11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 6 : C12N 9/64

Transcripción

1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 6 : C12N 9/64 C12N 11/08 A61K 38/49 C12P 21/08 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Complejo que contiene el factor de coagulación IX. k Prioridad: AT 163/91 k 73 Titular/es: Immuno Aktiengesellschaft Industriestrasse 67 A-1221 Wien, AT k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Linnau, Yendra y Sazgary, Maria k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ungría Goiburu, Bernardo ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Complejo que contiene el factor de coagulación IX. La invención se refiere a un complejo que contiene el factor de coagulación así comoaun procedimiento para la fabricación de un preparado farmacéutico que contiene factor IX. El factor de coagulación IX se emplea para el tratamiento de substitución de pacientes, que padecen hemofilia B. Esta enfermedad de la sangre resulta de una falta de factor IX. Para el tratamiento de substitución, se emplean concentrados de factor que contienen la mayoría de las veces adicionalmente también los factores de coagulación II, VII, IX y X (complejo protrombina). Los factores de coagulación contenidos en concentrados de este tipo pertenecen a los factores dependientes de vitamina K y están asociados entre sí envirtuddesuestructurasimilar. Pero para sangres, que padecen hemofilia B, cada adición de otros factores de coagulación distintos al factor IX significa una carga. Por lo tanto, se pretende emplear concentrados de factor IX altamente enriquecidos alternativamente a los preparados combinados en la terapia. El material de partida para la fabricación de preparados de factor IX es plasma humano, que contiene el factor IX pero solamente en cantidades reducidas (4 µg/ ml). Por lo tanto, para la obtención del factor IX no sólo deben procesarse grandes cantidades de plasma, sino que deben separarse también en la mayor medida posible las proteínas concomitantes perturbadoras. Hay que añadir de forma agravante que estas proteínas concomitantes presentan propiedades físico-químicas similares. Otra dificultad consiste en que el producto final debe liberarse de agentes infecciosos en el transcurso de la elaboración, puesto que el material de partida puede contener por ejemplo virusdehepatitisohiv.peroenestecasocada etapa individual del procedimiento y cada inactivación del virus deben realizarse de manera que se mantenga en la mayor medida posible la actividad biológica del factor IX. Desde hace años se intenta encontrar un procedimiento que cumpla óptimamente los requisitos mencionados. El enriquecimiento del factor IX con disminución simultánea de los otros factores mediante procedimientos cromatográficos se consigue, naturalmente, tanto mejor cuanto más específica es la interacción del factor de coagulación IX con la fase estacionaria. Para la fabricación de una fracción que contiene factor IX a partir de mezclas acuosas que contienen los factores II, VII, IX y X se conocen ya procedimientos cromatográficos de intercambio de iones y de afinidad. Según el procedimiento descrito en el documento DE-C se obtiene una fracción que contiene factor siendo adsorbido el factor IX en primer lugar en un adsorbente que llega un grupo α-hidroxiamino. La elución del factor IX adsorbido se realiza mediante elevación de la concentración de amina o de sal, lo que alude a fuerzas de unión iónicas entre el factor IX y el adsorbente. A continuación de esta primera fase de enriquecimiento se conecta una purificación por medio de cromatografía en una matriz que lleva hidrato de carbono sulfatado. Los procedimientos cromatográficos de afinidad se caracterizan por una alta especificidad. El factor IX se adsorbe en un material de vehículo através de anticuerpos u otros grupos con alta afinidad al factor por ejemplo heparina, se lava y se eluye. Por ejemplo, según el procedimiento del documento EP-A se adsorbe factor IX en heparina inmovilizada. La elución del factor IX se realiza mediante la elevación de la concentración de sal en el tampón. Lo mismoes aplicable para anticuerpos contra factor IX como vehículo de afinidad. En el documento EP-A se adsorbe factor IX en un anticuerpo inmovilizado y se eluye por medio de un gradiente de sal. Un problema consiste en que en las condiciones de elución aplicadas no solo se disocia el factor sino también heparina o bien anticuerpos, que están presentes a continuación como impurezas en el producto final. Además, se sabe que un concentrado de factor de coagulación, que contiene los factores II, VII, IX y X, se puede liberar por medio de cromatografía en una matriz hidrófoba de antígenos de virus, siendo ligados los antígenos mencionados hidrófobamente a la matriz, mientras que los factores de coagulación pasan la matriz manteniendo su actividad biológica (J. Vir. Meth., 3, (1981)). En Folia Haematol., Leipzig 7 (1979); I, páginas se describe la separación de factores de coagulación sanguínea humana de fibrinógenos y factor VIII mediante cromatografía con butilsefarosa. La invención tiene el cometido de preparar un procedimiento cromatográfico, que no presente los inconvenientes mencionados y posibilite un enriquecimiento potente del factor IX a partir de una mezcla acuosa, que contenga adicionalmente otras proteínas, especialmente plasmacimógeno o proteínas dependientes de la vitamina-k. Según la invención, se pone a disposición un complejo del factor de coagulación IX que consta de un vehículo a base de un polímero con grupos hidrófobos, en el que está ligado factor IX de al menos -con respecto a la actividad en plasma- (288 x 76 %) : (3669 x %) veces de actividad frente a plasmacimógenos o proteínas dependientes de vitamina-k. El factor IX puede estar presente ligado selectivamente en el complejo según la invención también a partir de una mezcla acuosa que contiene, además del factor adicionalmente al menos una proteína dependiente de vitamina-k, como proteína C, proteína S o los factores II, VII y X, o bien a partir de una mezcla acuosa que contiene el complejo protrombina. La invención se basa en el reconocimiento de que se absorbe factor de coagulación IX en una matriz que presenta cadenas laterales hidrófobas a partir de una solución acuosa, que presenta alta conductividad, de forma selectiva, es decir, en presencia de un plasmacimógeno o de una proteína dependiente de vitamina K. Esto es sorprendente porque las proteínas mencionadas poseen propiedades físico-químicas similares. Esta

