Transformación de espermatogonias tipo A de ratón mediada por liposomas

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1 Transformación de espermatogonias tipo A de ratón mediada por liposomas G. Villuendas 1, A. Gutiérrez-Adán 1, A. Jiménez 1, E. Roldán 2, B. Pintado 1 * 1 Dpto. de Reproducción Animal y Recursos Zoogenéticos, INIA, Ctra. de la Coruña, Km 5,9 Madrid (España) 2 Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC. C/ José Gutiérrez Abascal, 2, Madrid (España) pintado@inia.es RESUMEN La transformación de espermatogonias indiferenciadas empieza a ser un sistema alternativo para la modificación de la línea germinal animal y obtención de animales genéticamente modificados a raíz de la posibilidad de trasplante de estas células al testículo de un macho receptor de la misma o diferente especie. El desarrollo de esta metodología implica la necesidad de optimizar un sistema de cultivo in vitro que permita el mantenimiento a largo plazo de esta estirpe celular de forma indiferenciada, y también la consecución de un sistema de transfección eficiente. Este trabajo explora el segundo aspecto comparando la capacidad de transfección de tres diferentes liposomas utilizando una construcción basada en la expresión de proteína fluorescente verde (GFP) como marcador de expresión. Nuestro estudio demuestra que es posible transfectar una población celular enriquecida en espermatogonias tipo A mediante diferentes fórmulas lipídicas (lipofectina, lipofectamina y cellfectina) con un rango bajo de citotoxicidad. Se han detectado diferencias en el nivel de expresión de GFP en las espermatogonias transfectadas dependientes del liposoma utilizado y del tiempo post-transfección. Los porcentajes de células transfectadas más elevados se obtuvieron con lipofectamina 48 horas después de la transfección. PALABRAS CLAVE: Espermatogonias tipo A Ratón Transfección Liposomas GFP INTRODUCCIÓN La incorporación de nueva información en el genoma animal es una de las herramientas más importantes desarrolladas en el campo de la Biotecnología, aunque se ha visto li- * Autor para correspondencia Recibido: Aceptado para su publicación:

2 292 G. VILLUENDAS et al. mitada por la relativa ineficiencia del proceso, especialmente en las especies domésticas. El desarrollo de una metodología que permite transplantar espermatogonias indiferenciadas de ratón (Brinster y Zimmermann, 1994) y de otras especies (Dobrinski et al., 2000) al testículo de ratones inmunodeprimidos ofrece nuevas posibilidades para la obtención de animales genéticamente modificados. Aunque en el caso de especies filogenéticamente diferenciadas las espermatogonias no fueron capaces de restablecer el proceso de la espermatogénesis (Dobrinski et al., 2000), dentro de la misma especie (Brinster y Avarbock, 1994) y en especies muy relacionadas (Ogawa et al., 1999) las células trasplantadas fueron capaces de colonizar el testículo receptor reiniciando la espermatogenesis y llegando a la producción de espermatozoides viables. Este hecho abre la posibilidad de realizar modificaciones genéticas en las células trasplantadas no sólo como sistema alternativo para la obtención de animales transgénicos, sino también como una posible vía para la terapia génica que permitiría la corrección de genes defectivos en las espermatogonias evitando así su transmisión a la siguiente generación. Para explorar estas posibilidades es preciso desarrollar dos aspectos técnicos importantes, por un lado la obtención, purificación y especialmente el cultivo a largo plazo de las espermatogonias en su forma indiferenciada, aspectos en los que hay avances destacables (Nagano et al., 1998) y por otro, el proceso de modificación genética de las células propiamente dicho. El presente trabajo ha centrado su atención en la optimización de sistemas de transformación transitoria de espermatogonias tipo A de ratón utilizando tres tipos diferentes de liposomas como paso previo al desarrollo de un sistema de transformación constitutiva. MATERIAL Y MÉTODOS Preparación de la suspensión celular. Congelación y descongelación Se obtuvieron testículos de ratones Swiss de 6-7 o de días de edad, recogiéndolos inmediatamente en tampón fosfato ph 7,2 (PBS). Tras la eliminación de la túnica albugínea, se lavaron tres veces por sedimentación en el mismo tampón fosfato que contenía además 5 g/ml de DNAsa I (Boehringer, Madrid, España). Posteriormente fueron incubados en 12 ml de PBS que contenía 5 g/ml de hialuronidasa IS, 1mg/ml de tripsina y 1 mg/ml de colagenasa IA (Sigma, Madrid, España) en un baño de agua con agitación a 32 C, rpm durante 15 minutos para eliminar los restos de células intersticiales. La mezcla se pipeteó varias veces hasta obtener una suspensión celular homogénea y se realizaron dos lavados en tampón fosfato para eliminar los restos de tripsina. Se llevó a cabo una segunda incubación de 30 minutos en las mismas condiciones y con las mismas enzimas (excepto tripsina), para separar las células del epitelio seminífero. Tras pipetear varias veces la suspensión celular, se centrifugó a 200g durante 1 minuto y se realizaron tres lavados en PBS para proseguir con el proceso experimental. La viabilidad celular se estableció paralelamente mediante el test de exclusión de azul Tripán (Fresheny, 1994) y por el porcentaje de células que incorporaron Hoescht (5 g/ml) pero que no resultaron permeables a ioduro de propidio (5 g/ml) según la metodología descrita previamente (Pintado et al., 2000). El porcentaje de células viables se determinó a partir del recuento de un mínimo de 250 células. Dada la imposibilidad de

3 TRANSFORMACIÓN DE ESPERMATOGONIAS 293 disponer y procesar suficientes animales donantes en una única jornada y con objeto de obtener un número suficiente de células para la realización de los experimentos de transformación, las suspensiones celulares completas obtenidas en distintos días fueron congeladas en nitrógeno líquido siguiendo la metodología previamente descrita (Avarvock et al., 1996). Purificación e identificación de las espermatogonias Para obtener una suspensión celular enriquecida en espermatogonias tipo A, se realizó una separación en un gradiente discontinuo de Percoll. Para ello se preparó una solución isosmótica de Percoll (Sigma) en tampón Hepes (HM), añadiendo 9 partes de Percoll y 1 parte de solución HM 10x. HM contenía ClK 1M, NaH 2 PO 4 1M, NaCl 0,8M, Hepes 10Mm, NaHCO 3 y ácido láctico 43mM. Una vez descongelada la suspensión celular según el protocolo descrito por Avarvock et al. (1996), células resuspendidas en 500 l de PBS, BSA 0,7 % y DNAsa 50 g/ml fueron depositadas en la parte superior de una columna que contenía un gradiente discontínuo de Percoll (Morena et al., 1996) preparado con las siguientes concentraciones; 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 36 %, 33 %, 30 %, 25 %, 20 % en PBS conteniendo BSA 0,7 % y DNAsa I 50 g/ml (Boehringer). Los tubos, de una longitud de 100 mm y un diámetro interno de 14 mm las células, se centrifugaron a 800g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se recogieron las diferentes fracciones celulares y se lavaron dos veces en PBS. Cada fracción obtenida fue analizada al microscopio con contraste de interferencia (Normaski). El tipo celular correspondiente a espermatogonia tipo A fue identificado de acuerdo a su morfología, tamaño celular y nuclear, etc. y en base a las diferencias de tinción con Hoescht como previamente ha sido descrito por otros autores (Van Dissel-Emiliani et al., 1989; Morena et al., 1996). Una vez confirmado por este procedimiento que las fracciones celulares obtenidas estaban enriquecidas en espermatogonias, se realizó un segundo paso de purificación para eliminar células somáticas contaminantes. Para ello las células obtenidas en la fracción seleccionada fueron preincubadas en medio DMEM (Life Technologies; Madrid, España) suplementado con glutamina 10mM, aminoácidos no esenciales 1x, penicilina/estreptomicina 100IU/ml gentamicina 50mg/ml y un 10 % de suero fetal bovino (FCS) de Gibco BRL, (Paisley, UK) durante 2-3 horas a 32 C en una atmósfera de 5 % de CO 2. Este procedimiento elimina la mayor parte de células somáticas que se adhieren al fondo de la placa, (Rossi et al., 1993). Las células germinales, que permanecen flotando en el medio, fueron recolectadas y resuspendidas en el medio anterior sin FCS para su posterior procesamiento experimental. Vector genético de transformación Para monitorizar la eficiencia de la transfección celular, utilizamos el plásmido EGFP que contenía el ADN de la proteína fluorescente verde (GFP) cuya expresión es dirigida por el promotor del citomegalovirus humano (hcmv). El transgén GFP junto con su promotor fueron aislados del plásmido mediante digestión con enzimas de restricción y posteriormente purificados mediante gradientes en cloruro de sodio (Gutiérrez-Adán y Pintado, 2000).

4 294 G. VILLUENDAS et al. Transfección celular En cada replica, los cultivos celulares enriquecidos en espermatogonias fueron transfectados transitoriamente mediante lipofección utilizando tres tipos distintos de liposomas: Lipofectina (L), Lipofectamina (LT) y Cellfectina (CL) (Life Technologies), siguiendo las recomendaciones de la casa comercial con las siguientes modificaciones. Los liposomas y el plásmido (3 g) se diluyeron por separado en 250 l de DMEM cada uno y posteriormente se mezclaron e incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos liposomas-adn. La transfección se realizó a una concentración fija de liposomas (0,06 mg/ml) seleccionada a partir de estudios previos que indicaban que concentraciones mayores de esta cantidad aumentaban significativamente la citotoxicidad. La cantidad de ADN (3 g) fue seleccionada de acuerdo con las recomendaciones de la casa comercial para ensayos de transfecciones transitorias y en base a los resultados obtenidos en estudios previos con otras líneas celulares (Meye et al., 1998; Subramanian et al. 1996). Una suspensión de espermatogonias ( células) resuspendida en 50 l de DMEM se incubó con los complejos liposoma-adn durante 4 horas a 32 C, 5 % CO 2 en pocillos de 50 mm 2 (Costar). Al cabo de este tiempo, se añadió a cada pocillo 0,6 ml de medio suplementado con un 10 % de FCS. La expresión del gen marcador (GFP) se analizó 24 y 48 horas después de la transfección. Para determinar la eficiencia de transfección así como la densidad y viabilidad celular en cada muestra, las células se recogieron y se lavaron en PBS. Para analizarlas se contaron al menos 250 células por pocillo. El experimento de transfección se repitió tres veces. Análisis estadístico Los resultados obtenidos de transformación y viabilidad celular se compararon por Análisis de Varianza usando la comparación de medias de Tukey. RESULTADOS Aislamiento y purificación de espermatogonias La digestión enzimática de testículo de ratones de 6-7 días dio lugar a un número de células (germinales y somáticas) comprendido en un rango entre 3, , células por testículo, mientras que con ratones de 16 días la población celular obtenida aumentaba significativamente, recogiendose entre y células por testículo. Para incrementar la proporción de espermatogonias tipo A del total de la suspensión celular se realizó una separación inicial de células en función de su tamaño y peso utilizando un gradiente de Percoll. En los ratones de 6-7 días aparecían tres fracciones, la fracción intermedia correspondía a las espermatogonias tipo A. Para los ratones de 16 días aparecían 9 fracciones (Fig. 1), las fracciones 4 y 5 del gradiente contenían un alto porcentaje de espermatogonias tipo A. Como segundo paso en el proceso de purificación, las células se incubaron durante 2 horas a 32 C en placas de cultivo. Este paso permitió eliminar aproximadamente un % correspondiente a células somáticas de tamaño semejante al de las espermatogonias y que habían quedado retenidas en el mismo gradiente de Percoll.

5 TRANSFORMACIÓN DE ESPERMATOGONIAS 295 Fig. 1. Gradiente de Percoll de células de testículo de ratón de días mostrando la posición de las fracciones de células después de ser sometidas a una centrifugación de 800 g durante 30 min. El tubo tiene una longitud de 100 mm y un diámetro interno de 14 mm. Transformación de las espermatogonias Para evaluar la eficiencia de transfección de las suspensiones de células testiculares descongeladas y posteriormente enriquecidas en espermatogonias tipo A, se realizaron diferentes combinaciones a base del mismo vector de expresión (pcmv-egfp) y tres fórmulas lipídicas; lipofectina (L), lipofectamina (LF) y cellfectina (CL). Ninguno de los tres liposomas a la concentración utilizada mostró un efecto citotóxico significativo a las 24 o las 48 horas en comparación con un control consistente en la solución de ADN sin agente lipídico (Fig. 2). La eficiencia de transfección de este tipo celular específico se determinó registrando el porcentaje de células con expresión de GFP (Fig. 3) a las 24 y 48 horas después de la transfección, ya que se ha descrito que la expresión transitoria de GFP en células de mamífero aumenta entre las 0-36 horas postransfección (Subramanian y Srienc, 1996). Además se comprobó mediante tinción con azul Tripán que las células en las que penetraba esta tinción no emitían fluorescencia verde, lo que indica que únicamente las células transfectadas eran viables, y viceversa. La eficiencia de transfección (Fig. 4) no superó en ningún caso el 40 % de la población celular, pero de los tres liposomas utilizados la lipofectina proporcionó porcentajes significativamente mayores que los otros dos agentes lipídicos, tanto a las 24 (a b c, P < 0,05) como a las 48 horas (d e, P < 0,05), mientras

