METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA HOMOGENEIDAD DE LOS MATERIALES DE REFERENCIA DE TRABAJO Y SU APLICACIÓN EN LA PRODUCCIÓN
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- María Victoria Gómez Toro
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1 METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA HOMOGENEIDAD DE LOS MATERIALES DE REFERENCIA DE TRABAJO Y SU APLICACIÓN EN LA PRODUCCIÓN EN EL INSTITUTO FINLAY Autores: Tania Barrios 1, Argentina Cruces 2, Ivis Ontivero 3, Brenda Serrano 4, Luis Izquierdo 5, Mario Landys Chovel 6, Tatiana Mahy 7, Patricia Hernández 8, Deborah Cisneros 8, Lucy Herrera 9, Niurka Gutiérrez Ingeniero Químico, Master en Aseguramiento de la Calidad, tbarrios@finlay.edu.cu 2. Licenciada en Bioquímica 3. Licenciada en Farmacia 4. Licenciada en Bioquímica 5. Licenciado en Matemática, Investigador Auxiliador 6. Licenciado en Ciencias Farmacéuticas, Master en Farmacología Experimental, Investigador Agregado 7. Licenciada en Farmacia 8. Técnico en Química 9. Licenciada en Bioquímica 10. Técnico en Química Instituto Finlay. Avenida 27 entre 198 y 202, La Lisa, C. Habana, Cuba
2 RESUMEN La comprobación de la homogeneidad del lote es un paso obligatorio durante la producción de los materiales de referencia de trabajo (MRT). Las propuestas experimentales más generalizadas se basan en la comparación de la variación bulbo a bulbo con la varianza analítica (precisión del método de ensayo utilizado en el estudio), lo que implica la necesidad de trabajar en condiciones rigurosas de repetibilidad y haciendo uso del método más preciso entre los disponibles con el objetivo de aumentar la potencia de la prueba. Sin embargo, en el orden práctico estas premisas no son siempre alcanzables, de ahí que en este trabajo se propongan variaciones a esta metodología que, sin renunciar al rigor desde el punto de vista estadístico, permitan adaptarse a las limitaciones experimentales y económicas de los métodos de ensayo seleccionados. El trabajo incluye las técnicas estadísticas a utilizar en el análisis de los resultados y la información obtenida con su aplicación en los lotes de MRT producidos durante el último año. Palabras claves: Materiales de referencia, homogeneidad.
3 INTRODUCCIÓN La homogeneidad es requisito para todos los materiales de referencia, de ahí que uno de los pasos a cumplimentar en la evaluación de cada candidato a Material de Referencia de Trabajo (MRT) sea la demostración de que éste, envasado en su forma final, tiene un grado de heterogeneidad no detectable, o que al menos no interfiere en el uso previsto 0. La bibliografía más reciente sobre el tema concuerda en que la homogeneidad absoluta es una condición ideal, difícilmente asegurable en el sentido estricto del término, de ahí que cobre relevancia el cuantificar el aporte que la falta de homogeneidad tiene sobre la incertidumbre asociada al valor de referencia reportado para el material 0. Planteando el problema en términos metrológicos, la demostración de la homogeneidad de un lote implica que la varianza asociada a la media de la característica de interés a lo largo de las unidades que lo conforman resulta no significativa en comparación con la variación que se estima tendrán los resultados analíticos del material en su uso de rutina 0. Esto implica la necesidad de contar con: una estimación realista de la varianza entre bulbos (s 2 Bbo), lo cual depende lógicamente del número de unidades y la forma en que han sido seleccionadas y el valor estimado de la varianza analítica, el cual se obtiene a través del análisis repetido de las porciones seleccionadas 0-0. Para asegurar mayor efectividad en el estudio, las determinaciones se realizan preferiblemente en condiciones de repetibilidad, utilizando métodos de ensayos suficientemente precisos 1-3. La precisión requerida para el estudio de homogeneidad puede definirse de acuerdo al uso previsto para el material, expresándola en función de la desviación estándar permisible para un ensayo como En nuestro caso los materiales de referencia se evalúan por métodos de ensayo inmunoquímicos, químicos o biológicos, entre los que generalmente no se dispone de varias opciones a escoger de acuerdo a su precisión. Esto hace que una de las variantes a considerar en la metodología sea el empleo del mismo
4 método de ensayo con el que se caracteriza el material candidato y la evaluación simultánea de la homogeneidad y el valor de la característica de interés 3. Las recomendaciones para el muestreo hacen hincapié en la necesidad de la aleatorización, tanto en la selección de las unidades como en el orden de ensayo de las mismas 0. En cuanto a la cantidad de muestras, las sugerencias varían número desde una cantidad igual al entero inmediato superior a tres veces la raíz cúbica del tamaño del lote 1, hasta la utilización de 12 muestras y nunca menos de 10 independientemente del tamaño del lote 1, 3. Este trabajo tiene como objetivo describir la metodología a seguir para la determinación de la homogeneidad en los materiales de referencia de trabajo en el Instituto Finlay. MÉTODOS La metodología para determinación de la homogeneidad tiene en cuenta los siguientes aspectos: selección del método de ensayo, muestreo, condiciones