3 3 ES T3 4 capacidad de adsorción selectiva del factor IX se puede utilizar para el enriquecimiento del factor IX. Una forma de realización preferida del complejo según la invención se caracteriza porque el factor IX está contenido en al menos cinco veces de actividad frente a otra proteína dependiente de vitamina K. El complejo según la invención se somete preferentemente a un tratamiento para la inactivación de agentes infecciosos eventualmente existentes. El complejo según la invención se puede fabricar, poniendo en contacto una mezcla acuosa, que contiene además del factor IX adicionalmente al menos un plasmacimógeno y una conductividad de al menos ms, preferentemente entre y 1 ms, con un vehículo a base de un polímero con grupos hidrófobos, para complejar el factor después de lo cual se lava dado el caso el complejo formado y dado el caso se somete a una inactivación de agentes infecciones eventualmente presentes. Según la invención, de esta manera el factor IX se enriquece a través de la técnica de la cromatografía hidrófoba. Ventajosamente, la formación del complejo se realiza en presencia de un detergente. La invención se refiere también a un procedimiento para la fabricación de un preparado farmacéutico que contiene el factor de coagulación que se caracteriza porque el factor IX se eluye a partir del complejo según la invención, después de lo cual eluato que contiene factor IX se procesa para obtener una preparación farmacéutica. La elución se realiza -como es habitual para la cromatografía hidrófoba, a conductividades más bajas que la adsorción. Más convenientemente, la elución se realiza a una conductividad que como máximo % más baja. Una forma de realización preferida del procedimiento según la invención consiste en que - se somete plasma o una fracción de plasma que contiene factor IX a una cromatografía de intercambio de aniones, donde se liga factor - el factor IX eluido se somete a una cromatografía de intercambio de aniones en presencia de un detergente, donde se liga factor - el eluato que contiene factor IX se somete a una inactivación de agentes infecciosos eventualmente existentes, y - se separa factor IX por medio de cromatografía hidrófoba y se procesa para obtener un preparado farmacéutico. El complejo según la invención se puede utilizar adicionalmente para la obtención de anticuerpos monoclonales o policlonales, que están dirigidos contra el factor IX. Con los ejemplos siguientes se explica en detalle adicionalmente la invención Ejemplo 1: A partir de litros de plasma humano se obtiene el complejo protrombina (los factores de coagulación de la sangre II, VII, IX y X) según el método de Brummelhuis (Methods of Plasma Protein Fractionation, ed. JM Curling, página 117, Acad. Press. 1980) mediante adsorción en DEAE-Sephadex. 0 ml de complejo de protrombina (3669 I. E. factor II, 288 I. E. factor IX y 2734 I. E. factor X) se diafiltran, para conseguir la composición del tampón A (NaCl 00 mm, citrato de sodio 1 mm, ph: 7). Una columna con ml de un polímero de vinilo hidrófilo con grupos butilo (Fractogel TSK- Butyl (MERCK, Darmstadt)) se equilibran con 0 ml de tampón A y el complejo de protrombina se aplica con una velocidad de flujo de 3 ml/h. Después de lavar el gel cargado con ml de tampón A, se eluye la fracción que contiene factor IX por medio de 180 ml de tampón B (NaCl 0 mm). El rendimiento para el factor IX estaba en 76% de la actividad de partida. La actividad específica del factor IX era 19,7 I.E. factor IX/mg de proteína. Los factores II y X pudieron verificarse en menos del % de la actividad de partida. Ejemplo 2 0 ml de complejo de protrombina se cromatografían de forma similar al ejemplo 1. Como material de la columna se emplean, sin embargo, 4 ml de un polímero de metacrilato con grupos fenilo (Toyopearl Phenyl M (TOSO HAAS, Stuttgart)), que fue equilibrado con sulfato amónico 1,4 M. La elución del factor IX se realiza con sulfato amónico 0,2 M. El rendimiento para el factor IX estaba en 48% de la actividad de partida y la actividad específica era 27,2 I.E. factor IX/mg de proteína. Ejemplo 3 ml de complejo de protrombina se prepurificaron por medio de sulfato de dextrano (Miletich y col., Analytical Biochemistry, 4 (1980)). Se aplicaron ml de eluato (912 I.E. factor 1 I.E. factor X) de forma similar al ejemplo 1 sobre una columna con ml de un polímero de agarosa con grupos octilo (Octyl-Sepharose- CL-4B (PHARMACIA, Suecia). La columna se equilibró previamente con 80 ml de tampón A. Después de lavar el gel cargado con 1 ml de tampón A se eluye la fracción que contiene factor IX con 80 ml de una solución NaCl de mmol. El rendimiento de factor IX estaba en 4% de la actividad de partida. La actividad específica era 186 I.E. factor IX/mg de proteína. El factor X solamente estaba presente ahora en trazas. Ejemplo 4 0 ml de complejo de protrombina se separaron de forma similar al ejemplo 1 por medio de cromatografía hidrófoba. Inmediatamente antes de la aplicación sobre 3 ml de un polímero de vinilo hidrófobo con grupos butilo (Fractogel TSK- Butyl) se trató el complejo de protrombina adicionalmente también con 2% de un polioxietilen-- sorbitan-monooletato Tween 80 y 0,01% de tri-(nbutil)fosfato según el procedimiento descrito en el documento US-A El rendimiento de factor IX estaba en 83% de la actividad de partida y la actividad específica 3

