UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS INSTITUTO SUPERIOR DE POSTGRADO MAESTRÍA DE MEDICINA TRANSFUSIONAL

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1 VALIDACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS Y COMPARADOS ENTRE EL MÉTODO MOLECULAR DE ACIDOS NUCLEICOS Y LA METODOLOGÍA SEROLÓGICA CLÁSICA REALIZADAS EN DONANTES DE SANGRE DEL HEMOCENTRO, CRUZ ROJA ECUATORIANA DE ENERO A DICIEMBRE Lcda. Ximena Haro Chávez Lcda. Eliana Catalina Herrera Escobar UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS INSTITUTO SUPERIOR DE POSTGRADO MAESTRÍA DE MEDICINA TRANSFUSIONAL QUITO, OCTUBRE 2014

2 VALIDACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS Y COMPARADOS ENTRE EL MÉTODO MOLECULAR DE ACIDOS NUCLEICOS Y LA METODOLOGÍA SEROLÓGICA CLÁSICA REALIZADAS EN DONANTES DE SANGRE DEL HEMOCENTRO, CRUZ ROJA ECUATORIANA DE ENERO A DICIEMBRE Lcda. Ximena Haro Chávez Lcda. Eliana Catalina Herrera Escobar UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS INSTITUTO SUPERIOR DE POSTGRADO MAESTRÍA DE MEDICINA TRANSFUSIONAL Dr. Manuel Patricio Hidalgo Dillon DIRECTOR Dr. Pablo Francisco Endara Dávila TUTOR METODOLÓGICO QUITO, OCTUBRE 2014

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5 v DEDICATORIA El presente trabajo dedicamos a todos quienes nos dieron su apoyo, al motivarnos día a día, para culminarlo.

6 vi RECONOCIMIENTO Agradecemos a Dios que nos ha concedido salud, tiempo y fortaleza, para alcanzar nuestro propósito. Agradecemos a las autoridades y docentes del Instituto Superior de Post Grado de la Facultad de Ciencias Médicas, por fortalecer nuestra formación y conocimientos profesionales; en especial al Doctor Marcelo Chiriboga, Coordinador de la maestría en Medicina Transfusional. Agradecemos a la Dra. Mónica Pesántez, Gerente del Hemocentro Cruz Roja Ecuatoriana de Quito, Institución de nobles ideales, quien permitió generosamente el acceso a la información pertinente para la elaboración de este estudio. Agradecemos a nuestro Director de Tesis Dr. Patricio Hidalgo, a nuestro asesor Metodológico Dr. Pablo Endara, por la guía, conocimientos y apoyo en la elaboración de la tesis, que nos permite cristalizar el objetivo fijado.

7 vii INDICE DE CONTENIDO RESUMEN... xiii ABSTRACT... xv PALABRAS CLAVES... xvii KEYWORDS... xviii INTRODUCCIÓN... 1 CAPÍTULO I... 3 PROTOCOLO Planteamiento del Problema Objetivo general Objetivos específicos Hipótesis alternativa Hipótesis nula Justificación... 6 CAPITULO II... 7 MARCO TEORICO Mecanismo de Infección Pruebas de Tamizaje Los de primera generación Los de segunda generación Los de tercera generación Los de cuarta generación ELISA con Anticuerpos Marcados ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA Sándwich DAS ELISA con Antígeno marcado, ELISA competitivo Metodología Molecular PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qpcr) Pooling automatizado de muestras Preparación automática de los muestras Amplificación automatizada de ácido nucleico Detección automatizada en tiempo real de productos de PCR mediante el analizador Cobas TaqMan HEPATITIS C Antecedentes Hepatitis C Estructura viral del virus de la Hepatitis C Variabilidad genómica del VHC Vías de Transmisión del VHC Vía Parenteral Hemodiálisis Tatuajes y Perforaciones Riesgo en personal sanitario Transmisión sexual en grupos de bajo riesgo Transmisión sexual en grupos de alto riesgo Transmisión vertical Usuarios de drogas vía parenteral Otros grupos de riesgo HEPATITIS B... 30

8 2.7.1 Antecedentes Hepatitis B Estructura del Virus HBV Región envoltura (S - Pre-S) Región Core, Pre-C Región P Región X Subtipos del Antígeno de Superficie (HBsAg) Variantes del VHB Marcadores Serológicos Antígeno de superficie del VHB (HBsAg) DNA del VHB (DNA-VHB) Antígeno del core (HBcAg) Antígeno e (HBeAg) Anticuerpos frente al antígeno del core (anti-hbc) Anticuerpos frente al antígeno del core de tipo IgM (anti-hbc IgM) Anticuerpos frente al antígeno de superficie (anti-hbs) Anticuerpos frente al antígeno e (anti-hbe) Variantes del VHB con expresión anómala de los determinantes antigénicos de subtipo Infección Oculta por el VHB VHB tipo Epidemiologia Vías de Transmisión Transmisión Parenteral Transmisión sexual Transmisión Vertical Infección Nosocomial Transplante de órganos VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VHI) Antecedentes VIH Estructura del VIH Gen gag Gen pol (precursor gag-pol) Transcriptasa inversa (p50) Integrasa (p31) Proteasa (p10) ARNasa (p15) Gen env Variabilidad genómica del VIH Epidemiología Vías de Transmisión Transmisión Sexual Transmisión Parenteral o Sanguínea Transmisión Vertical (madre-hijo) Transmisión Prenatal Transmisión Perinatal Transmisión Postnatal CAPITULO III METODOLOGÍA Diseño del estudio Recolección de datos Plan de análisis viii

9 3.4 Variables Matriz de Variables Definición y Operacionalización de Variables Cuadro 6. Definición y Operacionalización de Variables Población Y Muestra Consideraciones éticas Validez y Confiabilidad CAPITULO IV MARCO ADMINISTRATIVO Recursos Cronograma de Actividades CAPITULO V RESULTADOS Características generales de la población de estudio Prevalencia de la seropositividad a los marcadores serológicos para Hepatitis B, Virus de la Inmuno Deficiencia Adquirida y Hepatitis C Análisis univariable entre factores analizados y reactividad de los marcadores serológicos Asociación de las variables con reactividad a cualquiera de los tres virus investigados por medio de técnica NAT Sensibilidad, Especificidad, Valor predictivo positivo y negativo y Exactitud de la técnica NAT en comparación con la técnica serológica clásica: Índice de concordancia entre la técnica serológica y de ácidos nucleicos NAT: Análisis de las muestras no concordantes CAPITULO VI DISCUSIÓN CAPITULO VII CONCLUSIONES CAPITULO VIII RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFIA ix

10 x INDICE DE CUADROS Cuadro 1. Períodos de ventana comparativos de las diferentes técnicas para el escrutinio de virus transmisibles por transfusión sanguínea Cuadro 2. Principales antígenos y anticuerpos en la infección en el diagnóstico de infección por VHB Cuadro 3. Genes del VIH y Funciones Cuadro 4. Tabla de Contingencia Cuadro 5. Matriz de variables Cuadro 6. Variables a estudiarse Cuadro 7. Recursos Cuadro 8. Cronograma... 68

11 xi INDICE DE TABLAS Tabla 1. Características generales de los donantes de sangre del Hemocentro durante el año Se muestran los números totales y porcentajes entre paréntesis. Solamente edad (*) se muestra la media y rango Tabla 2. Seroprevalencia de los marcadores virales HBsAg, VIH y VHC tamizado por microelisa, en donantes de sangre del Hemocentro durante el año Tabla 3.Asociaciones entre las variables recolectadas y la reactividad al HBsAg- Marcadores serológicos. El valor p es calculado para la prueba de Chi cuadrado en todas las asociaciones excepto para edad en donde para T-test...75 Tabla 4. Asociaciones entre las variables recolectadas y la reactividad al VIH-Marcadores Serológicos. El valor p es calculado para la prueba de Chi cuadrado en todas las asociaciones excepto para edad donde es para T-Test (*).. 77 Tabla 5. Asociaciones entre las variables recolectadas y la reactividad al VHC. El valor p es calculado para la prueba de Chi cuadrado en todas las asociaciones excepto para edad donde es para T-Test (*) Tabla 6. Asociaciones entre las variables recolectadas y la reactividad a cualquiera de los 3 genomas virales por medio de la técnica de ácidos nucleicos NAT. El valor p es calculado para la prueba de Chi cuadrado en todas las asociaciones excepto para edad donde es para T-Test (*)..81 Tabla 7. Tabla 2x2 gold standar Tabla 8 Fórmula de sensibilidad Tabla 9. Fórmula de especificidad Tabla 10. Fórmula del valor predictivo positivo...84 Tabla 11. Fórmula del valor predictivo negativo.. 84 Tabla 12. Fórmula de la exactitud.. 85 Tabla 13. Comparación de los resultados reactivos/no-reactivos entre la técnica serológica versus la técnica NAT Tabla 14. Asociación entre los resultados individuales de Marcadores serológicos y el hecho de presentar concordancia o discordancia entre las técnicas serológica y molecular 87

12 xii INDICE DE GRAFICOS Gráfico 1. Estructura viral del VHC...22 Gráfico 2. Genoma del VHC..23 Grafico 3. Distribución epidemiológica mundial del VHC..26 Gráfico 4. Estructura VHB..31 Gráfico 5. Genoma viral VHB.33 Gráfico 6. Distribución Mundial del VHB.. 41 Gráfico 7. Organización genómica del VIH1 47 Gráfico 8. Variabilidad genética el VIH.52 Gráfico 9. Distribución epidemiológica mundial del VIH...53 Gráfico 10. Características generales de los donantes de sangre del Hemocentro durante el año Grafico 11. Seroprevalencia de marcadores serológicos de HBsAg, VIH, VCH Grafico 12. Seroprevalencia del factor edad asociado a la reactividad HBsAg-Marcador serológico 76 Grafico 13. Seroprevalencia del factor edad asociado a la reactividad VIH-Marcador serológico 78 Grafico 14. Seroprevalencia del factor edad asociado a la reactividad VHC Marcador serológico 80 Grafico 15. Seroprevalencia de factores asociado a la reactividad por edad según NAT..82 Grafico 16. Seroprevalencia de factor género asociados a la reactividad según técnica serológica y NAT...83

13 xiii RESUMEN La seguridad de los productos sanguíneos es una prioridad de los Bancos de Sangre y Hemocentros, los cuales tienen la finalidad de distribuir sangre segura. Es posible incrementar esta seguridad mediante la implementación de las técnicas de Biología Molecular que permiten la detección de material genético, tanto ADN como ARN, lo cual acorta el período de ventana, es decir, el tiempo entre la primera infección y el momento en el que la prueba ya puede detectarla. Se realizó un estudio observacional retrospectivo transversal analítico en muestras de donantes de sangre del Hemocentro de la Cruz Roja Ecuatoriana en Quito, desde enero a diciembre del año 2011, comparando los resultados obtenidos en el tamizaje por el método molecular de ácidos nucleicos (NAT) con los resultados obtenidos usando la metodología serológica clásica. Esto se hizo con la finalidad de medir la concordancia de los resultados en las dos técnicas utilizadas y para establecer la prevalencia del Virus de inmunodeficiencia humana,(vih), Hepatitis B (VHB) y Hepatitis C (VHC). Según la técnica serológica clásica, se determinó una seroprevalencia de 0,14% para VHB y VHC con 26 y 27 resultados reactivos respectivamente, en tanto que para el virus de inmunodeficiencia humana la prevalencia fue de 0,22% con 42 resultados reactivos. Una muestra fue concomitantemente reactiva para dos marcadores: para el marcador VHB y para VIH (0,01%). En el análisis univariable entre factores analizados y reactividad de los marcadores serológicos, pese a no existir diferencias significativas en género y el promedio de edad de los individuos donantes reactivos y no reactivos, la categoría de edad de 26 a 33 años estuvo asociada significativamente con un incremento en la prevalencia de reactividad en VIH (p < 0,01).

14 xiv En la técnica NAT se determinó una seroprevalencia de 0,12% con 23 casos positivos para VHB, VHC y VIH sin diferenciación individual. La prevalencia en el género masculino fue significativamente mayor: 0.17%, en contraste con 0.04% del género femenino ( p < 0.001). Tomando como referencia a la técnica molecular NAT como la prueba de oro en comparación a la técnica serológica, la sensibilidad fue de 100%, la especificidad fue 99%, el valor predictivo positivo fue 24.4%, el valor predictivo negativo fue 100% y la exactitud global, 99%. Hubo resultados no reactivos, concordantes en las dos técnicas, se observaron 23 resultados positivos usando NAT y la técnica serológica clásica, y 71 resultados reactivos solo con la técnica serológica, el índice de concordancia fue 99,6%. Sin embargo, el índice Kappa obtuvo un valor de 33,3% por los casos positivos discordantes. Todos los resultados reactivos de VHC (27 casos) en técnica serológica fueron negativos con NAT. Según los resultados obtenidos en este estudio, no se detectó ningún caso con infección viral en período de ventana serológica, con prueba de NAT Recomendamos la implementación de la técnica de ácidos nucleicos NAT individualizada para cada uno de los marcadores, pues creemos que esto permitirá demostrar la sensibilidad real de la prueba y en un futuro permitirá realizar nuevos estudios comparativos en forma paralela e individual.

