Estudio molecular del oncogen BCR/ABL t(9:22) en pacientes venezolanos con Leucemia Mieloide Crónica.

Transcripción

1 Universidad Simón Bolívar Decanato de Estudios de Postgrado Coordinación de Biología Estudio molecular del oncogen BCR/ABL t(9:22) en pacientes venezolanos con Leucemia Mieloide Crónica. Tesis Doctoral presentada a la Universidad Simón Bolívar por Fanny Carreño Como requisito parcial para optar al título de Doctora en Ciencias Biológicas Realizado bajo la Tutoría de: Dr. René Utrera Sartenejas, Enero 2008

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3 DEDICATORIA Siento un inmenso placer al elogiar con esta tesis a las dos personas que engendraron en mí la curiosidad y la pasión por el mundo desgarrador y fascinante de la LEUCEMIA A mi hijo Alejandro Antonio A mi maestro José Luís López ii

4 AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mis más sinceros agradecimientos al Dr. René Utrera por brindarme la oportunidad de desarrollar este proyecto tan ambicioso, el cual, sin lugar a dudas, ha permitido nuestro crecimiento personal y entera satisfacción al aportar un humilde granito de arena en la búsqueda de una mejora en la calidad de vida de las personas que sufren estos tipos de aflicciones. Al Dr. José Luís López a quien admiro y respeto infinitamente. Él es la persona que con su paciencia, cariño, buen humor y amor por su trabajo me enseñó que cuando se cree y ama lo que se está haciendo no importan las adversidades y el reconocimiento porque siempre te queda la satisfacción de que estas ayudando a mejorar la vida de un enfermo. A la Dra. Osiris Da Costa, por su invaluable ayuda en la obtención de las muestras, las interminables revisiones y discusión de historias clínicas, su apoyo en la revisión del manuscrito y su amistad desinteresada. Osiris mil gracias. A la Dra. Leonor Cárdenas, por abrirme siempre las puertas de su consulta en la busca de muestras e historias clínicas, así como todo su apoyo profesional y personal en la culminación de este proyecto. A las Lic. Aramilena Prado y Patricia Rodríguez quienes me brindaron todo su apoyo en la realización de la técnica citometría de flujo y en la revisión y discusión de los resultados referentes a este tema. Chicas, siempre les estaré en deuda. Al Dr. Ivan Galindo, por permitirme realizar en su laboratorio la técnica de RT-PCR en Tiempo Real y por todo su apoyo y colaboración durante los experimentos. Al Dr. Juan Carlos Martinez, por su infinita paciencia en los interminables momentos de consultas sobre los experimentos de RT-PCR en Tiempo Real. Mil gracias Juan. A los Dres. Pedro Sánchez, Ana Monzón y Elsa Tovar por todas las facilidades que me dieron durante la estandarización del panel de las translocaciones. A mi esposo Carlos Méndez, por toda su ayuda en la realización de la estadística de este trabajo. Carlos, sin temor a dudas, haz sido mi horizonte en la culminación de este trabajo, sin ti este logro no hubiera sido posible. Gracias por cruzar hacia mi camino y empezar a caminar junto a mi, gracias por tanto amor a nuestros hijos y sobre todo gracias por seguir allí con tu infinita paciencia y sabiduría. Te amo. A la Dra. Susana Blanco, porque en el momento más difícil de mí doctorado sólo tú me enseñaste la puerta que conduciría a mi objetivo final. Siempre estaré cuando me necesites susi (ve susi ve). A la Dra. Margarita Rodríguez, por todos sus consejos oportunos y por ser esa madre que todos los estudiantes necesitamos en los momentos más difíciles. A la Dra. Antonieta Porco, por sus valiosos consejos en las discusiones de laboratorio y por su apoyo moral en los momentos de duda. Al Dr. Emilio Herrera, trabajar contigo ha sido una experiencia de vida para mí. Tú mano amiga recogió los despojos, los pego con sonrisas, cafés y canciones, pero también con trabajo, perseverancia y confianza en mí y en mi trabajo. Profe, muchas gracias, su confianza y cariño me permitieron levantarme y culminar hoy este camino. Siempre te estaré en deuda. Al Dr. Guillermo Barreto (mi coordinador), por estar siempre allí para escuchar mis dudas, mis quejas, mis sin sabores, pero sobre todo para darme opciones de salida. Guille mil gracias. A la Dra. Martha Bravo, por comenzar conmigo este camino y por mantenerme atada a una silla durante las horas interminables de discusión de papers. Los caminos que iniciamos con amigos son más llevaderos en los momentos más tortuosos, pero son esos mismos caminos los que a veces y sin un por qué separan nuestros destinos. Espero que tu sendero esté siempre lleno de dicha y amor. iii

5 A mis inolvidables amigas Noelis, María José y Yumelis, me siento muy afortunada de que ni el tiempo, ni la distancia, ni las dificultades hayan podido agrietar las paredes de nuestra amistad. Gracias por estar siempre allí. Las quiero. A mis panas del asco: Pedro, Ariana, Giselle, Cristinita. Gracias por aguantar a esta Cumanesa en todos sus momentos. A los compañeros y profesores amigos del laboratorio de genética de poblaciones: Rosita, Angela, Tatiana, Bladimir, Maribet, Victor, Nicida, Prof. Jazmin, Prof. Marisol. Gracias por compartir conmigo esos momentos de trabajo extra. A la Doctora Yajidy El Abed, por haber recorrido este camino conmigo y compartir los interminables trasnochos y fines de semana en la Univ. Amiga, gracias por todas tus palabras de aliento y apoyo cuando más lo necesité. A mis amiguis de celular: Rafa (monster), Gladinex, Anita, Loly, Adriana, Jaki, deisy, Juancito. A mis amiguis del laboratorio: Estluz, Leomig, Andreina, Roybel, Luisa, Patricia, Pedro, Mayela, Vanessa, Yurianny, Fifí, Carolina, María José, Orbelis. A las super chicas de la coordinación Judiht y Marisol, quienes además de cumplir su trabajo a cabalidad están siempre pendientes de que sus chicos estén al día y terminen lo más pronto posible su camino académico. Gracias Judiht por guiarme siempre. A la coordinadora Prof. Solange Issa, por todo su gran apoyo y colaboración durante la entrega del manuscrito. Gracias profe. A mis dos angeles guardianes: Joa y Maggi, ustedes son el mejor regalos que me dieron mis padres. Gracias por perseverar conmigo en este camino. Las amo. A mis padres, Antonio y Alida, quienes me enseñaron que el regalo más valioso que tenemos para dar es la humildad. Los amo. A mi hijo Rodrigo, regalo especial de dios que llegó en su justo momento. A dios gracias. A la Señora Margarita Vallejo, por su paciencia y colaboración durante el escrito de este manuscrito y por enseñarme que no importa cuanto trabajo tengas, la familia siempre esta primero. A mis cuñis Hector, Enrique, Sandy, Norelis, por su solidaridad. A mis amigos Nora, Oliver, Sergio, Israel, Priscila y cheo. Gracias por todo el amor y cuidado hacia mi y mis hijos. Nora, eres una hermana más. A mis tías, tíos y primas lindas que nunca me desampararon, Enrique, Lilia, Zuleima, Hortensia, Marisol, Carelin, Elianny, Hayarit, Francys, Vanesa, Daniela, Osmari. A mi hija putativa Liz, que dios te bendiga. Al FONACIT por financiar este proyecto (código G ) y por darme la beca que permitió mi residencia en Caracas y permanencia en el postgrado. A todos GRACIAS iv