4 ES T3 6 era 24,1 I.E. factor IX/mg de proteína. Ejemplo Para inactivar eventuales agentes patógenos, se calientan 2 g del complejo de protrombina liofilizado según el procedimiento descrito en el documento EP-A durante horas a C con elevación de la presión parcial del vapor de agua. A continuación se realiza la cromatografía hidrófoba en ml de un polímero de agarosa con grupos octilo (Octyl-Sepharose-CL-4B). El rendimiento de factor IX estaba en 63% de la actividad de partida. La actividad específica era 32 I.E. factor IX/mg de proteína

5 7 ES T3 8 REIVINDICACIONES 1. Complejo de factor de coagulación IX que consta de un vehículo a base de un polímero con grupos hidrófobos, en el que está ligado factor IX de al menos - con respecto a la actividad en plasma- (288 x 76%) : (3669 x %) veces de actividad frente a plasmacimógenos o proteínas dependientes de vitamina-k. 2. Complejo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína dependiente de vitamina K se selecciona del grupo proteína C, proteína S, así como factor II, VII y X. 3. Complejo de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el factor IX está ligado a partir de una mezcla acuosa, que contiene el complejo de protrombina. 4. Complejo de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el factor IX está contenido en al menos cinco veces de actividad frente a otra proteína dependiente de vitamina K.. Complejo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, tratado para la inactivación de agentes infecciosos eventualmente presentes. 6. Procedimiento para la fabricación de un complejoqueconstadeunvehículo a base de un polímero con grupos hidrófobos, en el que está ligado factor caracterizado porque se pone en contacto una mezcla acuosa, que contiene además del factor IX adicionalmente al menos un plasmacimógeno y una conductividad de al menos ms, preferentemente entre y 1 ms, con un vehículo a base de un polímero con grupos hidrófobos, para complejar el factor después de lo cual se lava dado el caso el complejo formado y dado el caso se somete a una inactivación de agentes infecciosos eventualmente presentes. 7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la formación del complejo se realiza en presencia de un detergente. 8. Procedimiento para la fabricación de un preparado farmacéutico que contiene el factor de coagulación caracterizado porque el factor IX se eluye a partir de un complejo según una delasreivindicaciones1aofabricadosegún la reivindicación 6, después de lo cual el eluato que contiene factor IX se procesa para obtener una preparación farmacéutica. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la elución se realiza a una conductividad que está comomáximo % por debajo de aquélla que se utilizó parala formación del complejo del factor IX según la reivindicación 6.. Procedimiento para la fabricación de un preparado farmacéutico, que contiene el factor de coagulación caracterizado por la combinación de las medidas de que - se somete plasma o una fracción de plasma que contiene factor IX a una cromatografía de intercambio de aniones, donde se liga factor - el factor IX eluido se somete a una cromatografía de intercambio de aniones en presencia de un detergente, donde se liga factor - el eluato que contiene factor IX se somete a una inactivación de agentes infecciosos eventualmente existentes, - el eluato que contiene factor IX se ajusta a una conductividad de al menos ms, preferentemente entre y 1 ms y se pone en contacto con un vehículoabasedeun polímero con grupos hidrófobos, después de lo cual se forma un complejo que consta del vehículo y factor - el complejo se lava dado el caso y se somete dado el caso a otra inactivación de agentes infecciosos eventualmente existente, y - se eluye factor IX del complejo y se procesa para obtener un preparado farmacéutico. 11. Utilización de un complejo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a para la obtención de anticuerpos monoclonales o policlonales, que están dirigidos contra el factor IX. 6 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva.