Obtención de la abrina y de la abrina aglutinina

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1 LABORATORIOS BETERÁ 17 Obtención de la abrina y de la abrina aglutinina Félix Ganem Báez, 1 José A. Lagomasino Carrera 2 y Yamilet Álvarez Tejo 3 RESUMEN En las semillas del Abrus precatorius se encuentran al menos 2 isolectinas, una tóxica con baja capacidad aglutinadora y otra, con menor toxicidad, pero alta capacidad eritroaglutinadora denominadas abrina y abrina aglutinina respectivamente. El objetivo de este trabajo consistió en la obtención de identificación de ambas especies moleculares, mediante la combinación de extracción selectiva con purificación por medio de técnicas cromatográficas de intercambio iónico y de afinidad. La movilidad electroforética de las proteínas se determinó sobre phasgel 8-25 %.Los resultados indicaron que más de 46 % de las lectinas presentes en el extracto de Tris pertenecen a la abrina, mientras que en el de HAc, 2 % pertenece a la abrina aglutinina. La movilidad electroforética de la abrina indicó la presencia de 2 compuestos de pesos moleculares cercanos a los 65 KD que se correspondieron con las halotoxina abrina I y abrina II. La abrina aglutinina presentó una banda cercana a los135 KD. Palabras clave: lectinas, abrina, cromatografía, purificación. Las semillas del Abrus precatorius contienen 2 isolectinas una con baja toxicidad y fuerte actividad eritroaglutinadora y otra muy tóxica pero con poca aglutinación. Estas se conocen como abrina y abrina aglutinina. 1 La actividad citotóxica de la abrina se ha venido utilizando en la elaboración de productos terapéuticos contra tumores malignos y actúa además como agente antimetástasis. 1, 2 Los métodos de obtención de estas lectinas plantean el uso combinado de varios tipos de cromatografía, la más usada es la de intercambio iónico, seguida de una columna de afinidad. 4 Otro método consiste en la extracción selectiva de ambas isolectinas y se continúa con las purificaciones cromatográficas señaladas antes. 1, 4. El objetivo del presente trabajo es la obtención y purificación de estas 2 isolectinas mediante una modificación del método de Godal. 1 MÉTODOS Extracción de la abrina Se maceran 20 g de semillas de Abrus precatorius previamente trituradas con 150 ml de Tris-HCl ( 50 mmol ) a ph 7,7 durante 24 h a 4 ºC. Se centrifuga a rpm por 20 min a 4 ºC. El sobrenadante se dializa 24 h con agitación suave, se elimina el precipitado por centrifugación, se toman 2 alícuotas de 100 µl para la determinación de proteínas por el método Azul de Coomasie y para el test de aglutinación, respectivamente. Extracción de la abrina aglutinina A 20 g de semillas se les realiza una secuencia de pasos semejante a la anterior extracción utilizando una solución de HAc 5 %. El sobrenadante obtenido después de la centrifugación se dializa 2 veces contra agua destilada y contra Tris- HCl ( 10 mmol ) a ph 7,7. El dializado se centrifuga bajo las condiciones expuestas anteriormente. Se toman dos alícuotas de 100 µl para determinar la concentración de proteínas y realizar el test de aglutinación. Purificación de los extractos de abrina La muestra se pasa a través de una columna (XK 50/30 ) de DEAE- Sepharosa preparada según el fabricante, la matriz se lava y equilibra con buffer Tris-HCL (10 µm). La muestra se eluye 1 Doctor en Ciencias Técnicas.Licenciado en Química Investigador Auxiliar. 2 Maestro en Ciencias. Licenciado en Química. 3 Licenciada en Biología.

