Mecanismo de la actividad enzimática Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

Transcripción

1 Mecanismo de la actividad enzimática Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

2 Clasificación de las enzimas 1. Oxidoreductasas: Oxidación Reducción 2. Transferasas: Transferencia de grupos C, N, o P 3. Hidrolasas: Desdoblamiento de enlaces por agua 4. Liasas: Separación de enlaces C-C, C-S, y ciertos enlaces C-N 5. Isomerasas: Racemización de isómeros geométricos (re-arreglos intra-moleculares) 6. Ligasas: Formación de enlaces entre carbono y O, S, N acoplados a la hidrólisis de enlaces fosfato de alta energía

3 1. Óxido - reductasas (deshidrogenasas) Catalizan la oxidación o reducción de sustratos Glucosa oxidasa Peroxidasas Lactato deshidrogenasa Ciclohexanona monooxigenasa

4 El mayor número de oxidorreductasas llevan a cabo la reacción: AH 2 + B A + BH 2 Donde: B es el aceptor de elctrones: NAD +, NADP +, ferricitocromo, etc. Nota: Esta reacción ocurre bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas Lactato deshidrogenasa

5 Lactato deshidrogenasa [(S)-L-Lactato:NAD + oxidoreductasa, EC ] Contiene cuatro sitios activos por molécula; esto es, cada subunidad polipeptídica contiene el equivalente a un sitio activo. No hay efecto cooperativo entre los 4 sitios activos. Mecanismo: Bi Bi secuencial ordenado NAD + Lactato Piruvato NADH E-NAD + L E E-NAD + E-NADH P E-NADH E

6 2. Transferasas Catalizan la transferencia de un grupo de un compuesto a otro, los grupos que son transferidos son C, residuos aldehídicos y cetónicos, acil, glicosil, alkil, nitrogenados, fósforo y grupos que contienen azufre. Most transaminases share a common substrate and product (glutamate and oxoglutarate) with glutamate dehydrogenase, and this permits a combined nitrogen excretion pathway for individual amino acids that is commonly described as "trans-deamination".

7 Mecanismo: Bi Bi Ping-Pong Alanine transaminase (EC ) A P B Q E EA-FP F FB-EQ E

8 3. Hidrolasas Catalizan las reacciones de hidrólisis donde el agua es el aceptor del grupo transferido Ejemplos: Amilasas, celulasas, β-galactosidasas, lipasas, Proteasas

9 Mediante gráficas de Lineweaver-Burk Enzima libre: V max = 26.2 mol mg -1 min -1 k cat = 29 s -1 K M = 1.35 mol dm -3 Enzima inmovilizada: V max = 5.2 mol mg -1 min -1 k cat = 5.7 s -1 K M = 0.2 mol dm -3 Ho-Shing Wu, Ming-Ju Tsai Kinetics of tributyrin hydrolysis by lipase. Enzyme and Microbial Technology, 35 :

10 4. Liasas Catalizan la lisis de un substrato, generando un doble enlace en una eliminación no-hidrolítica, no-oxidativa (Sintetasas catalizan la adición a un doble enlace, la reacción inversa de una liasa) Pyruvate decarboxylase (EC )

11 Active site of pyruvate decarboxylase with selected amino acids: Glu-51, Glu-477, Asp-444, and Asp-28. Also displayed are cofactors TPP and Mg 2+. Susane Lowe and J. Gregorzye Ikus Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi. Journal of General Microbiology, 138:

12 5. Isomerasas Catalizan las reacciones de isomerización

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14 6. Ligasas (sintetasas) Catalizan la formación de enlaces entre dos compuestos usando la energía derivada del desdoblamiento de un enlace pirofosfato tal como se encuentra en el ATP

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16 Características de las Enzimas Tasas catalíticas extremadamente altas Condiciones de reacción suaves Especificidad de reacción Regulación Las enzimas (catalizadores biológicos) son efectivas en pequeñas cantidades Permanecen sin cambios después de la reacción No afectan el equilibrio de una reacción reversible, simplemente incrementan la velocidad a la cual el equilibrio se alcanza

17 Especificidad de las enzimas Especificidad de substrato El resultado del reconocimiento molecular El substrato (pequeño) se enlaza a la enzima (grande) vía fuerzas débiles: Enlaces-H, van der Waals, iónicas (algunas veces interacciones hidrofóbicas) El sitio de enlace de un sustrato es generalmente una hendidura sobre la superficie de la enzima que es complementaria para el substrato - en forma (geométricamente complementarios) - en características químicas (complementariedad electrónica) al substrato

18 Especificidad de las enzimas Especificidad absoluta: Especificidad relativa: Quimoselectividad Regioselectividad Estereoespecificidad: Inespecificidad

19 Especificidad absoluta Cataliza la reacción de un substrato único a un producto particular Existen enzimas que sólo aceptan una molécula como sustrato, ejemplos: a) Uricasa, la cual actúa solamente sobre ácido úrico b) Arginasa, la cual actúa solamente sobre arginina c) Carbonic anhidrasa, la cual actúa solamente sobre ácido carbónico d) Lactasa, la cual actúa solamente sobre lactosa e) Sucrasa, la cual actúa solamente sobre sucrosa f) Maltasa, la cual actúa sobre maltosa g) acetilcolinesterasa que actúa solamente sobre los ésteres de colina

20 Especificidad relativa Ciertas enzimas muestran especificidad relativa, ya que actúan sobre muchos compuestos que poseen un rasgo estructural común. Por ejemplo, la fosfatasa del riñón cataliza la hidrólisis de ésteres fosfato del ácido fosfórico a diferentes velocidades, la amilasa hidroliza el almidón independiente de su origen. Las proteasas y lipasas hidrolizan proteinas y lípidos. Es decir, catalizan el mismo tipo de reacción con varios sustratos; pero que tienen en común un mismo grupo químico (amino, fosfato, metil), el cual es el directamente modificado en la reacción, ejemplo esterasa que actúa sobre los grupos éster. Quimoselectividad Es la capacidad de catalizar reacciones con otros grupos funcionales como por ejemplo hidrólisis o síntesis de un enlace amida (aminólisis).

21 Regioselectividad Es la capacidad para discriminar entre las posiciones externas sn-1,3 ó la posición interna sn-2. Lipasa sn-2 selectiva Lipasa sn-1,3 selectiva

22 Estereoespecificidad Es la capacidad de diferenciar entre moléculas de sustrato que posean enantioisómeros cuando se trata de sustratos quirales. O Ciclohexanona Monooxigenasa H O O + H O O O 2,NADPH, H + H 2O, NADP + H H

23 A Stereo Specificity sp 3 D B Enzyme surface C The tetrahedral structure of carbon orbital has rigid steric strain which makes the basic building unit of protein conformation D B B C C D These two triangles are not identical Juang RH (2004) BCbasics

24 Amplia especificidad (La excepción a la regla) Catalizando un amplio rango de compuestos y reacciones

25 Chymotrypsin Has A Site for Specificity O N C C N C C Specificity Site R H R O - C Ser Active Site O N C C N C C Catalytic Site Juang RH (2004) BCbasics

26 Specificity of Ser-Protease Family Planta Piloto de Fermentaciones Trypsin Chymotrypsin Elastase cut at Lys, Arg cut at Trp, Phe, Tyr cut at Ala, Gly O O C N C C N C C C C NH 3 + COO - C Asp Deep and negatively charged pocket O O C N C C N C Non-polar pocket Active Site O O C N C C N CH 3 Shallow and non-polar pocket Juang RH (2004) BCbasics

27 Algunos otros términos importantes Cofactores Iones metálicos Móleculas orgánicas (coenzimas) usualmente derivados de vitaminas FAD NAD/H Grupos Prostéticos Cofactores enlazados covalentemente Apoenzima/holoenzima

28 Cofactores y Coenzimas Son pequeñas moléculas que se asocian con enzimas para facilitar las reacciones que amino ácidos no pueden hacer solos Ejemplo: oxidación reducción Iones metálicos que actúan como cofactores - Cu 2+, Fe 3+, y Zn 2+ Cofactores orgánicos son generalmente referidos como coenzimas - NAD + y CoA Cosubstratos - cofactores que están solamente asociados transientemente con la enzima Grupos prostéticos - cofactores que están permanentemente asociados con la enzima

29 Con y sin Cofactor/Coenzima Haloenzima Una enzima catalíticamente activa con su cofactor Apoenzima - enzima sin el cofactor Apoenzima + cofactor haloenzima (inactive) (active)

30 Regeneración de Coenzimas Las coenzimas son cambiadas químicamente en la reacción en la cual participan Las coenzimas deben ser regeneradas para poder completar el ciclo catalítico En las reacciones catalizadas por NADH, NAD + es reducido a NADH. El NADH debe ser nuevamente oxidado NAD + para permitir que ocurran múltiples ciclos de la reacciones Para los cofactores unidos transientemente, algunas veces la regeneración es realizada por otra enzima En el caso de grupos prostéticos, la regeneración ocurre en una fase separada de la misma secuencia de reacciones enzimáticas

31 Coenzimas Adenosine Triphosphate (ATP) Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD + ) Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADP + ) Flavin Adenine Dinucleotide (FAD)

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33 Metales y oligoelementos importantes como cofactores enzimáticos Metal Ejemplo de enzima Función del metal Fe Citocromo oxidasa Oxidación reducción Cu Ácido ascórbico oxidasa Oxidación-reducción Zn Alcohol deshidrogenasa Facilita la unión de NAD + Mn Histidina amoniaco liasa Facilita la catálisis mediante la extracción de electrones Co Glutamato mutasa El Co forma parte de la coenzima cobalamina Ni Ureasa Lugar catalítico Mo Xantina oxidasa Oxidación-reducción V Nitrato reductasa Oxidación-reducción Se Glutatión peroxidasa Sustituye al S en una cisteína del lugar activo