Memoria Técnica Proyecto
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- María del Carmen Pereyra Mora
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1 Memoria Técnica Proyecto TÍTULO DEL PROYECTO: Dar salud a la edad. Claves del envejecimiento vascular saludable en la poblacion octogenaria ACRÓNIMO: CEVASALU INVESTIGADOR PRINCIPAL/COORDINADOR PROYECTO: Teresa Padró Capmany ENTIDAD: Instituto Catalán de Ciencias Cardiovasculares (ICCC)- IIB Sant Pau San Antoni Maria Claret 67, Barcelona Proyecto realizado con la financiación del IMSERSO (expediente 3/20), Area temática: Envejecimiento saludable Barcelona, 25 Junio 203 CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares
2 La edad vascular y el aumento de susceptibilidad a patología vascular en relación a la edad son factores clave en el grado de morbilidad y discapacidad en edades avanzadas. De hecho, según la encuesta de discapacidades, deficiencias y estado de salud en la población española (EDDES, 999), aproximadamente el 35% de enfermedades discapacitantes en personas mayores de 80 años son debidas a manifestaciones clínicas derivadas de patología vascular. Además, muchas de las enfermedades caracterizadas como degenerativas en el envejecimiento patológico, como es el caso del Alzheimer tienen un componente vascular y/o microvascular relevante. El retraso en la manifestación clínica o la ausencia de patología cardiovascular y sus factores de riesgo en edades avanzadas es un factor determinante para un envejecimiento saludable y aportar no solo más años a la vida de un individuo sino más vida a esos años ganados. Hasta ahora, nuestro conocimiento sobre la biología del envejecimiento es todavía muy limitado. Durante la última década se han realizado diferentes estudios génicos basados en grupos de muy avanzada edad que han permitido establecer asociaciones entre una mayor longevidad y la presencia de alelos génicos específicos. Sin embargo, la presencia/ausencia de una isoforma génica específica (por ejemplo polimorfismo) representa únicamente un factor de riesgo para un envejecimiento patológico en lugar de presentarse una longevidad saludable, en ausencia de patologías crónicas discapacitantes. Por el contrario, son los niveles de expresión génica, así como la presencia de modificaciones post trasduccionales en las proteínas que de ellos derivan los que determinan la ausencia o presencia de una enfermedad. El estudio realizado ha tenido como finalidad identificar y caracterizar perfiles de expresión génica y de patrones proteicos asociados a un retardo en el envejecimiento vascular y favorecedores por ello de una longevidad saludable en una población de edad avanzada. CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 2
3 Este estudio específico, desarrollado en el Instituto Catalán de Ciencias Cardiovasculares (ICCC), se ha realizado a partir de muestras de sangre de una población octogenaria, toda ella de la misma edad y con residencia habitual en una área de unos 40Km de diámetro (situado al sur de la ciudad de Barcelona), a fin de homogeneizar al máximo los efectos ambientales externos. Las muestras de sangre se recogieron en el año 20 en el marco de un estudio en red con el Grupo Investigador del estudio OCTABAIX. Las muestras utilizadas en el estudio se han mantenido a 80ºC, sin descongelar hasta la fecha de su estudio, en el Biobanco del ICCC. Tanto las muestras biológicas como la información de las variables antropométricas e historiales clínicos de los donantes, almacenadas en la base de datos y utilizadas en el estudio, se encuentran debidamente codificadas, de acuerdo con la ley de protección de datos. La actividad realizada como parte del proyecto incluye:. Definición de los grupos de estudio dentro de la población octogenaria OCTABAIX. Se han seleccionado dos grupos (n=9/grupo) en base a las siguientes características proporcionadas por los clínicos del estudio OCTABAIX. Ausencia o presencia enfermedad cardiovascular clínica (infarto de miocardio y/o isquemia cerebral). Marcadores de envejecimiento satisfactorio definidos por (a) el índice de Barthel (para las actividades de la vida diaria) y (b) el indice de Lawton (para las actividades instrumentales de la vida diaria y (c) el índice MEC (escala mini examen cognoscitivo) La población en estudio incluye 5 hombres y 23 mujeres todos ellos de 87 años de edad cuando se obtuvo la muestra de sangre para el estudio realizado. En el momento que se recogió la muestra, los individuos con envejecimiento saludable presentaron un valor medio en el índice de Barthel superior a 95 y de 30 en el índice MEC, mientras que los CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 3
4 individuos con envejecimiento no saludable presentaron un índice de Barthel en el rango de y un índice MEC inferior a 26. Un 45% de los individuos en el grupo de envejecimiento no saludable habían sufrido un infarto de miocardio y un ictus, un 7% han sufrido un infarto, un 30% un ictus con manifestación clínica evidente y 8% enfermedad vascular periférica. Ambos grupos presentaron un valor medio en el índice de masa corporal (IMC) entre 26 y 30, aunque la puntuación nutricional (MNA) era un 20% más baja en el grupo con envejecimiento no saludable. En lo que refiere a factores de riesgo cardiovascular establecidos (hipercolesterolemia, diabetes, hipertensión), en el grupo con envejecimiento no saludable, más del 70% de la población recibía tratamiento farmacológico para uno o más de ellos (80% estatinas, 83% IECAS, ARAII o betabloqueantes, 2% insulino dependientes) y 65% del grupo estaba en tratamiento con antiagregantes y un 50% recibía antagonistas de calcio. Los tratamientos más frecuentes en el grupo con envejecimiento saludable eran diuréticos (44%) e IECAs (22%) y únicamente individuo de los 8 del grupo recibía antiagregantes y antagonistas de calcio. 2. Preparación de mrna a partir de la muestra de sangre de sangre total. Se ha elegido los tubos PAX por contener una solución estabilizadora de RNA que permite mantener de forma estable el mrna de las células sanguíneas. La extracción de mrna se ha realizado mediante reactivos comerciales, siguiendo el protocolo descrito por el proveedor (Qiagen). La cantidad de mrna obtenido en cada una de las muestras se ha cuantificado mediante un espectrofotómetro tipo NanoDrop 000 (ThermoScientific) y la integridad de las mismas mediante un equipo Bioanalyzer 200 (Agilent Technologies) 3. Estudio del patrón de expresión génica diferencial. Este estudio se ha realizado en diferentes fases que incluyen () análisis de expresión de genoma completo utilizando microarrays d expresión ; (2) análisis estadístico de los resultados para obtener las diferencias de expresión entre los grupos de envejecimiento saludable y no saludable (3) CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 4
5 validación de dianas moleculares seleccionadas mediante la técnica de PCR a tiempo real; (4) análisis de integración de los resultados mediante plataformas informáticas que permiten realizar el estudio de los datos usando Biología de Sistemas. De forma breve, - El perfil de expresión génica diferencial en individuos longevos sanos comparado con aquellos con envejecimiento no saludable se ha llevado a cabo un análisis de expresión de genoma completo (aproximadamente genes), utilizando un microarray de expresión (GeneChip Human Gene.0ST Arrays, Affymetrix), siguiendo el procedimiento descrito por los proveedores en un equipo System 3000 (Affymetrix). En esta fase se han se han comparado 2 grupos de 8 individuos cada uno, a fin de obtener una N con suficiente potencia estadística. - El análisis estadístico para obtener los patrones de expresión diferenciales entre los dos grupos en estudio se ha realizado mediante el programa estadístico Partek Genomic Suite (Partek Inc) y corroborado con los paquetes estadísticos SPSS y StatView. Las diferencias se han considerado significativas para un valor estadístico p<o= 0,05, corregido por contrastes múltiples mediante el FDR para eliminar posibles falsos positivos. - La validación de los genes de interés seleccionados a partir del estudio de la expresión de genoma completo se ha realizado mediante la técnica de PCR a tiempo real. Para esta validación se han diseñado tarjetas microfluídicas (Life Technologies), basadas en la tecnología de sondas TaqMan y se ha utilizado un equipo 7900HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems Life Technologies) para su análisis. Aquellos genes que por sus características no se dispone de sondas para uso en tarjetas se han analizado de forma individual. Se han analizado, además, una serie de genes (htert, SIRT, FOXO3, ADAM0) cuyos cambios de expresión se han asociado a procesos de senescencia celular de forma consistente en la literatura. Los niveles de expresión de mrna para los diferentes genes se han CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 5