6 296 G. VILLUENDAS et al. que la diferencia observada en la eficiencia de la transfección a las 24 horas entre lipofectamina y cellfectina (b c, P < 0,05) desapareció a las 48h % de células viables horas 24 horas 48 horas Horas post-transfección Control L LT CL Fig. 2. Porcentajes de espermatogonias viables a las 24 y 48 la posteriores a su transformación con lipofectina (L), lipofectamina (LT) y cellfectina (CL). No hay diferencias significativas entre los distintos liposomas estudiados Fig. 3. Expresión de GFP en espermatogonias: A) Observación de una suspensión celular procedente de la fracción enriquecida en espermatogonias tipo A con contraste de interferencia 400X. B). El mismo campo examinado con filtro UV muestra las células positivas que emiten fluorescencia y que se identificaron con una flecha en la imagen A

7 TRANSFORMACIÓN DE ESPERMATOGONIAS % de células con fluorescencia a b c d e e 0 24 horas 48 horas Tipo de liposoma L LT CL Fig. 4. Porcentajes de células transformadas viables que expresan el gen marcador 24 y 48 horas después de la transformación con lipofectina (L), lipofectamina (LT) o cellfectina (CL). Dentro de cada tiempo de observación, columnas con distinta letra son significativamente diferentes (P < 0,05) DISCUSIÓN La espermatogénesis es un proceso celular muy complejo que conlleva la proliferación, diferenciación y maduración de más de 20 tipos celulares distintos. Para este experimento seleccionamos ratones de 6-7 días de edad porque a pesar de obtenerse globalmente un menor número de células por testículo, un gran porcentaje de las células germinales localizadas en los túbulos seminíferos corresponde a la fase celular indiferenciada, espermatogonia tipo A (aproximadamente el 16 % del total de las células de los túbulos seminíferos son espermatogonias tipo Ayel84%restante son células de Sertoli), mientras en ratones de días sólo el 10 % corresponde a esta fase de la espermatogénesis, mientras que hay un 50 % de células germinales en otras fases (espermatogonias B y espermatocitos) y un 40 % de células de Sertoli (Bellvé et al., 1977; Bellvé, 1993). El promedio de células obtenido en nuestro protocolo experimental concuerda con los valores previamente descritos por otros autores (Bellvé et al., 1993) y demuestra la eficiencia de las columnas de Percoll para realizar la separación celular y la obtención de fracciones enriquecidas en espermatogonias indiferenciadas. Por otra parte, la combinación con el cultivo durante 2 horas permitió desechar un porcentaje importante de células somáticas que presentan una gran tendencia a adherirse a la superficie de cultivo. Los resultados de expresión de GFP a las 24 y 48 horas demuestran que es posible transfectar in vitro las espermatogonias tipo A de ratón usando liposomas. De entre los ti-

