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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A23K 1/18 A23K 1/00 A23K 1/16 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Técnica que permite aumentar la concentración de ácido linoleico conjugado en la leche y/o el tejido adiposo de un rumiante. k Prioridad: FI FI k 73 Titular/es: VALIO OY Meijeritie Helsinki, FI k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Nurmela, Kari y Griinari, Mikko k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ungría López, Javier ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Técnica que permite aumentar la concentración de ácido linoleico conjugado en la leche y/o el tejido adiposo de un rumiante. La presente invención se refiere a un método para aumentar la concentración de ácido linoléico conjugado, es decir, expresado químicamente con precisión, el isómero cis-9,trans-11 de ácido octadecadienoico (CLA, cis-9,trans-11-c18:2) en la grasa de la leche y/o la grasa de tejido de un rumiante, introduciendo en la alimentación del rumiante, ya sea como tal o en combinación con otro forraje, por separado o junto con otros ácidos grasos, ácido vaccénico, es decir, expresado químicamente con precisión el isómero trans-11 de ácido octadecenoico (trans-11-c18:1). Recientemente, se ha observado que el ácido linoléico conjugado, es decir, CLA, proporciona una protección bastante efectiva contra diversas formas de cáncer (Ha Y.L. y cols., Cancer Res. 1990, 0:97; Ip C. y cols., Cancer 1994, 74:0). Se ha observado que es eficaz contra los cánceres de piel y estómago de ratón y contra el cáncer de la glándula mamaria en las ratas (Scimeca J. A. y cols., Diet and Breast Cancer. American Inst. Of acancer Res. 1994, Plenum Press, Londres). El crecimiento de células cancerígenas en el hombre también ha podido ser inhibido en cultivos celulares (Shultz T.D. y cols., Canc. lett. 1992, 63:12). Se ha observado asimismo que tiene otros efectos metabólicos, parte de los cuales hacen pensar claramente en efectos sobre la salud (Banni, S. y J.C. Martin, Trans fatty acids in human nutrition. Ed. Sebedio and Christie, The Oily Press, Dundee). En la naturaleza, CLA está presente principalmente como componente de la grasa de tejido y la grasa de la leche de los rumiantes, siendo cis-9,trans-11 el principal isómero (aproximadamente 90 %). También están presentes pequeñas cantidades de otros isómeros en la leche, si bien en el contexto de la presente invención, CLA se refiere específicamente al isómero cis-9,trans-11. Por lo tanto, uno de los objetos de la presente invenciónconsiste en proporcionar un método adecuado para la cría de animales según el cual se puede aumentar la concentración de CLA en la grasa de la leche y/o la grasa de tejido de un rumiante. Esto se ha conseguido con arreglo a la invención según el modo descrito en las reivindicaciones de patente adjuntas. El método según la presente invención es adecuado para todos los rumiantes, en particular rumiantes lactantes, como por ejemplo la vaca, en virtud del cual es posible producir para los consumidores leche y productos lácteos con una composición de ácido graso modificada. El cambio en la composición de ácido graso de la leche y los productos lácteos es ventajoso para la salud de los consumidores. Normalmente, CLA, es decir ácido graso cis-9-trans-11-c18:2, constituye entre el 0,3 y el 0,7 % en peso de todos los ácidos grasos de la leche de la vaca. Incluso a esta concentración, puede ya proteger a las personas que consumen productos lácteos contra el cáncer, si la ingestión de grasa láctea es suficientemente alta (Knekt P.R. y cols., Brit. J. of Cancer 1996, 73:687). Los hábitos en el consumo de grasas alimenticias han cambiado en los últimos años. El consumo de grasas, en particular de grasa de leche, ha disminuido y, como consecuencia, también ha disminuido la ingestión de CLA con el alimento. Al aumentar la concentración de CLA en la leche en una cantidad correspondiente a la disminución en el consumo de grasa de la leche, sería posible recuperar la ingestión de CLA con el alimento hasta el nivel de los años anteriores, sin necesidad de aumentar el consumo de grasas. El aumento de la concentración de CLA en la leche puede tener por tanto una