INSULINA. Cat. DA VER.1. Solo para diagnóstico In Vitro Para uso exclusivo de laboratorios clínicos o de gabinete Conservar entre 2 C a 8 C
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- María Miranda Guzmán
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1 INSULINA Cat. DA VER.1 Inmunoensayo de la ima para la Determinación Cuantitativa de la Concentración de Insulina en Suero Humano. + Ag Ins + Btn k a - Btn Solo para diagnóstico In Vitro Para uso exclusivo de laboratorios clínicos o de gabinete Conservar entre 2 C a 8 C NOMBRES COMUNES Y DE PROPIEDAD Inmunoensayo de la ima de Insulina USO DESTINADO Para la determinación cuantitativa de la concentración de insulina en suero humano. INTRODUCCIÓN La Insulina humana es un péptido producido en las células beta del páncreas y es responsable del metabolismo y almacén de los carbohidratos. Como resultado de una bioretroalimentación los niveles de insulina se inc rementan con el consumo de azúcares y declina cuando el contenido de azúcar es bajo de absorción. En la población diabética el mecanismo de producción de insulina es disparejo debido a las predisposiciones genéticas (Tipo I) o porque el estilo de vida y/o fac tores hereditarios (Tipo II). En tales casos tanto la producción de insulina ha sido estimulada por medicación o ha sido suplementada por métodos orales o intravenosos. La determinación cuantitativa de insulina puede ayudar en seleccionar la dosis que el paciente debe recibir. De otra forma, la insulina circulatoria puede ser encontrada en muchos niveles altos en pacientes con tumores pancreáticos. Estos tumores secretan altos niveles anormales de insulina y así causa la hipoglucemia. Acordemente, la hipoglucemia rápida es asociada con las concentraciones altas inapropiadas de insulina fuertemente sugieren un tumor célula-islet (insulinoma). Para dis tinguir los insulinotas de hipoglucemia reales debido a la administración de insulina, se recomiendan los valores del suero C-péptido. Vea por favor la prueba de CPéptidos por ELISA de Monobind Cat# ). Estos insulinotas pueden estar localizados por dosis intravenosas provocadas de tolbutamida y calcio. PRINCIPIO DE LA PRUEBA Ensayo Inmunoenzimático Competitivo (Tipo 3) Los reactivos esenciales requeridos para un ensayo inmunoenzimatico incluye anticuerpos de una alta afinidad y especificidad (Ab), (enzima conjugada e inmovilizada), con epitopes de reconocimiento diferentes, en exceso, y antígeno nativo (Ag). En este procedimiento, la inmovilización toma lugar durante el ensayo en la superficie del pozo en la microplaca durante la interacción de estreptavidina cubierta sobre el pozo y agregado exogenadamente un anticuerpo de insulina monoclonal biotinilado. Una vez mezclado el anticuerpo monoclonal biotinilado, el anticuerpo de enzima etiquetada y un suero que contiene el antígeno nativo, resulta una reacción entre el antígeno nativo y los anticuerpos, sin competencia o impedimento estérico, para formar un complejo de sándwich soluble. La interacción esta ilustrada por las iguiente ecuación: k -a Btn = Anticuerpo Monoclonal Biotinilado (cantidad en exceso) Ag Ins = Antígeno Nativo (cantidad variable) = Anticuerpo monoclonal etiquetado (cantidad en exceso) - Btn = Complejo Antígeno-Anticuerpo k a = Valor Constante de Asociación k -a = Valor Constante de Disociación Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a través de la reacción de alta afinidad de streptavidin y el anticuerpo biotinilado. Esta interacción esta ilustrada abajo: - Btn + Estreptavidina cw Complejo Inmovilizado Estreptavidina cw = Estreptavidina inmovilizada en el pocillo. Complejo Inmovilizado = Complejo de Sandwich unido a la superificie de la fase solida. Después de que se obtiene el equilibrio, la fracción del anticuerpo-atado es separado del antígeno desatado por la decantación o la aspiración. La actividad enzimática en la fracción del anticuerpo-limite es directamente proporcional a la concentración nativa del antígeno. Utilizando diversas referencias del suero de los valores sabidos del antígeno, una curva de la reacción a cierta dosis puede ser generada de la cual la concentración del antígeno de un desconocido puede ser comprobada. REACTIVOS Materiales abastecidos con el equipo de prueba Calibradores Insulina liofilizados- Iconos A-F Seis (6) frascos de referencia del suero para el antígeno de Insulina en losniveles de 0(A), 5(B), 25(C), 50(D), 100(E) y 300(F) μiu/ml. Reconstituya cada frasco con 2mL de agua destilada o desionizada. Los calibradores reconstituidos son estables por sesenta (60) días entre 2-8 C. Se ha agregado un preservativo. *Nota: los calibradores, basados en suero humano, se calibraron usando una preparación de referencia, el cual fue ensayado contra WHO 1st IRP 66/304. Reactivo de ima de Insulina Un frasco que contiene la enzima etiquetada con afinidad purificada monoclonal de ratón x-insulina IgG, monoclonal biotinilado de ratón x- insulina IgG en solución, tinte y preservativo. Almacene a 2-8 C. Distribuido por: DIAGNÓSTICA INTERNACIONAL S.A. de C.V. Rudyard Kipling 4886 Col. Jardines de la Patria CP Zapopan, Jalisco, México Lada sin costo: c/ 10 líneas Tel: 01 (33) c/ 10 líneas 1
2 Microplaca Revestida con Estreptavidina - 96 pozos Una (1) microplaca con 96 pozos cubiertos con estreptavidin y empaquetado en una bolsa de aluminio con un agente desecante. Almacénese a 2-8 C. Solución Concentrada de Lavado Un (1) frasco que contiene un surfactante en solución salina. Un preservativo ha sido agregado. Almacénese a 2-30 C. Substrato A Un (1) frasco que contiene tetrametilbencidina (TMB) en solución. Almacén en 2-8 C. Substrato B Un (1) frasco que contiene peróxido de hidrógeno (H²O²) en solución. Almacénese en 2-8 C. Solución de Paro Un (1) frasco que contiene un acido fuerte (1NHCI). Almacénese en 2-8ºC. Instructivo NOTA 1: No utilice los reactivos después de la fecha de vencimiento del kit. NOTA 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) días cuando están almacenados en 2-8ºC. NOTA 3: Los reactivos son para una sola microplaca de 96-pozos. Materiales requeridos pero no abastecidos 1. Pipeta capaz de entregar los volúmenes 50 μl y 100μL con una precisión mejor de 1.5%. 2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volúmenes ml y ml con una precisión mejor de 1.5%. 3. Lavador de microplacas o una botella de apretón (opcional). 4. Lector de Microplaca capaz de leer absorbancia con filtros de longitud de onda de 450nm & 620nm. (El filtro de 620nm es opcional). 5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la microplaca. 6. Plástico envolvente o tapa para la microplaca para los pasos de la incubación. 7. Aspirador al vacío (opcional) para los pasos de lavado. 8. Contador de tiempo. 9. Contenedor para almacenar la solución de lavado. 10. Agua destilada o desionizada. 11. Materiales del control de calidad PRECAUCIONES Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser no-reactivos para el antígeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH 1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba sabida puede ofrecer el aseguramiento que los agentes infecciosos están ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los Buenos procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden encontrar en el centro para el control de enfermedad/el instituto nacional de la salud, Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos, 2da Edición, 1988, HHS. RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION Los especímenes deben ser sangre, suero en tipo y tener las precauciones generales en la colección de muestras del venipunctura. Para la comparación exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno del suero de la mañana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo liso de venipunctura de tapón rojo sin aditivos o anticoagulantes (para suero) o tubos de evacuación contenidos con EDTA o heparina. Permita que la sangre coagule. Centrifugue el espécimen para separar el suero de las células. Las muestras se pueden refrigerar en 2-8 C por un período máximo de cinco (5) días. Si el espécimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra se puede almacenar en las temperaturas de -20 C por hasta 30 días. Evite congelar y descongelar. Cuando analice en duplicado, se requiere ml del espécimen. PREPARACION DE LOS REACTIVOS SOLUCION DE LAVADO. Diluir el contenido del concentrado de lavado con 1000 ml de agua destilada o desionizada en un contenedor adecuado. Almacénese a temperatura ambiente entre los C por no mas de 60 días. SOLUCIÓN DE TRABAJO SUSTRATO. Vierta el contenido del frasco etiquetado con Solución A en el frasco etiquetado con Solución B. Mezcle y guarde a 2-8 C. Coloque la tapa amarilla sobre el frasco transparente para una fácil identificación. Mezcle y etiquete acordemente. Almacénese a 2-8 C. Nota: No se use el sustrato de trabajo si este se ve azul. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Antes de proceder con el análisis, traiga todos los reactivos, referencias del suero y controles a temperatura ambiente (20-27 C). 1. Saque los micropozos necesarios para cada suero de referencia, controles y muestras. Guarde los micropozos nuevamente dentro de la bolsa de aluminio, séllela y almacénela en 2-8 C. 2. Pipetee ml (50 µl) de los sueros de referencia, controles y muestras en los pozos correspondientes. 3. Agregue ml (100μL) de la solución del Reactivo de la ima de Insulina a todos los pozos. Es muy importante dispensar todos Los reactivos cerca del fondo de los micropozos. 4. Golpear suavemente uno de los extremos de la microplaca por segundos para mezclar. Selle la microplaca con una cubierta de plástico. 5. Incube por 120 minutos a temperatura ambiente (20-27 C) 6. Deseche el contenido de la microplaca por decantación o aspiración. Si decanta, después golpee ligeramente la placa seca con el papel absorbente. 7. Agregue 300μL de la solución de lavado (véase la sección de la preparación del reactivo), decántelo o aspírelo. Repita dos (2) veces adicionales para un total de tres (3) lavados. Un lavador automático o manual de placas puede ser utilizado. Siga las instrucciones del fabricante para el uso apropiado. Si se emplea una botella de apretón, llene cada micropozo bien, presionando el envase (evite burbujas de aire) para dispensar la solución de lavado. Decante y repita dos (2) veces adicionales. 8. Agregue ml (100μL) de la solución de Substrato a todos los pozos (véase la sección de la preparación el reactivo). Agregue siempre los reactivos en el mismo orden para reducir al mínimo diferencias de tiempo de reacción entre los pozos. NO AGITE DESPUES DE ADICIONAR EL SUSTRATO 9. Incube en la temperatura ambiente por quince (15) minutos. 10. Agregue ml (50μL) de la solución de paro a cada pozo y mezcle suavemente por segundos. Agregue siempre los reactivos en el mismo orden para reducir al mínimo diferencias del tiempo de 2
3 reacción entre los pozos. 11. Lea la absorbancia en cada pozo a 450nm (con una longitud de onda de referencia de nm para reducir al mínimo imperfecciones del pozo) en un lector del microplacas. Los resultados se deben leer en el plazo de treinta (30) minutos de haber agregado la solución de paro. CALCULO DE RESULTADOS Una curva en la reacción se usa para comprobar la concentración de Insulina en especímenes desconocidos. 1. Registre la absorbancia obtenida del listado del lector del micro placas conforme al ejemplo Trace la absorbancia para cada referencia duplicada del suero contra la concentración correspondiente de Insulina en μiu/ml en el papel de gráfico lineal. (No promedie los duplicados de las referencias del suero antes de dibujar). 3. Conecte los puntos y dibuje la mejor curva a través de los puntos trazados. 4. Para determinar la concentración de Insulina para un desconocido, localice la absorbancia media de los duplicados para cada desconocido en el eje del gráfico, encuentre el punto que se intersecta en la curva, y lea la concentración (en μui/ml) del eje horizontal del gráfico (los duplicados del desconocido se pueden hacer un promedio según lo indicado). En el siguiente ejemplo, el promedio de absorbancia (0.624) intersecta la curva de respuesta en (66.8 μui/ml) la concentración de Insulina. (vea la figura 1). I.D. Muestra Cal A Cal B Cal C Cal D Cal E Cal F Ctrl 1 Ctrl 2 Paciente Pozo Número Ejemplo 1 Abs (A) A B C D E F G H A B C D E F G H A B Media Abs (A) Valor μiu/ml Nota: Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilustrativas solamente no deben usarse para basarse en la curva preparada con cada análisis. Absorbancia Paciente Figura Insulina (µui/ml) PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD Para que el ensayo sea válido, se deben considerar los siguientes criterios: 1. La absorbancia (OD) del calibrador 0 μui/ml debe ser La absorbancia (OD) del calibrador 300 μui/ml debe ser Cuatro de los seis pool de control de calidad deben estar dentro de los rangos establecidos. CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y alto rango de la curva de la reacción para monitorear el buen funcionamiento del análisis. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada método de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben de mantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos proveídos. Los métodos estadísticos pertinentes deben ser empleados para comprobar las tendencias. El laboratorio individual debe tener límites de funcionamiento aceptables de análisis. Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un cambio experimental en las condiciones o degradación del kit de reactivos. Reactivos frescos deben usarse para determinar la razón de las variaciones. ANALISIS DE RIESGO A) Rendimiento del Ensayo 1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo se mantenga constante para lograr resultados reproducibles. 2. El pipeteo de las muestras no debe extenderse a más de diez (10) minutos para evitar la desviación del análisis. 3. Muestras altamente lipémicas, hemolizadas o ampliamente contaminadas no deben utilizarse 4. Si se utiliza más de una (1) placa, se recomienda repetir la curva de respuesta de dosis. 5. La añadidura de la solución de sustrato inicia una reacción cinética, la cual termina con la adición de la solución de paro. Ambas adiciones deben realizarse en la misma secuencia para eliminar cualquier desviación de tiempo durante la reacción. 6. Los lectores de placa leen verticalmente. No toque el fondo de los pozos. 7. La falla al remover la solución adherente de manera adecuada en los pasos de lavado de aspiración o decantación pueden resultar en una mala réplica y resultados falsos. 8. Utilice componentes del mismo lote. No mezcle reactivos de distintos lotes. 9. El pipeteado exacto y preciso después de la hora exacta, así como los requisitos de temperatura prescritos son esenciales. Cualquier desviación de estos puede dar resultados Inexactos
4 10. Todos los estándares nacionales aplicables, incluyendo reglamentos y leyes no están limitados a los procedimientos de laboratorio, deben seguirse estrictamente para garantizar el cumplimiento y el uso adecuado del dispositivo. 11. Es importante calibrar todo el equipo ej. Pipettes, Readers, Washers and/or the automated instruments used with this device, and to perform routine preventative maintenance. B) Interpretación 1. Las mediciones y la interpretación de los resultados debe ser realizada por una persona calificada o un profesional capacitado. 2. Los resultados de laboratorio por sí solos son sólo un aspecto de la determinación de la atención al paciente y no debe ser la única base para la terapia, particularmente si los resultados entran en conflicto con otros determinantes. 3. Los resultados de exámenes válidos, controles y otros parámetros deben estar dentro de los rangos indicados y los requisitos de ensayo. 4. Si el kit de ensayo se modifican, como por partes de mezcla de kits diferentes, podría producir resultados falsos resultados en la prueba, o que los resultados se interpreten incorrectamente, en este caso Monobind no tendrá ninguna responsabilidad 5. Si se utiliza la reducción de datos controlada por computadora para interpretar los resultados de la prueba, es imperativo que los valores previstos por los calibradores, caigan dentro del 10% de las concentraciones asignadas. 6. Muestras de pacientes con concentración de insulina mayores a 300 μui/ml deben ser diluidas con el calibrador cero y ensayadas nuevamente. Multiplique el valorr obtenido por el factor de dilución para obtener el valor correcto. El resultado de este test de Insulina por si solo no es de valor diagnóstico, se debe utilizar en conjunto con otros criterios clínicos y procedimientos diagnósticos. VALORES ESPERADOS Los valores de insulina son constantemente más altos en plasma que en suero; así, se prefiere el suero. Comparado con los valores rápidos en individuos no obesos ni diabéticos, los niveles de insulina son mayores en individuos obesos no diabéticos y menos en atletas entrenados. A pesar de que la pro insulina tiene reacción cruzada con los ensayos más competitivos de insulina, hay menos del 1% de reacción cruzada encontrada con pro insulina usando el método de Insulina por ELISA. Basados en información clínica reunida por Monobind en concordancia con la literatura publicada los siguientes rangos han sido designados. Estos rangosdeben ser usados solamente como guías: Niños 12 años Adulto (Normal) Diabetico (Tipo II) 10 μui/ml μui/ml μui/ml Es importante mantener en mente que el establecimiento del rango de valor el cual se espera encontrarse por un método dado por una población de personas normales es dependiente a la multiplicidad de factores: la especificidad de los métodos, la población analizada y la precisión de los métodos en manos de los analistas. Por esta razón cada laboratorio debe depender del rango esperado de valores establecidos por el fabricante solo hasta un rango interior que puede ser determinado por el analista usando el método con una población indígena al área en el que el laboratorio esta ubicado. CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO A) Precisión La precisión dentro y entre el análisis de la prueba de Insulina por sistema de microplaca fue determinada por análisis en tres diferentes niveles de pool de sueros control. El número, valor principal, desviación estandard y coeficiente de variación para cada uno de estos controles de suero son presentados en la tabla 2 y tabla 3. TABLA 2 Precisión Dentro de Análisis (Valores en μui/ml) Muestra N X SD CV Pool % Pool % Pool % TABLA 3 Precisión Entre Análisis (Valores en μui/ml) Muestra N X SD CV Pool % Pool % Pool % * Según lo medido en diez experimentos en duplicado por siete días. B) Sensibilidad La sensibilidad (límite de detección) fue comprobada determinando la variabilidad del calibrador de suero 0 μlu/ml y usando el 2 SD (95% certeza) estadística para calcular la dosis mínima. Una dosis mínima detectable fue determinada a 0.75 μiu/ml. C) Precisión El procedimiento de Insulina por microplaca de ELISA fue comparado con un método de referencia de radioinmunoanálisis. Se utilizaron especímenes biológicos de personas (sintomáticas y asíntomáticas). (El rango de valores va desde 0.01 μui/ml 129 μui/ml). El número total de estos especímenes fue de 104. Los datos obtenidos se muestran en la tabla 4. Método Media (x) TABLA 4 Análisis de Regresión Correlación Coeficiente Este Método 13.6 y= (x) Referencia 11.4 Solo pequeñas cantidades de sesgo entre este kit de ELISA para insulina y el metodo de referencia están indicados por la cercania de Los valores medios. La ecuación de regresión y el coeficiente de correlación indican que es un excelente metodo. D) Especificidad El % de reactividad cruzada de Insulina para seleccionar sustancias fue evaluada agregando la sustancia que interfería a una matriz del suero en varias concentraciones. La reactividad cruzada fue calculada derivando un cociente entre la dosis de la sustancia que interfería a la dosis de 4
5 la sustancia que interfería a la dosis de insulina para desplazar el mismo trazo de la absorbancia. Sustancia React. Cruzada Concentración Insulina Pro Insulina ng/ml C-Péptido No detectable 75 ng/ml Glucagon No detectable 150 ng/ml REFERENCIAS 1. Eastham RD, Biochemical Values In Clinical Medicine, 7th Ed Bristol, England, John Wright& Sons, LTD (1985) 2. Gerbitz VKD, Pancreatische B-zellen Peptide: Kinetic and Konzentration von Proinsulin, Insulin and C-peptide in Plasma and Urine Probleme der Mezmethoden Klinische und Lietraturubersicht, J Clin Chem Biochem, 18, (1980) 3. Boehm TM, lebovitz He, Statiscal analysis of Glucose and Insulin responses to intravenous tolbutamide; evaluation of hypycemic and hiperinsulinemic states Diabetes Care; (1979) 4. National Committee for Clinical Laboratory Standars; Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture: approved standars, 4th Ed, NCCLS Document H3-A4, Wayne PA; (1998) 5. Turkington RQW, Estkowsky A, Link M, Secretion of insulin or connecting peptide; a predictor of insulin dependence of obese diabetics ; Archives of Internal Mes, 142, (1982). 6. Sacks D, Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Ed, Philadelphia, WB Saunders Co (1994) 7. Kahnn CR, Rosenthal As, Immunologic reactions to insulin, insulin allergy, insulin resistance and autoinmune insulin syndrome, Diabetes Care, 2, (1979) FABRICADO POR: MONOBIND INC. 100 NORTH POINTE DRIVE LAKE FOREST, CA USA 5
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