Variantes genéticas del Vih-1, resistencia transmitida a drogas antirretrovirales y progresión clínica en pacientes cubanos no tratados
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- José Antonio Villalba Redondo
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1 ARTÍCULO ORIGINAL / ARTÍCULO ORIGINAL Variantes genéticas del Vih-1, resistencia transmitida a drogas antirretrovirales y progresión clínica en pacientes cubanos no tratados Hiv-1 genetic diversity, transmitted drug resistance and diseases progression in naive treatment cuban patients Liuber Yans Machado Zaldivar 1 Héctor Manuel Díaz Torres 2 Orlando Martínez Pérez 3 Madeline Blanco de Armas 4 Liodelvio Martínez Fernández 5 Marta Dubed Echevarría 6 Nancy Ruiz Gutiérrez 7 Eladio Silva Cabrera 8 Rev Panam Infectol. 2014;16(4): Recibido el 29/4/2014 Aprobado el 20/10/2014 Institución donde el trabajo fue realizado: Laboratorio de Investigaciones del Sida, 1 Licenciado en Bioquímica. Máster en Bioquímica Investigador Agregado Laboratorio de Investigaciones del Sida (LISIDA), 2 Especialista de II Grado en Medicina Interna. Doctor en Ciencias Médicas. Máster en Infectología. Investigador 3 Licenciado en Microbiología. Máster en Bioinformática. Universidad de las Ciencias Informáticas, La Habana, Cuba. 4 Licenciada en Bioquímica. Doctora en Ciencias de la Salud. Investigador Auxiliar Laboratorio de Investigaciones del Sida (LISIDA), 5 Especialista de II Grado en Medicina Interna. Máster en Infectología. Hospital Clínico Quirúrgico Hermanos Ameijeiras, La Habana, Cuba 6 Licenciada en Biología. Máster en Virología. Investigador 7 Licenciada en Biología. Máster en Bioquímica. Investigador 8 Especialista de II Grado en Microbiología. Doctor en Ciencias Veterinarias. Investigador Titular Laboratorio de Investigaciones del Sida (LISIDA), RESUMEN Objetivos: En el presente estudio se determinó la asociación del subtipo del VIH-1 y la resistencia transmitida a los antirretrovirales (ARV) con la progresión a la enfermedad en un grupo de pacientes cubanos infectados por el VIH-1 sin historia de tratamiento antirretroviral. Materiales y Métodos: Se estudiaron 160 individuos de reciente diagnóstico al VIH-1 no tratados entre diciembre de 2007 y diciembre de Se determinó el conteo de CD4+ y la carga viral, así como la variante genética y el perfil de resistencia genotípica a los ARV. Para asociar la progresión de la enfermedad al subtipo viral y la resistencia a ARV se tuvieron en cuenta los valores del conteo de CD4+ para la estimación de la sobrevida según Kaplan-Meier. Resultados: En la muestra estudiada se evidenció una amplia circulación de variantes genéticas del VIH-1, con predominio del subtipo B. El 20 % de las muestras analizadas presentaron alguna mutación asociada a resistencia transmitida a los ARV. No existen diferencias significativas entre los estimados de sobrevivencia del subtipo viral (p=0.221) y la resistencia a ARV (p=0.449). No se encontró asociación en la progresión clínica de la enfermedad, el subtipo viral y la resistencia transmitida a los ARV. Conclusión: Estos resultados enfatizan la necesidad de monitorear la vigilancia de la resistencia transmitida a los ARV, debido a la importancia de la información en la efectividad en los programas de terapia antirretroviral y los servicios. Palabras claves: Subtipo; Resistencia a drogas; Antirretrovirales, VIH-1 ABSTRACT Objectives: The aim of present study was determined the association of HIV- 1 subtype and transmitted drug resistance with the diseases progression in a group of naïve treatment Cuban patients. Methods: 160 newly diagnosed HIV-1 patients and naïve treatment were studied between December 2007 and December CD4 cell counts, viral load, HIV-1 subtype and antiretroviral drug resistance test were performed. Survival analysis by Kaplan-Meier was used to associate CD4 cells counts with viral subtype and drug resistance. Results: High HIV-1 genetic diversity with predominate 221