6 RESUMEN Estudio molecular del encogen BCR/ABL en pacientes venezolanos con leucemia mieloide crónica. La leucemia mieloide crónica (LMC) es una patología clínica común, caracterizada por la expansión clonal de células mieloides progenitoras. Esta es causada por la translocación recíproca y no aleatoria t(9;22)(q34;q11), que origina el gen de fusión BCR-ABL en el cromosoma 22 (conocido como cromosoma Filadelfia, Ph+), el cual codifica para una proteína quimérica funcionalmente activa que es capaz de ejercer un efecto transformante en todas las células que la producen. Este trabajo reporta el estudio molecular por RT-PCR de la translocación BCR-ABL en 297 pacientes venezolanos diagnosticados clínicamente con LMC. Los análisis estadísticos de estos datos demuestran que dicha translocación se presenta con una frecuencia de 67.3% (200/297), la cual no corresponde con lo reportado en estudios previos (95%). De los 200 pacientes positivos para BCR/ABL, las variantes estuvieron distribuidas de la siguiente manera: b2a2 (43.5%), b3a2 (39.5%), e1a2 (3.5%), mientras que de sus co-expresiones se encontró que: b2a2/b3a2 (12.5%) y b2a2/e1a2 (1%). Los datos obtenidos de las variantes con mayor frecuencia (b2a2 y b3a2) concuerdan con los resultados reportados en otros países. Las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 fueron clonadas y secuenciadas, pudiéndose identificar en algunos pacientes, el punto de fusión que identifica a cada una de ellas. En las secuencias realizadas sobre la variante b2a2 fueron detectadas 2 mutaciones puntuales silentes: a) (T/C) en la posición 402 de 3 pacientes y b) (T/C) en la posición 434 de 1 paciente, ambas en la región abl del híbrido BCR/ABL, mientras que las secuencias realizadas para las variantes b3a2 y e1a2, evidenciaron el punto de fusión reportado, no detectándose mutaciones en la porción del gen abl. El cálculo de la frecuencia para las variantes reportadas evidenció que ninguna de ellas estuvo relacionada con la edad o el sexo, aunque se observó una mayor probabilidad de detección de la enfermedad en etapa adulta, principalmente a partir de los 40 años. La estandarización de un panel de translocaciones asociadas con diversos tipos de leucemia permitió la identificación de éstas en 40 pacientes que dieron negativos para la quimera BCR/ABL, 2 fueron positivos para CBFβ/MYH11, 5 positivos para AML1/ETO, 6 positivos para E2A/PBX1, 3 positivos para SIL/TAL, 11 positivos para TEL/AML y 9 positivos para PML/RARα. Análisis por citometría de flujo permitió hacer la clasificación de 10 pacientes LMC en fase inicial (3 FC) y crisis blástica (7 CB), a estos últimos se les logró identificar su linaje y fueron clasificados en LMCCB mieloide (4) y en LMCCB linfoide (3). El estudio de los tres factores que pueden originar la resistencia al tratamiento con Imatinib demostró que en las tres fases de la enfermedad la resistencia a Imatinib fue causada por un aumento en los niveles de expresión de BCR/ABL y no por la presencia de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de esta quimera o por un aumento en los niveles de expresión del gen Lyn, el cual ha sido abundantemente implicado en la resistencia a Imatinib. Estos datos demuestran que BCR/ABL ejerce directamente un efecto transformante en las células que lo expresan en pacientes con una resistencia primaria, tal como ha sido reportado. Este trabajo confirma que la detección molecular de la LMC es la vía más rápida, confiable y efectiva en el diagnóstico temprano de la LMC, el cual colabora con el tratamiento y supervivencia de los pacientes que sufren esta patología. Así mismo, se demuestra la importancia de los paneles de diagnóstico y la gran ayuda que ofrece la citometria de flujo en la clasificación de la LMC y otras leucemias. La evolución de estos estudios, contribuirán a la obtención de un mayor conocimiento del comportamiento de la LMC en la población venezolana y a un mejor tratamiento en base a las diferentes terapias que hoy en día son aplicadas en nuestro país. Palabras claves: LMC, BCR/ABL, Lyn. v

7 ÍNDICE GENERAL Introducción 1 Clínica de la Leucemia Mieloide Crónica (LMC) 2 Factores genéticos y no genéticos (ambientales) relacionados a la LMC 4 Citogenética de la LMC 5 Caracterización de los genes translocados en la LMC 7 Vías de señalización celular que se ven afectadas en pacientes LMC 11 Adhesión celular alterada 12 Activación constitutiva de la señalización mitogénica 13 Reducción de la apoptosis celular 15 Degradación de proteínas inhibidoras de ABL por proteosomas 17 Tratamiento de la LMC 18 Tratamiento de la LMC con Imatinib 20 Resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC 22 Sobre-expresión de la quimera BCR/ABL 23 Modificación en la expresión de genes por BCR/ABL 23 Expresión del gen Lyn 25 Mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL 27 Otras modalidades de tratamiento para la LMC 28 Técnicas empleadas para el diagnóstico y clasificación de las leucemias 29 Citogenética 30 Citometría de flujo 31 Señales de dispersión 32 Señales de Fluorescencia 32 PCR en tiempo real 34 Justificación e importancia del tema tratado 39 Objetivos General 42 Específicos 42 Metodología Diagnóstico molecular de BCR/ABL 45 Obtención de las muestras 45 Extracción de ARNtotal 45 Obtención de células mononucleares (Gradiente de Ficoll) 45 Extracción de ARN total. Protocolo A 45 Extracción de ARN total. Protocolo B 46 Determinación de la concentración y calidad del ARNt 47 Transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa 47 Transcripción reversa (RT) 47 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 47 Clonación de las variantes de BCR/ABL 50 Preparación de células competentes 50 Ligación 51 Transformación 52 Extracción y Purificación del ADN plasmídico (Mini-prep) 53 Digestión del ADN plasmídico con enzimas de restricción (endonucleasas) 53 Secuenciación manual y automática de los productos de BCR/ABL 54 vi

