Mecanismo de acción de antimicrobianos sobre bacterias

Transcripción

1 Microbiología General Bioquímica LA 2018 Mecanismo de acción de antimicrobianos sobre bacterias Bibliografía Brock. Biología de los Microorganismos. Madigan, Martinko, Dunlap, Clark ª edición. Ed. Pearson. Cap. 27 Brock. Biology of Microorganisms. Madigan, Martinko, Stahl, Clark ª edición. Cap. 26 Antibiotics. Actions, origins, resistance. Christopher Walsh ASM Press.

2 CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO Métodos químicos Antimicrobiano: compuesto químico, natural o sintético, que mata o inhibe el crecimiento de los microorganismos. Bactericidas: producen la muerte de los agentes infecciosos Bacteriostáticos: inhiben el crecimiento bacteriano aunque el microorganismo permanece viable

3 CONTROL QUÍMICO DEL CRECIMIENTO BACTERIANO Agentes antimicrobianos para uso externo Productos usados para el control de microorganismos en aplicaciones comerciales e industriales. Ejemplos: alimentos, torres de refrigeración de aire acondicionado, productos textiles y papelero, depósitos de combustible Productos diseñados para prevenir el crecimiento de patógenos para los seres humanos en ambientes inanimados y en superficies corporales externas. Se dividen en esterilizantes, desinfectantes y antisépticos Agentes antimicrobianos utilizados in vivo Utilizados en el interior del cuerpo humano para el control de enfermedades infecciosas. Pueden ser sintéticos o naturales (antibióticos)

4 ANTIMICROBIANO Sustancia capaz de actuar sobre los microorganismos, inhibiendo su crecimiento o destruyéndolos Quimioterapéutico Sustancia producida de manera sintética que posee la propiedad de inhibir el crecimiento o destruir microorganismos Antibiótico Sustancia producida por el metabolismo de organismos vivos, principalmente hongos y bacterias, que posee la propiedad de inhibir el crecimiento o destruir microorganismos

5 Antecedentes Históricos Treponema pallidum Paul Ehrlich (1908) Toxicidad selectiva. Creó el primer compuesto químico sintético (Salvarsan) que podía curar una infección, la sífilis Estructura química del Salvarsan La bala mágica

6 Antecedentes Históricos Sulfamidas Descubiertas por Gerhard Domagk (1932) mientras buscaba colorantes para teñir Staphylococcus aureus. Un colorante rojo (Prontosil Rubrum) protegía a ratones y conejos contra dosis letales de estáfilos y estreptococos hemolíticos.

7 Antecedentes Históricos A la sustancia se le dio el nombre de Penicilina, porque el hongo contaminante fue identificado como Penicillium notatum. Efectiva contra las peores enfermedades infecciosas del momento, como la tuberculosis, sífilis, cólera o neumonía. Alexander Fleming (1928) Descubrió el primer antibiótico, cuando por accidente se contaminó un cultivo de Staphylococcus aureus con un hongo y observó un halo transparente de inhibición de crecimiento de este microorganismo alrededor del hongo.

8 Antecedentes Históricos Aminoglicósidos Son azúcares complejos unidos por enlaces glicosídicos. Atraviesan la membrana citoplasmática por un mecanismo oxígeno dependiente. Los grupos NH 2 y OH interactúan con proteínas del ribosoma. La estreptomicina fue aislada en 1944 por el Dr. Selman Waksman a partir de Streptomyces griseus

9 Antecedentes Históricos

10 Resistencia frente a ATB Antibiótico Uso Clínico Resistencia observada Sulfonamidas Penicilina Estreptomicina Cloranfenicol Vancomicina Cefalosporinas 1960 Fines de 1960 Meticilina Necesidad constante de encontrar o desarrollar nuevos antibióticos