2 Zaldivar LYM (1) et al. Variantes genéticas del vih-1, resistencia transmitida a drogas antirretrovirales y progresión clínica en pacientes cubanos no tratados of subtype B was showed. Overall, 20 % had evidences of any mutations associated to transmitted drug resistance. No significant differences were detected when compared the survival analysis of viral subtype (p=0.221) and drug resistance (p=0.449). Conclusion: These results emphasize the necessity of monitoring of drug resistance surveillance, because of important information on effectiveness of antiretroviral therapy programmes and services. Keys words: Subtype, Drug resistance HIV-1; Antiretroviral, HIV-1 INTRODUCCIÓN El diagnóstico y monitoreo de la infección por el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), la vigilancia epidemiológica, la asistencia médica y el tratamiento, son elementos claves en la estrategia nacional de prevención y control del VIH/sida en Cuba (1-2). La epidemia cubana de VIH/sida se caracteriza por presentar una elevada variabilidad genética en la población seropositiva, con predominio del subtipo B y la circulación de otros subtipos y formas recombinantes (3-6). Sin embargo, esta condición no ha limitado el empleo de la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) en la población infectada (2), la cual ha beneficiado a 9662 personas hasta el año 2013 (Registro informatizado, MINSAP, 2014). Transcurrida una década del empleo de la TARGA en Cuba, estudios recientes realizados en la población seropositiva cubana tratada y no tratada, han detectado un aumento de la resistencia del VIH-1 a los fármacos antirretrovirales (ARV) (7-8). Se ha postulado que los subtipos no B pueden tener implicaciones en las variaciones de la progresión a sida, el tiempo de comenzar la TARGA, el cambio de la terapia y el manejo de la resistencia a drogas (9). Sin embargo, son pocos los estudios que asocien la diversidad genética del VIH-1 y la resistencia a los ARV con la progresión de la enfermedad en pacientes no tratados. El objetivo del presente trabajo fue determinar la asociación de las variantes virales del VIH-1 y la resistencia transmitida a los ARV con la progresión de la enfermedad en un grupo de pacientes cubanos no tratados. MATERIALES Y MÉTODOS Pacientes En el período comprendido entre los meses de diciembre de 2007 y diciembre de 2012, se estudiaron 160 muestras clínicas, procedentes de personas de reciente diagnóstico al VIH-1 (fecha de diagnóstico menor de seis meses) y sin historia previa de tratamiento con ARV. Consideraciones éticas Los procedimientos para la toma de la muestra, se llevaron a cabo según exigencias éticas o normas del Ministerio de Salud Pública de la República de Cuba y el Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente (CITMA), que contempla los principios enunciados en la declaración de Helsinki para las investigaciones médicas en seres humanos. Previo a la toma de muestra, se tomó el consentimiento informado de cada paciente que participó en los estudios. Procesamiento y análisis de las muestras Se colectaron 10 ml de sangre periférica en tubos con EDTA (0.2 M, ph 7.2) mediante punción venosa y se separó el plasma mediante centrifugación durante 20 minutos a 2000 g. El plasma se conservó a -85 º C hasta su uso. La carga viral plasmática y el conteo de CD4+ se determinaron al momento del diagnóstico de la infección por VIH-1 y posteriormente en las consultas de seguimiento, según las pautas cubanas para la atención médica al paciente que vive con VIH/sida (Pautas cubanas para la atención médica integral a las personas que viven con VIH/sida, MINSAP). La carga viral plasmática se determinó mediante el empleo del estuche COBAS Ampliprep/COBAS Taqman HIV- 1 Test (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Los resultados de la carga viral plasmática se expresaron en UI/mL y se emplearon