8 Purificación de los productos de PCR (protocolos A y B) 54 Secuenciación manual 55 Reacción de secuenciación para los productos de la PCR 55 Reacción de secuenciación para los plásmidos 56 Corrida electroforética de las reacciones de secuenciación manual, en geles de poliacrilamida al 6%. 56 Tinción con plata para los geles de secuencia 57 Secuenciación automática 57 Análisis estadístico en el diagnóstico molecular 58 Detección de otras translocaciónes que inducen leucemia: panel de diagnóstico 59 Obtención de la muestra 59 RT-PCR convencional: 60 Citometría de Flujo 62 Determinación de la LMC mediante citometría de flujo usando paneles de anticuerpos monoclonales específicos. 62 Obtención de la muestra 64 Procesamiento de las muestras en el citómetro de flujo y su correspondiente análisis. 64 Análisis de los resultados 65 Factores implicados en la resistencia al tratamiento de la LMC con imatinib 70 Modificación de la expresión génica por bcr/abl 70 Obtención de la muestra 71 Selección de genes a ser estudiados 71 Tratamiento del ARNtotal con ADNasa 72 Aislamiento de ARNmensajeros 72 RT-PCR convencional 73 RT-PCR en Tiempo Real 74 Análisis de los datos 74 Cuantificación relativa sin curva estandar 74 Análisis estadístico 75 Detección de mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL. 76 Obtención de la muestra 76 RT-PCR 76 Purificación de los productos de la PCR 78 Secuenciación automática 79 Resultados 80 Diagnóstico molecular de BCR/ABL 80 Extracción de ARN total. 80 Extracción de ARN total. Protocolo A 80 Extracción de ARN total. Protocolo B 82 Determinación de la translocaciòn BCR/ABL por transcripción inversa a partir de ARNt y su posterior amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) 83 Clonación de productos de PCR con variantes de BCR/ABL 85 Secuenciación de las muestras clonadas o productos de PCR de las diferentes variantes de BCR/ABL 87 Secuenciación manual 88 Secuenciación automática 91 Variante b2a2 91 Variante b3a2 94 Variante e1a2 96 Análisis estadístico de los resultados obtenidos en el diagnóstico molecular de BCR/ABL 98 vii

9 Frecuencia de la quimera BCR/ABL en pacientes LMC Venezolanos 99 Frecuencia de la variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 en pacientes LMC venezolanos. 99 Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2 y b2a2/b3a2 entre pacientes LMC venezolanos y otros países latinoamericanos. 101 Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2 y b2a2/b3a2 entre pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo. 103 Detección de otras translocaciónes que inducen leucemia: panel de diagnóstico 106 Citometría de Flujo 110 Caso LMC 111 Caso LMC en crisis blástica (CB) linfoide 113 Caso LMC en crisis blástica (CB) mieloide 115 Factores implicados en la resistencia al tratamiento de la LMC con imatinib 119 Modificación de la expresión génica por BCR/ABL 119 Selección de los pacientes a ser evaluados 119 Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR 121 Eliminación de ADNg en las muestras de ARNt usadas en la síntesis de ADNc 121 Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR convencional para los genes GAPDH, Lyn y AKAP Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR en Tiempo Real para los genes GAPDH, Lyn y AKAP Evaluación por PCR en Tiempo Real del gen Lyn en pacientes Venezolanos con LMC 124 Estadística de la RTQPCR 128 Detección de mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL 132 Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR para el punto de fusión y el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL 132 Secuenciación automática del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL de los pacientes con LMC 134 Discusión 141 Conclusiones 173 Lista de Referencias 176 Anexos 204 Anexo A 205 Anexo B 206 Anexo C 207 Anexo D 209 Anexo E viii

10 ÍNDICE DE FIGURAS Fig. Título Pág. 1 Esquema representativo del proceso de Hematopoyesis. 2 2 Esquema representativo de la translocación recíproca y no aletoria 6 entre los cromosomas 9 y 22 que originan el cromosoma Filadelfia que participa en la aparición y evolución de la LMC. 3 Esquema representativo de los diferentes dominios estructurales 8 presentes en las proteínas (A) BCR, (B) ABL y el híbrido (C) BCR/ABL. 4 Esquema representativo de la estructura de los genes abl y bcr en sus 10 respectivos cromosomas y las diferentes isoformas quiméricas que se pueden forman a partir de la fusión de ambos. 5 Esquema representativo del complejo de adhesión focal Esquema de las diferentes vías de señalización celular que pueden ser 15 afectadas por la expresión del híbrido BCR/ABL. 7 Esquema de algunas vías de señalización celular que pueden ser afectadas 17 por la expresión del híbrido BCR/ABL. 8 Representación de las tres primeras modalidades terapéuticas usadas 19 para el tratamiento de la LMC. 9 Presentación farmacéutica del inhibidor Glivec, modo de acción y su 22 estructura química. 10 Identificación de genes que pueden ser usados para distinguir 24 pacientes LLA sensibles y resistentes al tratamiento con Imatinib. 11 Identificación de los diferentes tipos de células inmaduras que 30 se pueden encontrar en un frotis sanguíneo de paciente con LMC. 12 Ilustración representativa de un estudio citogenético con células de 31 un paciente LMC. 13 Ilustración representativa del funcionamiento del citómetro de flujo. 33 ix