11 Resistencia microbiana a los antibióticos Perdida de sensibilidad de un microorganismo a un ATB Intrínseca Adquirida La bacteria no tiene la molécula/reacción enzimática que es el blanco del antibiótico Diferencias en la permeabilidad El ATB es expulsado eficientemente por sistemas de eflujo Adquisición de genes por transferencia horizontal: Conjugación Transformación Transducción Mutaciones

12 Mecanismos de Resistencia frente a ATB 1 Inactivación por destrucción o modificación de la droga 2 Modificación del sitio blanco 3 Disminución de la concentración intracelular: Disminución de la entrada Aumento de la salida

13 Autoprotección de Bacterias productoras de Productos Naturales Los productores de antibióticos desarrollaron mecanismos de protección e inmunidad contra sus propias armas, son un reservorio natural de genes de defensa anteriores al uso clínico de los antibióticos...

14 Clasificación de los antibióticos 1 Según su origen 2 Según su estructura química 3 Según su actividad sobre microorganismos 4 Según su espectro de acción 5 Según su mecanismo de acción

15 Clasificación según su origen Quimioterapéutico o Sintétco Sustancia producida de manera sintética que posee la propiedad de inhibir el crecimiento o destruir microorganismos Productos Naturales Sustancia producida por el metabolismo de organismos vivos, principalmente hongos y bacterias, que posee la propiedad de inhibir el crecimiento o destruir microorganismos Semisintéticos Productos naturales con modificaciones químicas en su estructura, que poseen mejoras en sus propiedades fisicoquímicas y/o farmacológicas

16 Clasificación según su estructura β lactámicos penicilinas cefalosporinas Tetraciclinas Aminoglicósidos Quinolonas Polipéptidos (síntesis ribosomal o no ribosomal) Macrólidos Cloranfenicol Streptomycin Esta diversidad estructural les permite interactuar con diferentes sitios blancos en las bacteria

17 Clasificación de los antimicrobianos según su efecto sobre el crecimiento bacteriano Bacteriostáticos: inhiben el crecimiento bacteriano Bactericidas propiamente dichos: producen la muerte sin necesidad de lisis Bactericidas bacteriolíticos: mediante la lisis celular producen la muerte

18 Clasificación de los antimicrobianos según su efecto sobre el crecimiento bacteriano Bactericidas: producen la muerte de los agentes infecciosos Bacteriostáticos: inhiben el crecimiento bacteriano aunque el microorganismo permanece viable Curva de crecimiento y agregado de ATB Log del Numero de células viables Agregado del ATB Bactericida Bacteriostático Control Tiempo

19 Clasificación según su espectro de acción

20 Determinación de espectro de acción de ATB Medio Agar Nutritivo Inocular una placa con un cultivo del microorganismo a testear Agregar sobre la superficie discos de papel conteniendo los ATB Incubar hs en estufa Los microorganismos susceptibles a un dado ATB muestran zonas de inhibición del crecimiento cerca de los discos Antibiograma: Se observan los halos de inhibición de cada uno de los antibióticos ensayados sobre la cepa correspondiente. La CIM se alcanza a determinada distancia del disco. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento se utiliza como indicativo de la sensibilidad o resistencia a cada antibiótico.

21 Cuantificación de la actividad antimicrobiana Concentración inhibitoria mínima (CIM) es la menor cantidad del agente antimicrobiano necesaria para inhibir el crecimiento de un microorganismo Concentración Inhibitoria Mínima

22 Clasificación de los antibióticos según su mecanismo de acción Síntesis de proteínas Síntesis Pared celular Síntesis RNA/DNA Metabolismo Ac. Fólico o Ac. Grasos

23 Por qué es importante conocer los blancos y los mecanismos de acción de los ATB? 1 Sentar las bases de la toxicidad selectiva 2 Categorizar los nuevos ATB 3 Encontrar un nuevo sitio blanco

24 Inhibición de la síntesis de la pared celular

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26 Síntesis de la pared celular