como criterio de exclusión para la posterior amplificación de los genes que codifican las enzimas proteasa y transcriptasa inversa (TI). Los valores correspondientes al conteo de CD4+ se obtuvieron a través de la base de datos SIDATRAT del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí (IPK) (10). Para la determinación del subtipo del VIH-1 y la resistencia a los ARV se aisló el ARN viral del plasma para amplificar la región del gen pol de VIH-1 que codifica las enzimas proteasa y TI, según los procedimientos descritos por Machado y cols (6, 8). Para la determinación de las mutaciones asociadas a resistencia y los niveles de resistencia a los ARV se utilizaron los programas disponibles en la base de datos de la Universidad de Stanford ( hivdb.stanford.edu). Asociación de las variantes genéticas del VIH-1 y de la resistencia transmitida con la progresión clínica Para asociar la progresión clínica de la enfermedad con las diferentes variantes genéticas del VIH-1 y a las mutaciones que determinan resistencia transmitida, se tuvieron en cuenta los conteos de las células CD4+ en porciento y valor absoluto de cada paciente desde el momento del diagnóstico confirmatorio hasta que clasificaron como sida y comenzaron la TARGA. Se analizaron 160 observaciones y se obtuvieron los estimados de sobrevivencia para los individuos que formaron parte del estudio durante el tiempo de la investigación (Mes 1_ diciembre 2007 hasta Mes 61_diciembre 2012). Se tomó como inicio del tiempo de sobrevivencia la fecha en que el paciente asistió por primera vez a la consulta después del diagnóstico confirmatorio de la infección por VIH-1 y como final del mismo la fecha en la que el paciente mostraba el evento de interés (enfermedad indicadora de sida y/o valor de conteo de CD4+ menor de 200 células/mm 3 ). Aquellos pacientes que no presentaron signos de progresión al final del estudio fueron considerados observaciones censuradas. Para el análisis de 222
3 sobrevivencia se compararon las agrupaciones subtipos B y no B y los diferentes subtipos: FRC18_cpx, FRC19_cpx, B, FRC_BG y otros, así como aquellos con presencia o no de mutaciones asociadas a la resistencia transmitida a los ARV. Las comparaciones entre los grupos de interés fueron realizadas a través de la prueba de log-rank, donde se planteó como hipótesis nula la ausencia de diferencias significativas entre las estimaciones de cada uno de los grupos en cada uno de los casos. Todos los análisis se llevaron a cabo con el paquete estadístico R versión , empleando el módulo survival versión según el estimado Kaplan-Meier. de resistencia y un segundo grupo No Resistentes que incluyó 128 individuos. El gráfico de sobrevivencia según el análisis Kaplan- Meier entre los grupos resistentes y no resistentes mostró resultados similares a los obtenidos de las comparaciones realizadas entre las diferentes variantes genéticas (Figura 2). La comparación realizada entre estos grupos no aportó evidencias suficientes para rechazar la hipótesis nula que se planteó al realizar el análisis (valor p = 0.499), por lo que se puede concluir que no existen diferencias significativas entre los estimados de sobrevivencia de cada uno de los grupos comparados. RESULTADOS En el estudio el 88.8% de los pacientes correspondieron al sexo masculino y sólo el 11.2% al sexo femenino. La distribución de los subtipos virales de VIH-1 en las muestras a las que se le realizó el análisis se comportó de la siguiente forma: B (35 %); FRC19_cpx (25.6 %); FRC 20, 23, 24_BG (18.1%); otros (incluye G, H, FRU, FRC05_DF) (14.4%) y FRC18_cpx (6.9%). En la Tabla 1 se exponen las características generales de los pacientes incluidos en el estudio. De las muestras estudiadas, el 20 % presentó alguna mutación asociada a resistencia transmitida a los antirretrovirales, fundamentalmente a los grupos de inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (ITIAN) e inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos (ITINAN). Asociación de las variantes genéticas del VIH-1 y la resistencia transmitida a los ARV con la progresión de la enfermedad en pacientes no tratados El análisis de sobrevivencia en personas infectadas con las diferentes variantes genéticas mostró una caída más acentuada de la probabilidad de sobrevivencia a los tres meses (primera línea vertical discontinua), la cual se sostuvo hasta los 12 meses (segunda línea vertical discontinua). Esto se debió a que se mostraron signos de progresión en estos tiempos en todos los grupos comparados. Desde los tres meses y aproximadamente hasta los 15 meses, la caída de la probabilidad de sobrevivencia fue más abrupta que en el resto de los meses (Figura 1). Las comparaciones realizadas entre los grupos de interés (Subtipo No-B vs Subtipo B y FRC18_cpx vs FRC19_cpx vs B vs FRC_BG vs Otros) no aportaron evidencias suficientes para rechazar la hipótesis nula planteada en el análisis (valor p = 0.964; valor p = 0.221, respectivamente), por lo que se puede concluir que no existen diferencias significativas entre los estimados de sobrevivencia de cada uno de los grupos comparados (Tabla 2). Para determinar la posible relación de las mutaciones asociadas a resistencia transmitida y la progresión de la enfermedad según el estimado Kaplan-Meier, los pacientes incluidos se dividieron en dos grupos, los que presentaron mutaciones asociadas a resistencia formaron el grupo Resistentes, que incluyó 32 pacientes con evidencia DISCUSIÓN Diversos estudios realizados en pacientes cubanos infectados con el VIH-1 han descrito una elevada variabilidad genética del virus, con un predominio del subtipo B y la presencia de otros subtipos y formas recombinantes (3-6), así como una alta frecuencia de mutaciones asociadas a la resistencia a los ARV en pacientes tratados y no tratados (7-8). Sin embargo, no existen estudios que asocien la diversidad genética de VIH-1 y la resistencia a los ARV con la progresión de la enfermedad en pacientes cubanos de reciente diagnóstico sin historia de tratamiento antirretroviral. En el presente trabajo no se encontró diferencia significativa en la progresión clínica de la enfermedad entre las variantes genéticas de VIH-1 detectadas en la muestra estudiada. Este resultado es similar al obtenido por Díaz y colaboradores al analizar la asociación de los subtipos B y no B con la progresión a sida en 400 pacientes cubanos infectados por el VIH-1 (11). Varios autores han referido que la progresión de la enfermedad puede deberse a múltiples factores, entre los cuales se encuentran factores virales y genéticos (12-14). Se plantea que la diversidad genética del VIH-1 no afecta la tasa de progresión a sida; sin embargo varios autores asocian los subtipos C, B y D con una progresión rápida de la enfermedad y los catalogan más agresivos que las variantes G, FRC01_ AE; FRC02_AG y A. Estos resultados se basan en evidencias de la coinfección con otros subtipos, así como los factores del huésped, que incluyen la respuesta inmunológica, las condiciones socio-económicas del individuo infectado y la susceptibilidad a comorbilidades y coinfecciones (15-16, 9). Otro aspecto a tener en cuenta, es el tiempo de evolución de la enfermedad, el cual varía entre individuos. En este estudio hubo pacientes que desarrollaron sida al momento del diagnóstico confirmatorio y otros al cierre de la investigación (2012), no habían desarrollado la enfermedad. Esta variación puede deberse a factores tales como: el diagnóstico tardío, la susceptibilidad del huésped (polimorfismo de los correceptores de quimocinas), la genética (genotipos del sistema del antígeno humano leucocitario (HLA del inglés human leukocyte -associated antigen), el sistema inmune (respuesta inmune directa al VIH), la edad del paciente en el momento de la seroconversión, las coinfecciones con otras variantes del VIH u otros agentes como los virus de la hepatitis B (VHB) 223