11 14 Ilustración representativa del modo de acción de los tres sistemas 36 de detección de la amplificación por RTQ-PCR. 15 Ilustración representativa del sistema Light Cycler para amplificación 37 por RTQ-PCR. 16 Esquema ilustrativo de la posición de los cebadores en los genes bcr 49 y abl (Panel A) y en las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 (Panel B). 17 Secuencias de las variantes b2a2 (Panel A), b3a2 (Panel B) y 50 e1a2 (Panel C) correspondientes a las diferentes translocaciones del híbrido BCR/ABL. 18 Dot plot de la serie blanca en condiciones de normalidad Esquema de los posibles casos que se pueden presentar a la hora del 66 análisis de resultados en los Dot plot de fluoresecencia Ag-Ag o mixto. 20 Dot plot de fluorescencia mixto Dot plot de fluorescencia mixto representativo de la separación en 68 cuadrante de las poblaciones celulares y valoración en porcentajes de la intensidad de expresión del Ag analizado. 22 Dot plot de fluorescencia Ag-Ag representativo de la separación 69 en cuadrante (líneas verdes) del enfrentamiento de dos antígenos y la valoración de sus expresiones en porcentajes. 23 Secuencia del híbrido BCR/ABL identificando el punto de fusión 78 y el dominio tirosina quinasa. 24 Extracción de ARNt Extracción de ARNt con Trizol Amplificación por RT-PCR de las diversas variantes de BCR-ABL Determinación de colonias positivas conteniendo el fragmento clonado Determinación de los clones positivos Secuencia manual del paciente 112 (b2a2) Alineación de las secuencias manuales de los pacientes LMC 20, , 130, 139 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL x

12 (Variante b2a2, número de acceso: AJ131467). 31 Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC 20, 93 54, 93, 112, 130, A9 y A6 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante b2a2, número de acceso: AJ131467). 32 Secuencias de los pacientes LMC 93 y A9 con el punto de fusión 93 de la quimera BCR/ABL, variante b2a2. 33 Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC 95 A15, 16, 17, 18 y 19 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante b3a2, número de acceso: AJ131466). 34 Secuencias de los pacientes LMC A15 y A19con el punto de 96 fusión de la quimera BCR/ABL, variante b3a2. 35 Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC 97 A7 y A14 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante e1a2, número de acceso: AF113911). 36 Secuencias de los pacientes LMC A7 y A14 con el punto de fusión de quimera BCR/ABL, variante e1a Análisis de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 de los pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo Distribución por grupos de edades de los pacientes BCR/ABL y distribución de la población general Venezolana Estandarización por RT-PCR de siete translocaciones vinculadas Con el origen y evolución de otros tipos de leucemia Dot-plot de la población celular (por tamaño y granulosidad) de los tes casos de LMC analizados Dot-plot de la población celular de un paciente con LMC analizado Dot-plot de la población celular de un paciente representativo de los tres casos de LMC en crisis blástica analizados Dot-plot de la población celular de un paciente representativo de los tres casos de LMC en crisis blástica analizados Ensayos de amplificación por PCR convencional en muestras previamente tratadas con ADNasa. 121 xi

13 45 Estandarización de la amplificación por PCR convencional de los genes GAPDH, Lyn y AKAP Gráficas de amplificación, curva de fusión y corrida en agarosa % de los productos de amplificación de los genes GAPDH, AKAP12 y Lyn en personas normales y pacientes con LMC. 47 Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes 126 con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes 126 con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes 127 con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes 127 con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp Gráfica de la expresión relativa del gen Lyn en controles (N, puntos 130 blancos) y pacientes LMC en las diferentes fases clínicas de enfermedad. 52 Gráfica de la expresión relativa aleatorizada de los gen GAPDH 131 y Lyn en las diferentes fases clínicas de la LMC. 53 Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación 133 del punto de fusión de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC 54 Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación 133 del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC 55 Alineación de la secuencias automáticas de los pacientes F1, F2, F3, F5, F6, 138 F10, F11, F12, F13, F14, F25, F16, F17, F18, F19 y la secuencia reportada para el dominio de BCR/ABL (número de acceso: NM005157) 56 Mutaciones puntuales encontradas en el dominio tirosina quinasa (SH1) de 166 la quimera BCR/ABL asociadas con la resistencia clínica a Imatinib. xii

14 ÍNDICE DE TABLAS Tabla Título Pág. I Mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa del a quimera 28 BCR/ABL que han sido asociadas con la resistencia al tratamiento con Glivec en pacientes con LMC y LLA. II Secuencia de cebadores empleados en la amplificación de las diferentes 48 variantes de la translocación BCR/ABL y del control interno BCR en pacientes LMC. III Translocaciones seleccionadas para la producción de paneles de 61 diagnóstico de Leucemias. IV Paneles de anticuerpos monoclonales usados en el diagnóstico de 63 enfermedades hematoncológicas. V Genes seleccionados para los estudios de expresión génica en pacientes 71 positivos para la translocación BCR/ABL. VI Secuencia de cebadores usados para la amplificación de la quimera 77 BCR/ABL y el dominio tirosina quinasa en pacientes con LMC VII Cuadro resumen de los 200/297 pacientes LMC positivos para 84 la translocación BCR/ABL y sus respectivas variantes obtenidas. VIII Cálculo de la frecuencia de BCR/ABL en pacientes Venezolanos con 99 LMC y su comparación con la frecuencia esperada de 95% de positivos para BCR/ABL, reportado en otros países. IX Frecuencia de las diferentes variantes BCR/ABL encontradas en 100 los pacientes LMC venezolanos y su comparación con un modelo de distribución uniforme. X Frecuencia de las variantes b2a2 y b3a2 encontradas en 101 los pacientes LMC venezolanos y su comparación con un modelo de distribución uniforme. XI Valores de p obtenidos de la comparación entre las frecuencias de 103 las variantes (b2a2, b3a2, b2a2/b3a2) encontradas en Venezuela xiii

15 y en otros países latinoamericanos. XII Resumen de los resultados obtenidos en la RT-PCR realizada 109 a 40 pacientes de los 96 que dieron negativos para la quimera BCR/ABL XIII Pacientes LMC positivos incluidos en el estudio de expresión génica 120 mediante la técnica de PCR en Tiempo Real. XIV Valores obtenidos a partir de la amplificación por PCR en Tiempo 129 Real de los genes GAPDH y Lyn. XV Resumen de los resultados obtenidos en el estudio de los factores 139 que afectan la respuesta al tratamiento con Imatinib XVI Compuestos inhibidores de proteínas tirosina quinasa y su espectro 171 de acción xiv