27 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Inhiben enzimas biosintéticas Fosfomicina, Cicloserina * Se combinan con moléculas transportadoras Bacitracina Secuestro de sustratos de la pared Vancomicina Inhiben las reacciones de entrecruzamiento del peptidoglicano Penicilinas, Cefalosporinas * * Análogos de sustratos

28 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Inhibición de enzimas biosintéticas Fosfomicina: inhibe la formación del 3 O D lactil éter de la NAG, o sea del ácido N acetilmurámico, debido a la semejanza estructural entre este antibiótico y el PEP, sustrato de la enzima Fosfomicina

29 RESISTENCIA Resistencia bacteriana a fosfomicina: Inactivación enzimática FosA: fosfomicin glutatión S transferasa

30 RESISTENCIA Resistencia bacteriana a fosfomicina: reducción de permeabilidad y modificación del blanco Reducción de permeabilidad Proteínas transportadoras GlpT y UhpT Listeria monocytogenes no posee transportadores y presenta resistencia intrínseca a fosfomicina Pseudomonas sólo posee el transportador GlpT Modificación del sitio blanco MurA Mutación Cys115Asp en E. coli Mycobacterium tuberculosis posee us Asp en sitio catalítico y presenta resistencia intrínseca a fosfomicina

31 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Inhibición de enzimas biosintéticas Cicloserina: Se comporta como análogo estructural de la D alanina, por lo que inhibe la acción de la racemasa que convierte la L ala a D ala, así como de la reacción de unión de dos D ala. D Ala D Ala Ligasa Cicloserina

32 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Interacción con moléculas transportadoras Bactoprenol: poliisoprenoide de 55 átomos de C que transporta las subunidades de peptidoglicano hacia la cara externa de la membrana.

33 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Tunicamicinas y Mureidomicinas son uridil péptidos que actúan como análogos de sustrato

34 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Bacitracina: péptido no ribosómico Se une al undecaprenolpirofosfato en presencia de Mg +2, bloqueando su desfosforilación, impidiendo la regeneración del transportador de membrana

35 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Secuestro del sustrato de la pared Vancomicina: glicopéptido Su gran tamaño limita el espectro de acción a bacterias Gram (+) Forma un complejo con los residuos de D alanina del muramilpentapéptido, estabilizado por cinco puentes de hidrógeno. Impide la transferencia de los precursores desde el transportador lipídico y la transpeptidación.

36 RESISTENCIA Resistencia bacteriana a Vancomicina Modificación del sitio blanco

37 RESISTENCIA Resistencia a Vancomicina VanH: Lactato deshidrogenasa VanA: Ligasa A ala X VanX: D ala D ala dipeptidasa VanY: D D Carboxipeptidasa

38 RESISTENCIA Resistencia a Vancomicina por modificación de D Ala por D Lac

39 RESISTENCIA Resistencia a Vancomicina: vanr, vans, vanh, vana,, vanx, vany Sistema de dos componentes D ala D ala VanS: Proteina sensora VanR: Activador transcripcional VanH: lactato deshidrogenasa VanA: Ligasa A ala X VanX: D ala D ala dipeptidasa VanY: D D Carboxipeptidasa D ala D Lac

40 Etapas finales de la síntesis de pared celular A β lactámicos A Bactoprenol: transporta los monómeros de peptidoglicano sobre la membrana citoplasmatica B Transglicosilasa: forma la unión entre la unidades B (1 4) disacaridicas C Transpeptidasa: enlaces interpeptídicos D Carboxipeptidasas: eliminan el extremo D Ala de las cadenas que van a entrecruzarse

41 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Inhibición de las reacciones de entrecruzamiento (transpeptidación) del peptidoglicano lactámicos

42 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Inhibición de las reacciones de entrecruzamiento (transpeptidación) del peptidoglicano Monobactamas: ej. Aztreonam. Activos sólo frente a Gram negativos. Penicilinas naturales: ej. Penicilina G, Penicilina V: espectro reducido, activas contra Gram positivos. Sensibles ph ácido Cefalosporinas: ej. Cefazolina, Cefalexina. Espectro reducido a Gram positivos. Carbapenemas: ej. Imipenem. Amplio espectro. Resistentes a lactamasas al igual que las Monobactamas. Ac. Clavulámico: Inhibe las B lactamasas

