Dr Javier Gómez Román Servicio de Anatomía Patológica Hospital Universitario Marqués de Valdecilla Universidad de Cantabria.

Dr Javier Gómez Román Servicio de Anatomía Patológica Hospital Universitario Marqués de Valdecilla Universidad de Cantabria. IDIVAL Santander

HASTA EL DIAGNÓSTICO Y MÁS ALLÁ... Buzz pathologist-year

EGFR y Biopsia líquida. Monitorización? A qué nos enfrentamos con la NGS? A la administración? A nosotros mismos? A nuestros límites?

EGFR y Biopsia líquida. Monitorización? A qué nos enfrentamos con la NGS? A la administración? A nosotros mismos? A nuestros límites?

A bad test can be just as dangerous as a bad drug. Daniel Hayes. 2016 ASCO President Validación Preanalítica / Analítica: Es reproducible el ensayo? Se han optimizado la preparación y manipulación de reactivos y muestras? Validación Clínica Separa grupos de pacientes el ensayo? Tiene valor pronóstico? Utilidad Clínica El resultado del ensayo permite realmente una intervención clínica que cambie la supervivencia?

Marchetti et al. J Thorac Oncol 2015

Los primeros 100 pacientes del estudio TRACER (tracking nonsmall cell lung cancer evolution through therapy) No EGFR, ALK

Al menos dos mutaciones fueron detectadas en cfdna en 46/96 pacientes con carcinomas en estadío precoz (48%) Una única mutación apareció en 12 casos más Existía una asociación con el subtipo histológico 30 de 31 Carcinomas epidermoides presentaban cfdna detectable (97%) 11 de 58 Adenocarcinomas presentaban cfdna detectable (19%) 5 de 7 tipos diferentes presentaban cfdna (71%) En Estadíos I, los Carcinomas epidermoides mostraban cfdna en 16 de 17 casos (94%) y los Adenocarcinomas en 5 de 39 (13%)

Seguimiento con PCR cada tres meses dos años en 24 pacientes 10 pacientes sin recidiva 14 pacientes con recidiva Al menos dos mutaciones se detectaron en 13 de los 14 pacientes con recidiva confirmada Antes En el momento de la recidiva clínica Al menos dos mutaciones se detectaron en 1 de los 10 pacientes sin evidencia clínica de recidiva (CRUK0013) Intervalo medio detección de cfdna y recidiva confirmada 70 días

Pacientes sin recidiva

Pacientes con recidiva

Subclonal sensible

El tratamiento con Quimioterapia convencional no parece actuar sobre las recidivas preclínicas Debemos tratar los subclones? Volumen tumoral correlaciona con el valor de detección en cfdna en plasma 10 cm 3 predice un 0,1% de frecuencia de variante mutada Detección precoz basada en TAC de baja radiación es capaz de detectar 0,4 cm (0,064 cm 3 ) Sensibilidad 1,4x10-4 de detección

La habitación de Arles (Vincent van Gogh 1889) expuesto en The Art Institute of Chicago.

Reconstrucción digital por Roy S. Berns and Brittany Cox, Munsell Color Science Laboratory, Rochester Institute of Technology, and Kelly Keegan, Department of Conservation, the Art Institute of Chicago

EGFR y Biopsia líquida. Monitorización? A qué nos enfrentamos con la NGS? A la administración? A nosotros mismos? A nuestros límites?

Mujer de 61 años de edad exfumadora de 50 paquetes/año Padre y hermana con cáncer de pulmón En marzo de 2014 lobectomía media derecha por Adenocarcinoma pt2, pn0 Noviembre de 2014 nuevo nódulo en lóbulo superior izquierdo Metástasis por Adenocarcinoma triple negativo (EGFR, ALK y ROS1) Carboplatino-Paclitaxel 6 ciclos Enero 2016 nueva recaída locorregional Cisplatino-Pemetrexed con Pemetrexed de mantenimiento hasta noviembre de 2016 Enero de 2017 persistencia de enfermedad. Radioterapia Enfermedad estable hasta septiembre de 2017. Progresión pulmonar Solicitan PD-L1 y NGS

Celularidad tumoral: 60%

PD-L1 22C3 Neg

Reported Variants Classification Unclassified Location exonic Variant Effect missense Genes KRAS Length 1 dbsnp rs121913529, rs121913530 Mutation c.34g>t Oncomine Variant Class Hotspot Coverage 1995 Type SNV Oncomine Gene Class Gain-of-function % Frequency AAA=0.00, AAC=0.00, AAG=0.00, AAT=0.00, ACA=26.17, ACG=0.00, ACT=0.00, AGC=0.00, ATA=0.00, ATC=0.75, ATT=0.00, CCA=0.00, CTC=0.00, GAC=0.00, GCA=0.10, GTC=0.00, TTC=0.00 Classification Unclassified Genes ERBB2 Mutation c.2305g>a Type SNV Location exonic Length 1 Oncomine Variant Class Hotspot Oncomine Gene Class Gain-of-function Variant Effect missense dbsnp rs121913468 % Frequency A=4.86, C=0.00, T=0.00 Coverage 925 Variant Details Gene: KRAS -- Exon: 2 --- chr12:25398283 --- NM_033360.3 --- Classification: Unclassified Sample Genotype Amino Acid b17-21437_v1 c.34g>t p.gly12cys * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Source UserName Description Notes Gene: ERBB2 -- Exon: 19 --- chr17:37880261 --- NM_004448.3 --- Classification: Unclassified Sample Genotype Amino Acid b17-21437_v1 c.2305g>a p.asp769asn * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon

La heterogeneidad molecular de las neoplasias proporciona la gasolina para la evolución y la resistencia a los fármacos Greaves M 2015

Se revisan 100 carcinomas en estadío precoz con muesrteo sistemático En total 327 regiones Alteraciones tempranas driver son robustas Alteraciones driver heterogéneas tardías aparecieron en el 75% de los tumores Genes relacionados con reparación de daño en ADN y remodelado de la cromatina No específicas de tipo histológico

p.asp769asn

Reported Variants Classification Unclassified Location exonic Variant Effect missense Genes KRAS Length 1 dbsnp rs121913529, rs121913530 Mutation c.34g>t Oncomine Variant Class Hotspot Coverage 1995 Type SNV Oncomine Gene Class Gain-of-function % Frequency AAA=0.00, AAC=0.00, AAG=0.00, AAT=0.00, ACA=26.17, ACG=0.00, ACT=0.00, AGC=0.00, ATA=0.00, ATC=0.75, ATT=0.00, CCA=0.00, CTC=0.00, GAC=0.00, GCA=0.10, GTC=0.00, TTC=0.00 Classification Unclassified Genes ERBB2 Mutation c.2305g>a Type SNV Location exonic Length 1 Oncomine Variant Class Hotspot Oncomine Gene Class Gain-of-function Variant Effect missense dbsnp rs121913468 % Frequency A=4.86, C=0.00, T=0.00 Coverage 925 Variant Details Gene: KRAS -- Exon: 2 --- chr12:25398283 --- NM_033360.3 --- Classification: Unclassified Lo trataríais???? Sample Genotype Amino Acid b17-21437_v1 c.34g>t p.gly12cys * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Source UserName Description Notes Gene: ERBB2 -- Exon: 19 --- chr17:37880261 --- NM_004448.3 --- Classification: Unclassified Sample Genotype Amino Acid b17-21437_v1 c.2305g>a p.asp769asn * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon

Paciente varón de 75 años de edad Masa pulmonar en el lóbulo superior izquierdo

B-160021949 Recibido: 31/10/2016 NTRAL TRAL VALDECILLA ( DR/A Salida: 04/11/2016 Informado: 01/12/2016 ANÁLISIS MOLECULAR DE MUTACIONES EN EL GEN EGFR INFORME DE PATOLOGÍA MOLECULAR (RC.APA.04.14-04) Material 75 remitido años Masculino Informe macroscópico rc.apa.04-14-01 B-160021949 Diagnóstico BIOPSIA DE PULMÓN. CILINDRO (PUNCH, BAAG, TRU-CUT) DE PULMÓN Recibimos en formol tres cilindros de pulmón que miden el de mayor tamaño 1 cm de longitud y del de menor tamaño 4 mm de longitud, son de coloración blanquecina y consistencia blanda. IT en tres bloques. Biopsia pulmonar de lóbulo superior izquierdo: - Adenocarcinoma de patrón acinar y micropapilar con infiltración perineural. Tipo de Estudio Realizado: Análisis de Identificación Molecular de Mutaciones en el gen EGFR Diagnóstico: Se realiza técnica para la detección de mutaciones en los exones 18, 19, 20 y 21 de EGFR por métodos de PCR en tiempo real que resulta: Resultado: MUTACIÓN DETECTADA EN EL EXÓN 18 de EGFR (NM_005228.3) Serie de validación ex18 c.2155g>a, p.(gly719ser) Observaciones: Esta mutación no está relacionada con sensibilidad a tratamiento con inhibidores de la actividad tirosin-quinasa Tecnología utilizada Cobas4800 EGFR mutation v.2 (Roche diagnóstica. IVD) Lote X05280 Material tisular utilizado: Tejido neoplásico fijado en formol e incluido en parafina. Procedencia de la biopsia: Tejido tumoral primario Porcentaje de células tumorales en la muestra: 70%

b16-21949_a1-a2_v1 SLC34A2(4) ROS1(32) chr4:25665952 chr6:117650609 * protein Gene: change EGFR takes -- Exon: into account 18 --- changes chr7:55241677 at multiple --- genomic NM_005228.3 loci in same --- codon Classification: Unclassified Sample Source Description rs397517085, rs397517086, rs397517 AAA=35.84, GenotypeCAA=0.00, CAT=0.00, Amino Acid 087, rs727504256 GCA=0.00, GGA=0.00, GTA=0.00 b16-21949_a1-a2_v1 c.2125g>a p.glu709lys UserName Notes Classification Genes Mutation Unclassified Gene: EGFR -- Exon: 18 --- chr7:55241706 EGFR --- NM_005228.3 --- Classification: c.2155g>t Unclassified Location Length Oncomine Variant Class Oncomine Gene Class exonic Sample 1 Hotspot Genotype Gain-of-function Amino Acid Variant b16-21949_a1-a2_v1 Effect dbsnp % Frequency c.2155g>t Coverage p.gly719cys * missense protein change takes into account changes at rs28929495, multiple genomic rs397517088 loci in same codon GA=0.00, GT=37.32, TT=0.00 1999 Source Variant Details Description UserName Notes Gene(s): SLC34A2(4) ROS1(32) - Location: chr4:25665952 chr6:117650609 - Classification: Unclassified Gene(s): TPM3(7) NTRK1(10) - Location: chr1:154142875 chr1:156844362 - Classification: Unclassified Sample Genes Location b16-21949_a1-a2_v1 Sample SLC34A2(4) Genes ROS1(32) chr4:25665952 Location chr6:117650609 * protein b16-21949_a1-a2_v1 change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon TPM3(7) NTRK1(10) chr1:154142875 chr1:156844362 * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Source Description Source UserName Description Notes UserName Notes Gene: EGFR -- Exon: 18 --- chr7:55241706 --- NM_005228.3 --- Classification: Unclassified Gene(s): ETV6(5) NTRK3(15) - Location: chr12:12022903 chr15:88483984 - Classification: Unclassified Sample Genotype Amino Acid b16-21949_a1-a2_v1 Sample c.2155g>t Genes p.gly719cys Location * protein b16-21949_a1-a2_v1 change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon ETV6(5) NTRK3(15) chr12:12022903 chr15:88483984 * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Source Description Source Description Type SNV

Larotrectinib (LOXO-101) Entrectinib (RXDX-101)

b16-21949_a1-a2_v1 SLC34A2(4) ROS1(32) chr4:25665952 chr6:117650609 * protein Gene: change EGFR takes -- Exon: into account 18 --- changes chr7:55241677 at multiple --- genomic NM_005228.3 loci in same --- codon Classification: Unclassified Sample Source Description rs397517085, rs397517086, rs397517 AAA=35.84, GenotypeCAA=0.00, CAT=0.00, Amino Acid 087, rs727504256 GCA=0.00, GGA=0.00, GTA=0.00 b16-21949_a1-a2_v1 c.2125g>a p.glu709lys UserName Notes Classification Genes Mutation Unclassified Gene: EGFR -- Exon: 18 --- chr7:55241706 EGFR --- NM_005228.3 --- Classification: c.2155g>t Unclassified Location Length Oncomine Variant Class Oncomine Gene Class exonic Sample 1 Hotspot Genotype Gain-of-function Amino Acid Variant b16-21949_a1-a2_v1 Effect dbsnp % Frequency c.2155g>t Coverage p.gly719cys * missense protein change takes into account changes at rs28929495, multiple genomic rs397517088 loci in same codon GA=0.00, GT=37.32, TT=0.00 1999 Source Variant Details Description UserName Notes Gene(s): SLC34A2(4) ROS1(32) - Location: chr4:25665952 chr6:117650609 - Classification: Unclassified Gene(s): TPM3(7) NTRK1(10) - Location: chr1:154142875 chr1:156844362 - Classification: Unclassified Sample Genes Location b16-21949_a1-a2_v1 Sample SLC34A2(4) Genes ROS1(32) chr4:25665952 Location chr6:117650609 * protein b16-21949_a1-a2_v1 change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon TPM3(7) NTRK1(10) chr1:154142875 chr1:156844362 * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Source Description Source UserName Description Notes UserName Notes Gene: EGFR -- Exon: 18 --- chr7:55241706 --- NM_005228.3 --- Classification: Unclassified Gene(s): ETV6(5) NTRK3(15) - Location: chr12:12022903 chr15:88483984 - Classification: Unclassified Sample Genotype Amino Acid b16-21949_a1-a2_v1 Sample c.2155g>t Genes p.gly719cys Location * protein b16-21949_a1-a2_v1 change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon ETV6(5) NTRK3(15) chr12:12022903 chr15:88483984 * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Source Description Source Description Type SNV Las mutaciones driver son mutuamente excluyentes?