16 LISTA DE ABREVIATURAS LMC = Leucemia mieloide crónica LMA = Leucemia mieloide Aguda LLA = Leucemia linfocítica aguda SP = Sangre periférica MO = Médula ósea c-abl = Designación para el gen abl bcr = Designación para el gen bcr ABL = Designación para la proteína ABL BCR = Designación para la proteína BCR BCR/ABL = Designación para la proteína quimérica Ph+ = Cromosoma filadelfia SH1 = Dominio 1 de homología con la familia Src SH2 = Dominio 2 de homología con la familia Src SH3 = Dominio 3 de homología con la familia Src ADN = Ácido desoxirribonucleico ARNm = Ácido ribonucleico mensajero ARNt = Ácido ribonucleico total DEPC = Dietilpirocarbonato b2a2 = Variante de BCR/ABL b3a2 = Variante de BCR/ABL e1a2 = Variante de BCR/ABL HLA = Sistema de leucocitos antígenos humano CDs = antígenos celulares IFNα = Interferon alfa STI751, Glivec = Fármaco usado contra la LMC FC = Fase crónica de la LMC xv

17 FA = Fase acelerada de la LMC CB = Fase de crisis blástica de la LMC K562 = Línea celular creada a partir pacientes LMC que expresa BCR/ABL. RTQ-PCR = Racción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa Lyn= Designación para el gen Lyn. LYN = Designación que se le da a la proteína codificada a partir de gen Lyn. GAPDH = gliceraldehil pirubato deshidrogenasa Fish = Técnica de inmunofluorescencia con sondas marcadas para ver cromosomas en metafase. CMF = Técnica de Citometría de flujo FSC = distribución de la serie blanca en el gráfico de dispersión de acuerdo al tamaño celular SSC = Distribución de la serie blanca en el gráfico de dispersión de acuerdo a su complejidad o granulocidad. Ag = Anticuerpo Monoclonal. CD 10, 20, 33, 34,.etc.= Nombre para designar a los diferentes antígenos celulares. xvi

18 INTRODUCCIÓN Algunas alteraciones cromosómicas y genéticas en las células progenitoras hematopoyéticas inmaduras, sean mieloides (que dan origen a eritrocitos, monocitos, plaquetas, megacariocitos, promielocitos, etc) o linfoides (que dan origen a linfocitos B, T y células suicidas naturales), han sido involucradas en la producción de proteínas quiméricas funcionales que dan origen a las leucemias (Ver figura 1) (Faderl y Col. 1999; López. 2002; Melo y Col. 2003). De acuerdo al tipo de célula progenitora que se altera, las leucemias han sido clasificadas en dos grandes grupos: (1) las leucemias mieloblásticas, en las cuales la alteración que se produce involucra a las células progenitoras de origen mieloide, y (2) las leucemias linfoblásticas, en las cuales la alteración envuelve a células progenitoras de origen linfoide. Adicionalmente, las leucemias han sido clasificadas en crónicas y agudas de acuerdo a la madurez del tipo celular comprometido y a la agresividad clínica con la cual se desarrollan. (Bennett y Col. 1976; Bennett y Col. 1996; Goldsby y Col. 2000). Por otra parte, las leucemias crónicas, en las que se incluyen a la leucemia mieloide crónica (LMC) y a la leucemia linfocítica crónica (LLC), se caracterizan fundamentalmente por la presencia de células sanguíneas en diferentes períodos de maduración y por ser consideradas menos agresivas en su inicio, aún cuando el paciente tiene menos probabilidad de sobrevivir en etapas avanzadas. Por su parte, las leucemias agudas, en las que se incluyen la leucemia mieloide aguda (LMA) y la leucemia linfoblástica aguda (LLA), están caracterizadas por un alto número de células inmaduras y por presentar cuadros agresivos en los inicios de la enfermedad, sin embargo, a diferencia de las leucemias crónicas, el paciente puede sobrevivir posterior a un tratamiento adecuado (Bennett y Col. 1976; Bennett y Col. 1996; Goldsby y Col. 2000). Una de las leucemias que más ha sido estudiada en la actualidad es la leucemia mieloide crónica (LMC), la cual ha marcado pauta para el estudio y comprensión de los otros tipos de leucemias. Esta enfermedad involucra a todas las células de origen mieloide y 1

19 algunas de las células de origen linfoide. Adicionalmente, estudios vinculados con la LMC la reportan como la más frecuente en adultos (15-20%), con una incidencia de 1-2 casos por cada personas por año. Por otra parte, la edad promedio en la cual se manifiesta esta enfermedad ha sido estimada cercana a los 45 años, con un intervalo comprendido entre los 25 y 70 años (70 %). Aunque la LMC es considerada como una leucemia que se manifiesta fundamentalmente en adultos, también ha sido reportada en niños (10%) (Faderl y Col. 1999; Figura 1. Esquema representativo del proceso de Hematopoyesis. Los círculos y flechas rojos identifican las células progenitoras mieloides y linfoides que dan origen a las diferentes células sanguíneas. La figura interna muestra los distintos componentes de la médula ósea entre los que se encuentran las células troncales hematopoyéticas y del estroma, las células de soporte del estroma, adipocitos y osteoblastos. Tomado de Clínica de la Leucemia Mieloide Crónica (LMC). La LMC se define clínicamente como una expansión clonal de células progenitoras hematopoyéticas principalmente del linaje mieloide donde se incluyen: granulocitos del tipo 2

20 promielocito, mielocito y metamielocito presentes tanto en la médula ósea (MO) como en la sangre periférica (SP). La gran cantidad de granulocitos presentes durante la LMC se debe a las alteraciones que ocurren en el proceso de diferenciación de estas células, impidiendo su desarrollo hacia glóbulos blancos maduros y provocando su acumulación y aumento desmesurado con respecto a las células normales (Golde y Gulate, 1994; Bennett y Col. 1996; Amarante-Mendes y Col. 1998; Deininger y Col. 2000; Kosugi y Col. 2000). Desde el punto de vista de su evolución clínica, la LMC se puede clasificar en tres fases:.- Fase crónica inicial. Tiene un período variable de duración (aproximadamente de 3 a 5 años). En esta fase se pueden observar cantidades similares de células maduras e inmaduras, tanto en MO como en SP. Adicionalmente, es posible encontrar en los pacientes que padecen de LMC un elevado recuento de leucocitos, esplenomegalia (crecimiento del bazo), baja actividad de la fosfatasa alcalina de los neutrófilos, anemia y un hipermetabolismo con la consecuente pérdida de peso, fatiga, fiebre y niveles elevados de ácido úrico..- Fase acelerada. Puede durar algunos meses y se caracteriza tanto por un aumento en el número de blastos en MO y SP ( 10%), como el de los basófilos y eosinófilos ( 20%). A su vez es posible encontrar leucocitosis (cuando el valor absoluto de leucocitos es mayor de ), visceromegalia (crecimiento de las vísceras) progresiva, anemia progresiva, trombocitosis (presencia de un alto número de plaquetas en la sangre), mielofibrosis (acumulación de fibras y células sanguíneas anómalas dentro de la médula ósea), dolor en los huesos, fiebre y un aumento en la resistencia al tratamiento..- Fase terminal o de crisis blástica. Está asociada a signos y síntomas de leucemia aguda o enfermedad extramedular, las cuales se caracterizan por un aumento excesivo de células blásticas mieloides o linfoide en MO y SP ( 20%) y pancitopenia (disminución de todas las poblaciones celulares de la sangre). En esta última etapa, el paciente tiene menos probabilidad de sobrevivir, pues se hace completamente resistente al tratamiento, y el período de vida pudiera verse limitado a unos pocos meses. Mas aún, existen algunos casos en los que se puede llegar a una fase refractaria final en la cual el paciente no responde a 3