4 Zaldivar LYM (1) et al. Variantes genéticas del vih-1, resistencia transmitida a drogas antirretrovirales y progresión clínica en pacientes cubanos no tratados Tabla 1. Características generales de los pacientes incluidos en el estudio 2007 n= n= n= n= n= n=6 Total n=160 Sexo (%) Masculino 1 (100) 21 (84) 51 (91.1) 40(88.9) 23 (85.2) 6 (100) 142 (88.8) Femenino - 4 (16) 5 (8.9) 5 (11.1) 4 (14.8) - 18 (11.2) Orientación Sexual (%) HSH 1 (100) 17 (68) 45 (80.4) 31 (68.8) 18 (66.7) 3 (50) 115(71.9) HT - 8 (32) 11 (19.6) 14 (31.1) 9 (33.3) 3 (50) 45 (28.1) Subtipo (%) B 1 (100) 8 (32) 22 (39.3) 17 (37.8) 8 (29.6) - 56 (35) FRC19_cpx - 11 (44) 14 (25) 7 (15.6) 5 (18.5) 4 (66.7) 41 (25.6) FRC_20, 23, 24_BG - 3 (12) 7 (12.5) 13 (28.9) 6 (22.2) - 29 (18.1) FRC18_cpx (7.1) 5 (11.1) 2 (7.4) - 11 (6.9) otros - 3 (12) 9 (16.1) 3 (6.7) 6 (22.2) 2 (33.3) 23 (14.4) Resistencia a ARV (%) - 5 (20) 11 (19.6) 10 (22.2) 5 (18.5) 1 (16.6) 32 (20) HSH: hombres que tienen sexo con otros hombres; HT: heterosexual; FRC: forma recombinante circulante Tabla 2. Prueba log-rank para la comparación del estimado de sobrevivencia entre grupos Grupos Chi cuadrado Grados de libertad p B vs no B B vs FRC19_cpx vs FRC18_cpx vs FRC_BG vs Otros y de la hepatitis C (VHC), además, la variabilidad genética, las características de la cepa viral (pérdida de fragmentos en el gen nef) y la capacidad replicativa (17-21). Al estudiar la posible asociación de la progresión clínica y la presencia de mutaciones asociadas a resistencia transmitida, no se encontró diferencia significativa. Estos resultados concuerdan con lo referido por otros autores, que plantean que la rápida progresión clínica a sida o la muerte no están asociadas a la presencia de variantes de VIH-1 resistentes a los ARV, debido a que las mismas pueden ser menos patogénicas que las variantes salvajes (22-23). Sin embargo, estudios realizados en grupos de pacientes que comenzarían TARGA, mostraron que aquellos que presentaban variantes del VIH-1 multirresistentes a los ARV tenían un alto riesgo de mayor progresión clínica y que el número de mutaciones asociadas a resistencia genotípica y mutaciones en sitios específicos de los genes que codifican proteasa y TI, predicen mortalidad (24-25). En el presente trabajo, solamente se detectó un paciente infectado con la variante FRC19_cpx multirresistente a los ARV. Este individuo, desde su diagnóstico en el año 2010 hasta el momento del cierre del estudio (2012), no mostró ningún evento sida. Sin embargo, la presencia de seis mutaciones asociadas a resistencia a los IP, ITIAN e ITINAN, comprometen las diferentes opciones terapéuticas a suministrarle, que podría conllevar a una progresión más acelerada de la enfermedad, tal como lo refirieron Zacarrelli y colaboradores en el 2007 (24). Varios autores han determinado la posible asociación de variantes resistentes con la progresión de la enfermedad en pacientes tratados (23) ; por lo que estudios de este tipo en individuos recientemente diagnosticados contribuiría a mejorar la atención médica a las personas que viven con VIH. REFERENCIAS 1. Díaz HM, Pérez MT, Lubián AL, Nibot C, Cruz O, Silva E, Rolo F, Izquierdo M. HIV Detection in Cuba: role and results of the National Laboratory Network. Medicc Review. 2011;13(2): Gorry C. Cuba s national HIV/AIDS Program. MEDICC Review. 2011;13(4): Rolo F, Miranda L, Wainberg M, Gu Z, Lobaina L, Noa E et al. Envelope V3 Region Sequences of Cuban HIV- 1 Isolates. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology. 1995; 9: Cuevas MT, Ruibal I, Villahermosa ML, Díaz H, Delgado E, Parga EV et al. High HIV-1 genetic diversity in Cuba. AIDS. 2002;16(12): Pérez L, Thomson M, Aragonés C, González Z, Pérez J, Casado G, et al. HIV Type 1 Molecular Epidemiology in Cuba: High Genetic Diversity, Frequent Mosaicism, 224
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