43 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular Grupo N acilo β lactámicos de segunda generación Penicilinas naturales: ej. Penicilina G, Penicilina V: espectro reducido, activas contra Gram positivos. Sensibles ph ácido Aminopenicilinas: ej. Ampicilina, Amoxicilina. Amplio espectro. Activas contra Gram positivos y Gram negativos. Más resistentes al ph ácido. Carboxipenicilinas: ej. Carbenicilina, Ticarcilina. Actividad anti Pseudomonas

44 Antibióticos que inhiben la síntesis de pared celular lactámicos: Mecanismo de acción Transpeptidasas PBP (Penicillin Binding Proteins) Inhibición de la reacción de transpeptidación y del entrecruzamiento del peptidoglicano Activan el mecanismo autolítico endógeno bacteriano

45 Acción bactericida de los β lactámicos PBPs: Participan en dos tipos de procesos: aumento de tamaño o elongación de la pared y formación del tabique. Estos procesos controlados por una gama de TG y TP que son los sitios de acción de las penicilinas ATB β lactámicos: Inhiben la TP, hay acumulación de precursores del PG, activación de autolisinas. Si está en medio hipotónico la bacteria se lisa. Cuando no está creciendo no tienen efecto.

46 Proteínas de unión a β lactámicos (PBP) Enzimas sensibles a penicilina o cefalosporinas Distinto grado de afinidad frente a los distintos β lactámicos Existen distintas PBPs con diferentes actividades. Intervienen en elongación y en la forma de la bacteria No todas las especies bacterianas presentan idéntico perfil de PBPs. Algunas tienen actividad carboxipeptidasa (CP) que liberan la alanina terminal Algunas son bifuncionales (TP y CP) SDS PAGE 14 C peniciloil proteinas Formación del septo transversal Formación del septo transversal

47 RESISTENCIA lactámicos: Inhiben las transpeptidasas Resistencia bacteriana a β lactámicos: a) Destrucción de la droga

48 RESISTENCIA Transpeptidasas Resistencia bacteriana a β lactámicos PBPs Inhibición de la reacción de transpeptidación y del entrecruzamiento del peptidoglicano Activan el mecanismo autolítico endógeno bacteriano lactamasas Existe enzimas de diferentes tipo: Serin β lactamasas (Tipo A, C y D) Metalo β lactamasas (Zn +2 ) Periplasmicas o unidas a membrana interna (Gram ) o extracelulares (Gram +) Constitutivas o inducibles

49 RESISTENCIA Las lactamasas en el periplasma evitan que los ATB lleguen a sus blancos

50 RESISTENCIA Estrategias para neutralizar las β lactamasas Desarrollo de lactámicos semisintéticos que sean hidrolizados lentamente (ej: carbapenem, monobactam) Inhibidores de lactamasas Complejo Estable

51 Estrategias para neutralizar las β lactamasas

52 RESISTENCIA Regulación de la expresión de los genes de las β lactamasas E. coli : ampgdr y ampc penicilina β lactamasa AmpC

53 RESISTENCIA Regulación de la expresión de los genes de las β lactamasas S. aureus : blar1 blai blaz

54 RESISTENCIA Síntesis de PBP2a insensible a β lactámicos S. aureus MRSA Resistencia bacteriana a β lactámicos: b) Reemplazo del sitio blanco Transglicosidasa Transpeptidasa

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56 Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos

57 Antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos nucleicos Inhibición de la DNA girasa Quinolonas Inhibición de la RNA polimerasa Rifampicina Inhibición de la síntesis de precursores Sulfamidas Trimetoprima

58 Replicación del DNA DNA Pol DNA Pol DNA girasa/topoii

59 Antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos nucleicos Quinolonas Interfieren la síntesis de ADN, bloquean la reacción de superenrollamiento dependiente de ATP catalizada por la girasa. En altas concentraciones pueden inhibir la Topoisomerasa II (enzima que presenta homología con la girasa). En bacterias G(+) actúan sobre Topoisomerasa IV No afectan la estructura de cromosomas humanos. Tienen un efecto bactericida

60 Antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos nucleicos Rifampicina: Es un antibiótico semisintético derivado de Amycolatopsis rifamycinica (previamente conocido como Streptomyces mediterranei). Se une de modo no covalente a la subunidad ß de la ARN polimerasa RNA polimerasa bloqueando la síntesis del mrna. Es útil en el tratamiento de la Tuberculosis, en combinación con drogas antituberculosas, como Isoniazida (inhibe la síntesis de lípidos de Mycobacterium tuberculosis) y Etambutol. También se usa en combinación con esta drogas para el tratamiento de la Lepra. RNA polimerasa

61 Antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos nucleicos Sulfamidas Descubiertas por Gerhard Domagk (1932) mientras buscaba colorantes para teñir S. aureus. Un colorante rojo (Prontosil Rubrum) protegía a ratones y conejos contra dosis letales de estáfilos y estreptococos hemolíticos.

62 Antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos nucleicos Sulfamidas Pteridina + PABA dihidropteroato sintasa dihidrofolato reductasa Análogos del PABA, antagonistas competitivos en la síntesis del ácido fólico bacteriano. Inhiben la dihidropteroato sintasa, necesaria para la incorporación del PABA al ácido dihidropteroico (precursor del ácido fólico).

63 Antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos nucleicos

64 RESISTENCIA Resistencia a Rifampicina y quinolonas: Modificación del sitio blanco Resistencia a Rifampicina: Mutaciones puntuales de subunidad β RNA Pol Resistencia a Quinolonas: Mutaciones puntuales de subunidad A de DNA Girasa

65 Antibióticos que interfieren con la función de la membrana plasmática

66 Antibióticos que interfieren con la membrana celular Polimixina B: Péptidos catiónicos que se insertan en la membrana. ATB se une al LPS o a las cargas negativas de la membrana, desorganizando la MC y generando cambios de permeabilidad de la misma y despolarización de la membrana. Relativamente tóxicos, poca utilidad terapéutica.

67 Antibióticos que interfieren con la membrana celular Daptomicina: Antibiótico lipopéptido cíclico, producido por Streptomyces roseosporus. Es bactericida por unión a la membrana celular de Gram (+). En presencia de Ca +2 produce una rápida despolarización de la membrana y muerte bacteriana, sin lisis celular.

68 Antibióticos que interfieren con la generación de ATP

69 Inhibición de la síntesis de proteínas

70 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 30S del ribosoma Aminoglicósidos: Estreptomicina, Neomicina, Kanamicina, Gentamicina, Tobramicina, Amikacina Tetraciclinas: Doxiciclina, Tetraciclina Que actúan sobre la unidad 50S del ribosoma Cloranfenicol Macrólidos: Eritromicina, Azitromicina, Claritromicina Lincosamidas: Clindamicina Que actúan sobre las aminoacil trna sintetasas Mupirocina Aminoacil trna sintetasas Mupirocina

71 Síntesis de proteínas

72 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 30S del ribosoma Aminoglicósidos Son azúcares complejos unidos por enlaces glicosídicos. Atraviesan la membrana citoplasmática por un mecanismo oxígeno dependiente. Los grupos NH 2 y OH interactúan con proteínas del ribosoma. La estreptomicina fue aislada en 1944 por el Dr. Selman Waksman a partir de Streptomyces griseus

73 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 30S del ribosoma Aminoglicósidos: Mecanismo de Acción Se unen a la subunidad 30S del ribosoma: Bloquea la formación del complejo de iniciación Produce lectura errónea del mensaje: proteína defectuosa El resultado final es la muerte de la bacteria, son bactericidas

74 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 30S del ribosoma Tetraciclinas: Estructura química y Mecanismo de acción F Met U A C Tetraciclinas A U G C G C G G A U C ARNm Bloquean la inserción del aminoacil trna La unión es transitoria, por lo que su efecto es reversible: son bacteriostáticos.