6 expresado de forma relativa en comparación a los niveles de expresión mostrados por los genes endógenos (actina beta y HPRT). - El análisis estadístico de expresión diferencial se ha realizado mediante el paquete estadístico StatView. Se ha utilizado el test estadístico ANOVA para 2 factores (envejecimiento saludable /sexo), si la interacción entre ambas no da significativa, se han considerado únicamente los factores principales. - A fin de poder interpretar los resultados en base a la relevancia biológica y funcional de los genes que han validado una expresión diferencial, se ha realizado análisis in silico mediante las herramientas informáticas GOstat y REVINGO, así como mediante Ingenuity Pathway Análisis (IPA, Ingenuity Systems) que permite, además identificar las vías canónicas de señalización y las redes de interacción entre genes. 4. Patrón proteómico diferencial en plasma de individuos octogenarios con/sin envejecimiento saludable. A fin de identificar proteínas del plasma asociadas a un envejecimiento saludable, se ha ha analizado el proteoma de plasma de ambos grupos de pacientes y se han comparado los perfiles proteicos de los sujetos de ambos grupos para determinar las proteínas con niveles de tectección o patrones diferenciales. Para ello se ha realizado la separación de las proteínas e isoformas proteicas por electroforesis bidimensional e identificado las proteínas de interés por espectrometría de masas MALDI ToF (esquema en Figura ). En una primera fase se ha realizado un subfraccionamiento del plasma mediante una columna que mediante el uso de anticuerpos específicos (Agilent) permite eliminar las proteínas mayoritarias (albumina, IgGs, IgAs, transferrina, α antitripsina, haptoglobina y fibrinógeno) que debido a su abundancia enmascaran las proteínas minoritarias potencialmente interesantes. En la fracción enriquecida en proteínas minoritarias se ha cuantificado la concentración de proteína total y se han sometido las muestras a una electroforesis bidimensional para la CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 6
7 separación de las proteínas en función a su punto isoeléctrico y masa molecular (Figura A). Para ello, en la primera dimensión (separación por punto isoeléctrico) se utilizaron tiras de acrilamida con gradiente de ph inmovilizado (tiras de IEF). Se ha utilizado el rango de ph entre 4 y 7 ya que en estudios previos de nuestro grupo hemos demostrado que es donde localizan >70% proteínas detectables por esta técnica en el suero. En la segunda dimensión, las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida SDS (0%). La visualización de las proteínas se realizó por marcaje fluorescente (Flamingo fluorescent stain, Bio Rad), su digitalización mediante un escaner tipo Typhoon 9400 y las imágenes resultantes se procesaron mediante el programa de análisis PDQuest (BioRad) a fin de identificar perfiles proteicos diferenciales. Este programa asigna a cada punto proteico un valor relativo que corresponde al volumen de cada punto comparado con la suma del volumen de todos los puntos del gel tras la sustracción de la señal de fondo. La normalización de las imágenes se llevó a cabo utilizando el modelo de regresión local (LOESS). El peso molecular de las proteínas se calcula en base a un marcador de peso molecular que se aplica en los geles de 2 DE y los pi se calculan en base al rango lineal de ph de las tiras de IEF. Para la identificación de las proteínas se utilizó un espectrómetro de masas de tipo MALDI TOF (matrix assited laser desorption/ionization time of flight; AutoFlex III Smartbeam MALDI TOF/TOF de Bruker Daltonics) que está compuesto por una fuente de ionización del tipo desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI) y un analizador de masas en el que la separación de iones se lleva a cabo por tiempo de vuelo (TOF). Como resultado se obtuvo un espectro para cada muestra en el que se representa la intensidad de cada ión/péptido detectado (eje y ) en función de su relación masa/carga (m/z; eje x ). La relación de masas de los péptidos obtenidos a partir de la digestión enzimática de una proteína (masa real), lo que se conoce como huella peptídica (mass fingerprint), se contrastó con la masa peptídica teórica obtenida en la digestión virtual en las bases de datos utilizando la herramienta de búsqueda MASCOT en la base de datos Swiss Prot 57.5, lo que permitió la identificación de las proteínas diferenciales (Figura B). Adicionalmente y para evitar las identificaciones ambiguas se utilizó el equipo en modo MS/MS para fragmentar los picos de interés de las proteínas seleccionadas. CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 7
8 A B Figura Procedimiento utilizado en el análisis proteómico del plasma Resumen de los resultados Estudio de expresión génica Se ha realizado a partir de un extracto de células sanguíneas, donde fundamentalmente está representada la función de las células leucocitarias, ya que por ser las únicas nucleadas son las que presentan mayor cantidad de mrna. El análisis high throughput (cribados de alto rendimiento) para determinar el patrón diferencial de expresión de mrna en individuos longevos sanos comparado con los que presentan envejecimiento no saludable se ha basado en 2 grupos de 8 individuos cada uno de ellos. El análisis de expresión de mrna (transcriptoma) de las células sanguíneas pone en evidencia que del total de genes analizados en los microarrays ( genes), el 40,8% se encuentran sobreexpresados en los ancianos saludables respecto a los no saludables, mientras la expresión de un 59.2% se halla disminuida. El aumento en expresión de los genes situados en el TOP 40 (los 40 genes con mayor aumento estadísticamente CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 8
9 significativo en octogenarios sanos) es de,6[,80,3] veces, mientras que la disminución es de,25 [,24,27] veces para los TOP 40 genes con mayor disminución estadísticamente significativa. En la figura 2, en la que se muestra la representación gráfica heat map de los genes con mayor expresión diferencial entre ambos grupos (n=8/grupo), se observa una clara diferenciación entre los genes que aumentan su expresión (en rojo) y los que disminuyen su expresión (en azul) entre ambos grupos, indicando que los individuos octogenarios sanos y aquellos con envejecimiento no saludable tienen perfiles de expresión génica claramente diferenciados Clusters jerárquicos Envejecimiento saludable no saludable disminución expresión genes aumento Figura 2 Asociación jerárquica de genes con expresión diferencial en relación al envejecimiento El análisis in silico realizado en base a 9 genes seleccionados con expresión diferencial muestra los siguientes resultados: () Los procesos biológicos y las funciones moleculares en las que están involucrados los genes con expresión diferencial sugiere que la población octogenaria sana tiene modificada la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune del individuo. De forma que 6 de los genes expresados diferencialmente (GED) (valor de p=3,46e 6 4,30e 2 ) en individuos longevos sanos se relacionan con la respuesta inflamatoria y con enfermedad inmunológica (valor de p=2,9e 5 4,6e 2 ). CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 9
10 (2) Las funciones moleculares y celulares más representadas en el patrón de expresión génica diferencial son: Muerte y supervivencia celular (GED= 2, p=3,46e 6 4,6e 2 ) Interacción y señalización celular (GED= 8, p=2,9e 5 4,30e 2 ) Crecimiento celular y proliferación (GED= 4, p=6,0e 4 4,63e 2 ) Cuando se realiza la interacción de todas las funciones en las que participan los genes de expresión diferencial (GED) entre octogenarios con envejecimiento satisfactorio y no satisfactorio, se observa que las redes de interacción más representativas (con score más elevado) (Figuras 3) son las relacionadas con:. Enfermedad immunológica, enfermedad hematológica ( score 4) 2. Enfermedad immunológica, enfermedad hematológica, muerte y supervivencia celular ( score 39) Red interacción Red interacción 2 Figura 3. Redes de interacción entre los genes expresados diferencialmente (GED) en la población octogenaria con envejecimiento saludable en base a los índices Barthel y MEC y la ausencia de patología cardiovascular. Por otro lado, cuando se analizaron vías moleculares de señalización establecidas (vías canónicas) se encuentra que aquellas en las que participan un mayor número de GED CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 0