15 xv ABSTRACT The safety level of blood products is a priority for blood banks and blood centers, which are designed to provide with safe blood. It is possible to increase these safety level by implementing molecular biology techniques, which allow for the detection of genetic material, either DNA or RNA, which shortens the "window period", that is, the time between the first infection and the moment when the test can detect it. A retrospective cross-sectional observational study was performed on samples of blood donors at the Ecuadorian Red Cross Blood Center in Quito, from January to December We compared the results obtained in the screening that used the molecular nucleic acids technique (NAT) with the results obtained by using the classical serological method. The objective was to measure the agreement between the two techniques and to establish the prevalence of Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis B (HBV), and Hepatitis C (HCV). By using the classical serological technique, a seroprevalence of 0.14 % for HBV and HCV was determined with 26 and 27 reactive results respectively, while for the human immunodeficiency virus, the prevalence was 0.22 % with 42 reactive results. A sample was concomitantly reactive to both the marker for HBV and the marker for HIV, the figure being 0.01%. Although there were no significant differences as to the reactive and nonreactive donors gender and average age, when the univariate analysis between factors and reactivity of serological markers was performed, the age group of years was significantly associated with an increased prevalence of HIV reactivity ( p < 0.01). When using the NAT technique, a seroprevalence of 0.12 % was found in 23 positive cases for HBV, HCV and HIV without individual differentiation; the prevalence in males was significantly higher: 0.17%, while the prevalence in the female group was 0.04 ( p<0.001).

16 xvi Taking the molecular technique NAT as the "ultimate test" reference and comparing it to the serological technique, it was found that the sensitivity was 100%, the specificity was 99%, the positive predictive value was 24.4%, the negative predictive value was 100%, and the overall accuracy was 99%. There were similar non-reactive results, which were concordant, as both techniques were used. The concordance index was 99.6%. 23 positive results were observed when using both the NAT technique and the serologic classical technique. 71 reactive results were observed when using only the reactive serologic technique; however, the Kappa index obtained a value of 33.3% for the discordant positive cases. All the HCV reactive results (27 cases) obtained with the serologic technique were negative when using the NAT technique. According to the results obtained in this study, no case of viral infection was detected in serological window period, when using the NAT technique. We recommend implementing the individualized nucleic acids technique, NAT, for each of the markers. We believe this will demonstrate the actual sensitivity of the test and will allow for further comparative research in a parallel and individual way in the future.

17 xvii PALABRAS CLAVES ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima NAT Técnica de detección de ácidos nucleicos VIH HBsAg VHC Donante voluntario Virus de Inmunodeficiencia Humana Antígeno de superficie Hepatitis B Virus de Hepatitis C Persona que por su propia voluntad dona sangre, una sola vez. Donante voluntario repetitivo Persona que por su propia voluntad dona sangre y lo hace en forma regular. Donante compensatorio Persona que dona sangre en reposición de hemocomponentes, que han sido requeridos por un familiar. Donante compensatorio repetitivo Persona que dona sangre, por varias ocasiones, en reposición de hemocomponentes, que han sido requeridos por un familiar

18 xviii KEYWORDS ELISA NAT VIH HBsAg Enzyme Linked Inmunosorbent Assay Nucleic acids technique Human Immunodeficiency virus Surface antigen of the hepatitis B virus VHC Volunteer donor Repetitive voluntary donor Hepatitis C virus Person who willingly donate blood once. Person who willingly donate blood and makes it regularly. Compensatory donor Person who donates blood in replacement of blood components that have been requested by a relative. Donor repetitive compensatory Person who donates blood, repeatedly, in replacement of blood components that have been requested by a family

19 INTRODUCCIÓN El presente trabajo, es un estudio realizado en Quito-Ecuador en el Hemocentro de Cruz Roja Ecuatoriana, para comparar los resultados de tamizaje en donantes de sangre obtenidos por dos métodos distintos, siendo estos: Serología clásica y método molecular, con el fin de destacar la importancia que conlleva la implementación de estas dos técnicas en forma rutinaria y conjunta para minimizar el riesgo transfusional. La transfusión sanguínea, se ha mantenido como una importante alternativa terapéutica, sin embargo, la transmisión de infecciones por vía transfusional es una de las complicaciones más importantes en receptores de sangre. En los últimos años se incrementaron las medidas para disminuir el riesgo de transmisión y en la actualidad, en los países desarrollados, es muy baja la posibilidad de desarrollar una enfermedad infecciosa como resultado de una transfusión, si se compara con otros riesgos derivados de las prácticas médicas. En la necesidad de disminuir el riesgo y de asegurar la calidad de la sangre y de los hemocomponentes, intervienen una adecuada selección del donante, una exhaustiva valoración,el tamizaje serológico y pruebas inmuno hematológicas. A pesar del tamizaje serológico sistemático en donantes de sangre para la detección de antígenos y/o anticuerpos para marcadores de enfermedades transmisibles por sangre, aún existe un riesgo residual post transfusional, ya que el período de ventana, es dependiente del tiempo de seroconversión, es decir el momento en el que los anticuerpos de una persona se han formado en suficiente cantidad que la detección de los mismos cambia de negativo a positivo. La aplicación de pruebas moleculares (NAT), para reducir este riesgo es una alternativa metodológica con el propósito de proporcionar el máximo de seguridad transfusional, pues permiten detectar la presencia de material genético del virus en sangre, entre ellos el Ácido Ribonucleico (ARN) del grupo M y O 1

20 del Virus de la Inmunodeficiencia Humana(VHI) tipo I y del ARN del VHI tipo II, el ARN del virus de la Hepatitis C (VHC) y el Ácido desoxirribonucleico (ADN) del virus de la Hepatitis B (VHB) en muestras de plasmas de donantes de sangre, antes que sean positivos los ensayos serológicos. M.Villanueva

21 CAPÍTULO I PROTOCOLO 1.1 Planteamiento del Problema La preocupación constante de la Medicina Transfusional, es proporcionar sangre y hemocomponentes seguros. Con el propósito de alcanzar el riesgo cero a nivel Transfusional, se han logrado desarrollar metodologías de mayor sensibilidad y especificidad para identificar a los agentes infecciosos transmisibles por sangre. Se debe considerar que existe una demora inevitable para obtener resultados reactivos que evidencien una infección, el potencial problema que origina ésta demora, es la seroconversión, ya que los microorganismos virus u otros agentes pueden estar presentes en el donador, y si este individuo dona sangre en esta fase, la sangre o los componentes pueden ser potencialmente infecciosos, pese a que las pruebas serológicas sean negativas M.Beltrán El desarrollo reciente de técnicas moleculares (NAT), susceptible de ser aplicada en forma rutinaria, posibilita la identificación de los virus en el plasma de donantes de sangre, minimizando el riesgo de contaminación de agentes potencialmente infecciosos. A.Arrazola Las pruebas de ácidos nucleicos, han sido las que han aumentado principalmente la seguridad de los productos sanguíneos, pues los genomas virales ácido desoxirribonucleico y ácido ribonucleico, (DNA/RNA) son actualmente demostrables, antes de la detección de los anticuerpos antivirales en la sangre de los donantes, de tal manera que el riesgo de transmisión de los virus de la inmuno deficiencia humana (VIH), de la Hepatitis B (HBSAg) y de la Hepatitis C (VHC) han disminuido considerablemente. A.Suárez

22 En Estados Unidos a principios de la década de los ochenta, la incidencia de transmisión por transfusión de VIH y VHB era extremadamente alta, entre 1: 100 y 1:1000 unidades transfundidas. Tras la introducción de NAT la proporción de unidades contaminadas por estos patógenos fue inferior a 1: De acuerdo a estadísticas norteamericanas ( ), cerca de 16.3 millones de unidades sanguíneas fueron tamizadas para ARN de VHC y casi 13 millones para ARN de VIH. De estas, 62 unidades (1 de tamizadas) resultaron positivas para ARN de VHC y negativas para VHC por métodos serológicos. Así mismo, 4 unidades 1 de cada fueron NAT positivas para ARN de VIH pero negativas para serología para el mismo patógeno. Comparativamente, un estudio realizado en Italia, 6 años después de la implementación de pruebas NAT ( ) de un total de donaciones, se obtuvieron 27 pruebas ARN positivo, 14 unidades tamizadas fueron ARN positivo para VIH y 197 fueron HBsAg ADN positivo. Cabe enfatizar que, de no haber empleado NAT, el uso terapéutico de estas unidades contaminadas así como sus hemoderivados, podría haber infectado a muchos receptores. G.Stramer El Hemocentro Nacional de Cruz Roja Ecuatoriana, a partir de noviembre del 2010, dispone de un Programa de Implementación de la prueba NAT, complementaria al tamizaje serológico, que permite disminuir el período conocido como Ventana Inmunológica aumentando de esta manera la sensibilidad y especificidad para la detección de muestras de los donantes infectados por los virus de la Hepatitis B, Hepatitis C y VIH, a fin de minimizar posibles contagios a través de la transfusión sanguínea. Durante el período comprendido de enero a diciembre del año 2011 en el Hemocentro de la Cruz Roja Ecuatoriana, se tamizaron rutinaria y paralelamente en sueros y plasmas de donantes de sangre para los marcadores serológicos para VHB, VHC, VIH con técnicas serológicas convencionales y técnica molecular de ácidos nucleicos. Por lo expuesto, la intención de este estudio es responder a la siguiente pregunta de investigación: Será que la validación de los resultados 4

23 obtenidos y comparados del método NAT y la metodología serológica clásica para el tamizaje de donantes de sangre del Hemocentro de Cruz Roja Ecuatoriana evidencian la importancia de la implementación de la técnica NAT como una prueba paralela complementaria para disminuir el riesgo Transfusional? 1.2 Objetivo general Validar y comparar los resultados obtenidos mediante el método molecular de ácidos nucleicos y la metodología serológica clásica para el tamizaje de donantes de sangre del Hemocentro Cruz Roja Ecuatoriana, de enero a diciembre de Objetivos específicos Comparar el porcentaje de resultados Reactivos entre los dos métodos Medir la asociación del factor sexo en resultados reactivos Medir la asociación del factor edad en resultados reactivos Medir la asociación del factor ocupación/profesión en resultados reactivos Medir la asociación del factor tipo de donación en resultados reactivos Medir la asociación del factor estado civil en resultados reactivos Calcular la prevalencia de seropositividad para los marcadores virales para VIH, HBsAg y VCH en los donantes de sangre voluntarios y compensatorios en el Hemocentro Nacional Cruz Roja Ecuatoriana durante el período de enero a diciembre de año

24 1.4 Hipótesis alternativa La técnica NAT mejora la detección de agentes virales en comparación con la técnica clásica. 1.5 Hipótesis nula La técnica NAT no mejora la detección de agentes virales en comparación con la técnica clásica 1.6 Justificación Considerando la importancia de la Terapia Transfusional como parte de un tratamiento para aquellos pacientes con diversas patologías, se ha estimado relevante aumentar principalmente la seguridad de los productos sanguíneos a través de la implementación de las pruebas moleculares de ácidos nucleicos (NAT), pues ésta técnica acorta significativamente el período de ventana es decir el tiempo entre la primera infección y el momento en el que la prueba ya puede detectar de manera segura la infección por agentes transmisibles por la sangre. En pruebas basadas en anticuerpos/antígenos, este período de ventana es dependiente del tiempo de la seroconversión, es decir, el momento en el que el estado de anticuerpos/antígenos de una persona cambia de negativo a positivo. 6

25 CAPITULO II MARCO TEORICO Se estima que más de 75 millones de unidades de sangre son donadas en el mundo, cada año. Lamentablemente, en los países en vías de desarrollo solamente 82 (43%) de los 191 países miembros de la Organización Mundial de la Salud (OMS), informan que realizan de manera rutinaria el escrutinio de todos los donantes de sangre para detectar infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus B de la hepatitis (VHB) y el virus C de la hepatitis (VHC). Esto trae como consecuencia que, aproximadamente, 13 millones de unidades no sean sometidas a las pruebas de detección correspondientes cada año, de tal forma que se calcula que se estén transmitiendo, por la vía transfusional, entre 8 y 16 millones de infecciones por el VHB, entre 2.3 y 4.7 millones de infecciones por el VHC y entre 80 mil y 160 mil infecciones por el VIH, anualmente, en el mundo. Más aun, sólo 9 de los 19 países de América Latina estudian 100% de la sangre transfundida para la detección del VIH y los virus de la Hepatitis B y C. Por el contrario, en los países industrializados como los Estados Unidos de América, a principios de la década de los ochenta, la incidencia de la transmisión del VIH, VHC y VHB era extremadamente alta de 1:100 a 1:1.000 unidades transfundidas. Sin embargo, en los últimos 20 años se han implementando técnicas para la determinación de marcadores infecciosos en las unidades de sangre. La evolución de las pruebas por inmunoensayo enzimático (ELISA) en generaciones cada vez con mayor sensibilidad y especificidad, la prueba de Antígeno (Ag) p24, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y hasta la prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) han logrado que la incidencia disminuya hasta 1:2 7

26 millones de unidades. Sin embargo, aún existe el riesgo residual, es decir la posibilidad de transmisión de infecciones por transfusión sanguínea que para Hepatitis B es de 1: unidades transfundidas, para hepatitis C 1:2 millones de unidades transfundidas, para el virus de la inmunodeficiencia humana es de 1: 1 a 2 millones de unidades transfundidas. Se cree que actualmente, con la implementación de NAT en unidades individuales, se podría tener una incidencia tan baja como 1:5 millones de unidades. J. Vásquez- 2006, A Pereira A. 2008, G Andreu G, P Morel Mecanismo de Infección Los virus difieren considerablemente en su composición, que varía entre formas tan extremas, como moléculas desnudas del ácido nucleico y estructuras complejas que contienen además lípidos, hidratos de carbono, proteínas y enzimas, procedentes a veces de la célula del huésped. El ácido nucleico de los virus puede contener ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) y ser de doble cadena o de cadena sencilla lineal o cíclico. Algunos pueden provocar infección generalizada en el huésped mientras que otros afectan solo a determinados tejidos u órganos. Algunas infecciones virales son de leve duración y limitadas, otras pueden permanecer toda la vida, e incluso transmitirse verticalmente de madres a hijos. La sangre es el vehículo más efectivo para la rápida diseminación del virus dentro del organismo, los viriones pueden circular libres en el plasma o bien contenidos o adsorbidos a leucocitos, plaquetas y eritrocitos. El ingreso inicial del virus a la sangre luego de la infección se denomina viremia primaria, la que aunque generalmente es clínicamente inaparente, conduce a la localización del virus en los órganos. La replicación viral en los grandes órganos blanco lleva a una producción sostenida de altas concentraciones de virus, produciendo una viremia secundaria y la subsiguiente infección en otras partes del cuerpo, resultando en 8

27 manifestaciones clínicas de la enfermedad asociada.b. Albert, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts La infección tiene un comportamiento semejante en el huésped, al que se le ha inoculado un patógeno, e implica los siguientes pasos: (a).la ruta de entrada del patógeno y el acceso a las zonas del huésped que invade el patógeno, (b).período de incubación, (c).cantidad de gérmenes, (d).la virulencia intrínseca o capacidad de multiplicación del organismo particular, (e).toxicidad (f).poder de invasión, (g).tiempo de actuación, (h).asociación microbiana, (i).el estado inmune del huésped que está siendo colonizado. Es importante recordar que un virus puede ingresar y replicar en un huésped, e inducir una respuesta inmunológica, sin producir signos ni síntomas de enfermedad. La mayoría de las infecciones, bajo circunstancias normales, son asintomáticas; la infección puede ser de corta duración y auto limitada (aguda), o de duración prolongada (crónica), y persistir durante toda la vida del huésped. HJ.Alter, HG.Klein- 2008; C.Falagán C, P.Váldez, A.León, X.Hechavarría, N.Cabeza -2003; S.Richter -2002; M.Beltrán Pruebas de Tamizaje Las pruebas de laboratorio que se realizan a las donaciones de sangre para el tamizaje de los distintos agentes transmisibles, se dividen en pruebas serológicas para la detección de anticuerpos y/o antígenos y pruebas moleculares (NAT). El método más utilizado es el ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay), como sus siglas en inglés lo indican, se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente), la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente 9

28 revelada mediante la adición de un substrato específico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro. Hay dos variaciones principales en éste método: (a). El que detecta la presencia de antígenos que son reconocidos por un anticuerpo, y, (b). El que detecta la presencia de anticuerpos a través de antígenos. Para describir los ELISA se usan los términos de primera, segunda, tercera y cuarta generación, determinados según la fuente antigénica Los de primera generación. Utilizan virus nativos purificados o no purificados o lisados celulares infectados preparados a partir de cultivos Los de segunda generación. Consisten en antígenos recombinantes, que son moléculas hechas de diversos tipos de proteínas que accionan una inmunorespuesta, obtenidos por clonación de fragmentos de ácidos nucleicos virales en levaduras, cultivo y purificación de las proteínas virales Los de tercera generación. Recurren a polipéptidos virales, péptido formado por una cadena de entre 10 a 50 aminoácidos, producidos por síntesis química Los de cuarta generación. Son los que permiten detectar antígenos y anticuerpos; poseen péptidos recombinantes sintéticos, son compuestos químicamente bien definidos, al realizar estudios con epitopes de difícil acceso o derivados de virus difícilmente cultivables y, por lo tanto, permiten reducir la variabilidad interensayo e intraensayo. Los ELISA se diferencian entre sí por los pasos a seguir durante el proceso y en especial por el tipo de conjugado que puede estar dirigido a un anticuerpo humano (pruebas indirectas) o contra un antígeno del 10

29 soporte sólido (en pruebas competitivas).cep. Council of Europe Publishing ELISA con Anticuerpos Marcados Los ensayos inmunológicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos como reactivos enlazantes específicos. Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulina purificada, pueden ser solubles o estar inmóviles en un soporte sólido, son empleados como conjugados no marcados o enzimáticos y por último reaccionan con un determinante antigénico específico de un antígeno o de un anticuerpo ligando-específico (anticuerpo primario) según el protocolo de análisis. Dentro de este grupo están los siguientes: ELISA Directo, ELISA Indirecto, ELISA sándwich Doble (DAS). X. Fuentes ELISA Directo. Ensayo simple de dos capas, consta de las siguientes etapas: Fijación al soporte insoluble tapizado de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados Adición de anticuerpos marcados conjugados con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. R. Lequin,

30 2.3.2 ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. V. Weemen ELISA Sándwich DAS. Double Antibody Sandwich, consta de las siguientes etapas: Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. 12

31 Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítope diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos 2.4 ELISA con Antígeno marcado, ELISA competitivo. Consta de las siguientes etapas: Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son análogas, el antígeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antígeno objeto de estudio, está relacionado serológicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el 13

32 soporte y la diferencia de densidad óptica (DO), es proporcional a la concentración del antígeno problema en la muestra. El ELISA de tipo competitivo difiere en que el anticuerpo primario compite con el conjugado que es un anticuerpo secundario, también dirigido contra el antígeno de la prueba para de ésta manera ocupar sitios reactivos en el antígeno.es por ello que en esta prueba de tipo competitivo tanto la muestra como el conjugado se agregan a la fase sólida (contiene el antígeno) al mismo tiempo. Si la concentración de anticuerpos en la muestra es más alta, muy poco de conjugado puede fijarse a los antígenos inmovilizados en la fase sólida, porque ahí se da la competencia, por lo que habrá ausencia de color. Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos: (a), ELISAs para detectar antígenos: ELISAs sándwich y (b), ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos. H. Prescott Metodología Molecular El avance de la Biología Molecular ha proporcionado técnicas cada vez más sensibles y por ende más seguras. Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAT), susceptibles de ser aplicadas de forma rutinaria, permiten detectar la presencia del material genético del virus en la sangre. Los genomas virales (DNA/RNA), son actualmente demostrables, incluso antes de la detección de los antígenos virales o de los anticuerpos antivirales en la sangre de los donantes, de tal manera que el riesgo de transmisión ha disminuido considerablemente. Marshall La metodología NAT ha demostrado ser eficiente para mejorar la seguridad transfusional, comparado con el tamizaje en serología clásica, basado solo en la detección de anticuerpos. Ya que estas son capaces de detectar la infección vírica solamente durante la fase crónica. Por ello es imprescindible contar con ambas metodologías para disminuir la 14

33 probabilidad de productos sanguíneos infectantes. BR. Jackon, MPBusch 2003; A.Fierro -2001; R. Jung -2000; VIRUS SEROLOGIA CLASICA NAT PCR (mini pool) NAT PCR (individual) VIH 16 días 10 días 7 días VHC 70 días 9 días 7 días VHB 59 días 49 días 38 días Cuadro 1. Períodos de ventana comparativos de las diferentes técnicas para el escrutinio de virus transmisibles por transfusión sanguínea Las pruebas NAT parten de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction); la PCR fue descrita por K.B. Mullis en 1985, es de las técnicas más sensibles y utilizadas en la investigación por su gran versatilidad en el análisis de ARN y ADN, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; pues en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original o molde. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las hebras de ADN para que vuelvan a duplicarse. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario 15

34 agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus acuaticus (polimerasa Taq), Pirococcus fusiosus (Pfu), Thermococus litoralis ( Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu,Vent). Hoy todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. JL.Chen PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qpcr). La reacción de PCR permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original, para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature. Se dividen en: (a), Técnicas basadas en fluorocromos no específicos y (b), Técnicas basadas en sondas específicas. En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real; permite cuantificar solo una secuencia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas. Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse) cuando la sonda está intacta y 16

35 presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen. La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-pcr puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. WB.Coleman- 2006; M.Busch-2005); C.Pasquier-2006 Las distintas técnicas NAT constan de cuatro procesos principales: Pooling automatizado de muestras. El pipeteo con el pipeteador Hamilton Micro Lab para muestras y controles. Está diseñado para procesar muestras en lotes; un lote se define como un conjunto de muestras y controles que se pipetean, extraen, amplifican y detectan conjuntamente. Una vez finalizado el pipeteo de un lote en el pipeteador Hamilton, se transfiere toda la bandeja de muestras al equipo Cobas Ampliprep para realizar el siguiente paso del proceso: Preparación automática de las muestras. Con el equipo Cobas Ampliprep. Los ácidos nucleicos de las dianas y las moléculas de control interno de Armored RNA añadidas, se procesan simultáneamente. La prueba Cobas TaqScreen MPX contiene reactivos que llevan a cabo cinco pasos secuenciales en el equipo Cobas Ampliprep. La solución de proteasa digiere las proteínas para propiciar la 17

36 lisis, inactivar las nucleasas y facilitar la liberación de ARN y ADN de las partículas víricas. La adición de reactivo de lisis a las muestras, provoca una lisis vírica y la inactivación de las nucleasas mediante la desnaturalización de las proteínas. El ARN y el ADN se liberan y se protegen simultáneamente de las nucleasas. Los ácidos nucleicos liberados se unen a la superficie de sílice de las micropartículas magnéticas añadidas. Esto se produce principalmente a causa de la carga positiva neta en la superficie de las micropartículas magnéticas y la carga negativa de los ácidos nucleicos en la concentración de sal caotrópica junto con la fuerza iónica de la reacción de la lisis. El reactivo de lavado elimina las sustancias no unidas y las impurezas, como, las proteínas, los restos de células y potenciales inhibidores de la PCR (hemoglobina, etc.) y reduce la concentración de sal. Los ácidos nucleicos purificados se liberan de las micropartículas magnéticas a una temperatura elevada con el tampón de elusión Amplificación automatizada de ácido nucleico. Con el analizador Cobas Taq-Man. Tras el aislamiento de los ácidos nucleicos purificados del plasma humano durante la preparación automatizada de las muestras, se utiliza la muestra maestra Cobas TaqScreen MPX (MMX), para la amplificación y detección de ARN, VIH I, (grupos M y 0), de VIH II y HCV, ADN VHB y ARN del control interno. Una vez activada mediante la adición de acetato de manganeso, la mezcla maestra Cobas permite la transcripción inversa (para dianas de ARN), seguida de la amplificación por PCR de regiones, altamente conservadas de VIH I( grupos M y 0) de VIH II y HCV, ADN VHB y ARN del control interno utilizando primers específicos. La detección simultánea de ácido nucleico amplificado se consigue mediante la generación de señales fluorescentes de la degradación 5 -nucleolítico de VIH I (grupos M y 0), VIH II, VHC, VHB y sondas específicas del control interno también presentes en la mezcla maestra. Se utilizan dos marcadores fluorescentes, un marcador etiqueta la sonda del control interno y el segundo marca todas las zonas específicas de las dianas que permiten la 18

37 identificación combinada multiplex de las dianas víricas y una identificación independiente del control interno. Transcripción inversa y amplificación mediante PCR se realizan con una enzima recombinante termoestable, la ADN polimerasa Z05. En presencia del manganeso (Mn2 + ), ADN polimerasa Z05 exhibe actividades tanto de transcriptasa inversa como de polimerasa de ADN. Esto permite que la transcripción inversa y la amplificación por PCR se produzcan en la misma mezcla de reacción. La amplificación mediante PCR se realiza mediante la polimerasa Z05, que extiende los cebadores alineados a lo largo de las plantillas diana para producir un ADN bicatenario (amplicón). Este proceso se repite mediante varios ciclos, en cada uno de los cuales se dobla la cantidad de ADN amplicón. La amplificación tiene lugar únicamente en la región de los genomas diana entre los cebadores; no se amplifican los genomas completos. Amplificación selectiva del ácido nucleico diana de la muestra se logra en la prueba Cobas TaqScreen MPX mediante el uso de la enzima AmpErase (urasil N-glicosilasa) y el trifosfato de desoxiuridina (dutp). La enzima AmpErase reconoce y cataliza la destrucción de las cadenas de ADN que contienen desoxiuridina, pero no del ADN que contiene desoxitimidina o ARN con ribouridina. El ADN natural carece de desoxiuridina, que sin embargo está siempre presente en los amplicones debido al empleo de trifosfato de desoxiuridina con trifosfatos de timidina como uno de los dntp del reactivo de mezcla maestra; por lo tanto, solamente el amplicón contiene desoxiuridina la cual permite que la enzima AmpErase pueda destruir el amplicón contaminante antes de la amplificación del ADN diana. Además, la enzima AmpErase destruye cualquier producto inespecífico que se pueda formar tras la activación inicial de la mezcla maestra por el manganeso. La enzima AmpErase que se incluye en el reactivo de la mezcla maestra, cataliza la escisión del ADN que contiene desoxiuridina en la posición de los residuos de desoxiuridina abriendo la cadena de la desoxirribosa en la posición C1. Cuando se calienta en el primer paso del ciclo térmico, la cadena de ADN 19

38 amplicón se rompe en la posición de la desoxiuridina, por lo que el ADN ya no puede amplificarse. La enzima AmpErase continúa inactiva durante un periodo de tiempo prolongado una vez que se ha expuesto a temperaturas superiores a los 55 C y, por lo tanto, no destruye el amplicón diana formado tras la PCR Detección automatizada en tiempo real de productos de PCR mediante el analizador Cobas TaqMan. Durante la amplificación por PCR, la elevada temperatura intermitente durante el ciclado desnaturaliza el amplicón diana y el amplicón del control interno para formar ADN monocatenario. 20 Las sondas de oligonucleótidos específicas para la detección se hibridan con la cadena sencilla del ADN amplificado. Los procesos de amplificación, hibridación y detección se producen simultáneamente. Detección de productos de PCR. La mezcla maestra Cobas TaqScreen MPX MMX contiene sondas de detección que son específicas para el ácido nucleico de VIH I (grupos M y O) VIH II, VHC, VHB o control interno. Cada sonda de detección se marca con (a). Uno de los dos marcadores fluorescentes que actúa como emisor y (b). Otro marcador que actúa como enmascarador. Un marcador emisor específico está asociado a las sondas específicas víricas y se mide a una longitud de onda definida. Un segundo marcador emisor distinto se asocia a la sonda específica del control interno y se mide a una longitud de onda diferente. En todas las sondas se utiliza un solo tipo de marcador enmascarador. Este sistema permite la detección de todas las dianas de virus amplificadas a una longitud de onda y la detección simultanea del ácido nucleico del control interno amplificado a otra longitud de onda. Antes de comenzar la amplificación por PCR, las sondas están intactas y la fluorescencia del marcador emisor se suprime con el marcador enmascarador debido a la transferencia de energía de tipo Fóster. Durante la amplificación por PCR, las sondas se hibridan con secuencias de ADN monocatenario específicas y se escinden por la actividad de la

39 nucleasa 5 a 3 de la ADN polimerasa Z05 en el momento en que se produce la amplificación. Una vez que el marcador emisor y el marcador enmascarador se separan mediante esta escisión, se desenmascara la actividad fluorescente del marcador emisor. Con cada ciclo de PCR, se generan cantidades crecientes de sondas escindidas y la señal acumulada del marcador emisor aumenta concomitantemente. La detección en tiempo real de los productos de PCR se consigue mediante la medición de la fluorescencia liberada por los marcadores emisores que representan las dianas víricas y el control interno independientemente. Gestión automatizada mediante el programa PDM data manager permite al usuario revisar e informar los resultados. Roche PDM data manager asigna resultados a todas las pruebas como no reactivas, reactivas o no validas. R.Higuchi- 2000; A.Eiras, S.Sauleda, D.Planelles SH.Kleinman, MC.Kuhns HEPATITIS C Antecedentes Hepatitis C. Científicos desarrollaron nuevos análisis de sangre para identificar la Hepatitis B (1963) y la Hepatitis A (1973), pero muchas de las muestras de sangre tomadas para detectar enfermedades producidas tras las transfusiones, resultaron negativas tanto a la Hepatitis A como a la Hepatitis B. Dado que el modo de transmisión era el mismo, los científicos clasificaron los casos no identificados como Hepatitis no A/no B. En los años 80, investigadores de los Centros para el Control de las Enfermedades, dirigidos por Daniel W. Bradley y de Chiron Michael Houghton identificaron el virus de la Hepatitis C (VHC). En 1990 los Bancos de Sangre comenzaron a analizar la sangre de los donantes para detectar la presencia del VHC, pero en 1992 se perfeccionó una prueba de sangre que permitía determinar la reactividad para este marcador. En la actualidad, el riesgo de contraer Hepatitis C a través de una transfusión 21

40 sanguínea es del 0,001% aproximadamente. MG. Ghany, DB.Strader, DL. Thomas, LB. Seeff-2009; JH. Jou, AJ. Muir ; JG. O'Leary, GL. Davis ; HR. Rosen Gráfico 3. Estructura viral del VHC Estructura viral del virus de la Hepatitis C El virus de la hepatitis C es un virus humano, clasificado dentro de un tercer género, (Hepacivirus), de la familia de los Flaviviridae, es un virus esférico, de aproximadamente 50 nm de diámetro, consta de una envoltura glicoproteica que contiene lípidos y su genoma es una molécula de ARN de cadena simple y polaridad positiva de nucleótidos de longitud, que contiene una única estructura de lectura que ocupa casi todo el genoma y codifica una poliproteína de unos aminoácidos. El ARN y la nucleocápside están envueltos en una cubierta derivada de membranas del huésped en donde las glicoproteínas codificadas del virus son insertadas para así iniciar su replicación en el huésped, expresar sus proteínas y causar la enfermedad. M. Houghton ; J. Marx ; PK Nelson ; E. Mast

41 Gráfico 4. Genoma del VHC La región 5 no codificante (5 UTR) del VHC, primeros nucleótidos, es esencial para la traducción, adoptando una estructura terciaria para el anclaje del ribosoma, lo que explica que su secuencia está tan bien conservada en todos los aislados (homología >97%). Ello le convierte en idónea para las técnicas de diagnóstico molecular basadas en PCR y para el diseño de nuevos fármacos antivirales. La mayor parte del resto del genoma actúa como ARN mensajero de un precursor poliproteico a partir del cual se liberan las distintas proteínas virales por la acción combinada de proteasas celulares y virales. Un 25% de la poliproteína da lugar a las proteínas estructurales (nucleocápside y envoltura) y el resto a seis proteínas no estructurales. El orden de los genes codificantes es: 5 -C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4ANS4B- NS5A- NS5B-3. 23

42 El producto del gen C, de 190 aminoácidos, constituye la subunidad básica de la proteína de la nucleocápside. Los siguientes genes E1 y E2 codifican las dos glicoproteínas de envoltura del VHC: gp35 y gp70. Una característica importante del gen E es la presencia de una región hiper variable (HVR-1) (primeros 27 aminoácidos de gp70, expuestos en la superficie del virus y que contienen epítopos para linfocitos. E1 y E2 estarían implicadas en la unión a receptores celulares y su posterior fusión, es decir, en la entrada del virus dentro de las células del huésped. Los genes no estructurales, NS2 y NS3 codifican dos proteasas que intervienen en el procesamiento de toda la región no estructural del precursor poliproteico. El producto de NS3, a continuación del dominio con actividad serín-proteasa, actúa como una helicasa capaz de desenrollar el molde de ARN durante la replicación del genoma. El producto NS4A actúa como cofactor de la actividad serín-proteasa de NS3. La función del producto p27 de NS4B es desconocida. NS5A da lugar a dos productos fosforilados de 56 y 58 kd cuya función se desconoce. Por último, el producto de NS5B contiene el dominio ARN polimerasa ARN-dependiente esencial para la replicación. La NS5 se ha implicado en la modulación de la respuesta antiviral del huésped mediada por el interferón. En concreto, se ha observado que la acumulación de mutaciones en una determinada región NS5A, la conocida como ISDR (interferon sensitivity determining region) se relaciona con una mejor respuesta al interferón en pacientes infectados por el genotipo 1b del VHC2. La zona codificante termina en un único codón de parada, al que sigue una región 3 no traducida (3 UTR) que contiene: una zona variable de 40 nucleótidos, seguida de una ristra de uracilos (poly-u), una secuencia polipirimidínica formada por secuencias poly-u con citocinas intercaladas y una región muy conservada (98-100% de homología) de 98 nucleótidos. 3 UTR es esencial para la replicación viral, aunque se desconocen sus funciones exactas. N. Acosta-Rivero ; N.Appel, T. Pietschmann, R. 24

43 Bartenschlager 2005; T. Astier, P. Bellecave, S.Litvak ; P. Andre, F Komurian-Pradel, S. Deforges, M. Perret, J. Berland Variabilidad genómica del VHC. Estudios clínicos y experimentales realizados antes y después del descubrimiento del VHC sugerían que la infección natural por VHC no induce una protección inmunológica en el huésped, pudiendo ser los individuos reinfectados en varias ocasiones con ARN-VHC homólogo o heterólogo. No obstante, la observación en el huésped de una respuesta inmune celular y humoral vigorosa durante la fase aguda y crónica de la infección por VHC, incluyendo anticuerpos específicos contra la envoltura y linfocitos T citotóxicos multiespecíficos (CTL), sugiere que es probablemente la variabilidad viral la que juega un papel clave en la persistencia de la infección por VHC. El VHC, como casi todos los virus ARN, se caracteriza por un alto grado de heterogeneidad genómica como consecuencia de la incapacidad de la ARN polimerasa para corregir errores durante la replicación. La observación de mutaciones de nucleótidos y aminoácidos específicamente segregables en grupos o subgrupos prácticamente en todas las regiones genómicas del VHC ha permitido la clasificación en genotipos y subtipos, cuyas secuencias difieren globalmente entre sí en 30 y 20%, respectivamente. En la actualidad se acepta la existencia de al menos 6 genotipos que tienen implicaciones diagnósticas, tanto a nivel serológico como molecular; divididos a su vez, en más de 84 subtipos. Los genotipos se denominan mediante un número del 1 al 6, y los subtipos mediante una letra minúscula, por orden de descubrimiento, por ejemplo., 1a, 1b, 2a, 3a, etc. M.Giménez-Barcons, S.Franco, Y. Suárez, X. Forns, S. Ampurdanès, F. Puig-Basagoiti 2001: X. Forns, R.Thimme, S.Govindarajan, S. Emerson, R. Purcell

44 2.6.4 Epidemiología La Hepatitis es una afección o enfermedad inflamatoria e infectocontagiosa que afecta al hígado, el cual se inflama y deja de funcionar correctamente. La infección por el VHC se caracteriza por una gran tendencia a la cronicidad, haciendo que ésta enfermedad sea una causa significante de morbilidad y mortalidad. La infección por el VHC es un problema sanitario a escala mundial con más de 170 millones de personas infectadas en el mundo. La prevalencia del VHC en la población general varía considerablemente, en los países industrializados es del 1-2%, mientras que en países Mediterráneos del Este y África la prevalencia es mayor, (hasta el 13% en Egipto). Las estimaciones más recientes realizadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) respecto al número de muertes muestran muertes al año directamente atribuibles al VHC. Sin embargo, la OMS estima que más de muertes al año son probablemente debidas al cáncer de hígado causado por el VHC, junto a una proporción significativa de muertes por cirrosis. En conjunto, estos datos sugieren que el VHC es responsable de aproximadamente un millón de muertes al año. Grafico 3. Distribución epidemiológica mundial del VHC 26

45 Mundialmente la distribución de los genotipos de VHC ha sido asociada con áreas geográficas y modos específicos de transmisión. Los genotipos 1, 2 y 3 están ampliamente distribuidos en el mundo mientras que los genotipos 4, 5 y 6 están confinados a áreas geográficas limitadas. Estudios realizados en la región metropolitana de Argentina (Ciudad de Buenos Aires y alrededores) y en regiones del sur de Brasil demuestran una mayor prevalencia del genotipo 1, principalmente 1b, seguido del genotipo 2 y 3 (5, 6, 7). Sin embargo, la distribución de genotipos se modifica continuamente debido tanto a cambios culturales que se asocian con nuevas conductas de riesgo como a movimientos poblacionales. N. Perico, D. Cattaneo, B. Bikbov, G. Remuzzi ; S. Riestra, E. Fernández, P. Leiva, S. García, G. Ocio, L. Rodrigo- 2001; C. Loras, C. Saro, F.Gonzalez-2009; R. Pellicano, I. Mladenova, S. Dimitrova, C. Bruno Vías de Transmisión del VHC El VHC se transmite por vía parenteral a partir de productos sanguíneos y en menor proporción por vía sexual o transmisión vertical (materno-fetal). Otras rutas parenterales de transmisión son a través de tatuajes, equipo de punción y cirugía infectados, el transplante de órganos de un donador infectado y el uso de equipos de diálisis y jeringas contaminadas en los usuarios de drogas intravenosas. La transmisión por contacto sexual con un individuo infectado y la exposición perinatal son rutas ineficientes, a menos que exista coinfección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que incrementa el riesgo de infección por estas vías. S. Pérez Cachafeiro S, JA. Iribarren Vía Parenteral. Antes de la incidencia de Hepatitis C post-transfusional se situaba entre el 5-13%, desde al iniciar el estudio de marcadores serológicos, la incidencia ha disminuido al 1%. A partir de que se instauró como rutina el tamizaje de VHC en todos los productos sanguíneos, se 27

46 redujo la incidencia y actualmente sólo 1 de cada 100,000 paquetes lleva el virus de la hepatitis C Hemodiálisis. En cuanto a otras rutas iatrogénicas de transmisión, se ha observado una mayor prevalencia de VHC en pacientes en tratamiento de hemodiálisis; parece existir una correlación directa entre la duración de diálisis y el número de transfusiones sanguíneas recibidas y la incidencia de infección por VHC. Otros posibles mecanismos de transmisión incluyen el uso compartido de máquinas de diálisis entre pacientes positivos para VHC y otros negativos, así como la transmisión nosocomial por el personal de diálisis Tatuajes y Perforaciones. En cuanto a la perforación de los lóbulos de las orejas y otras partes del cuerpo, la acupuntura y el tatuaje, han sido indicados como posibles factores de riesgo de Hepatitis, si el equipo utilizado está contaminado; sin embargo, la transmisión a través de estas actividades es rara.e. Neninger, P Velbes Riesgo en personal sanitario. El riesgo de adquirir la infección por VHC tras un pinchazo accidental con material contaminado, se ha considerado globalmente de 1%; los grupos de alto riesgo incluyen entre otros a cirujanos, ginecólogos, al personal de laboratorio y de hemodiálisis, de medicina intensiva y de salas de urgencias. D. Thorburn Transmisión sexual en grupos de bajo riesgo. Aunque la transmisión sexual existe, parece que esta vía es poco eficaz. El riesgo de infección del VHC dentro de la pareja es mayor para la mujer que para el varón. Algunos estudios muestran que las parejas de pacientes con hepatitis crónica por virus C tienen alto riesgo de adquirir el virus, y éste aumenta con la mayor duración de la exposición. Se ha 28

47 estimado que la probabilidad de adquirir la infección por contacto heterosexual reiterado con un miembro de la pareja infectado es de 0.3% en 10 años. Se debe advertir a los pacientes, que el uso de preservativo disminuye el riesgo de contagio Transmisión sexual en grupos de alto riesgo. Se estima una seroprevalencia del 4 al 6 % del VHC entre personas con múltiples parejas sexuales, pues parece existir una correlación positiva entre esta condición y el VHC, el hecho de no utilizar preservativos, mantener relaciones sexuales vía anal, relaciones sexuales traumáticas, historia de enfermedades de transmisión sexual, y pacientes coinfectados por VIH. R.Palacios Transmisión vertical. Los estudios sobre la transmisión vertical del VHC son escasos y dificultosos debido a los pequeños tamaños de muestra, las distintas características de las gestantes evaluadas, la inadecuada duración del seguimiento y la falta de consenso en los criterios de laboratorio para definir la infección pediátrica por VHC. Se han demostrado tasas altas de transmisión si las madres están infectadas concomitantemente por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o presentan títulos de ácido ribonucleico (ARN) de VHC superiores al millón de copias. Es posible que el embarazo produzca una mayor lesión en la célula hepática en las mujeres anti-vhc positivas mediante un mecanismo inmunológico. Es más frecuente la transmisión si la madre ha adquirido la infección del VHC mediante transfusión, o drogadicción, pues hay mayor carga vírica, y modificación del sistema inmunitario que puede favorecer así mismo la aparición de cepas víricas con más facilidad de replicar en el recién nacido. En el calostro se han detectado tanto anticuerpos contra el VHC como ARN del virus, pero no se ha comprobado transmisión madre hijo a través de la lactancia. El índice de transmisión en niños amamantados es idéntico al de niños alimentados con biberón, pero en madres sintomáticas con cargas víricas altas es aconsejable no dar el pecho. En 29

48 madres con VHC se ha detectado en la saliva ARN del virus, pero no se ha demostrado que constituya la fuente de infección. La transmisión vertical del VHC en los niños nacidos por vía vaginal parece más elevada que en los nacidos por cesárea, pero no es una evidencia firme. En niños nacidos de madres positivas para anti-vhc, se les recomienda realizar ARN de VHC a los 2 y 6 meses de vida y/o test para anti-vhc a los 18 y 24 meses. La positividad de anti-vhc en los neonatos previo a los 15 meses puede deberse a transferencia transplacentaria de anticuerpos de VHC. B. Fischler, G. Lindh, S. Lindgren Usuarios de drogas vía parenteral. Las personas con abuso de drogas vía parenteral tienen la mayor prevalencia de infección por VHC y que constituyen un potencial reservorio de VHC en la comunidad. La prevalencia varía, según la localización geográfica mundial y aumenta de forma proporcional a la duración del uso de drogas Otros grupos de riesgo. Los adictos a drogas vía oral, al ser comparados con los adictos por vía parenteral tienen menor incidencia de infección por VHC. En cuanto a los consumidores de cocaína vía nasal, dado que con frecuencia se comparte el material de inhalación, se ha observado que hay mayor incidencia del VHC, por lo que ésta, podría ser considerada como una posible vía de transmisión del VHC. A. Kornblit, A. Mendes Diz- 2006; NNUU HEPATITIS B Antecedentes Hepatitis B. Es una infección hepática potencialmente mortal causada por el virus de la Hepatitis B (VHB), fue el primer virus de Hepatitis que se identificó y constituye un importante problema de salud a nivel mundial siendo el tipo 30

49 más grave de Hepatitis viral; puede causar hepatopatía crónica y conlleva un alto riesgo de muerte por cirrosis y cáncer hepático. El primer brote registrado causado por el VHB fue en 1885, como consecuencia de un brote de viruela en 1883 se vacunaron a astilleros usando linfa de otros individuos, después de varias semanas y hasta ocho meses más tarde, 191 de los trabajadores vacunados presentaron ictericia que fue diagnosticada como Hepatitis sérica. En 1909 casos similares se reportaban por el uso de agujas hipodérmicas que fueron utilizadas y reutilizadas para el tratamiento de Sífilis Estructura del Virus HBV Gráfico 4. Estructura VHB El genoma del virus mide 42 nm de diámetro tiene dos zonas, una interna de 27 nm denominada núcleo o core, donde se encuentra el genoma, y una externa de composición lipoproteica. Es un virus DNA y se clasifica dentro del género Hepadnavirus, en el grupo que infecta exclusivamente a los mamíferos. 31

50 La estructura genómica del VHB está formada por dos cadenas de DNA, la cadena larga, denominada L(-), tiene un tamaño de aproximadamente de 3.2 kilo base (Kb), con los extremos 5 y 3 fijos, formando un círculo casi continuo. La cadena corta, o S(+), tiene una longitud variable, pudiendo ser hasta un 50% más corta que la L(-), con un extremo 5 fijo y un extremo 3 libre y variable. Dentro del genoma se distinguen cuatro fragmentos de lectura abierta de transcripción (ORF) denominados S/pre-S, Core/pre-C, P y X. El primero de ellos codifica tres proteínas del antígeno de superficie la SHBs, MHBs y LHBs. El segundo, denominado Core/pre-C, sintetiza una proteína de 183 a 185 aminoácidos donde se identifican dos zonas la pre-c y C. Una transcripción parcial de este gen da lugar a la formación del llamado antígeno e (HBeAg). El ORF P sintetiza la DNA polimerasa y el ORF X sintetiza la proteína HBx, que es exclusiva de los Hepadnavirus que infectan a mamíferos, con función transcripcional. La estructura circular del genoma está asegurada por las regiones de cohesión (220 nucleótidos), situadas en los extremos 5' de cada cadena. En esta región existe una secuencia de 11 nucleótidos que se repite directamente en el otro extremo de la región de cohesión. Estas secuencias repetidas, denominadas DR1 para la situada en la cadena L(- ), y DR2 para S(+), se encuentran implicadas en la replicación e integración del genoma del virus en los hepatocitos. El virus incrementa su capacidad codificante al existir un solapamiento importante entre los distintos ORF. La totalidad del genoma que codifica a Pre-S1, Pre-S2 y al gen S se solapa con la región P, que a su vez solapa parcialmente la región X y al gen C- Pre-C. 32

51 Gráfico 5. Genoma viral VHB Región envoltura (S - Pre-S). Codifica las proteínas de envoltura (HBsAg) del virus, el gen S codifica la proteína pequeña SHBs del HBsAg de unos 25 kd, que representa el componente mayoritario en las envolturas vacías del virus. Ciertas mutaciones puntuales en el gen S modifican el subtipo del VHB. El gen Pre-S2 codifica la proteína mediana MHBs del HBsAg (Gp33/36), la cual juega un papel importante en la unión del virus al receptor hepático, siendo un buen marcador de replicación del virus y, por tanto, de diagnóstico y pronóstico de la infección. Es una proteína muy inmunógena, creando una respuesta de anticuerpos neutralizantes capaces de inhibir la unión del virus al hepatocito. El gen Pre-S1 codifica la proteína mayor LHBs del HBsAg (p39/gp42). Tanto Pre-S1 como Pre- S2 desarrollan un papel importante en la respuesta inmune frente al VHB, al estimular a los linfocitos T Helper (Th), originando una respuesta de anticuerpos neutralizantes anti-s Región Core, Pre-C. Responsable de la formación del antígeno c (HBcAg) de la nucleocápside y del antígeno e (HBeAg). La región C codifica la proteína 33

52 de la nucleocápside vírica o core, cuyo tamaño molecular es de 22 kd. Se encuentra unida al retículo endoplasmático del hepatocito, sin ser secretada a la sangre. La transcripción de la región Pre-C y C codifica la síntesis del antígeno e (HBeAg) de 15 kd, originándose en un primer paso un péptido precursor de unos 25 kd que, por la acción de proteasas celulares, se escinde para dar la proteína HBeAg que penetra en el retículo endoplasmático celular y es secretado a la sangre Región P. Codifica la polimerasa de ADN del virus, enzima básica de 92 kd, situada en el interior de la nucleocápside, con actividad de polimerasa dependiente de ARN y ADN. La ADN-polimerasa del VHB presenta en su secuencia de aminoácidos una homología parcial con la transcriptasa inversa de varios retrovirus oncógenos. Está implicada en los mecanismos de transcripción inversa del VHB y de encápsidación del ARN pregenómico Región X. Codifica una proteína X (HBsAg) de 145 aminoácidos que contiene el promotor del gen C. Aunque la función de ésta proteína no es bien conocida se sabe que interviene en la regulación de la expresión del genoma del VHB y por lo tanto, regula los mecanismos de transcripción y replicación del virus. El péptido x (HBxAg) es inmunógeno y se detectan anticuerpos frente al mismo en pacientes con hepatitis aguda, crónica o carcinoma hepatocelular, aún en ausencia de otros marcadores de infección por VHB. A. Kay,F.Zoulim-2007,J.Beck J, M. Nassal M 2007,MJ.Bouchard MJ,RJ. Schneider RJ-2004, V.Bruss Subtipos del Antígeno de Superficie (HBsAg) El antígeno de superficie (HBsAg) constituye el 80% de la cubierta viral. Se han identificado ligeras variaciones en el material genético responsable de la codificación del HBsAg, con un determinante antigénico común a y 2 pares de antígenos mutuamente excluyentes, d/y y w/r, 34

53 resultando en 4 subtipos principales: adw, ayw, adr y ayr. Se ha descrito la heterogeneidad del determinante antigénico w, identificándose 10 distintos subtipos del HBsAg Variantes del VHB El VHB presenta una elevada variabilidad genómica (10% de su secuencia nucleotídica). Se han descrito mutaciones en todas sus regiones génicas, que afectan no sólo a la evolución clínica de la infección por VHB y a la respuesta terapéutica, sino que tienen consecuencias importantes desde el punto de vista diagnóstico (patrones serológicos atípicos), preventivo (reformulación de la vacuna) y epidemiológico (transmisión vertical/horizontal de las variantes).hl. Zaaijer, F.Ter Borg, HTMCuypers, MH.Hermus Marcadores Serológicos Antígeno de superficie del VHB (HBsAg). Se detecta en suero a partir de la cuarta semana de infección mediante técnicas de enzimoinmunoanálisis (EIA), con un límite de detección de 0,12 ng/ml. Con un método de estas características, la posibilidad de falsos negativos no supera el 1%. La detección de este marcador serológico se relaciona invariablemente con una infección por el VHB. La posibilidad de que exista infección siendo este marcador serológico negativo, sólo se puede dar en tres circunstancias excepcionales. La primera, durante el primer mes del período de incubación de la infección. La segunda, en la fase de resolución de la infección cuando se ha negativizado el antígeno sin llegar a desarrollarse los anticuerpos anti- HBs todavía. Por último, en el caso de mutación del VHB que determina una incapacidad de éste para sintetizar el HBsAg. No obstante, estas circunstancias son excepcionales en la práctica habitual y la negatividad de este antígeno se considera sinónimo de ausencia de infección por el VHB. En caso de duda razonable, presencia de otros marcadores e inexistencia de otras causas de infección hepática, la determinación del ácido nucleico del VHB puede ser un elemento de ayuda diagnóstica. 35

54 DNA del VHB (DNA-VHB). Su positividad en suero indica replicación viral y se detecta con técnicas de hibridación, branched DNA y PCR. El límite de detección con la técnica comercial más sensible que existe (Amplicor Monitor HB Roche) es de 102 a 103 copias/ml sin diferencias entre los distintos genotipos. En la práctica clínica se considera como replicación viral positiva, según la Asociación Americana para Estudio del Hígado (AASL), la presencia de valores superiores a 104 copias/ml. Las indicaciones actuales para solicitar la determinación de DNA del VHB son las siguientes (no es necesario para el diagnóstico y seguimiento de una hepatitis aguda por el VHB): Valoración inicial de una infección crónica por el VHB, ya que la replicación es un factor de progresión de la enfermedad y de su actividad Decisión de tratamiento de una Hepatitis crónica por VHB, ya que sólo deben tratarse los enfermos con replicación viral positiva Monitorizar el tratamiento con antivirales o interferón en las Hepatitis crónicas por VHB Antígeno del core (HBcAg). Es una proteína sintetizada por el propio virus y, aunque su detección en el núcleo celular en la biopsia hepática, con técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa, es signo evidente de replicación viral, el desarrollo de las técnicas de detección del ADN le ha hecho perder utilidad. La detección en suero es posible, previo tratamiento del mismo, pero carece de utilidad clínica Antígeno e (HBeAg). Es una proteína que se produce por escisión de la proteína precore y core, de tal forma que su tamaño se transforma de 25 kd en 17 kd. Se detecta en suero con técnicas de EIA y su positividad va unida, casi invariablemente, a la replicación viral. Sin embargo, la negatividad de este 36

55 marcador no implica la ausencia de ésta, ya que en los enfermos infectados por virus mutantes que no sintetizan el HBeAg, no lo presentan en suero a pesar de la existencia de replicación viral. Actualmente, su utilidad reside en identificar la cepa del virus infectante salvaje, si expresa el HBeAg en el suero, o mutante si no lo hace Anticuerpos frente al antígeno del core (anti-hbc). La respuesta humoral a la presencia en suero del HBcAg es la producción de anticuerpos frente a él, aparece casi simultáneamente a la detección del HBsAg y permanece después de la resolución de la infección como prueba de haber estado en contacto con el VHB. Las personas vacunadas frente al VHB no presentan este anticuerpo, ya que la vacuna sólo contiene el HBsAg. Su método de detección habitual es el EIA, que tiene una especificidad muy alta. En la clínica frecuente la detección de anti- HBc como único marcador de infección por el VHB no es excepcional y su significado puede ser triple. La primera posibilidad es que se trate de un falso positivo, dada la gran sensibilidad de la técnica, y en estos casos no se detecta el ADN del virus, siendo la respuesta a la vacunación frente al VHB completamente normal. La segunda posibilidad es que se trate de una infección oculta por el VHB que sólo se exprese por este marcador, esta posibilidad, dada la alta sensibilidad de las técnicas de detección de HbsAg, es muy rara, detectándose en estos casos el ADN vírico y la respuesta a la vacunación es nula. La última posibilidad, la más frecuente, es que se trate de una infección pasada y que no se detecten, por haberse perdido los estímulos antigénicos, la presencia de anticuerpos frente al antígeno de superficie, en este caso no se detecta tampoco el ADN y la respuesta a la vacuna es anamnésica Anticuerpos frente al antígeno del core de tipo IgM (anti-hbc IgM). Realizado con técnicas de EIA, se le aplica un punto discriminante que proporciona una sensibilidad de detección de Hepatitis aguda por el VHB de casi el 100%, de tal forma que su negatividad descarta una infección aguda, es decir de menos de seis meses de evolución. Su especificidad 37

56 no es del 100%, ya que puede ser positivo en caso de infección crónica por el VHB (evolución superior a seis meses) con replicación viral elevada. De cualquier forma en la práctica clínica habitual constituye un marcador específico de Hepatitis aguda por VHB Anticuerpos frente al antígeno de superficie (anti-hbs). Estos anticuerpos se detectan en la actualidad por técnicas de EIA. Puede realizarse una determinación cualitativa o cuantitativa, en unidades internacionales (UI), considerándose nivel de protección específico cifras superiores a 10 UI. La detección de este anticuerpo supone un estado inmunitario frente al HBsAg, por lo que se detecta tras una infección pasada frente al VHB apareciendo entonces unido al anti-hbc. En los sujetos con inmunidad activa a través de la vacunación este marcador es el único positivo. Estos anticuerpos aparecen tras la desaparición del HBsAg y nunca antes de los cuatro meses de la infección por el virus. Excepcionalmente, puede detectarse en un enfermo la presencia simultánea de HBsAg, anti-hbc y anti-hbs; ésta circunstancia se explica cuando una persona con inmunidad frente al virus B se infecta por la cepa mutante del virus. Tras aparecer en suero el anti-hbs, éste puede permanecer de por vida como señal de infección pasada, pero en algunas personas puede perderse y detectarse únicamente el anti-hbc. Esta eventualidad ha sido puesta de manifiesto en los casos de infección por el VHB en enfermos transplantados con donante que expresaban en suero el anti-hbc acompañado o no de anti-hbs, ya que el riesgo de ser infectados es casi del 100% SSC 2003; esto se produce por dos circunstancias, una es el transplante de un hígado con restos ocultos de infección por el VHB que no se expresa serológicamente y la otra por el estado de inmunosupresión que conlleva el transplante Anticuerpos frente al antígeno e (anti-hbe). Se detecta con técnicas de EIA y con sensibilidades muy altas. Su presencia en general es indicativa de baja o nula replicación y, consecuentemente, poca infectividad. Este marcador puede ser positivo, 38

57 con replicación viral elevada, cuando el enfermo está infectado por una cepa del VHB mutante que no expresa el HBeAg. Su utilidad actual en el diagnóstico y toma de decisiones terapéuticas es muy baja salvo para identificar la infección por una cepa salvaje, que expresa el HBeAg, o por una cepa mutante, que no lo expresa. YS Chen, CL Chen-2003; C Ferrai, G Missae, C Boni, S Urbani -2003; BJ Mcmahon HBs Ag Antígeno de superficie del VHB Detectable 30 a 60 días después de la infección Anti-HBs Anticuerpos frente al HBs Ag Proporciona inmunidad crónica HBcAg Anti-HBc IgM Antígeno core del VHB Anticuerpos IgM frente al HBcAg Detectable en sangre únicamente como componente interno de los viriones Se desarrolla en la infección aguda y persiste unos 6 meses. HBeAg Antígeno e del VHB Marcador de replicación viral Anti-HBe Anticuerpos fente al HBeAg Se correlaciona con disminución de replicación viral y de infectividad. Cuadro 2. Principales antígenos y anticuerpos en la infección en el diagnóstico de infección por VHB Variantes del VHB con expresión anómala de los determinantes antigénicos de subtipo Originados por mutaciones en el gen S del VHB, se han descrito dos situaciones: a) coexistencia de determinantes antigénicos mutuamente excluyentes en el suero de un mismo paciente (coinfección o reinfección por cepas VHB de distinto subtipo), y b) ausencia de expresión de los 39

58 determinantes de subtipo. SA. Whalley, JM Murray, D. Brow-2001; J. Torresi Infección Oculta por el VHB Conceptualmente se trata de enfermos que muestran un perfil serológico de Hepatitis B resuelta o con ausencia de marcadores de VHB, en los que se detecta la presencia de ADN-VHB integrado o libre en suero o hígado, o en ambos, aunque con más frecuencia solo en hígado. Desde el punto de vista clínico, no existen pruebas de que esta infección oculta pueda tener un papel constante en el daño hepático y solo explicaría casos aislados. Esta infección oculta explicaría la reaparición de actividad viral en situación de inmunodeficiencia o la posibilidad de transmitir la infección cuando se transplanta el hígado a un enfermo. La explicación de la infección oculta por VHB sin expresar serológicamente el HBsAg puede deberse a dos mecanismos: uno es que ciertos reordenamientos del genoma del virus dan lugar a cambios en las proteínas S que las hace indetectables con las técnicas comerciales, y la segunda posibilidad, mucho más frecuente, es que sin existir cambios en el genoma hay una supresión de la replicación y de la expresión de éste que determina la ausencia de 6 marcadores serológicos. La importancia clínica de esta infección oculta no está totalmente aclarada y se ha implicado en cierto grado de lesión o mala respuesta a tratamiento antiviral de otras coinfecciones. Actualmente, desde el punto de vista práctico, la implicación es clara para contraindicar la donación de un hígado de un enfermo con Hepatitis B resuelta a un receptor que no posee marcadores de VHB, ya que el riesgo de infección en el receptor es de casi el 100%. D.Ganem, AM.Prince ; VHB tipo 2 Se caracteriza desde el punto de vista serológico, por reactividad aislada al HBsAg sin seroconversión anti-hbc y ausencia de HBeAg. Transitoriamente, pueden detectarse anticuerpos anti-hbs con niveles bajos de HBsAg y ADN vírico. El diagnóstico de la infección por VHB tipo 40

59 2 implica incrementar la sensibilidad de los métodos de detección actuales del HBsAg, mediante ensayos que introduzcan anticuerpos policlonales y monoclonales específicos de la región Pre S-2 de subtipo d, o bien mediante técnicas de PCR del gen S. El origen del VHB tipo 2 parece estar en la aparición de mutaciones en el gen X, regulador de la replicación, que ocasiona que el virus se replique y exprese de forma insuficiente, siendo incapaz de estimular una respuesta inmune adecuada Epidemiologia Gráfico 6. Distribución Mundial del VHB Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), aproximadamente 2 billones de personas se han infectado, alguna vez, por el virus de la Hepatitis B, y de ellos más de 360 millones son portadores crónicos del 41

60 virus. Sobrevienen más de 50 millones de infecciones nuevas y mueren más de al año, por la enfermedad o sus consecuencias. La mayor parte de los casos se dan en países en desarrollo, sobre todo en niños, con el agravante de que en muchos países no es posible vacunar de forma sistemática, por problema de costos, aunque estos se han ido reduciendo significativamente en los últimos años. Este problema ha sido abordado por la OMS y otras organizaciones y a partir de 2008, 177 países han incorporado vacuna contra la Hepatitis B como parte integrante de los programas nacionales de vacunación infantil. A grandes rasgos se puede valorar la distribución de la Hepatitis B en el mundo, valorando el número de portadores crónicos de HBsAg: a) Endemicidad baja, del 0,1 al 0,5 %: en el norte, oeste y centro de Europa, Norteamérica y Australia; b) Endemicidad intermedia, del 2 al 7%: en el Este de Europa, la zona mediterránea, la antigua URSS, el Sudoeste asiático, Centroamérica y Sudamérica; y c) Endemicidad alta, alcanza el 8-20% en el Sudeste asiático, África tropical y regiones de China. La infección por HBV conlleva una amplia gama de presentaciones clínicas que van desde la enfermedad asintomática, la enfermedad aguda auto limitada, la Hepatitis crónica que progresa a falla hepática y cirrosis, y la Hepatitis fulminante y el estado de portador crónico asintomático. Sólo un pequeño número de infecciones agudas se diagnostican ya que sólo 10% de los niños y 30 a 50% de adultos con infección aguda pueden presentar cuadros sintomáticos con ictericia. El riesgo de desarrollar una Hepatitis crónica es inversamente proporcional a la edad a la cual se adquiere la infección, 90% de los recién nacidos infectados presentarán una infección crónica en comparación con 25 a 50% de los niños entre 1 a 5 años, y tan sólo 5 a 10% de niños mayores de 5 años.w. Robinson-2000; K.Sepkowitz

61 Vías de Transmisión El virus se encuentra en todos los líquidos orgánicos, pero sus máximas concentraciones se alcanzan en hígado y sangre. El periodo de incubación medio es de 90 días, pero puede oscilar entre 30 y 180; el virus se puede detectar a los días de la infección y persiste durante un período de duración variable. El reservorio del VHB lo constituyen los individuos infectados, la capacidad infectante de un portador es tanto mayor cuanto mayor es la replicación viral. En personas infectadas se ha detectado HBsAg en casi todos los líquidos corporales como: saliva, líquido seminal, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico, leche, líquido sinovial, jugo gástrico, líquido pleural y orina. Algunos de éstos líquidos corporales, especialmente el semen y la saliva, son infecciosos aunque menos que el suero Transmisión Parenteral. La incidencia de Hepatitis B secundaria a transfusión sanguínea ha disminuido de manera notable tras la exclusión de donantes remunerados y con la implementación del tamizaje sistemático de las muestras sanguíneas mediante la detección de HbsAg. Los pacientes que requieren muchas transfusiones, como los hemofílicos o los enfermos con talasemia, son los que mayor riesgo tienen de contagiarse por el VHB Transmisión sexual. El mecanismo de transmisión sexual de VHB es muy importante en la difusión del virus en todo el mundo y de hecho en los países de endemia baja e intermedia el 50% de los casos de Hepatitis B se producen por contactos hetero u homosexuales. La promiscuidad sexual y la coexistencia de otras enfermedades de transmisión sexual facilitan el riesgo de infección por el VHB Transmisión Vertical. La transmisión de la infección al feto puede provenir de una madre infectada cursando con cuadro agudo o crónico, siendo la transmisión 43

62 vertical (TV) más frecuente en los casos de infección aguda adquirida en el último trimestre del embarazo, debido probablemente a la escasa producción de anticuerpos maternos que puedan ser transferidos al feto; alcanza tasas de infección de 80-90%, en comparación con 10% si es transmitida en el primer trimestre. El período de mayor riesgo de TV ocurre durante el parto (85% de las infecciones perinatales) y sólo en 5 a 15% se produce durante el embarazo. Es importante mencionar que el riesgo de desarrollar portación crónica en aquellos niños infectados perinatalmente y que no recibieron inmunoprofilaxis llega hasta 90%, cifra mucho más elevada que la infección en el adulto. El mayor riesgo de cronicidad de la infección antenatal viene determinada por la presencia de HBeAg materno, antígeno que es capaz de atravesar la barrera placentaria, no existiendo una respuesta inmunitaria adecuada en el feto. La presencia de HBeAg en suero materno es un marcador de infectividad, siendo más elevado en cuadros agudos. Por el contrario, se ha comprobado una disminución a menos del 5% de TV en madres HBeAg (- ) HBsAg (+). Un estudio realizado el año 2003 comparó mujeres embarazadas HBsAg (+) con HBeAg (+) y (-). Junto con confirmar el paso de HBeAg transplacentario, fenómeno no demostrado hasta esa fecha, demostró que el HBeAg puede ser detectado en suero del lactante hasta los seis meses de vida a pesar de recibir profilaxis activa-pasiva al nacer (administración de vacuna anti VHB e inmunoglobulina específica, respectivamente), siendo esto un factor de riesgo del desarrollo de la cronicidad en recién nacidos infectados. Aunque se ha aislado el virus en la leche materna, no se ha demostrado infección por esta vía, por lo que la lactancia materna no está contraindicada. JT. Redd, J. Baumbach, W. Kohn-2007; CS.Coffin, PM.Mulrooney-Cousins 2011; J. Balanzó, J Enríquez Infección Nosocomial. El VHB es el virus sanguíneo más frecuentemente contagiado en el ámbito sanitario, la transmisión suele producirse de paciente a paciente o de paciente a personal sanitario, a través del instrumental médico o de 44

63 pinchazos accidentales. El riesgo de contagio después de un accidente con riesgo biológico por pinchazo o corte se estima en un 30% para el virus de la Hepatitis B (VHB), 3% para el virus de la Hepatitis C (VHC) y 0,3% para el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Todos los profesionales de la salud pueden ser contagiados con el VHB por el hecho de estar trabajando en el ámbito sanitario, si bien los grupos de mayor riesgo son los cirujanos, patólogos y las personas que trabajan en unidades de hemodiálisis u oncología. Por otro lado, la transmisión del VHB de profesionales sanitarios a pacientes es extremadamente infrecuente. Desde hace más de una década se vacuna sistemáticamente al personal que trabaja en centros sanitarios. WHO Transplante de órganos. No deben utilizarse órganos para transplante procedentes de pacientes HBsAg (+). Los injertos hepáticos de donantes HbsAg (-) pero anti-hbc (+), pueden transmitir la infección al receptor. Estos órganos pueden usarse, obteniendo previamente consentimiento del receptor y manteniendo una vigilancia concreta en este aspecto en el período posttrasplante. D.Ganem, AM. Prince VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VHI) Antecedentes VIH. El descubrimiento del virus de la inmunodeficiencia humana VIH/SIDA en la década de los 80 del siglo pasado, revolucionó todas las disciplinas médicas; en la Medicina Transfusional se produjeron cambios en todos sus procesos, desde la selección de donantes hasta la utilización de componentes sanguíneos y hemoderivados. En los primeros meses de 1980 se informó al Centro de Control de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos, la aparición inusual de neumonías por Pneumocystis carinii y sarcomas de Kaposi en individuos 45