gran importancia para la salud pública. Aumentar la concentración de CLA en la leche hasta un nivel superior al anterior supondría un efecto especialmente positivo, ya que en los experimentos con animales, se ha observado que el efecto protector de CLA tiene una clara respuesta a dosis (Ip. C. y cols., Cancer 1994, 74:0). CLA en la comida también puede reducir la cantidad de colesterol negativo (LDL) en la sangre (Lee y cols. 1994, Atherosclerosis, 8:19). La gente lleva ingeriendo el isómero CLA natural de la grasa de la leche miles de años sin haber observado ninguna desventaja. La formación de ácido linoléico conjugado (cis-9,trans-11-c18:2) durante la isomerización de ácido linoléico (cis-9,cis-12-c18:2) en el rumen ha sido descrita del siguiente modo: cis-9,cis-12-c18:2 (ácido linoleico) cis-9,trans-11-c18:2 (ácido linoleico conjugado, CLA) trans-11-c18:1 (ácido vaccénico) C18:0 (ácido esteárico) 2

3 1 2 Se ha logrado aumentar la concentración de CLA en la leche alimentando a las vacas con aceites vegetales que contienen ácido linoléico (Griinari, J.M. y cols., J. Dairy Sci. 1998, 81:121). Kelly cols. (Kelly M.L. y cols., J. Nutr. 1998, 128:881) comparó tres adiciones de aceite vegetal al forraje y su efecto sobre la concentración de CLA en la leche y observó que la adición de aceite con la mayor concentración de ácido linoléico (aceite de girasol) proporcionó la mejor respuesta de CLA en la leche. Observaron que la concentración de CLA en la leche se puede aumentar alimentando a los animales con grasas oleosas que contienen específicamente ácido linoleico. Hasta ahora se creía que el CLA que pasaba a la grasa de la leche se derivaba únicamente del ácido linoleico presente en el forraje del animal, es decir, del isómero cis-9,cis-12- de ácido octadecadienoico, que los microbios del rumen isomerizaban en cis-9,trans-11-c18:2 antes de reducirlo al ácido vaccénico (trans- 11-C18:1) y también a ácido esteárido (C18:0). CLA no está formado en cantidades considerables en la hidrogenación de ácido linolénico, es decir el isómero cis-9,cis-12,cis-1-c18:3 de ácido octadecatrienoico, sino que el ácido vaccénico es también un importante producto de biohidrogenación de ácido linolénico (Harfoot and Hazlewood 1988, The rumen microbial ecosystem. Ed. Hobson, P.N. Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Países Bajos). Según la teoría prevaleciente, parte del CLA formado como producto intermediario en la biohidrogenación de ácido linoleico se escapa del rumen junto con el flujo continuo de salida del fluido del rumen antes de reducirse en ácido vaccénico. El CLA que se escapa del rumen es absorbido principalmente en el intestino delgado, se transfiere a través de la circulación de la sangre a la glándula mamaria y se une ahí como parte de la composición de ácido graso de la grasa de la leche. Los autores de la presente invención han observado que el aceite de pescado, que contiene bajos niveles de ácido linoléico (en la tabla 1 se muestra la composición), aumenta la concentración de CLA en la leche (tabla 2). TABLA 1 Composición de ácido graso del aceite de pescado 3 4 Ácido mirístico (14:0) 8,6 Ácido palmítico (16:0) 18,6 Ácido palmitoléico (cis-9-16:1) 11,9 Ácido esteárico (18:0) 3,6 Ácido oleico (cis-9-18:1) 9,4 Otros cis-ácidos 0,9 Ácido vaccénico (trans-11-18:1),2 Ácido elaídico (trans-9-(18:1) 0,2 Ácido linoléico (18:2,n-6) 2, Ácido linolénico (18:3,n-3) 1,7 EPA (:,n-3),2 DHA (22:6,n-3) 7,6 % 0 3

4 TABLA 2 Efecto de la alimentación con aceite de pescado sobre la composición en ácidos grasos de la leche ( % del total de ácidos grasos) Sin adición de aceite Con adición de aceite 1 C12:0 3,4 1,9 C14:0 12,8 9,3 C16:0 38,1 34,3 C18:0 9,7 3,8 C18:1 26,1 28,6 trans-11-c18:1 1,1 3,2 C18:2 2,4 2,6 C18:3 0,2 0, CLA 0,7 1, El mecanismo generalmente aceptado de formación de CLA antes descrito (Harfoot and Hazlewood 1988) tampoco explica el aumento de la concentración de CLA en la leche cuando las vacas se alimentan de pasto como único forraje (Griinari y cols., 1998, J. Dairy Sci. 81 (Suppl.1): 0 (Abstr.)), ya que el principal ácido graso en la grasa presente en la hierba del pasto es ácido linolénico y la proporción del ácido linoléico es típicamente bastante baja. En función de las observaciones