8 298 G. VILLUENDAS et al. pos de agentes lipídicos analizados, la lipofectina resultó significativamente más efectiva que la lipofectamina o la cellfectina. Nuestros niveles de transformación transitoria, próximos al 35 % en el caso de la lipofectina son elevados teniendo en cuenta que se trata de un cultivo primario. Permanece todavía por determinar si los resultados obtenidos en transfección transitoria son indicativos de lo que sucedería en transformaciones estables, pero esto no podrá analizarse hasta que no exista un sistema que permita mantener las espermatogonias indiferenciadas períodos de tiempo suficientemente prolongados como para permitir la selección de las células transformadas establemente. Sin embargo la posibilidad de incluir ADN exógeno en esta línea celular y repoblar con ella el testículo de un animal receptor puede ser una alternativa interesante a otros sistemas de modificación del genoma que merece ser considerada. SUMMARY Liposome mediated transformation of type A spermatogonia from mice Genetic modification of undifferentiated spermatogoniae may be a alternative approach to modify animal germ-cell lines in order to obtain transgenic animals. Following modification, it is proposed that the altered germ cells would repopulate within the gonads following the transplantation of these altered cells to the testicle(s) of recipient animals of the sane or different specie. In order to test this hypothesis, it is necessary to establish an in vitro culture system that enables the long-term survival of the spermatogoniae cell line in an undifferentiated form and also a system that permits an efficient transformation process. This paper focuses on the second aspect; that involving the transformation process, utilizing three different liposomes and a green fluorescent protein (GFP) reporter system. Our observations provide evidence that it is possible to transiently transform a highly enriched population of type A spermatogonia with different lipidic formulas (lipofectin, lipofectamin and cellfectin) with minimal adverse effect on the cells. GFP expression level depended on the liposome used and the length of the post-transfection culture. The highest percentages of transfected cells were obtained with lipofectamin 48 la post transfection. KEY WORDS: Type A spermatogonia Mouse Transfection Liposome GFP AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido subvencionado por la Comunidad Autónoma de Madrid. Proyectos CAM 07B/006/97 y CAM 07B/004/99 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS AVARBOCK M.R., BRINSTER, R.L., Reconstitution of spermatogenesis from frozen spermatogonial stem cells. Nature Med. 2, BELLVE A.R., Purification, Culture and Fractionation of Spermatogenic Cells. En: Methods in Enzymology Guide to Techniques in Mouse Development. Wassarman P.M., DePamphilis M.L., eds. Academic Press, pp BELLVÉ A.R., CAVICCHIA J.C., MILLETTE C.F., O BRIEN D.A., BHATNAGAR Y.M. DYM M., Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell. Biol. 74,

9 TRANSFORMACIÓN DE ESPERMATOGONIAS 299 BRINSTER R.L., AVARBOCK M.R., Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91, BRINSTER R.L., ZIMMERMANN J. W Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91, DOBRINSKI I., AVARBOCK M.R., BRINSTER R.L., Germ Cell Transplantation From Large Domestic Animals Into Mouse Testes. Mol. Reprod. Dev. 57, FRESHNEY R.I., Culture of Animal Cells: A manual of Basic Techniques. Wiley-Liss, 486 pp. GUTIÉRREZ-ADÁN A., PINTADO B., Effect of flanking matrix attachment regions on the expression of microinjected transgene during preimplantation development of mouse embryos. Transgenic Res. 9, MEISTRICH M.L., VAN BEEK M.E.A.B., Spermatogonial stem cells. En. Cell and molecular biology of the testis C. Deskardins C., Ewin L.L. eds. New York, Oxford University Press, pp MEYE A., BACHE M., HINZE R., SCHMIDT H., WURL P., HOLZHAUSEN H.J., RATH F.W., TAUBERT H., Molecular characterization and liposomal transfection of a p53-mutated cell line established from a poorly differentiated leiomyosarcoma. Int. J. Oncol. 13: MORENA A.R., BOITANI C., PESCE M., DE FELICI M., STEFANINI M., Isolation of higly purified type A spermatogonia from prepuberal rat testis. J. Androl. 17, NAGANO M., AVARBOCK M.R., LEONIDA E.B., BRINSTER C.J., BRINSTER, R.L., Culture of mouse spermatogonial stem cells. Tissue Cell 30, OGAWA T., ARECHAGA J.M., AVARBOCK M.R., BRINSTER R.L., Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules. Int. J. Dev. Biol 41, OGAWA T., DOBRINSKI I., AVARBOCK M.R., BRINSTER R.L., Xenogeneic spermatogenesis following transplantation of hamster cells to mouse testes. Biol. Reprod. 60, PINTADO B., DE LA FUENTE J., ROLDAN E.R., Permeability of boar and bull spermatozoa to the nucleic acid stains propidium iodide or Hoechst 33258, or to eosin: accuracy in the assessment of cell viability. J. Reprod. Fertil. 118, ROSSI G.L., BESTETTI G.E., NEIGER R., Sexually dimorphic effects on aging on tuberoinfundibular dopaminergic neurons and lactotropes in rats. Mech. Ageing Dev. 72, SUBRAMANIAN S. SRIENC F., Quantitative analysis of transient gene expression in mammalian cells using the green fluorescent protein. J. Biotechnol. 49, VAN DISSEL-EMILIANI F.M.F., DE ROOIJ D., MEISTRICH M.L., Isolation of rat gonocytes by velocity sedimentation at unit gravity. J. Reprod. Fertil. 121,