21 ningún tipo de tratamiento (Kantarjian y Col. 1993; Golde y Gulate, 1994; Beedassy y Col. 2000; Di Bacco y Col ). Factores genéticos y no genéticos (ambientales) relacionados a la LMC. Factores genéticos: Hasta ahora no se ha encontrado ningún factor genético o predisposición que induzca LMC. Por ejemplo, estudios en pacientes gemelos afectados con LMC no reportan un mayor riesgo de desarrollar esta enfermedad por parte del hermano que no se ha visto afectado. Sigue siendo un misterio el por qué sólo uno de dos gemelos idénticos es capaz de desarrollar LMC, siendo su genética idéntica y el ambiente al que son expuestos prácticamente el mismo (John y Col. 1973). Actualmente, la única asociación descrita de un factor genético con la aparición de la LMC deriva de los trabajos realizados con el sistema de histocompatibilidad (HLA). Se ha demostrado que la respuesta inmune mediada por linfocitos T, vía expresión de diferentes alelos HLA, juega un rol muy importante en la inmunosobrevivencia contra la LMC. En tal sentido, Cortes y col. (1998) demostraron que ciertas moléculas de HLA clase I y II son capaces de asociarse con BCR/ABL e inducir una respuesta inmune tipo CD8+ linfocito T citotóxico contra esta proteína quimérica. Por su parte, Yasukawa y colaboradores (2000) realizando un estudio sobre los diferentes alelos reportados para HLA y las variantes b2a2 y b3a2 presentes en la LMC, encontraron que existía una asociación en la expresión de algunos tipos de alelos HLA y las variantes expresadas en pacientes LMC en comparación con personas normales. Estos resultados suponen una ventaja de no padecer la enfermedad en aquellas personas que expresan los alelos que son capaces de presentar a la quimera ante el sistema inmune para que sea degradada. En contraparte a los trabajos anteriores, Mundehada y colaboradores (2004) no consiguieron ninguna asociación específica entre las diferentes variantes de las quimeras presentes en la LMC y los alelos HLA reportados anteriormente. Aunque los hallazgos obtenidos en este tema no han producido resultados contundentes, han abierto una puerta en la búsqueda de diferentes tipos de moléculas que pudieran inducir una predisposición a la LMC. 4

22 Factores no genéticos (ambientales): Existen muchos factores no genéticos que han sido relacionados con el origen y evolución de la LMC. Por ejemplo, las exposiciones por largo tiempo a altas energías de radiación (tal como ocurrió en Japón durante la segunda guerra mundial), algunas drogas (quimioterapia), algunos inmunosupresores y las radiaciones usadas en el tratamiento de otros tipos de canceres u otras enfermedades, pueden incrementar el riesgo de aparición de LMC entre un 20 30%. Otros factores asociados a la aparición de la LMC que han sido estudiados incluye: los campos electromagnéticos de frecuencias extremadamente baja, pesticidas, bencenos, formaldehídos, infecciones virales (por ejemplo el virus HTLV-1, que causa la leucemia/linfoma de células T del adulto) y errores en la recombinación que ocurren a lo largo de la vida, entre otros (Sompayrac 1999). La propensión a la leucemia también puede verse incrementada luego de largos períodos de endogamia en una población. Adicionalmente, una hipótesis similar ha planteado que las personas que no han sido expuestas durante su juventud a los agentes infecciosos comunes, pueden tener mayor propensión a sufrir de leucemias. Los agentes infecciosos serían nuevos en su sistema causando una inmunorespuesta fuerte e inadecuada (Robien y Ulrich. 2003). Citogenética de la LMC: Aunque la LMC se conoce hace más de 150 años, la alteración cromosómica que la produce no fue descubierta sino hasta 1960 (Nowell y Hungerford). A partir de este momento fue conocida como la enfermedad del cromosoma Ph+ (o cromosoma Filadelfia en honor a la ciudad donde fue descubierta por primera vez), debido a que la principal característica que presentaban los pacientes que la padecían era la presencia de un cromosoma 22 de menor tamaño en su cariotipo, con respecto al cromosoma 22 de personas normales. Años más tarde, fue incluida dentro del subgrupo LMC debido a que el 95% de los pacientes que presentaban esta patología clínica también presentaban un cromosoma 22 con las mismas características que las reportadas por Nowell y Hungerford y a partir de este momento se convirtió en el distintivo de identificación de la LMC (Faderl y Kantarjian. 2000; Goldman y Melo. 2003). 5

23 A principios de los años 70 el estudio detallado del cromosoma Ph+ permitió descubrir que su origen es producto de la translocación de la porción distal del cromosoma 22 dentro de otro cromosoma, usualmente el cromosoma 9 (Rowley, 1973). Citado por Goldman y Melo. 2003). En 1982 De Klein y colaboradores, demostraron que el oncogen abl estaba involucrado en la translocación generada desde el cromosoma 9 al cromosoma 22, indicando que la translocación era recíproca y no aleatoria entre los brazos largos de ambos cromosomas. Esto sugirió, por primera vez, un rol determinante del gen abl en la aparición y evolución de la LMC. Para el año de 1984 Prakash y Yunis, mapearon la secuencia de los puntos de corte en los cromosomas 22 y 9 en las sub-bandas 22q11.21 y 9q34.1, respectivamente. A partir de ese momento la translocación fue también denotada como t(9;22)(q34;11). Más aún, estos investigadores también reportaron que aunque la posición del corte en el cromosoma 9 era poco variable, en el cromosoma 22 si existía un alto grado de variabilidad en el punto de corte, el cual estaba agrupado en un área que fue llamada bcr ("binding cluster region"). En 1985 Shtivelman y colaboradores se refirieron a esta región como un gen al que se le denominó bcr, además reportaron que en la translocación el oncogen abl era transferido al cromosoma 22 (Ver figura 2). Figura 2. Esquema representativo de la translocación recíproca y no aleatoria entre los cromosomas 9 y 22 que originan el cromosoma Filadelfia que participa en la aparición y evolución de la LMC. Las bandas de color rojo y amarillo representan la región de ambos cromosomas involucrados en el punto de fusión. Tomado de 6