antes citadas, los autores de la presente invención han llegado a la conclusión de que el CLA de la leche también puede derivarse de otra fuente distinta a la de la isomerización de ácido linoleico que tiene lugar en el rumen. Por otra parte, dado que en el rumen de una vaca que se alimenta únicamente de pasto estaban presentes determinados isómeros de CLA (cis-9,trans-11-c18:2 y trans-9,trans-11-c:18:2) en una relación media de 1:1, pero en la leche la concentración del isómero cis-9,trans-11-c18:2 era veces mayor que la del isómero trans-9,trans-11-c:18:2 (Griinari y Nurmela, sin publicar), los autores de la presente invención observaron que el CLA de la grasa de la leche podía formarse en una situación de alimentación concreta en gran medida en otro lugar distinto al rumen. Se ha observado que los isómeros de CLA antes mencionados se transfieren desde el tracto digestivo hasta la leche prácticamente a la misma velocidad, de manera que lo que participa en esta situación no es la discriminación de uno de los isómeros de ácido graso (Chouinard y cols., 1998, J. Dairy Sci. 81 (Suppl. 1): 33 (Abstr.). Porlotanto,lapresenteinvención se basa en la sorprendente observación de que la adición al alimento de un aceite que contiene bajos niveles de ácido linoleico causó un considerable aumento en la concentración de CLA en la leche. La sustancia inicial de CLA debe formarse, sin embargo en el rumen, ya que CLA está presente en cantidades considerables en la grasa de la leche y la grasa del tejido de los rumiantes solamente. Se ha observado asimismo en relación con la presente invención que en una vaca que se alimenta únicamente de pasto, la concentración de diversos ácidos trans-grasos (es decir isómeros de ácido graso formados en el rumen) en el flujo del producto de la digestión que sale del rumen predice de cerca las concentraciones de estos ácidos grasos en la leche (figura 1). La íntima correlación entre la concentración en el producto de la digestión del rumen y la concentración en la grasa de la leche corrobora la hipótesis del origen del rumen de estos isómeros de ácido graso. En lo que se refiere a CLA; dicha correlación no es cierta, sin embargo (Figura 2a). La concentración de ácido vaccénico (trans-11) en el producto de digestión del alimento que sale del rumen explica de hecho la variación de la concentración de CLA en la leche de una forma considerablemente mejor (figura 2b). Un examen de la relación entre el ácido vaccénico y CLA en la grasa de la leche demuestra que la concentración es incluso más cercana (figura 2c). Esta correlación tan cercana se explica probablemente como una relación de sustrato metabólico (trans-11-c18:1) y producto (cis-9,trans-11-c18:2). En función del examen anterior de la correlación y la conclusión a ella asociada, se realizó la sorprendente observación en conexión con la presente invención de que el CLA de la leche puede formarse en determinadas condiciones de alimentación principalmente a través de la desaturación del ácido vaccénico en CLA. Dicha conversión tiene lugar bajo la acción de la enzima -9 desaturasa en los tejidos del animal, del siguiente modo: 4

5 desaturasa trans-11-c18:1 (ácido vaccénico) cis-9,trans-11-c18:2 (CLA) Por lo tanto, es posible que el CLA de la grasa de la leche se forme principalmente en los tejidos del rumiante, ya que -9 desaturasa añade un enlace doble cis-9 al ácido graso trans-11-c18:1 que se forma en el rumen y se escapa del rumen junto con el alimento digerido. -9 desaturasa es una enzima activa en varios tejidos diferentes, pero se ha observado su actividad en particular en la glándula mamaira, donde desatura ácido esteárico (C18:0) en ácido oleico (cis-9-c18:1) (Kinsella J.E., Lipids 1972, 7:349). Por otra parte, se ha observado que la -9 desaturasa microsómica en las células hepáticas de la rata desatura ácido graso trans-11-c18:1 en cis-9,trans-11-cla in vitro (Mahfouz M.M. y cols. y cols. Biochim. Biophys. Acta 1980, 618:1). La alimentación que aumenta la formación de ácido vaccénico, es decir, ácido graso ácido trans- 11-C18:1, en el rumen puede por tanto, debido a la desaturación del ácido graso trans-11-c18:1 en la glándula mamaria o en otro lugar del organismo de la vaca, aumentar la concentración de CLA en la leche. El efecto que se ha mencionado del aceite de pescado que aumenta la concentración de CLA en la leche podría también explicarse a través del efecto de este aceite de pescado en la síntesis en el rumen de ácido graso trans-11-c18:1. Esto se apoya en la observación de Pennington y Davis (J. Dairy Sci :49) sobre una mayor síntesis en el rumen de ácido vaccénico cuando se alimentó con aceite de pescado a las vacas. De acuerdo con la presente invención, el aumento de la concentración de CLA en la leche en determinadas situaciones de alimentación se explica en gran medida por la formación del ácido graso trans-11-c18:1 en el rumen y la desaturación de dicho ácido graso en CLA en el organismo de la vaca y por tanto, no a través de la formación de CLA en el rumen, tal como se había creído hasta ahora (Harfoot and Hazlewood 1988). El enriquecimiento que se ha descrito anteriormente del isómero cis-9,trans-11-cla en la leche en proporción con la concentración del isómero trans-9,trans-11-cla en las vacas alimentadas con pasto se explica por el hecho de que el isómero trans-9,trans-11 no puede formarse en los tejidos de la vaca, mientras que el isómero cis-9,trans-11 podría formarse principalmente como producto de la desaturación. Respectivamente, con la alimentación con pasto quizá tan sólo se forma una reducida proporción del cis-9,trans-11-cla de la leche en el rumen. La presente invención se basa en el aumento de la concentración CLA en la grasa de la leche y la grasa de tejido alimentando al rumiante con un suplemento de grasa que contiene ácido graso trans-11-c18:1, es decir ácido vaccénico, es decir, el sustrato de la -9 desaturasa natural del organismo. El ácido vaccénico se convierte en el organismo, por ejemplo en la glándula mamaria, en cis-9,trans-11-cla y se secreta a la leche. De manera similar, el CLA formado en los tejidos se puede incorporar en los lípidos de tejido. En la patente EE.UU se describe un método según el cual se pueden reducir las grasas de la leche de la vaca y aumentar la producción de leche mediante el uso de ácidos trans grasos. En el método, por ejemplo, se administra a la vaca por infusión una mezcla de isómero trans-18:1. No obstante, en esta publicación no se afirma que el suplemento de ácido graso trans-(18:1) en el forraje del animal pueda aumentar la concentración de CLA en la grasa de la leche y la grasa de tejido. Se ha observado que el alimento que contiene ácido graso trans-11-c18:1 aumenta la concentración de CLA cis-9,trans-11 en la sangre (Salminen y cols., J. Nutr. Biochem. 1998, 9:93) cuando la dieta de los sujetos sometidos a ensayo contenía de una forma que se desviaba de la dieta convencional, una cantidad muy reducida de ácidos grasos poliinsaturados. El aumento de la concentración de CLA en la sangre descrito por Salminen y cols. (1998) demuestra que la desaturación del ácido graso trans anteriormente observada en células hepáticas (Mahfouz M.M. y cols. Biochim. Biophys. Acta 1980, 618:1) es un proceso activo también en seres humanos, pero lo limita a dietas que contienen cantidades limitadas de ácidos grasos poliinsaturados. Santora y cols. (1998) (documento presentado en el encuentro anual de AOCS, Chicago), observó que cuando se alimentaba con ácido vaccénico a ratones, se triplicaba la concentración de CLA de la grasa de tejido. La formación de CLA disminuía cuando el forraje de los ratones contenía un % de aceite de maíz. El aceite de maíz contiene grandes cantidades de ácidos grasos poliinsaturados, es decir, la actividad de la desaturasa depende del grado de insaturación de la dieta. La presente invención demuestra que se puede utilizar un rumiante para la producción del isómero CLA natural más común para alimentos humanos mediante la adición de ácido vaccénico (trans-11-c18:1) en el forraje del rumiante. Preferiblemente, el rumiante es un rumiante lactante, como una vaca, si bien la invención se puede aplicar a rumiantes destinados a la producción de carne. En la alimentación de un rumiante resulta ventajoso proteger, a través de métodos de protección conocidos, la grasa trans-11-c18:1 de los efectos de la biohidrogenación en el rumen. Por ejemplo, en la patente EE.UU se describe un método comúnmente utilizado para la protección de la grasa.