Mujer de 24 años con un Timoma tipo AB de la OMS seguido en otro centro que fue sometido a quimioterapia neoadyuvante Masa de 16 cm que engloba vasos mediastínicos y afecta pericardio Neumonectomía derecha en 2013

B-130008576 Diagnóstico Estudios complementarios (A) - Pleura infradiafragmática: - Tejido fibroescleroso infiltrado por nidos microscópicos de Timoma (B) - Adenopatía 4R: - Cinco ganglios linfáticos sin evidencia de malignidad (C) - Adenopatía 7: - Cuatro ganglios linfáticos sin evidencia de malignidad (D) - Pulmón derecho: - Timo y pulmón derecho con un Timoma residual microscópico en nódulo de 7 cm de eje máximo (nidos microscópicos de timoma sobre nueve preparaciones correspondientes a nódulo macroscópico) que infiltra pulmón y respeta el borde quirúrgico de resección - Pulmón con alteraciones por compresión - Un ganglio linfático sin evidencia de malignidad (E) - Implante pleural: - Pared torácica infiltrada por Timoma (F) - Implante pleural 2: - Pared torácica infiltrada por Timoma (G) - Implante pleural 3: - Pared torácica infiltrada por Timoma (H) - Implante pleural 4: - Pared torácica infiltrada por Timoma ANÁLISIS MOLECULAR DE EXPRESIÓN DE PD-L1 Se realiza técnica inmunohistoquímica frente a PD-L1 con el anticuerpo 22C3 de Dako (PD-L1 pharmdx) con referencia SK006 en plataforma automatizada Autostainer link 48 que resulta: - Positiva en células neoplásicas en un rango del 90% (Positivo con alta expresión) Puntos de corte: 1-49%: Positivo con baja expresión >50% Positivo con alta expresión La positividad está relacionada con respuesta a tratamiento con inhibidores específicos de PD1/PD-L1

PET 2015

TAC 2017

b13-8576_f3_v1 SLC34A2(4) ROS1(34) chr4:25665952 chr6:117645578 Variant Details * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Gene(s): SLC34A2(4) ROS1(34) - Location: chr4:25665952 chr6:117645578 - Classification: Unclassified Source Description Sample Genes Location UserName b13-8576_f3_v1 Notes SLC34A2(4) ROS1(34) chr4:25665952 chr6:117645578 * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Gene(s): SLC34A2(4) ROS1(32) - Location: chr4:25665952 chr6:117650609 - Classification: Unclassified Source Description Sample Genes Location b13-8576_f3_v1 UserName Notes SLC34A2(4) ROS1(32) chr4:25665952 chr6:117650609 * protein change takes into account changes at multiple genomic loci in same codon Gene(s): SLC34A2(4) ROS1(32) - Location: chr4:25665952 chr6:117650609 - Classification: Unclassified Source UserName Description Notes Gene(s): AR - Location: chrx:66776185 - Classification: Unclassified Confirmamos????? Sample Location Copy Number b13-8576_f3_v1 chrx:66776185 6.86 * protein Gold change takes into standar???? account changes at multiple genomic loci in same codon Source Description UserName Notes

Se conocen numerosos genes con los que ROS1 se fusiona. Se mantiene el dominio quinasa El punto de fusión siempre está proximal al extremo 5 en los exones 32, 34, 35 ó 36