del estudio, diseño del experimento, análisis estadístico de los resultados. Selección del método de ensayo: La técnica escogida para el estudio debe ser capaz de detectar variaciones en la concentración del componente de interés. En el caso de que sean varios componente, debe seleccionarse aquel que se prevé sea el menos homogéneo. Si esta condición es aplicable a más de uno, la comprobación debe realizarse para el que se considere más importante dentro del producto. El método de ensayo a emplear debe lograr una precisión igual o mejor que la del ensayo en el que se pretende usar el material de referencia candidato. Es necesario considerar además el número máximo de muestras que es posible analizar en una corrida del ensayo. Muestreo: Si el MRT se ha elaborado y envasado en el Laboratorio de Materiales de Referencia y se conoce el orden de llenado de los bulbos, estos se enumeran consecutivamente y se seleccionan aquellos que correspondan a los 12 primeros números aleatorios generados por un software adecuado. Si el MRT fue llenado en las áreas de
5 producción o no es posible conocer el orden de llenado de los bulbos, se muestrea estratificadamente entre las cajuelas que conforman el lote. Condiciones del estudio: Siempre que el número de alícuotas que es posible analizar en una corrida del ensayo lo permita, todos los bulbos serán evaluados en condiciones de repetibilidad, en caso contrario las muestras se distribuirán balanceadamente, en tantos ensayos como sean necesarios, siguiendo un diseño anidado. El analista designado para realizar el trabajo analítico deberá ser aquel que logre mejor precisión en el método de ensayo seleccionado. Diseño del experimento: Para el desarrollo de los ensayos, el responsable del estudio subdividirá cada bulbo en dos o tres porciones, las cuales serán identificadas con un número de forma aleatoria. La identificación asignada a cada porción de muestra no se revelará al analista responsable de realizar el ensayo. Las porciones serán analizadas en orden consecutivo según su identificación. Si la variante a aplicar es el diseño anidado, las porciones se repartirán de forma tal que las que correspondan a un mismo bulbo sean evaluadas en el mismo ensayo. Análisis estadístico de los resultados: Los resultados son inspeccionados inicialmente de forma tal que puedan detectarse errores burdos, relacionados con la manipulación, preparación de diluciones de las muestras, etc. Un gráfico de Concentración vs. el número de bulbo, hace posible identificar tendencias significativas que puedan ser atribuibles al proceso de distribución de las unidades del lote y detectar posibles valores atípicos. Si estos últimos se presentan y el resultado discrepante mostrado refleja la existencia de una unidad atípica, es decir, los valores de las réplicas de este bulbo, son concordantes, pero su media es significativamente diferente de la del resto de las muestras, los valores no deben ser eliminados pues pueden ser indicativos de falta de homogeneidad. Si por el contrario, la dispersión entre las réplicas de alguno de los bulbos es mucho mayor que la mostrada en el resto de las unidades examinadas por presentar algún valor individual notablemente diferente, los datos correspondientes al bulbo en cuestión serán eliminados antes de
6 continuar el procesamiento estadístico. Si el problema se presenta en más de un bulbo el estudio debe ser repetido. Se realiza posteriormente la prueba de normalidad y se comprueba la homogeneidad de varianzas para finalmente comprobar la hipótesis de homogeneidad del lote por medio de un ANOVA simple, si todas las muestras fueron evaluadas en el mismo ensayo, o un ANOVA completamente anidado, en caso de que se hayan efectuado más de una corrida. Todos los cálculos estadísticos se realizan utilizando el programa MINITAB 15. En ambos casos el aporte de la diferencia entre bulbos a la incertidumbre del valor de referencia aceptado para el lote (u Bbo ) se determina a partir de la varianza entre grupos (bulbos) estimada en el ANOVA, tal como se describe en la ISO Guía 35 0 : 2 u Bbo s EntreGrupos RESULTADOS El procedimiento descrito ha sido puesto en práctica durante los dos últimos años a todos los materiales de referencia producidos en nuestro laboratorio, los cuales han sido utilizados con varios fines entre los que pueden citarse las curvas de calibración, muestras control de calidad y como patrones en los ensayos biológicos. Los resultados de la evaluación del MRT de acetil-colina, utilizado en la curva de calibración del ensayo de determinación de o-acetilo por el método de Hestrin ilustran el uso de esta metodología de trabajo. En este ejemplo se utilizó el mismo ensayo con que fue determinado el valor de la característica de interés, lo que permitió incluir en el valor de incertidumbre reportado el aporte de la falta de homogeneidad. Aunque el esquema experimental más típico es la evaluación de todas las porciones de muestras en condiciones de repetibilidad, en este ensayo sólo pueden incluirse hasta 5 muestras con tres réplicas cada una, motivo por el cual se analizaron los 12 bulbos distribuidos en 2 corridas del ensayo, en un diseño anidado a dos niveles, con tres réplicas por cada unidad de muestra.
7 La Figura 1 muestra las concentraciones de o-acetilo obtenidas para cada réplica de cada bulbo muestreado. Por el comportamiento de los valores no es posible identificar ninguna relación de dependencia entre los resultados de concentración y el orden de llenado de los bulbos, lo que indica que es poco probable la ocurrencia de algún problema en esta etapa que pueda haber afectado su homogeneidad. Tampoco se destaca ninguna unidad cuya media sea marcadamente diferente, ni algún valor individual que resulte atípico con relación al resto de los datos. Estas deducciones se corroboran en los resultados de las prueba de homogeneidad de varianza (valores de probabilidad de 0.196, por la prueba de Bartlett y por la prueba de Levene) y el ANOVA (Tabla 1). El aporte de la diferencia entre bulbos representa el 0.35% de la varianza total, muy por debajo de la variabilidad analítica que constituye el 46.52%. El valor de la incertidumbre estándar por falta de homogeneidad es DISCUSIÓN El valor estimado de la desviación estándar de repetibilidad en este estudio es muy similar al reportado en la validación de este ensayo lo que demuestra que el no haber efectuado las mediciones en condiciones de repetibilidad no afectó la calidad de la evaluación realizada. Un resultado análogo se obtuvo con el resto de los lotes en los que se aplicó el mismo diseño experimental de acuerdo con la información que resume la Tabla 2. La metodología descrita permite evaluar si las diferencias entre las unidades del lote candidato son aceptables para su uso como MRT. Sin embargo, considerando que el resultado del estudio de homogeneidad depende de la magnitud de la variación analítica, es necesario incluir en el procesamiento de los datos la comprobación de que el desempeño mostrado por el ensayo se corresponde con el obtenido durante la validación.
8 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1.- Fearn, T; Thompson, M. A new test for sufficient homogeneity. Analyst, 2001, 126, Lawn, R; Rope, P; Holcombe, G; Stuart, B. Investigation of cost-effective production procedures. LGC/VAM/2001/ Guidelines for the in house production of reference materials. Version 2LGC/ VAM/1998/ ISO Guía 35. Reference materials. General and statistical principles for certification. Third edition Thompson, M; Ellison, S; Wood, R. The international harmonized protocol for the proficiency testing of analitycal chemistry laboratories. Pure Appl. Chem., Vol. 78, No. 1, pp , 2006.
9 Tabla 1. Resultados del análisis de varianza: ANOVA anidado: Concentración vs. Ensayo por bulbo. Fuente Grados de libertad Suma de Cuadrados Cuadrado medio F P Ensayo 1 0,3198 0, ,109 0,001 Bulbo 10 0,1515 0,0151 1,022 0,454 Error 24 0,3556 0,0148 Total 35 0,8269 Componentes de la varianza Fuente Comp. Var. % del Total Desv. Est Ensayo 0,017 53,13 0,130 Bulbo 1, ,35 0,011 Error 0,015 46,52 0,122 Total 0,032 0,178
10 Concentración mol/ml vs. Bulbo Bulbo Figura 1. Variabilidad de la concentración de o-acetilo por bulbo. Tabla 2. Resultados del diseño experimental por lotes. Lote Valor estimado de analítica en el estudio Valor estimado de analítica en la validación Lote 1 0,095 0,109 Lote 2 0,046 0,05797 Lote 3 0,021 0,035 Lote 4 0,010 0,04
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