas muestras pueden contener inhibidores de la PCR! CUANDO: Cuando el virus está presente!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

80 Si el virus no está presente en la muestra El resultado será falsamente negativo!

81 MÉTODOS MOLECULARES: PCR para ADENOVIRUS Plasma Suero G.R. S.E. MO Controles Pos Neg En plasma, suero, glóbulos rojos, sangre entera y médula osea se observa una banda de 139 pb. correspondiente a una porción del gen del hexón. Izq: controles de peso molecular. M Echavarria et al J. Clin. Microbiol Ej: PCR directa para virus a ADN

82 Ventajas y desventajas de métodos moleculares Alta sensibilidad y especificidad Estan reemplazando al cultivo para los virus cultivables! Rapidez? Desventajas: Necesidad de controles de calidad estrictos Riesgo de contaminación Personal entrenado Equipamiento y costo

83 Métodos moleculares Cualitativos Para ADN PCR directas PCR anidadas (nested) PCR multiples (Multiplex PCR) Detección de ARN mensajero Para ARN: RT-PCR Cuantitativas Carga Viral; PCR en Tiempo Real Otros métodos Secuenciación; Estudios de filogenia: árboles

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88 PCR en tiempo real Ventajas: Amplifica y detecta al mismo tiempo Mas rápido que la PCR común Es cuantitativa! Desventajas: Las mismas que la PCR común Necesidad de controles de calidad

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90 PCR EN TIEMPO REAL Figura 8 METODOS MOLECULARES PARA DIAGNOSTICO DE VIRUS RESPIRATORIOS B: PCR EN TIEMPO REAL PARA DETECTIÓN DE DIFERENTES GENOTIPOS DE ADENOVIRUS Detección de diferentes serotipos de Adenovirus por PCR en Tiempo Real. El gráfico con distintas curvas muestra el aumento de fluorescencia -en distintos colores- en función del Ct (ciclo que atraviesa el o valor de corte threshold- ). A menor Ct, mayor concentración del genoma viral en la muestra. En el control negativo (agua) no se observa curva. Las diferentes curvas representan la amplificación de los distintos serotipos de adenovirus. Tomado de Marcela Echavarria, Laboratorio de Virología Clínica, CEMIC: A generic multiplex Real Time PCR for detection of human adenoviruses: Validation with various adenovirus serotypes, Clinical Virology Symposium, 2005

91 10 5 F Nº de ciclos 35 PCR en Tiempo Real

92 Los métodos moleculares se veran en detalle en el Seminario de la semana próxima

93 Muestras: obtención y envío Muestra adecuada en el momento adecuado! Muchas muestras son irrepetibles! Cual y cuando es adecuado?? Envio en condiciones de Bioseguridad y bien rotulada Orden con datos del paciente Comunicación con el laboratorio! Interpretación del resultado

94 MAYOR COMUNICACIÓN ENTRE MÉDICO Y LABORATORIO DE VIROLOGÍA!!!!! Cuando? Como obtener? Cómo enviar la muestra?

95 Descansemos..

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