CITOMETRÍA DE FLUJO PARA HEMATÓLOGOS MAYO 2014

Transcripción

1 CITOMETRÍA DE FLUJO PARA HEMATÓLOGOS MAYO 2014 Patricia Rodríguez Domínguez Coordinadora de las Unidades de Citometría Banco Municipal de Sangre Laboratorio Clínico Blau

2 SOCIEDAD VENEZOLANA DE HEMATOLOGÍA EDUCACIÓN MÉDICA CONTÍNUA DECLARACIÓN DE POTENCIAL CONFLICTO DE INTERESES Conferencia: Diagnóstico de HPN por CF Conferencista: Patricia Rodríguez Domínguez. ITEMS CASA COMERCIAL Acciones Sueldo / Honorarios profesionales Consultorías o asesorías Fondos para investigación Becas Testimonios Comité de Ética Invitación a eventos nacionales /internacionales NO NO NO NO NO NO NO ALEXION PHARMACEUTICALS Con el objeto de asegurar un adecuado balance, independencia, objetividad y rigor científico en todas las actividades de educación continua de la SVH, los conferencistas deberán declarar a la audiencia si han sido beneficiarios de recursos financieros de empresas fabricantes o proveedoras de medicamentos, reactivos o material relacionado con su conferencia durante los últimos 12 meses. La intención de esta declaración es permitir a la audiencia determinar bajo su propio criterio si la información presentada pudiera estar influenciada por las relaciones o compromisos del expositor.

3 Hemoglobinuria Paroxística Nocturna Enfermedad clonal adquirida no maligna y crónica que afecta a la CPH Mutación somática gen que codifica sub-unidad A de la enzima fosfatidil inositol n-acetil glucosaminil transferasa (PIG-A) en cromosoma X Deficiencia de glicosil-fosfatidil-inositol (GPI), glicolípido que ancla varias proteínas a la membrana celular Adaptado de C. Saltiel 2012

4 HPN CD59: Inhibidor de la lisis reactiva de la membrana promovida por la activación del complemento CD55: Factor acelerador del decaimiento del complemento HEMÓLISIS INTRAVASCULAR Adaptado de C. Saltiel 2012

5 GI-HPN: Formas clínicas del HPN CATEGORÍA HEMÓLISIS MO Clon HPN HPN clásica ++++ LDH Hiperplasia eritroide Morfología N Grande Clon >50% Asociada a falla medular +/++ LDH Displasia Hipoplasia Clon < 10% HPN subclínica (-) Displasia Hipoplasia Clon <0,1%

6 CLONES HPN Tipo I: Expresión Normal Tipo II: Expresión Parcialmente Deficiente Tipo III: Expresión Totalmente Deficiente

7 INVESTIGACIÓN POR CITOMETRÍA DE FLUJO COMIENZOS 1985, técnica complementaria. Históricamente se inició con las proteínas involucradas en la patogenia CD55 y CD GII-HPN prueba más sensible e informativa disponible para el Dx de HPN (Parker et al, Blood 2005)

8 HPN: CITOMETRÍA DE FLUJO Detección de proteínas asociadas a GPI en varias líneas celulares (estimación del tipo y tamaño del clon patológico, clon HPN) CRITERIO DIAGNÓSTICO: demostración de dos proteínas deficientes asociadas a GPI en dos poblaciones celulares diferentes. SE DEBEN INVESTIGAR POR LO MENOS DOS PROTEÍNAS POR LÍNEA CELULAR.

9 CD55 CD59 CD16 CD48 CD66c CD109 CD55 CD58 CD59 PrPC AChE JMH Ag Dombroch CD55 CD58 CD59 CD109 PrPC GP500 Gova/b LAPNB1 HG Ag CD58* CD14 CD24 CD66b CD87 CD157 PrPC p50-80 GPI-80 ADP-RT NA1/NA2 GR Plaquetas PMN PROTEINAS ASOCIADAS A GPI Stem Cell CD59, CD90, CD109 CD14 CD55 CD58* CD59 CD48 CD52 CD87 CD109 CD157 Group 8 PrPC GPI-80 CD16 LB Monocitos LT CD24 CD58 CD48 CD73 L NK CD55 CD59 CD52 CD108 ADP-RT CD90 CD55 CD59 PrPC CD108 CD16* CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 PrPc CD16 CD58* CD48 CD87 PrPc CD73 CD109 (Adaptación de Lucio Luzzatto)