11 fueron también las relacionadas con el sistema inmunitario y la formación de células hematopoyéticas (Figura 4). Figura 4: Vías canónicas mas representadas en el pérfil de expresión diferencial de los individuos octogenarios con envejecimiento saludable A partir de los perfiles de expresión génica diferencial identificados y los estudio in silico realizados se seleccionaron un total de 43 genes representativos de las modificaciones moleculares y funcionales observadas entre individuos longevos sanos y aquellos con envejecimiento no saludable para su validación por PCR a tiempo real, incluyéndose además 9 genes en base a resultados publicados previamente en la literatura (Figura 5). TRANSCRIPCION RNA SINTESIS ACIDOS NUCLEICOS RESPUESTA INFLAMATORIA PRODUCCION ENERGIA CELULAR METABOLISMO ACIDOS GRASOS HEMATOPOIESIS CRECIMIENTO CELULAR COMPLEMENTO COAGULACION SINTESIS PROTEICA METABOLISMO GLUCIDICO CICLO CELULAR CANALES INTERCAMBIO IONICO ACTIVIDAD TELOMERASA FACTOR TRANSCRIPCION ESTABILIDAD CROMOSOMAS METABOLISMO/TRANSPORTE CITOSQUELETO SEÑALIZACION CELULAR SISTEMA INMUNE Figura 5. Funciones celulares de los genes validados por PCR a tiempo real para el análisis diferencial entre individuos longevos con/sin envejecimiento saludable CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares
12 El estudio de validación se ha realizado en 36 individuos de 87 años de edad (4 hombres y 22 mujeres) distribuidos en 2 grupos aparejados por sexo de envejecimiento saludable /no saludable. A nivel de la fracción leucocitaria de la sangre, 0 de los 52 genes analizados por PCR a tiempo real han mostrado un aumento /disminución estadísticamente significativo en los individuos octogenarios con envejecimiento saludable. Los genes que aumentan en mayor medida su expresión están relacionados con el sistema inmune, regulación a nivel transcripcional del RNA, regulación citoesqueleto celular y tránsito intracelular de vesículas, mientras que los que disminuyen su expresión están principalmente relacionados con procesos de intercambio iónico o involucrados en procesos de señalización celular (tabla ). Tabla. Genes que modifican significativamente su expresión a nivel de la fracción leucocitaria de la sangre en individuos octogenarios con envejecimiento saludable comparados con los que presenta un envejecimiento no saludable Nombre gen codificado (&) CEVASALU - A CEVASALU - B CEVASALU - 2 CEVASALU - 3 CEVASALU - 4 CEVASALU - 5 CEVASALU - 6 CEVASALU - 7 CEVASALU - 8 CEVASALU - 9 Expresión gen aumento / disminución* x3,0 x2,0 x,5 x,5 x,3 x,2 x,2 x,5 x2,0 x2,0 Función de la proteína Sistema inmune Sistema inmune Sistema inmune Sistema inmune Regulación transcripcional RNA Regulación citoesqueleto celular Tránsito intracelular de vesículas Canales intercambio iónico Canales intercambio iónico Señalización celular (&) Los genes identificados se dan codificados debido a que el trabajo está pendiente de publicación * Indica el valor medio de aumento o disminución de la expresión del gen en octogenarios sanos respecto a octogenarios con envejecimiento no saludable CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 2
13 Cuado realizamos, mediante el programa informático IPA, el análisis de redes de interacción de los genes validados con expresión diferencial obtenemos que las funciones celulares más representadas ( store 2 ) refieren a interacción y señalización célula célula, desarrollo y función del sistema hematológico y tráfico de células del sistema inmunológico. En resumen, los resultados del estudio de expresión génica sugieren de forma consistente la importancia a nivel molecular de procesos relacionados con una buena respuesta del sistema inmune a fin de que se favorezca un envejecimiento saludable en la población. Estudio del perfil proteómico diferencial del plasma El estudio