64 adultos jóvenes previamente sanos pero con conductas homosexuales. Estas enfermedades raras aparecían solo en sujetos inmunodeprimidos, es decir, sin capacidad para defenderse de las infecciones y de algunos tumores. En pocos meses se describieron casos similares en otros países occidentales, fundamentalmente europeos. En 1983 el equipo del que forma parte Luc Antoine Montagnier, describió e identificó lo que sería uno de los mayores descubrimientos de las últimas décadas del siglo XX, apenas poco después de que este síndrome fuera reconocido como una nueva entidad patológica. Inicialmente el virus fue llamado, virus asociado a linfomadenopatía (LAV), poco después el equipo del estadounidense Robert Gallo confirmó el descubrimiento del virus y que este era el causante del SIDA. El virus fue renombrado virus T-linfotrópico tipo III (HTLV-III), en el mismo año, 1983, en que se identificó el virus, diversos equipos empezaron a trabajar en la secuencia de su genoma y en la caracterización de sus proteínas, publicada a principios de Robert Gallo y Luc Montagnier son los dos descubridores del virus del SIDA, uno norteamericano y el otro francés, cada uno investigó por su cuenta, llegando a las mismas conclusiones. Ese fue el motivo de que se pasaran años reclamándose mutuamente la autoría del descubrimiento. Como parte de la resolución del conflicto, el virus adquirió su denominación definitiva, human immunodeficiency virus (HIV) que en castellano se expresa como virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). L. Montagnier-2002; RC. Gallo Estructura del VIH 1-2 Los genomas del VIH-1 y VIH-2 son muy similares, ambos están compuestos por los tres genes básicos de la familia de los retrovirus; la partícula vírica esférica mide aproximadamente unos 110 nm de diámetro y está formada por tres capas superpuestas: una bicapa lipídica externa (derivada de la célula huésped durante el proceso de salida de viriones por gemación), una matriz esférica intermedia y una cápside troncocónica 46

65 interna, que contiene el genoma vírico y diversas proteínas esenciales. La información genética del VIH está compuesta por dos hebras idénticas, no unidas entre sí, de ARN monocatenario, no segmentado, de polaridad positiva y que debe transformarse, mediante transcripción inversa. Los tres genes principales del VIH, comunes a todos los retrovirus, se denominan gag (de grupo), pol (de polimerasa) y env (de envoltura). Básicamente, el primero codifica las proteínas del core (matriz, cápside y nucleocápside), el segundo expresa diversas enzimas involucradas en la síntesis e integración del ADN provírico y el tercero codifica las proteínas víricas de envoltura externa. Sin embargo, y a diferencia de los retrovirus simples, el VIH posee seis genes adicionales, dos reguladores (tat y rev) y cuatro accesorios (nef, vpr, vpu y vif); no esenciales in vitro. Gráfico 7. Organización genómica del VIH1 47

66 Gen gag. Es traducido a una proteína precursora, la p55, que luego se asocia, durante la gemación por la que se liberan nuevas partículas víricas desde de la célula infectada, a dos copias del ARN viral, para el que presenta una región afín, y a otras proteínas virales y celulares. Una proteasa, producto del gen pol corta durante la maduración del virión la p55 en cuatro proteínas que se incorporan a sus lugares respectivos: (a). La proteína p24 forma la cápside, (b).la proteína p17 constituye la matriz, situada bajo la envoltura, a la que estabiliza. Una parte de las proteínas se unen al complejo molecular que acompaña al ADN viral al interior del núcleo. En la superficie de la proteína existe una región cariofílica (literalmente afín al núcleo) que es reconocida por la maquinaria molecular de importación nuclear. Éste es el mecanismo que permite al VIH infectar células diferenciadas, no destinadas a dividirse, algo que no ocurre en ningún otro retrovirus, (c). Las proteínas p6 y p7 (ó p9) forman la nucleocápside. Dentro de la cápside, además de las dos copias idénticas del ARN viral hay ejemplares de tres enzimas necesarias para la multiplicación del virus: una transcriptasa inversa, una integrasa y una proteasa. Estas enzimas, así como una ARNasa se producen a partir de la proteína Pol Gen pol (precursor gag-pol). Dentro de la cápside, además de las dos copias idénticas del ARN viral hay ejemplares de tres enzimas necesarias para la multiplicación del virus: una transcriptasa inversa, una integrasa y una proteasa. Estas enzimas, así como una ARNasa se producen a partir de la proteína Pol, después del corte de una proteína precursora mixta derivada de la traducción, una de cada 20 veces, de los genes gag y pol. La propia proteasa vírica rompe la proteína anterior, con una eficiencia limitada, para obtener las proteínas Gag (p55) y Pol. Luego la proteína precursora Pol es cortada a su vez para formar las cuatro proteínas, la proteasa, la transcriptasa inversa, la ARNasa y la integrasa son proteínas víricas que 48

67 se expresan a través de una proteína de fusión Gag-Pol denominada p Transcriptasa inversa (p50). Su función es la síntesis del ADN de doble cadena del provirus usando como patrón la cadena singular del ARN viral. Es una ADN-polimerasa que puede actuar como dependiente del ADN tanto como del ARN. Una vez formada la primera cadena de ADN, complementaria del ARN viral, la ARNasa lo separa de él, lo que permite a la transcriptasa inversa ejecutar la síntesis de la segunda cadena de ADN tomando como molde la primera que se formó. Así pues, para la síntesis de la primera cadena la actividad de la transcriptasa inversa es ARN-dependiente, pero para la de la segunda es ADN-dependiente Integrasa (p31). Realiza la inserción del ADN proviral en el genoma de la célula huésped. No se requiere ATP para su actividad y debe cumplir sucesivamente tres funciones: (a).con una actividad exonucleasa corta dos nucleótidos del extremo 3' de cada una de las dos cadenas del ADN proviral, (b).con una actividad endonucleasa (de doble cadena) corta el ADN del huésped en el punto de integración. No hay un lugar fijo en el genoma para que esto se realice, sino que ocurre en cualquier región muy accesible de la cromatina, lo que se supone que favorece la expresión del provirus, al coincidir esas regiones del genoma con las más transcritas, (c).por último, con una actividad ligasa el ADN proviral es soldado, mediante sólo un enlace covalente en cada extremo, en el ADN celular Proteasa (p10). Se trata de una aspartil-proteasa cuya forma funcional es un dímero del que se conoce la estructura tridimensional. Actúa cortando las piezas de las proteínas Gag, Pol y de la Gag-Pol 49

68 ARNasa (p15). Separa las cadenas de ARN de las de la ADN durante la transcripción inversa Gen env. La proteína precursora de envoltura, Env, de 160 kd (gp160) se expresa a partir del ARNm maduro o tardío (al igual que gag y pol). Inicialmente es sintetizada en el retículo endoplásmico y, posteriormente, migra al aparato de Golgi, donde es glucosilada mediante la adición de 25 a 30 cadenas laterales de carbohidratos que son agregados a residuos de asparagina en el extremo N-terminal. Esta glucosilación es imprescindible para la infectividad vírica (10). Posteriormente, una proteasa celular escinde la gp160 en dos subunidades, la proteína superficial (gp120) y la proteína transmembrana (gp41), que permanecen asociadas entre sí de manera no covalente y que oligomerizan, generalmente en trímeros, en la superficie del virión. En la partícula vírica madura, estos trímeros dan lugar a las 72 proyecciones externas visibles en la bicapa lipídica de la superficie vírica. La interacción entre el VIH-1 y su receptor celular CD4 está mediada a través de dominios específicos en la proteína superficial gp120 (gp125 en VIH-2). Estructuralmente, la gp120 presenta nueve enlaces disulfuro intracatenarios altamente conservados y cinco regiones hipervariables (denominadas V1-V5), cuyas secuencias aminoacídicas pueden variar enormemente entre las cepas del VIH-1. J. Colomina Rodríguez, A. Galdames Farias-2010; JH.Simon, NC.Gaddis, RA.Fouchier, MH. Malim- 1998; HZ. Streicher, MS. Keitzm RC. Gallo 2000; J. Chinen, WT. Shearer

69 GEN env gag pol gp 160 gp 120 gp 41 p 55 p 24 p 17 p 9 p6 PROTEINA Transcriptasa inversa Integrasa Proteasa Precursor Cuadro 3. Genes del VIH y Funciones FUNCION Proteína de la envoltura Interacción con receptores y correceptores Fusión de membrana Precursor Proteína de la nucleocápside Proteína de la matríz Ribonucleoproteína asociada al ARN viral Retrotrascripcpión del genoma viral Actividad RNAsa H Integración del genoma viral retrotranscrito Procesamiento de las proteínas virales que forman la estructura del virión tat Tat Transactivación Regulación de transporte y rev Rev procesamiento de ARN nef Nef Retrotranscripción. Infectividad vif Vif Infectividad viral vpr Vpr Transactivador vpu Vpu Liberación de viriones tev Tev Activador tat y rev 51

70 2.8.3 Variabilidad genómica del VIH Gráfico 8. Variabilidad genética el VIH El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), al igual que otros virus ARN, presenta alta variabilidad genética in vivo. Este hecho está mediado por mecanismos moleculares que incluyen mutaciones, recombinaciones, y frecuentes delecciones e inserciones. Esta evolución ha dado lugar a cuatro grupos: M (main, principal), O (outlider, distante), N (neither, un uno ni otro), P. El grupo M es el que ha sufrido una mayor diversificación, y en él se han definido varios subtipos A, B, C, D, F, G, H, J y K.. La mayoría de las variantes que afectan a los humanos pertenecen al grupo M y menos comúnmente al grupo O. Sin embargo en 1998 se documentó el primer caso de una infección del grupo N, vinculado al virus de simios, en una mujer que vivía en Camerún. Y en 2009 se encontró un cuarto grupo de VIH designado grupo P en una mujer de Camerún que vivía en Paris. La nueva variante identificada por el equipo de Jean- Christophe Plantier, del Centro Nacional de referencia del virus de la inmuno deficiencia humana, parece ser el prototipo de un nuevo grupo del VIH 1. Respecto al VIH-2 se han establecido hasta el momento seis subtipos (A, B, C, D, F y 52

71 G). Estudios epidemiológicos han concluido que, en cada área geográfica, predomina un subtipo aunque cada vez es más frecuente su intercambio geográfico. SEFH- 2008; V.Shanmugam, W.M. Switzer, J.N. Nkengasong, G. Garcia-Lerma, T.A. Green, E. Ekpini, M. Sassan-Morokro, F. Antunes, K. Manshino, V. Soriano, S.Z. Wiktor, W. Heneine- 2000; J Yamaguchi, A. Vallari, P. Swanson, P. Bodelle, L. Kaptue, C. Ngansop, L. Zekeng, L.G. Gurtler, S.G. Devare, C.A. Brennan-2002; LG.Rivera-Morales, V.A. Novitsky, J.R. Trujillo, C. Lavalle-Montalvo, C. Cano-Dominguez, J. Ramos-Jimenez, E. Jimenez-Rios, L. Flores-Flores, P. Lopez-Guillen, P. Gilbert, F. Vannberg, R.S. Tamez-Guerra, C. Rodriguez-Padilla, and M. Essex Epidemiología Gráfico 9. Distribución epidemiológica mundial del VIH Desde la descripción de los primeros casos a principios de la década de los ochenta, el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) se ha convertido en la primera pandemia del siglo XXI, a pesar de los avances 53

72 terapéuticos, que han modificado el espectro de la enfermedad en los países más desarrollados hasta convertirla en una "infección crónica manejable". El VIH continúa siendo un problema de salud mundial de una magnitud sin precedentes, ha provocado un estimado de 25 millones de fallecimientos en el mundo y ha generado profundos cambios demográficos en los países más afectados. La epidemia del VIH ha trascendido a todos los países del mundo y es el continente africano el que alberga, en forma dramática, el mayor número de casos, seguido de Asia meridional y sudoriental, y en tercer lugar se encuentra América Latina. En el 2008, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha reportado casos de personas que viven con VIH, recientemente infectados y muertes y aproximadamente niñas y niños nacieron con el VIH, elevándose a el número total de niñas y niños menores de 15 años que viven con el VIH. A nivel mundial, el porcentaje de mujeres se ha mantenido estable (50 %) durante varios años entre las personas que viven con el VIH, aunque la proporción de infecciones en las mujeres está aumentando en varios países. En los últimos años, el uso generalizado de los tratamientos antirretrovirales de gran actividad (TARGA) en los países desarrollados ha prolongado el periodo de incubación del SIDA y ha reducido drásticamente la mortalidad de los afectados. Todo ello se ha traducido en un aumento de la supervivencia y de la calidad de vida de las personas infectadas por el VIH, y en términos epidemiológicos, en una reducción de la incidencia anual de casos de SIDA y en un incremento del número de personas que viven con la infección (prevalencia de VIH). R. Ochoa- 2004, V. Simon, K. Abdool-2006; PL. Fleming, PM. Wortley, JM. Karon JM, KM. DeCock-2000; A. Farrugia

73 El ritmo de progreso es cada vez mayor, lo que antes se conseguía en una década, ahora se logra en 24 meses", declaró Michel Sidibé, director ejecutivo de ONUSIDA. Sudáfrica, por ejemplo, consiguió aumentar el acceso al tratamiento del VIH en un 75% en los últimos dos años, mejora gracias a la cual 1,7 millones de personas pudieron acceder al tratamiento. Consecuentemente, los índices de nuevas infecciones por el VIH descendieron en más de en tan solo dos años. Los países están asumiendo una responsabilidad compartida aumentado la inversión nacional, entre 2001 y 2011, más de 81 países aumentaron en un 50% su inversión nacional. ONU SIDA Vías de Transmisión El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) ataca el sistema inmunitario y debilita los sistemas de vigilancia y defensa contra las infecciones y algunos tipos de cáncer. A medida que el virus destruye las células inmunitarias y altera su función, la persona infectada se va volviendo gradualmente inmunodeficiente. La inmunodeficiencia entraña una mayor sensibilidad a muy diversas infecciones y enfermedades que las personas con un sistema inmunitario saludable pueden combatir. La fase más avanzada de la infección por el VIH se conoce como síndrome de inmunodeficiencia adquirida, o SIDA y puede tardar entre 2 y 15 años en manifestarse, dependiendo del sujeto. El SIDA se define por la aparición de ciertos tipos de cáncer, infecciones u otras manifestaciones clínicas graves. El VIH infecta exclusivamente al ser humano, siendo éste el único reservorio conocido en la naturaleza. Por ello, la transmisión del VIH se produce siempre desde una persona infectada a otra susceptible y requiere ciertas condiciones para ser transmitida (a).que el agente causal esté presente en suficiente cantidad, (b).las condiciones medio ambientales y de contacto permiten al virus pasar de la persona infectada a la sana, el VIH fuera del organismo es lábil y sobrevive poco tiempo. Por ello, para infectar el organismo debe penetrar en su interior y entrar 55