2 18 con un gradiente salino a saltos con soluciones de NaCL de diferentes concentraciones ( 0,1, 0,2, 0,3 y 0,4 M ). Se emplea un flujo de 5 ml/ min. La elución se monitorea a 280 nm en un BIOPILOT de Pharmacia, a las fracciones obtenidas se les determinan concentración de proteínas y aglutinación. Purificación de los extractos de abrina aglutina Se utilizan las mismas condiciones que la purificación anterior, pero se eluye con un gradiente salino continuo a partir de una solución de NaCL 2 mol. La elución de las proteínas se registró a 280 nm, se determinó la concentración de proteínas y la aglutinación a las fracciones obtenidas. Purificación mediante columna de afinidad Las fracciones con aglutinación positiva se purifican por cromatografia de afinidad en columna XK-16 empaquetada con Sepharosa 4B equilibrada con PBS a ph 7,3, la muestra se introduce con flujo de 1 ml/min, se eluye con galactosa (0,1 mol) en PBS y se monitorea a 280 nm en un equipo FPLC. La fracción proteica eluida con galactosa se dializa contra el buffer de estabilización. La actividad aglutinadora de la abrina se expresa en µg/ml y se determina mediante una dilución seriada de una solución de abrina de 1 mg/ml. Esta actividad es la menor concentración requerida para aglutinar una suspensión a 2 % de eritrocitos humanos con una hora de incubación a 25 ºC. 5 La evaluación electroforética se realiza en un equipo Phast-System empleando Phastgeles con gradientes 8-25 % de poliacrilamida y patrones de catalasa (60 KD), albúmina (67 KD) y ß-galactosidasa (130 KD). RESULTADOS El comportamiento cromatográfico de los diferentes extractos sobre las columnas de DEAE- Sepharosa con diferentes sistemas de elución se muestran en las figuras 1 y 2. La presencia de 4 picos caracterizan a estos perfiles, en el primero se encuentran las proteínas no retenidas denominadas contaminantes, mientras que los picos II, III y IV corresponden a las eluidas por el gradiente salino, donde se encuentran tanto la abrina como la abrina aglutinina como lo muestra el test de aglutinación. Las fracciones purificadas por la columna de Sepharosa-4B muestran en la figura 3 un perfil cromatográfico típico de una cromatografía de afinidad; un primer pico compuesto por las proteínas no retenidas y un segundo formado por las proteínas que eluyen con la solución de galactosa. En la tabla 1 se muestra el comportamiento cuantitativo de el proceso de purificación, el rendimiento promedio de tres extracciones realizadas alcanza 46 % para la abrina y 32 % para la aglutinina. La electroforesis de la abrina (fig. 4) indica la presencia de 2 bandas, ambas ligeramente por debajo de los 60 KD y una a la misma altura de los 67 KD. La abrina aglutinina presenta una sola banda a igual altura que la banda de 130 KD. Tabla 1. Comportamiento del proceso de purificación de las isolectinas Pasos del proceso Volumen total (ml) Concentración de proteínas (mg/ml) Cantidad de proteínas (mg) Rendimiento % Abrina Abrina/Aglutina Abrina Abrina/Aglutina Abrina Abrina/Aglu-tina Abrina Abrina/Aglutina. Extracto crudo Extracto dializado Purificación/ intercambio iónico ,77 0,2 446,6 167 Purificación/ afinidad ,5 0,

3 Fig.1. Perfil cromatográfico de la cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharosa del extracto de abrina. 19

4 20 Fig. 2. Perfil cromatográfico de la cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharosa del extracto de abrina aglutinina.

5 Fig. 3. Perfil cromatográfico de la cromatografía de afinidad en Sepharosa 4B de la fracción del pico II obtenida en la purificación del extracto de abrina. 21

6 22 1: B-Galactosidasa (130 KD). 2: Extracto de abrina aglutinina. 3: Extracto de abrina aglutinina. 1: Catalasa (60 KD). 2: Extracto de abrina. 3: Albúmina (67 KD). Fig. 4. Movilidad electroforética de la abrina y de la abrina aglutinina.

7 DISCUSIÓN La combinación adecuada de diferentes sistemas cromatográficos, así como de extracción permiten resolver satisfactoriamente complejas mezclas de proteínas como es el caso que nos ocupa con la separación de la abrina y de la abrina aglutinina. El empleo de gradiente salino a salto en la cromatografía de intercambio iónico sobre DEAE-Sepharosa, permitió obtener una mejor separación de los componentes de los extractos que el gradiente continuo, como se muestra en los cromatogramas de las figuras 1 y 2. La utilización adecuada de la cromatografía de afinidad permite obtener la separación de ambas abrina con alta pureza, lo que se pone de manifiesto al determinar el comportamiento electroforético de ambas especies moleculares y la ausencia de otras bandas acompañantes. El contenido de abrina es más de 3 veces el de la aglutinina lo cual es importante por su mayor interés farmacológico. SUMMARY In the seeds of the Abrus precatorius they are 2 isolectins at least, a toxic one with low agglutinative and other capacity, with smaller toxicity, but high capacity eritroaglutinative denominated abrin and abrin aglutinin respectively. The objective of this work consisted on the obtaining of identification of both 23 molecular species, by means of the combination of selective extraction with purification by means of technical chromatography of ionic exchange and of likeness. The mobility electroforetic of the proteins was determined on phasgel 8-25%.This indicated that more than 46 % of the present lectins in the extract of Tris belong to the abrin, while in that of HAc, 2% belongs to the abrin aglutinin. The mobility electroforetic of the abrin indicated the presence of 2 made up of near molecular weight to the 65 KD that belonged together with the halotoxin abrin I and abrin II. The abrin aglutinin presented a near band to 135 KD. Key words: lectins, abrin, chromatography, purification. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Godal A. Abrin variants and inmunotoxins Patente. WO/ Tung T. Orally administrable anti-metastatic lectin composition and method Patente No.5,053, Sharon N, Lis H. Lectins Israel.Chapman and Hall Press Olnes S, Phil A. Molecular action of toxin and viruses. Elsevier, Amsterdan 1982: Sigma Catalogo. Abrus precatorius aglutinin. 1995:1848. Recibido: 2 de mayo del Aprobado: 6 de junio del Lic. Félix Gavem Báez. Edificio E-18 Apto 21 Zona 10, Alamar, Habana del Este, Ciudad de La Habana.