proteómico diferencial del plasma mediante la técnica de electroforesis deiferencial y espectrometría de masas ha permitido identificar 99 puntos proteicos en el plasma de los individuos octogenarios, que corresponden a proteínas agrupadas en 4 grupos funcionales diferentes (Tabla 2). Tabla 2. Grupos funcionales proteínas identificadas en el suero. Grupo funcional Adhesión celular Coagulación/Hemostasis Complemento Metabolismo tejido adiposo Estructurales Factores de transcripción Fase aguda Metabolismo grupos hemo Metabolismo lipídico Metabolismo vitaminas Regulación negativa angiogénesis Regulación presión sanguínea Sistema inmune Transporte/regulación presión osmótica coloidal sanguínea CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 3
14 Al comparar el perfil plasmático de los grupos con envejecimiento saludable (ES) y sin envejecimiento saludable (ENS) (Figura 6) se han detectado cambios en relación a proteínas de 9 grupos funcionales (Figura 7). Figura 6. Imagen representativa proteoma de plasma individuos ES y ENS. El grupo proteico que presenta mayores cambios es el relacionado con la coagulación y la homeostasis, que representa un 39% de todas las proteínas diferenciales identificadas. El segundo grupo funcional con un perfil diferencial más marcado entre ambos grupos es el de proteínas de fase aguda, que representa un 9% de las proteínas diferenciales. Figura 7 Grupos funcionales diferenciales en plasma de sujetos octogenarios comparado con individuos con un envejecimiento no saludable. Resultados obtenidos a partir del análisis proteómico diferencial en geles de poliacrilamida. CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 4
15 Hay que destacar que a nivel de cambios en proteínas relacionadas el sistema hemostático, los individuos con un envejecimiento saludable y que no han tenido ningún evento isquémico presentan niveles más reducidos en 3 proteínas que regulan negativamente el sistema fibrinolítico que los individuos con un envejecimiento no saludable (Figura 8), viéndose en estos últimos individuos muy aumentada una proteína pro coagulante A CEVASALU-prot CEVASALU-prot2 B PROTEINAS anti-fibrinoliticas CEVASALU-prot3 PROTEINAS pro-coagulantes CEVASALU-prot4 Figura 8. Perfil proteómico diferencial de proteínas del sistema hemostático En resumen, los resultados de este estudio, basado en patrones diferenciales de expresión génica y proteómica a nivel de la fracción celular y plasmática de la sangre en individuos octogenarios, sugieren que el envejecimiento saludable se asocia principalmente a un aumento en la expresión de genes de respuesta inmune y una disminución en la expresión de genes de intercambio iónico, mientras que a nivel plasmático se presenta un perfil diferencial que afecta muy especialmente a proteínas del sistema hemostático, de forma que se favorece el perfil pro fibrinolítico del plasma en la población octogenaria sana. El hecho de que se hayan detectado cambios de expresión, tanto génica como proteica, a nivel de muestras sanguíneas abre la posibilidad de que los componentes moleculares CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 5
16 identificados puedan ser de utilidad como biomarcadores de envejecimiento precoz. Estudios en grupos poblacionales más amplios y de diferentes rangos de edad, son imprescindibles para evaluar su relevancia traslacional y su posibilidad de aplicación en la práctica clínica, bien a nivel de biomarcadores o como dianas moleculares a tener en cuenta a fin de potenciar el envejecimiento cronológico en condiciones saludables. Los resultados de este proyecto se enviarán a publicar tan pronto como se descarte el interés de proteger parte de ellos para una posible aplicación traslacional. De hecho, actualmente se está ya preparando un manuscrito que se enviará próximamente para publicación a una revista del área cardiovascular dentro del primer cuartil. Los manuscritos que deriven de este estudio mencionarán específicamente el apoyo económico del Imserso en la realización del estudio. Una vez aceptados para publicarse se hará llegar una copia al Imserso para su diseminación. CEVASALU; IP: T. Padró; Instituto Catalán Ciencias Cardiovasculares 6
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