24 Caracterización de los genes translocados en la LMC: Posterior al descubrimiento de la translocación t(9;22)(q34;11) y a la identificación de los genes involucrados en ella, la atención se centró principalmente en la caracterización detallada de los genes abl y bcr, la proteína híbrida (bcr/abl) que se produce en la translocación y las funciones celulares en las que se ven envueltos (Melo 1996; Kantarjian y Col. 2000). El gen abl humano es el homólogo del oncogen v-abl del virus de la leucemia murina de Abelson. El ARNm que se transcribe a partir de este gen comprende 11 exones (denominados a1- a11), los cuales codifican para una proteína de 145-KDa conformada por aminoácidos. Entre las propiedades que caracterizan a la proteína ABL se incluye una actividad enzimática del tipo tirosina quinasa no receptora, que se expresa en todos los tejidos y que está presente en las dos isoformas originadas por un corte y empalme alternativo ( splicing ) del primer exón del ARNm del gen. Adicionalmente, la proteína ABL contiene diversos dominios estructurales: a) tres dominios de homología Src: SH1, SH2 y tirosina quinasa SH3, los cuales están ubicados en el extremo N-terminal, b) un dominio central rico en prolina que permite la interacción con dominios SH3 de otras proteínas y por último c) un dominio ubicado en el extremo C-terminal que contiene señales de localización nuclear, unión al ADN, exportación hacia el citoplasma y de unión a F-actina y G-actina, (ver figura 3). Basado en su estructura proteica, la proteína ABL puede ser ubicada tanto en el citoplasma como en el núcleo y ha sido implicada en la regulación de procesos celulares tan importantes como: la diferenciación celular, el ciclo celular, la adhesión celular y respuesta a estrés. En condiciones normales, la actividad enzimática de la proteína ABL es fuertemente regulada por la unión intramolecular de la porción inicial de la región N- terminal (comprendida por el exon 1 [1b o 1a] y la primera parte del exon 2 [a2]) al dominio SH1, (Kipreos y Wang, 1990; Sawyers y Col. 1994; Lewis y Col ; Faderl, y Col. 1999; Van Etten, 1999; Yuan y Col. 1999; Pluk y Col ; Goldman, y Melo

25 Figura 3. Esquema representativo de los diferentes dominios estructurales presentes en las proteínas (A) BCR, (B) ABL y (C) el híbrido BCR/ABL. Las nomenclaturas p160, p145 y p210 representan otra forma en la que son llamadas estas proteínas. N y C indican los extremos N-terminal y C-terminal de cada proteína respectivamente. Los bloques de distintos colores representan los diferentes dominios estructurales para cada proteína. En el dominio serina/treonina de BCR se señala la ubicación del residuo de tirosina 177. El esquema del híbrido BCR/ABL muestra las regiones de la proteína que corresponden a BCR y ABL, así como el punto de fusión más común. Tomado de Expert Reviews in Molecular Medicine 2003 Cambridge University Press. Por su parte, el gen bcr transcribe un ARNm que abarca 25 exones (también denominados e1 e25) los cuales codifican para una proteína de 160-KDa conformada por aminoácidos. El producto proteico de este gen es expresado en todos los tejidos y, al igual que ABL, presenta diferentes dominios estructurales: a) en el extremo N-terminal se encuentra un dominio hélice vuelta hélice involucrado en la formación de homodímeros u homotetrámeros (oligomerización), además de un dominio de unión a SH2, b) en la porción central se encuentra un dominio con actividad enzimática serina-treonina quinasa (cuyos únicos sustratos identificados han sido BAP-1 y el mismo BCR) y adicionalmente un dominio con homología a los factores de intercambio de GTP por GDP, Rho, Rho GEF y por último c) en el extremo C-terminal un dominio que facilita la unión de lípidos dependientes de Calcio (CalB) y un dominio con homología a la proteína activadora de la GTPasa Rac (Rac-GAP), la cual es una pequeña GTPasa de la super familia Ras que regula la 8

26 polimerización de actina y la actividad de una NADPH oxidasa en células fagocíticas (ver figura 3) (Deininger y Col. 2000). La localización celular de BCR ha sido precisada específicamente en el citoplasma y dentro de sus funciones mas importantes destaca su participación en las vías de transducción de señalización celular, lo cual quedó evidenciado cuando se demostró que BCR fosforilada en su residuo de tirosina 177 es capaz de unirse a la proteína adaptadora Grb2 (proteína que participa en la activación de la vía de señalización de Ras). Otras investigaciones han demostrado que la proteína BCR también posee la capacidad de asociarse con el ADN y con la proteína XPB, a través de su estructura aminoacídica, lo cual le permite jugar un rol crucial durante el proceso de reparación del ADN, iniciación general de la transcripción y regulación del ciclo celular (Laurent y Col. 2001; Duncan y Col. 2003). Además de las características estructurales específicas de la proteína BCR cabe destacar que tanto el gen como la proteína deben su nombre a la presencia de regiones conocidas como "binding cluster region" (bcr), las cuales han sido reportadas como regiones sensibles a ruptura. Hasta ahora, se conocen tres regiones dentro del gen bcr que presentan estas características, las cuales han sido ubicadas de mayor a menor dependiendo de la frecuencia con que ocurre el corte. Estas son: la región bcr mayor (M-bcr), la región bcr menor (m-bcr) y la región bcr micro (µ-bcr) (ver figura 4) (Wetzler y Col. 1995; Maru y Col. 1999; Takeda y Col. 1999; Laurent y Col. 2001). De la fusión de los genes abl y bcr en t(9;22)(q34;q11), y su posterior transcripción y traducción, se originan dos proteínas híbridas denominadas BCR/ABL y ABL/BCR. La proteína quimérica BCR/ABL es funcionalmente activa y ha sido demostrado que ejerce un efecto importante en la transformación de las células presentes en los pacientes con LMC. Sin embargo, aún cuando el híbrido ABL/BCR es transcripcionalmente activo, hasta los momentos, no se ha determinado su participación en algún rol funcional que lo vincule al origen y evolución de la enfermedad, a pesar de todos los estudios que se han realizado en la región codificante de esta proteína (Mes-Masson y Col. 1986). 9