75 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 30S del ribosoma Tetraciclinas: Unión de la tetraciclina al ribosoma El conocimiento del sitio de unión e interacción del ATB con el blanco permite el diseño racional de nuevos ATB. Es activa en presencia de Mg +2

76 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 50S del ribosoma Cloranfenicol: Estructura química y Mecanismo de acción Originalmente producido por Streptomyces venezuelae, actualmente se sintetiza químicamente. Se une a la enzima peptidil transferasa en la subunidad 50S Inhibe la formación del enlace peptídico. Detiene la síntesis de proteínas. Es un agente bacteriostático.

77 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 50S del ribosoma Macrólidos y Lincosamidas: Estructura y Mecanismo de acción Inhiben la peptidil transferasa y la translocación Se detiene la síntesis de proteínas liberando prematuramente el peptidil trna. Son bacteriostáticos.

78 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Que actúan sobre la subunidad 50S del ribosoma Macrólidos: Unión al ribosoma

79 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas Inhibición de aminoacil trnasintetasas Mupirocina: Estructura y Mecanismo de acción Se une a la isoleucil trna sintetasa del microorganismo, de manera que impide la incorporación de la isoleucina a las proteínas. Bacteriostático a bajas concentraciones y bactericida a altas concentraciones.

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81 RESISTENCIA Resistencia a macrólidos: Modificación del sitio blanco Unión de Macrólidos al ribosoma Dimetilación de residuo Adenina rrna 23S Mutaciones puntuales de rrna o proteínas ribosomales

82 RESISTENCIA Resistencia a macrólidos: Disminución de la concentración intracelular ErmB: Macrólidos Small multidrug subfamily

83 RESISTENCIA Resistencia a Tetraciclina: Disminución de la concentración intracelular Cuando la tetraciclina entra a la célula se une con alta afinidad a la proteina TetR, que funciona como represor del gen de la bomba TetA (MFS), se sobreproduce y se inserta en la membrana

84 RESISTENCIA Adenilación Resistencia a aminoglicósidos Modificación de la droga: Kanamicina Fosforilación Acetilación

85 RESISTENCIA Resistencia a aminoglicósidos Modificación de la droga: Cloranfenicol Acetilación Hidrólisis Fosforilación

86 Sitios blanco de acción de los principales antibacterianos and function Daptomycin Lipid biosynthesis Platensimycin

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88 Evolución de la resistencia en Staphyloccocus aureus Staphylococcus aureus MRSA Bacteria Gram positiva que causa graves infecciones intrahospitalarias (1970) y en la comunidad (1990) BlaZ MecR MecI MecA VanH VanA VanX Necesidad de nuevos ATB y nuevos blancos (linezolid) Mutaciones en ARNr, proteínas ribosomales L3 o L4, o Cfr metiltransferasa

89 Nuevos sitios blanco de acción? Decoración de la superficie celular: Durante la síntesis de la pared en bacterias Gram positivas las proteínas de superficie son clivadas y unidas covalentemente al peptidoglicano por sortasas (enzimas que están ancladas en la membrana celular). En los patógenos hay múltiples sortasas con especificidad para diferentes grupos de proteínas. Son fácilmente accesibles a ligandos, que podrían inhibir su actividad

90 Nuevos sitios blanco de acción? Biosíntesis de isoprenoides: muchos patógenos clínicamente importantes contienen genes que codifican enzimas para una vía de síntesis de isoprenoides que tiene deoxixilulosa 5 P como intermediario (en lugar de mevalonato, como en la vía de síntesis clásica encontrada en eucariotas). Estas enzimas son esenciales para la formación de lípido I y II, y no están presentes en humanos.