6 1 2 Para aumentar la concentración de CLA en la grasa de la leche resulta ventajoso alimentar con ácido vaccénico, es decir ácido graso trans-11-c18:1, en una mezcla que contiene grandes cantidades de ácidos grasos saturados, ya que el paso de los ácidos grasos saturados hasta las glándulas mamarias favorece la actividad de la -9 desaturasa de la glándula mamaria y por lo tanto puede favorecer también la conversión del isómero trans-11 en cis-9,trans-11-cla. La forma más ventajosa de dosificar ácido vaccénico a los animales consiste en suministrarlo mezclado con el forraje o como un suplemento del alimento por separado. Las dosis de ácido vaccénico preferibles que se añadan pueden determinarse midiendo la cantidad de ácido vaccénico mediante el cual se obtiene un nivel de CLA óptimo en la leche, de manera que la adición sea suficientemente económica en lo que se refiere a los costes. La invención quedará ilustrada a continuación con los ejemplos. Ejemplo 1 El propósito del experimento consistió en demostrar que trans-11-c18:1 dosificado a vacas lactantes post-ruminalmente en el tracto digestivo se convertía en cis-9,trans-11-cla en los tejidos. Se llevó a cabo el experimento adminsitrando leche sin grasa (vehículo kg/d) a las vacas por infusión continua en el abomaso durante tres días (periodo preliminar). Durante los siguientes tres días (influsión), se administraron por infusión a las vacas 2 g/d de una mezcla de ácido graso trans-11 y ácido graso trans- 12-C18:1, emulsionado en leche sin grasa. Se determinaron las concentraciones de trans-11-c18:1 y CLA de la leche de las vacas el tercer día tanto de la secuencia preliminar como de la infusión. En la tabla 3, a continuación, se muestran los resultados. TABLA 3 3 Período preliminar Infusión %aumento Ácido graso de la leche mg/g de grasa de leche) trans-11-c18:1 12,0 14,0 17 cis-9,trans-11-c18:2 2,8 4, La concentración de trans-11-c18:1 en la leche aumentó durante la infusión, lo que demuestra que el ácido graso administrado por infusión había sido absorbido, había pasado a las glándulas mamarias yhabía pasado a formar parte de la grasa de la leche. La concentración de CLA también aumentó, lo que demuestra que una parte significativa del ácido graso trans-11-c18:1 recibida por el animal se había convertido en los tejidos de la vaca en CLA. Este experimento demuestra que los rumiantes, que producen CLA de forma natural en su organismo, aumentan la producción de CLA si reciben ácido graso trans-11-c18:1 en una forma absorbible, por ejemplo, añadido a su forraje. El ácido graso trans-11-c18:1 se debe dosificar en el forraje diariamente, ya que la concentración de CLA en la leche disminuye inmediatamente cuando se interrumpe la alimentación. En este experimento, la concentración de CLA en la leche descendió hasta el nivel basal dos días después de haber interrumpido la infusión de los ácidos trans grasos (figura 3). Ejemplo 2 Se alimentaron vacas lecheras (n=2) con una mezcla de grasa vegetal endurecida (0, 0 ó 0 g/d) que contenía un 7,9 % de ácido graso trans-11-c18:1. La concentración de CLA en la leche aumentó cuando se aumentó la alimentación con grasas vegetales endurecidas (tabla 4). Este experimento demuestra un efecto de respuesta a dosis entre la ingestión de la dieta de ácido graso trans-11-c18:1 y la concentración de CLA en la leche de la vaca. 6

7 TABLA 4 Control, 0 g/d 0 g/d 0 g/d En ácidos grasos de la leche, % trans-11-c18:1 1,2 2,1 2,6 cis-9,trans-11-c18:2 0, 1,0 1,

8 REIVINDICACIONES 1. Un método para aumentar la concentración de isómero cis-9-trans-11 de ácido octadecadienóico en la grasa de la leche y/o la grasa de tejido de un rumiante, caracterizado porque el isómero trans-11 de ácido octadecenoico se incluye en el alimento del rumiante, ya sea como tal o mezclado con otro alimento, por separado o junto con otros ácidos grasos. 2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado porque el rumiante es un rumiante lactante Un método según la reivindicación 1 ó 2,caracterizado porque el isómero trans-11 de ácido octadecenoico está protegido ante la reducción en el rumen. 4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el otro ácido graso consiste en ácidos grasos saturados.. Uso del isómero trans-11 de ácido octadecenoico para aumentar la concentración del isómero cis-9-trans-11 de ácido octadecadienoico en la grasa de la leche y/o la grasa de tejido de un rumiante, incluyéndolo en el alimento del rumiante como tal o mezclado con otro forraje, por separado o junto con otros ácidos grasos. 6. Uso según la reivindicación, caracterizado porque el rumiante es un rumiante lactante. 7. Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque el isómero trans-11 de ácido octadecenoico está protegido contra la reducción en el rumen. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los otros ácidos grasos son ácidos grasos saturados NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 8

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