27 Figura 4. Esquema representativo de la estructura de los genes abl y bcr en sus respectivos cromosomas y algunas de las isoformas quiméricas que se pueden formar a partir de la fusión de ambos. Las flechas rojas indican los diferentes puntos de ruptura para ambos genes. Tomado de The New England Journal of Medicine, El gen híbrido bcr/abl involucra generalmente al exon 2 (a2) del gen abl y los exones, 1 (e1), 12 (b2) 13 (b3) y 19 (e19) del gen bcr. La variabilidad en el punto de corte del gen bcr ha permitido detectar varias isoformas BCR/ABL o variantes en los pacientes con LMC. Una de estas isoformas es producida como consecuencia de la ruptura en la región menor de corte del gen bcr (m-bcr), la cual involucra el exón 1 e induce la expresión de un ARNm de 7.5 kb que codifica para una proteína de 190 KD. Esta primera variante proteica, denominada p190 BCR/ABL o e1a2, está presente en el 70% de los casos de LLA de adulto y en un 20% de los casos LMC (Hermans y Col. 1987). La segunda isoforma es producida como resultado de una ruptura en la región mayor de corte de bcr (M-bcr) que involucra los exones 12 y 13, conduciendo a la producción de un ARNm de 8.5Kb que codifica para una proteína de 210 KD. Esta isoforma denominada p210 BCR/ABL, es la más común en los casos de LMC (95%), la cual a su vez se subdivide en dos variantes: b2a2 y b3a2, denominadas así por Melo y Col. (1995). La tercera y última isoforma del híbrido BCR/ABL es la menos común y se produce como resultado de una ruptura en la región micro de corte de bcr (µ-bcr) que involucra al exon 19, codificando una proteína de 230 KD. Esta isoforma denominada p230 BCR/ABL o e19a2, fue primero identificada en pacientes con un tipo de leucemia conocida 10

28 como leucemia neutrofílica crónica (LNC) y que ha sido reportada en pocos casos de LMC (ver figura 4) (Melo y Col.1993; Melo, 1996; Wilson y Col. 1997; Briz y Col. 1997; Kantarjian, y Col. 2000; Quackenbush y Col. l. 2000; Duncan, y Col. 2003). Cabe destacar que además de las isoformas más comunes descritas anteriormente, también han sido identificadas otras variantes de BCR/ABL reportadas con una frecuencia de aparición mucho menor. Estas variantes han sido denominadas: e1/a3, b2a3, b3a3, e2/a1a, e6/a2, e8/a2 y e13/a2. (Melo y Col. 1994; Melo, 1996; Melo, y Col. 1996; Pane y Col. 1996; Ravandi y Col. 1999; Laurent y Col. 2001). Vías de señalización celular que se ven afectadas en pacientes con LMC. La quimera BCR/ABL conserva la actividad enzimática tipo tirosina-quinasa de la proteína ABL pero de una manera desregulada (la proteína está activada constitutivamente). Dada su funcionalidad, el híbrido BCR/ABL ha sido vinculado de manera crucial en las vías de señalización que participan en el crecimiento, diferenciación y apoptosis celular. Por lo tanto, basado en la importancia vital que tiene la actividad tirosina-quinasa de la proteína ABL (mantenida en la quimera) y sumado a la nueva capacidad de interactuar con múltiples dominios de otras proteínas, gracias a las nuevas conformaciones adquiridas por su unión con BCR, se ha hecho necesario tratar de entender los mecanismos mediante los cuales esta células transformadas conducen a una condición de malignidad. (Melo 1996; Deininger y Col.2000; Kantarjian y Col. 2000). Uno de los eventos que desencadena el efecto transformante de la fusión BCR/ABL incluye la inducción de la proliferación de estas células de una manera independiente de los factores de crecimiento hematopoyéticos (eritropoyetina, trombopoyetina, interleuquina 3 o 6, factores estimulantes de colonias granulocito-macrófago y factor de células troncales), quienes cumplen este rol en condiciones normales. Este hecho, desencadena una serie de cambios intracelulares que traen como consecuencia la expansión del clon maligno con respecto a las células que no producen la proteína quimérica (Cline 1994; Faderl y Col. 1999). 11

29 Basados en diversas investigaciones referidas a las diferentes vías de señalización celular que pueden ser afectadas por la proteína híbrida BCR/ABL (Verfallie y Col. 1997; Deininger y Col. 2000; Melo y Col. 2003), las cuales participan no sólo al inicio sino durante la progresión de la LMC, han sido propuestos 4 mecanismos principales para incidir en la transformación maligna de las células de pacientes con LMC: 1) Adhesión celular alterada, de los clones transformados con las células del estroma de la médula ósea (MO) y de la matriz extracelular. 2) Activación constitutiva de la señalización mitogénica. 3) Reducción de la apoptosis celular. 4) Degradación de proteínas inhibitorias de ABL mediada por proteosomas. 1. Adhesión celular alterada: En el microambiente del estroma de la médula ósea ocurren procesos de adhesión y mantenimiento de las células progenitoras de la sangre. Estos procesos son regulados por receptores y agonistas de supervivencia y proliferación a través de una estimulación directa sobre estas células, lo cual facilita la adquisición de una buena fijación, comunicación y control de la diferenciación (Di Bacco y Col. 2000). En efecto, el proceso de adhesión celular es llevado a cabo por un grupo de proteínas receptoras de la superficie celular conocidas como integrinas. Estas proteínas son glicoproteínas compuestas de dos sub-unidades α y β (α4β1 y α5β1), donde la cadena α determina la especificidad por el ligando y la cadena β participa en la activación de la vía de transducción de señal, posterior a la unión del ligando. Esta vía de señalización se inicia cuando las integrinas son activadas por su ligando e inducen el reclutamiento tanto de proteínas del citoesqueleto (tales como tensina, paxillina, talina y vinculina) como de proteínas con actividad tirosina-quinasa (Fax y c-abl) y proteínas adaptadoras (GRB2 y CRKL), las cuales forman el complejo de adhesión focal (Clark y Brugge, 1995; Schwartz y Col. 1995; Lewis, y Col. 1996). Varios estudios han demostrado que las células progenitoras presentes en los pacientes con LMC, exhiben una disminución en su capacidad para adherirse a las células del estroma 12