10 FLAER: del inglés fluorescinated inactive aerolysin variant GPI

11 GRUPO CONSENSO Michael J Borowitz, MD, PhD Johns Hopkins Stephen J Richards, PhD NHS, Leeds UK Fiona E Craig, MD University of Pittsburgh Wendell F Rosse, MD Duke University Joseph A DiGiuseppe, MD, PhD Hartford Hospital Robert D Sutherland, PhD Toronto General Hospital Andrea Illingworth, MS Dahl-Chase Diagnostic Services Carl T Wittwer, MD, PhD University of Utah

12 CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA TIPO DE MUESTRA : SANGRE PERIFÉRICA, NO MÉDULA ÓSEA ANTICOAGULANTE RECOMENDADO: EDTA, HEPARINA O ACD VOLUMEN: 1-3 ML ESTABILIDAD: MENOR DE 48 PARA LEUCOCITOS. ALMACENAMIENTO: A TA, (4 DESPUÉS DE 24h)

13 ORIENTACIÓN CLÍNICA: Tipo de Ensayos CATEGORÍA HEMÓLISIS MO Clon HPN HPN clásica ++++ LDH Hiperplasia eritroide Morfología N Grande Clon >50% RUTINA Asociada a falla medular +/++ LDH Displasia Hipoplasia Clon < 10% HPN subclínica (-) Displasia Hipoplasia Clon <0,1% DE ALTA SENSIBILIDAD

14 ESTRATEGIAS PARA LA PRUEBA DE HPN Tipo de análisis N de células Células Blanco Estrategia Reactivos Informativos Alta sensibilidad (0.01%) Eritrocitos Glicoforina A+ Dispersión CD59+/- CD55 Rutina (1%) Granulocitos CD15/SSC FLAER, CD24, CD66b, CD16*, 2 REACTIVOS ESCENCIALES No se recomienda usar CD55/CD59 Monocitos Uso limitado Eritrocitos Log SSC/FSC Glicoforina A opcional Granulocitos CD45/SSC CD45/CD15 CD59+/- CD55 FLAER, CD24, CD66b, CD16*, 2 REACTIVOS ESCENCIALES No se recomienda usar CD55/CD59 Monocitos CD45/SSC CD45/CD33 SSC/64 FLAER,CD14 CD48,CD55, CD157

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16 ON TIPO DE INFORME RESULTADOS POBLACIÓN CELULAR DEFICIENCIA RESULTADO ( % Y TIPO DE CLON) ERITROCITOS EN CD59 0.2% TIPO II Y 11.1% TIPO III GRANULOCITOS EN FLAER/CD24 0.1% TIPO II Y 51.8% TIPO III MONOCITOS EN FLAER/CD14 1% TIPO II Y 40.6% TIPO III tipo I Normal tipo I Normal tipo I Normal CONCLUSIÓN EL ESTUDIO DETECTÓ CLONES TIPO HPN EN LAS TRES LÍNEAS CELULARES ESTUDIADAS DISTRIBUIDAS DE LA SIGUIENTE MANERA, 11.3% EN ERITROCITOS, 51.9% EN GRANULOCITOS Y 41.6% EN MONOCITOS. ESTOS HALLAZGOS INMUNOFENOTÍPICOS SON COMPATIBLES CON HPN. CORRELACIONAR CON DATOS CLÍNICOS Y DE LABORATORIO

17 CONCLUSIONES, Octubre 2013 Seguir fielmente todas las recomendaciones técnicas del grupo de la Sociedad Internacional de Citometría en las publicaciones * PROTEÍNAS ASOCIADAS A GPI INVESTIGADAS ERITROCITOS CD59 CD235A MONOCITOS FLAER, Y CD14 CD64 Y CD45 GRANULOCITOS FLAER Y CD24 CD15 Y CD45 FLAER* MARCADORES DE SELECCIÓN DE POBLACIÓN INSUSTITUIBLE; POR SER LA TÉCNICA MÁS ESPECÍFICA Y SENSIBLE EN LA DETECCIÓN DE CLONES HPN. *

18 CONCLUSIONES LA CITOMETRÍA DE FLUJO ES LA TÉCNICA DE ELECCIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE HPN YA QUE PERMITE: Identificar, clasificar y estimación porcentual del tamaño de los clones con déficit,en proteínas asociadas a GPI con niveles de sensibilidad de hasta 0.01%. Dicha estimación se ha asociado como factor predictivo de la hemólisis y/ó trombosis. Conocer la historia natural y la biología de la enfermedad Evaluar el tratamiento LIMITACIONES DE LA TÉCNICA : Al estudio de monocitos cuando se encuentran muy disminuidos Ensayo de alta sensibilidad en las citopenias severas Hipogranularidad y displasia en los neutrófilos

19 FLAER FLAER

20 Patricia Rodríguez Domínguez