Figura Soporte de Colágeno Tipo I. Se muestran el diámetro (4,5 cm) del soporte de colágeno obtenido (A) y el espesor (1mm) del mismo.

Transcripción

1 4 Hipótesis El TCAA al momento de ser injertado secreta factores que modulan inflamación, quimiotáxis celular, angiogénesis, síntesis y remodelación de la matriz extracelular, eventos importantes en el cierre de heridas.

2 5 Resultados 5.1 Elaboración del TCAA Siguiendo la metodología estandarizada por el grupo de trabajo en ingeniería de tejidos se elaboraron soportes de colágeno I de 4,5cm de diámetro y un espesor de 1mm de espesor. Figura Soporte de Colágeno Tipo I. Se muestran el diámetro (4,5 cm) del soporte de colágeno obtenido (A) y el espesor (1mm) del mismo. El tejido conectivo artificial autólogo (TCAA) obtenido con fibroblastos de la mucosa oral de los conejos y con los soportes de colágeno tipo I (en total 21 soportes), se fijó y cortó. Los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina y se observaron al microscopio de luz para evaluar la organización histológica del tejido formado (Figura 5.2). Se identificó formación de matriz extracelular eosinófila entre las células, fibras de colágeno del soporte de

3 Capítulo 5 57 colágeno (FSC) y fibras de colágeno sintetizadas por los fibroblastos (FCN), las cuales se ven más delgadas que las fibras del soporte. Los fibroblastos se evidencian con morfología en forma de uso y con núcleos basófilos grandes, indicativo de células funcionales. Figura 5. 2.Tejido conectivo artificial autólogo de 7 días de incubación, teñido con hematoxilina-eosina. Imagen de un corte en baja magnificación (A) y alta magnificación (B). Las siglas corresponden a: Fibroblastos (F), matriz extracelular (MEC), fibras de colágeno originales del soporte (FSC), fibras de colágeno nuevas sintetizadas por los fibroblastos (FCN). Escala de 50µm y 10 µm. Figura 5. 3.Tejido conectivo artificial autólogo de 7 días de incubación. Vista macroscópica 5.2 Evaluación del perfil de factores presentes en el

4 58 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial medio de cultivo del TCAA y cultivos de fibroblastos de mucosa oral de conejo Determinación de la concentración de proteína en medios de cultivo Con el fin de utilizar la misma cantidad de proteína en los análisis de los medios de cultivo, se realizó la cuantificación de proteína total en los sobrenadantes, antes de iniciar la determinación de los factores expresados. Inicialmente se realizó una curva de calibración utilizando albumina sérica bovina (BSA) como patrón en un rango de 0mg a 0.1mg. Las cuantificaciones de proteína fueron llevadas a cabo con el método del ácido bicinconínico. En la Error! No se encuentra el origen de la referencia. 5.4, se muestra en rojo la curva de calibración elaborada con base en los datos y el coeficiente de determinación (R 2 ) de la recta obtenida. Curva de calibración cuantificación de proteína total Absorbancia (nm) y = 16,597x R² = 0,98196 Proteína Total (mg) Figura 5. 4 Curva de calibración de cuantificación de proteína total. Con el método del ácido bicinconínico se elaboró la curva de calibración para la determinación de proteína total en los medios analizados, con albumina sérica bovina (BSA) en un rango de concentración de 0mg a 0.1mg de proteína total, la lectura se realizó a una longitud de onda de 590nm.

5 Capítulo 5 59 Los medios en evaluación provenientes de los cultivos de TCAA y monocapas de fibroblastos, fueron muestreados a las 4 h, 3 y 7 días. En la curva de calibración previamente elaborada se interpolaron los valores de densidad óptica de las muestras, previa sustracción de la absorbancia del medio de cultivo, con el fin de calcular la concentración de proteína total de cada una de ellas. La Error! No se encuentra el origen de la referencia.1, muestra los resultados. Tabla 5. 1 Concentración de proteína de los sobrenadantes de medio de cultivo de TCAA cultivado a las 4horas, 3 y 7 días. SUSTITUTO TIEMPO REPLICA Absorbancia (nm) Proteina Total (mg) Tejido a 1,21 0,073 Conjuntivo 4 horas b 1,30 0,079 artificial c 0,70 0,042 autólogo a 1,58 0,095 (TCAA) 3 días b 1,64 0,099 c 1,41 0,085 Monocapa de fibrobastos a 1,64 0,099 7 días b 1,58 0,095 c 1,64 0,099 a 0,92 0,055 4 horas b 0,97 0,058 c 0,97 0,058 a 0,72 0,043 3 días b 0,70 0,042 c 0,91 0,055 a 0,79 0,047 7 días b 0,97 0,058 c 0,87 0, Detección de factores por medio de microarreglos de anticuerpos Con base en los datos obtenidos en la cuantificación de proteínas, se escogió utilizar para él análisis un volumen de medio con una concentración de 0,039 mg de proteína

6 60 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial total, ya que este valor se encuentra en el rango de detección del microarreglo de anticuerpos utilizado. Los valores de intensidad lumínica medidos fueron expresados en porcentaje; se consideró como 100% el valor luminiscencia obtenido con los controles positivos. La absorbancia de los controles negativos, en todos los casos fue 0; todos los controles estaban incluidos en los arreglos de anticuerpos del kit. Los resultados obtenidos en el ensayo de detección de los factores secretados en los medios de cultivo del TCAA y del cultivo de fibroblastos, se organizaron según la función de estos en los procesos de reparación de heridas, así: Factores de crecimiento, factores angiogénicos y angiostáticos, citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias, factores remodeladores de la matriz y quimoquinas Factores de crecimiento La tabla 5.2, reporta la intensidad observada de los factores de crecimiento, o sus receptores, que fueron secretados por los fibroblastos en los dos tipos de cultivo evaluados (Monocapa de fibroblastos y TCAA). Todos los valores de intensidad obtenidos, excepto los de el VEGF-R3 a los 3 días y el VEGF a los 7 días, fueron significativamente diferentes. En los medios provenientes de los cultivos de TCAA los factores estimuladores de colonia (GM-CSF y G-CSF), no fueron secretados en ninguno de los tiempos evaluados. En estos medios la secreción del receptor 3 del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF-R3), se vio significativamente aumentada al día 7, mientras que en los otros tiempos evaluados fue menor o igual. Adicionalmente, se evidenció que la secreción del VEGF-R2 fue significativamente mayor en todos los tiempos y la secreción de TGF-B1 y de IGF-1 significativamente menor. Los fibroblastos del TCAA en el momento en que este se injerta (7 días), no secretan PDGF-BB y disminuyen significativamente con respecto a los fibroblastos cultivados en monocapa, la secreción de FGF-2 y EGF.

7 Capítulo 5 61 Tabla 5. 2 Porcentaje de Intensidad observado en los factores de crecimiento FACTOR DE CRECIMIENTO TIEMPO DE EVALUACION Monocapa de Fibroblastos Tejido Conjuntivo Artificial Promedio D.E Promedio D.E p-valor 4 horas GM-CSF 3 días días horas G-CSF 3 días días horas VEGF-R3 3 días días horas VEGF-R2 3 días días horas VEGF 3 días días horas TGF-ß1 3 días días horas IGF 1 3 días días horas PDGF-BB FGF-2 3 días días horas días

8 62 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial EGF 7 días horas días días Factores angiogénicos y angiostáticos detectados, que intervienen en los mecanismos de cicatrización de heridas La tabla 5. 3 muestra los valores de intensidad promedio de los factores angiogénicos secretados en los medios evaluados. Se observan diferencias significativas entre el perfil de secreción de los cultivos bidimensionales de fibroblastos y el cultivo de TCAA, excepto en la angiostatina y la angiopoyetina-2 a los 7 días. La endostatina se encontró significativamente aumentada a los 3 y 7 días en los medios de TCAA; también, la angiostatina a las 4 h y 3 días, sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la intensidad de luminiscencia de esta citoquina entre los dos tipos de medios evaluados a los 7 días. Cabe resaltar que no se encontró presencia de angiogenina en ninguno de los tiempos y en ninguno de los medios estudiados. Aunque se detectó trombopoyetina en el medio de los cultivos en monocapa de los fibroblastos, esta proteína nunca se detectó en los medios de los cultivos de TCCA Tabla 5. 3 Porcentaje de intensidad observado de factores angiogénicos FACTOR ANGIOGENICOS TIEMPO DE EVALUACION Monocapa de Fibroblastos Tejido Conjuntivo Artificial Promedio D.E Promedio D.E p- valor Endostatina 4 horas días días Angiostatina 4horas días días Angiopoyetina-2 4 horas días días Angiopoyetina-1 4 horas días días

9 Capítulo 5 63 Trombopoyetina 4 horas días días Angiogenina 4 horas N.C. 3 días N.C. 7 días N.C Citoquinas anti-inflamatorias y pro-inflamatorias detectadas, que intervienen en los mecanismos de cicatrización de heridas. Como se observa en la Tabla 5.4, el perfil de citoquinas anti-inflamatorias y proinflamatorias fue diferente en los dos tipos de cultivo. En las muestras de medios de cultivo de fibroblastos en monocapa se identificaron todas las citoquinas que son reconocidas por los anticuerpos del microarreglo en todos los tiempos evaluados. Tabla Porcentaje de intensidad de citoquinas anti- inflamatorias y pro- inflamatorias. CITOQUINA TIEMPO DE EVALUACION Monocapa de Fibroblastos Tejido Conjuntivo Artificial p- valor Promedio D.E Promedio D.E IL-10 4 horas días días IL-4 4 horas días días IL-8 4 horas días días IL-6 4 horas días días IL-2 4 horas días días IL-1ß 4 horas días días IL-1α 4 horas días días

10 64 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial TNF-α 4 horas días días IFN-Υ 4 horas días días En los medios provenientes de los cultivos de TCCA las interleuquinas 6, 8 y 10 nunca fueron detectadas. Sin embargo, si se encontraron IFN-γ, IL-4 y TNF-α en porcentajes significativamente mayores a los secretados por los fibroblastos en monocapa, a las 4 horas, así como al tercer día fueron halladas TNF-α, ΙL-1α, IL-1β,IL-2 e IL-4; la secreción de esta última, fue significativamente mayor en los medios derivados de TCAA que en los de los cultivos de monocapas de fibroblastos. En el día 7 en los cultivos de TCAA no se encontraron IFNγ, TNF-α, IL-2, IL-6, IL-8 e IL-10. Al comparar la secreción encontrada en estos medios con la de los medios de monocapas de fibroblastos, se encontró disminución significativa de la secreción de IL-1α y aumento significativo de IL-1β, e IL Factores remodeladores de matriz extracelular. En la Tabla 5.5, se incluyeron los datos de intensidad de fluorescencia de los factores remodeladores de la matriz. El arreglo de anticuerpos evaluó la presencia de 4 factores de estos factores: TIMP-1, TIMP-2, MMP-9 y MMP-1. En todos los tiempos, la secreción de TIMP-1 y MMP-9 en los medios provenientes de los cultivos de TCAA fue significativamente menor con respecto a la detectada en los cultivos de fibroblastos en monocapa. Contrariamente, la secreción de MMP-1 siempre fue significativamente mayor mientras que la de TIMP-2 lo fue solo a los 3 y 7 días. Tabla Porcentaje de intensidad observada de factores remodeladores FACTOR REMODELADOR TIMP-2 TIMP-1 TIEMPO DE EVALUACION Monocapa de Fibroblastos Tejido Conjuntivo Artificial p- valor Promedio D.E Promedio D.E 4 horas días días horas días

11 Capítulo 5 65 MMP-9 MMP-1 7 días horas días días horas días días Quimoquinas detectadas, que intervienen en los mecanismos de cicatrización de heridas. Tabla Porcentaje de intensidad de las quimoquinas analizadas. QUIMOQUINA Tie 2 MCP-4 MCP-1 I-TAC UPAR RANTES TIEMPO DE EVALUACION Monocapa de Fibroblastos Tejido Conjuntivo Artificial p- valor Promedio D.E Promedio D.E 4 horas días días horas días días horas días días horas días días horas días días horas días días PECAM-1 4 horas

12 66 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial 3 días días La Tabla 5.6, presenta los datos de intensidad de fluorescencia obtenidos para la quimoquinas. En los medios de cultivo de las monocapas de fibroblastos, todos los anticuerpos anti-quimoquinas del microarreglo fueron reconocidos por sus respectivos antígenos en los tiempos evaluados. En los medios provenientes de los TCAA, MCP-1 no fue detectada en ninguno de los tiempos evaluados. A las cuatro horas se encontraron MCP-4, I-TAC y UPAR significativamente aumentados en comparación con los medios de los fibroblastos cultivados, mientras que los porcentajes de intensidad lumínica de GRO, ENA-78, I-309 y RANTES no mostraron diferencias significativas. También, hubo un incremento significativo en las intensidades de MCP-4, I-TAC, I-309 y UPAR en los medios de TCAA al tercer día. En este mismo día, Tie-2, MCP-3 y PECAM-1 fueron detectados en niveles que no son diferentes de los vistos en los medios provenientes de los fibroblastos. En el día 7, mantuvieron la misma tendencia del día 3; sin embargo, se observó un aumento significativo de los porcentajes de intensidad de UPAR y PECAM-1 con respecto a los cultivos en monocapa. 5.3 Cuantificación de los Factores Ensayo de preconcentración de los anticuerpos anti-factor De acuerdo con la naturaleza química de cada factor, peso molecular y reconstitución, se realizaron ensayos de preconcentración para elegir el ph adecuado del buffer para poder inmovilizar y así obtener una detección óptima. Con base en los datos obtenidos en los sensogramas de los ensayo con el biosensor, se escogieron los ph y las concentraciones que mostraron mayor amplitud en las curvas, correspondientes a una mayor unión de los anticuerpos anti-factor (asociación-disociación), representada en Unidades de Resonancia (UR). Los resultados obtenidos presentados en la Tabla 5.7, muestran el ph del buffer vehículo de la inmovilización y la concentración de trabajo escogida de cada uno de los anticuerpos. Tabla 5. 7 Anticuerpos antifactor utilizados, ph del Buffer y concentración óptima

13 Capítulo 5 67 Anticuerpo ph Buffer de Acetato de Concentración Figura Sodio mab EGF µg/ml 5.4 mab IL µg/ml 5.5 pab Ang µg/ml 5.6 mab TNF-α µg/ml 5.7 mab TGF-β µg/ml 5.8 mab VEGF µg/ml 5.9 En la Figura 5.5, se grafican los datos de unidades de resonancia (UR) obtenidos en función del tiempo durante el ensayo de preconcentración del factor de crecimiento epidermal (EGF). Los resultados expresados en la gráfica, indican que la curva obtenida cuando se utilizó el buffer de acetato de Sodio ph: 4.1 y la concentración de 50 µg/ml del anticuerpo monoclonal anti-egf (mab EGF), fue la que proporcionó mayor respuesta expresada en unidades de resonancia.

14 68 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial Figura Ensayo de preconcentración del mab EGF. Se muestran los valores en Unidades de resonancia encontrados en función del tiempo, empleando soluciones buffer vehículo de inmovilización a diferentes ph y diferentes concentraciones del mab EGF. La Figura 5.6, muestra la gráfica obtenida a partir de los valores UR obtenidos durante el ensayo de pre-concentración llevado a cabo para la interleuquina 4 (IL-4). En la gráfica se observa que la curva obtenida cuando se utilizó el buffer de acetato de Sodio ph: 4.5 y la concentración de 50 µg/ml del anticuerpo monoclonal anti-il4 (mab IL-4), fue la que proporcionó mayor respuesta en unidades de resonancia. Figura Ensayo de preconcentración del mab IL-4. Se muestran los valores en Unidades de resonancia encontrados en función del tiempo, empleando soluciones buffer vehículo de inmovilización a diferentes ph y diferentes concentraciones del mab IL-4.

15 Capítulo 5 69 La Figura 5.7, corresponde a la gráfica correspondiente a los valores UR medidos en función del tiempo durante el ensayo de pre-concentración de la angiopoyetina-2. La gráfica indica que la curva obtenida al utilizar buffer de acetato de Sodio ph: 4.1 y 50 µg/ml del anticuerpo policlonal anti-angiopoyetina-2 (Ang-2), fue la que proporcionó mayor respuesta en unidades de resonancia. Figura Ensayo de preconcentración del pab Ang-2. Se muestran los valores en unidades de resonancia encontrados en función del tiempo, empleando soluciones buffer vehículo de inmovilización a diferentes ph y diferentes concentraciones del anticuerpo policlonal anti-angiopoyetina 2 (pab Ang-2).

16 70 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial La Figura 5.8, corresponde a los ensayos de pre-concentración del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). En la gráfica se puede observar que la curva obtenida cuando se utilizó el buffer de acetato de Sodio ph: 4.1 y la concentración de 50 µg/ml del anticuerpo monoclonal anti-tnf- α (mab anti-tnf-α), fue la que proporcionó mayor respuesta en unidades de resonancia. Figura 5. 8 Ensayos de preconcentración del mab TNF-α. Se muestran los valores en Unidades de resonancia encontrados en función del tiempo, empleando soluciones buffer vehículo de inmovilización a diferentes ph y diferentes concentraciones del mab TNF-α.

17 Capítulo 5 71 La Figura 5.9, corresponde a los ensayos de pre-concentración del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). En la gráfica se puede observar que la curva obtenida cuando se utilizó el buffer de acetato de Sodio ph: 4.1 y la concentración de 50 µg/ml del anticuerpo monoclonal anti-factor de crecimiento transformante beta (mab anti-tgf-ß1), fue la que proporcionó mayor respuesta en unidades de resonancia. Figura Ensayo de preconcentración del mab TGF-ß1. Se muestran los valores en Unidades de resonancia encontrados en función del tiempo, empleando soluciones buffer vehículo de inmovilización a diferentes ph y diferentes concentraciones del mab TGF-ß1

18 72 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial La Figura 5. 10, grafica los resultados de los ensayos de pre-concentración del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). En la gráfica se puede observar que la curva obtenida cuando se utilizó el buffer de acetato de Sodio ph: 4.5 y la concentración de 1 µg/ml del anticuerpo monoclonal anti-vegf (mab anti-vegf), fue la que proporcionó mayor respuesta en unidades de resonancia. Figura Ensayo de preconcentración del mab VEGF. Se muestran los valores en Unidades de resonancia encontrados en función del tiempo, empleando soluciones buffer vehículo de inmovilización a diferentes ph y diferentes concentraciones del mab VEGF.

19 Capítulo Activación Inmovilización de los Anticuerpos anti-factor Los resultados de la activación por vía amino para cada uno de los anticuerpos monoclonales y policlonal, mostraron rangos de Unidades de Resonancia (UR) entre 5000 y La Tabla 5.8, muestra los valores de UR de cada uno de los anticuerpos inmovilizados en las condiciones escogidas en los ensayos de pre-concentración. Tabla 5. 8 Cantidad de anticuerpos evaluados en Unidades de Resonancia Anticuerpo Inmovilización Figura (RU) mab EGF mab IL pab Ang mab TNF-α mab TGF-β mab VEGF

20 74 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial La Figura 5.11, muestra el sensograma de la inmovilización del anticuerpo monoclonal anti-egf humano en la superficie del chip CM5 del biosensor BIAcore mediante la química de acoplamiento amina. En la figura se evidencian: la activación de la superficie con NHS/EDC, la inmovilización del ligando, bloqueo de los sitios activos libres con etanolamina clorhidrato ph 9,5 y la línea base final. La cantidad inmovilizada corresponde a la diferencia en RU entre la línea base final y la inicial, correspondiente a 7500UR en este caso. Figura Ensayo de inmovilización del mab EGF

21 Capítulo 5 75 La Figura 5.12 muestra el sensograma de la inmovilización del anticuerpo monoclonal anti IL-4 humano en la superficie del chip CM5 del biosensor BIAcore mediante la química de acoplamiento amina, es presentado en la Figura En la figura se aprecia la activación de la superficie con NHS/EDC, la inmovilización del ligando, el bloqueo de los sitios activos libres con etanolamina clorhidrato ph 9,5 y la línea base final. La cantidad inmovilizada corresponde a la diferencia en UR entre la línea base final y la inicial, en este caso fue de 536 UR. Figura Ensayo de inmovilización del mab IL-4

22 76 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial La Figura 5.13, presenta el sensograma de la inmovilización del anticuerpo policlonal anti-ang-2 humano en la superficie del chip CM5 del biosensor BIAcore mediante la química de acoplamiento amina. En la gráfica se muestra: la activación de la superficie con NHS/EDC, la inmovilización del ligando y el bloqueo de los sitios activos libres con etanolamina clorhidrato ph 9,5 y la línea base final. La cantidad inmovilizada corresponde a la diferencia en RU entre la línea base final y la inicial, en este caso este valor corresponde a UR. Figura Ensayo de inmovilización de pab Ang-2

23 Capítulo 5 77 La Figura 5.14 muestra el sensograma de la inmovilización del anticuerpo monoclonal anti-tnf- α humano en la superficie del chip CM5 del biosensor BIAcore mediante la química de acoplamiento amina. En la figura se muestra: la activación de la superficie con NHS/EDC, la inmovilización del ligando,y el bloqueo de los sitios activos libres con etanolamina clorhidrato ph 9,5, 4. Línea base final. La cantidad inmovilizada corresponde a la diferencia en RU entre la línea base final y la inicial, para este factor se obtuvieron 7695 UR.. Figura Ensayo de inmovilización del mabtnf- α

24 78 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial La Figura 5.15 reperesenta el sensograma de la inmovilización del anticuerpo monoclonal anti- TGF-ß1 humano en la superficie del chip CM5 del biosensor BIAcore mediante la química de acoplamiento amina. En la figura se muestran:la activación de la superficie con NHS/EDC, la Inmovilización del ligando, y el bloqueo de los sitios activos libres con etanolamina clorhidrato ph 9,5. Línea base final. La cantidad inmovilizada corresponde a la diferencia en RU entre la línea base final y la inicial, en este caso 6565 UR. Figura Ensayo de inmovilización del TGF-ß1

25 Capítulo 5 79 La Figura 5.16 muestra el sensograma de la inmovilización del anticuerpo monoclonal anti-vegf humano en la superficie del chip CM5 del biosensor BIAcore mediante la química de acoplamiento amina. En la figura se evidencia: la activación de la superficie con NHS/EDC, la inmovilización del ligando y el bloqueo de los sitios activos libres con etanolamina clorhidrato ph 9,5. Línea base final. La cantidad inmovilizada corresponde a la diferencia en RU entre la línea base final y la inicial., para este caso 6500 UR. Figura Ensayo de inmovilización del mabvegf