74 en contacto con la sangre del individuo expuesto,(c).que la persona sana sea susceptible, permitiendo al agente producir infección. El VIH se ha aislado de diversos fluidos como la sangre, el semen y líquido preseminal, las secreciones vaginales, la leche materna y tejidos del organismo de las personas infectadas, sin embargo, solo en algunos se alcanzan concentraciones con capacidad infectiva. Aunque el VIH está presente en la saliva, no se ha demostrado que esta pueda transmitir la infección. El VIH no puede atravesar la piel intacta, por lo que la vía de entrada de la infección en el huésped puede ser a través de la piel dañada por heridas, punciones e incluso por micro lesiones, y a través de mucosas aun estando intactas. Existen tres vías fundamentales de transmisión del VIH: parenteral, sexual y vertical Transmisión Sexual. El medio más común de transmisión del VIH, siguen siendo las relaciones sexuales sin protección con una persona infectada. En los países donde la epidemia es de bajo nivel es decir, lugares en que la prevalencia del VIH es inferior al 1% en la población general, la transmisión está a menudo vinculada a las relaciones sexuales de riesgo en el contexto de la prostitución o entre hombres, mientras que en las epidemias generalizadas es decir, entornos en que la prevalencia del VIH en la población general adulta es superior al 1%, las relaciones sexuales con parejas múltiples, en las que se hace un uso escaso e irregular del preservativo. Todas las prácticas sexuales que favorecen las lesiones y las irritaciones aumentan el riesgo de transmisión, las relaciones sexuales con penetración vaginal o anal, heterosexual u homosexual, los contactos oro-genitales (contacto boca-órgano genital) pueden transmitir el VIH si hay lesiones sangrantes en cualquiera de las dos zonas. Las relaciones anales son las más infecciosas, porque son las más traumáticas y la mucosa anal es más frágil que la mucosa vaginal. El riesgo de infección aumenta con el número de relaciones sexuales, pero una única relación sexual puede ser suficiente. El riesgo de 56

75 transmisión es mayor en el sentido hombre-mujer que en el contrario, mujer-hombre Transmisión Parenteral o Sanguínea. La transmisión del VIH por la sangre es, en la actualidad, el principal modo de transmisión del SIDA en todos los países desarrollados, ya que la mayoría de portadores de anticuerpos del VIH son usuarios de drogas por vía parenteral (UDVP). Las jeringuillas y agujas contaminadas que son compartidas pueden transmitir el VIH; además, los objetos que se utilizan para la preparación de la droga también pueden estar contaminados. El riesgo de transmisión del VIH por transfusiones de productos derivados de la sangre en la actualidad se minimiza, ya que desde existe la obligatoriedad de detectar anticuerpos anti-vih1-2 en todas las muestras de sangre donada. Los elementos de cuidado corporal (tijeras, hojas de afeitar, cepillo dental, pinzas, etc.) presentan un riesgo teórico de transmisión del VIH ya que pueden entrar en contacto con la sangre. S.Anthony, EB Fauci L. Dennis, LKasper, L.Stephen. Hauser, L. Dan.J.Longo, L. Jameson, J. Loscalzo -2009; UNAIDS-2010; ONUSIDA Transmisión Vertical (madre-hijo). La vía de transmisión vertical constituye un mecanismo de infección del VIH en la edad pediátrica y puede ocurrir durante el embarazo, el parto o la lactancia. El 10% de los casos de infección vertical ocurren antes del tercer trimestre y el 75% en las etapas finales de la gestación o en el parto y entre el 10 al15% pueden acontecer durante la lactancia materna. Sin aplicar ninguna medida profiláctica, la tasa de transmisión vertical es del 15 al 30%, pero con el uso de la terapia antirretroviral en la madre durante el embarazo, el parto y en las primeras 4 semanas de vida del niño, junto a la posibilidad de cesárea electiva, la probabilidad de contagio madre-hijo se ha reducido a menos del 2%. La transmisión vertical de la 57

76 infección por el VIH entre madre e hijo puede producirse en las siguientes circunstancias: Transmisión Prenatal. El VIH es capaz de atravesar la placenta e infectar al feto, esto puede suceder a partir de la octava semana de gestación, sin embargo, es mucho más frecuente que ocurra en las últimas semanas, concretamente en los últimos 60 días del embarazo Transmisión Perinatal. El recién nacido es capaz de infectarse al final de la gestación y en el parto. El mecanismo de esta infección parece ser a través de las secreciones vaginales o sangre de la madre infectada por vía ascendente, que se favorece muy eficazmente por las contracciones uterinas preparto. Este hecho se ha documentado en el Registro Internacional de Gemelos nacidos de madres infectadas, en el cual el primer gemelo se infecta con una frecuencia tres veces mayor que el segundo, debido a que está más en contacto con las secreciones maternas y realiza el mecanismo de arrastre. Actualmente está confirmado y documentado que la cesárea electiva antes de que se inicie el trabajo del parto, reduce el riesgo de transmisión vertical de la infección por el VIH Transmisión Postnatal. El VIH, al igual que otros virus, es capaz de excretarse a través de la leche materna, pudiendo infectarse por penetración del virus en piel o mucosas del niño a través de soluciones de continuidad, o mediante paso a través de la barrera gastrointestinal. No todos los niños lactantes de madres infectadas se infectan. Se calcula que la tasa de transmisión atribuible a lactancia materna es del 14% y aumenta al 29% si la madre que amamanta a su hijo se ha infectado después del parto. En países desarrollados no se recomienda la lactancia materna a las madres infectadas por el VIH, con lo que prácticamente desaparece esta vía de infección. Por el contrario, en los países en vías de desarrollo la OMS 58

77 aconseja mantener la lactancia materna ya que es mayor el riesgo de morir si el bebé no lacta, que el de adquirir la infección. AP. Kourtis, FK. Lee, EJ. Abrams, DJ. Jamieson, M. Bulterys ; I. Thior, S. Lockman, LM. Smeaton-2006; D. Hawkins, M. Blott, P. Clayden

78 CAPITULO III METODOLOGÍA 3.1 Diseño del estudio Este análisis se realizó por medio de un estudio observacional retrospectivo Transversal Analítico. 3.2 Recolección de datos Los datos de donantes de sangre del Hemocentro de Cruz Roja Ecuatoriana se obtuvieron desde la base del Sistema Informático Institucional, bajo correspondiente autorización. Los datos corresponden a códigos de donación, tipo de donación, fecha de donación, edad, género, ocupación, estado civil. Además se incluyeron los resultados reactivo y no reactivo para el antígeno de superficie de la Hepatitis B, los anticuerpos anti-vih del virus de la inmunodeficiencia humana y anticuerpos anti.vhc de la Hepatitis C, que fueron procesados a través de la técnica serológica clásica de microelisa de tercera generación, individual para cada marcador, y por la técnica de ácidos nucleicos NAT, TaqScreen MPX de primera generación, que no dispone de un marcador enzimático específico que determine la presencia individualizada del genoma viral de HBsAg, VIH y VHC; en pool de seis muestras, ya que el advenimiento de la tecnología de microchips hizo posible inventar aparatos con alto rendimiento al realizar mezclas o pooles de plasmas o sueros de los donante, y aún más, determinar en un mismo tubo de reacción los dos virus ARN que corresponden al VHC y VIH y el ADN de VHB. (Anexo A). 60

79 3.3 Plan de análisis Los porcentajes del número de muestras reactivas para los 3 marcadores estudiados, ya sea por uno u otro método serán calculados en relación al número total de donantes. La reproductibilidad o repetitividad de los resultados a través de las dos pruebas será considerado por medio de dos estimadores: (a) El índice de concordancia de resultados, y (b) el coeficiente de repetitividad Kappa (K). Para estimar la asociación de cada variable estudiada sobre la positividad de las muestras, inicialmente se estratificará al universo de donantes en dos grupos: los reactivos a cualquiera de los 3 marcadores estudiados y aquellos que son no reactivos. Cada variable como sexo, edad, ocupación/profesión, estado civil y tipo de donación, será tabulada para calcular el porcentaje de individuos. Una vez tabulados y calculados los porcentajes, se procederá a aplicar el test estadístico de Chi cuadrado para establecer diferencias significativas entre los grupos reactivos y no reactivos. Alternativamente se puede someter los datos al análisis de regresión logística multivariada para establecer independencia de las asociaciones por cada variable estudiada. Medir la sensibilidad y la especificidad de la técnica NAT en comparación con la técnica serológica clásica y calcular la sensibilidad y la especificidad de la técnica serológica clásica en comparación con la técnica NAT. Tablas de contingencia dos por dos serán construidas para tabular el número de verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos y falsos negativos. Los valores de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y exactitud, serán calculados en base a las fórmulas clásicas descritas a continuación: 61

80 TÉCNICA SEROLOGICA TÉCNICA MOLECULAR NO REACTIVO REACTIVO a c b d Cuadro 4. Tabla de Contingencia Sensibilidad a/ (a + c) Especificidad d/ (b + d) Valor Predictivo Positivo a/(a + b) Valor Predictivo Negativo d/(c + d) Exactitud a + d/ ( a +b +c + d) Para calcular la prevalencia de seropositividad para los marcadores virales para VIH, HBsAg, y VHC, se relacionará el número de reactivos para cada marcador sobre el total de donantes analizados multiplicados por 100, tanto en la técnica serológica clásica como en la técnica molecular. Todos estos análisis serán realizados en el software STATA 9, con un nivel de significancia del 5% 62

81 3.4 Variables Matriz de Variables. Variables Independientes Género Edad Ocupación/Profesión Estado Civil Tipo de Donación Variables Dependientes Resultados y Validación Metología Serológica Clásica Metodología Molecular Cuadro 5. Matriz de variables 63

82 3.4.2 Definición y Operacionalización de Variables VARIABLES A ESTUDIARSE VARIABLE DEFINICIÓN CONCEPTUAL DIMENSIÓN INSTRUMENTO O MÉTODO ESCALA Metodología Serológica Clásica para marcadores virales VIH, VHC,VHB Es un enzimoinmunoanálisis para la detección de anticuerpos frente al virus del VIH I, II y anti VIH grupo O, y del antígeno VIH P24 en suero Inmunológica/ o plasma humano. laboratorial en Es un base a la enzimoinmunoanálisis presencia de cuallitativo para la detección anticuerpos in vitro de anticuerpos frente /antígenos en al virus de la VHC. sangre Es un ensayo cualitativo para la deteccion de antígenos de superficie del virus de la VHB, en suero o plasma humano. El ensayo microelisa, emplea un inmunoabsorbente unido a los pocillos de la microplaca que consta de péptidos sintéticos específicos para los anticuerpo/antígenos que se unen a segmentos del núcleo altamente antigénico. Durante el transcurso del análisis los controles y las muestras se añaden a los pocillos y se incuban, los anticuerpos/antígenos, específicos se unirán si los hubiera al inmunoabsorbente, tras el lavado se añade el conjugado, se incuba, se lava y porteriormente se añade el sustrato, esta reacción enzima/sustrato se termina por la adición de ácido sulfúrico. Se procede a lectura fotométrica. Cualiativa binaria : Reactivo No Reactivo Metodología Molecular para marcadores virales VIH, VHC y VHB (NAT) Edad Estado civil Sexo Ocupación Es una prueba cualitativa in vitro para la detección directa del ARN del VIH I grupo M y O, VIH II y Para la detección del ARN del VHC. Para la detección del ADN del VHB en muestras de plasmas de donantes de sangre Tiempo de existencia desde Temporal el nacimiento Es la condición particular que caracteriza a una persona en lo que hace a Condicional/ sus vínculos personales con Circunstancial individuos de otros sexo o de su mismo sexo. (Según RAE) Conjunto de seres que tienen uno o varios caracteres fenotípicos Empleo, oficio o actividad que se la realiza habitualmente La tecnología de reacción en cadena de la polimerasa es una prueba multiplex cualitativa, que permite el MoleculE/ cribado y la detección simultánea en laboratorial en pool. Utiliza una técnica genérica de base de preparación de ácido nucleico, que amplificación de amplifica más de una frecuencia ácidos diana y se detecta mediante pares nucleicos del múltiples de primers y sondas en un material tubo de reacción. La prueba genético incorpora un control interno para (ARN/ADN) del supervisar el rendimiento en cada virus prueba además de una enzima para reducir la posible contaminación a causa de material anteriormente amplificado. Morfológica Actividad laboral Revisión de base de datos en la Cruz Roja Revisión de base de datos en la Cruz Roja Revisión de base de datos en la Cruz Roja Revisión de base de datos en la Cruz Roja Cualiativa binaria : Reactivo No Reactivo Cuantitativo: años cumplidos hasta el momento de la donación Categórico: Soltero/a Casado/a Divorciado/a Viudo/a Unión libre Categórico: Masculino o Femenino Categórico: Estudiante Empleado privado Empleado público Profesional Ama de casa Militar Tipo de donación Ceder voluntariamente su sangre, algún órgano etc. Con destino a personas que lo necesitan. De acuerdo a la motivación del donante. Revisión de base de datos en la Cruz Roja Categórica: voluntario o por Compensación Cuadro 6. Definición y Operacionalización de Variables 64

83 Los datos serán recolectados en el instrumento creado por las autoras. Ver Anexo A 3.5 Población Y Muestra Este estudio no requerirá de una estimación o cálculo de muestra debido a que será realizado en la totalidad del universo, tamizada por los dos métodos. El estudio se realiza en muestras de donantes de sangre del Hemocentro de la Cruz Roja Ecuatoriana, en la ciudad de Quito, desde enero a diciembre del año A todos los sujetos que acudieron a donar sangre, se les otorgó un folleto informativo y un cuestionario de autoexclusión. El folleto describe los factores de riesgo de las enfermedades de transmisión a través de la sangre, enfatiza la información de las infecciones virales VHB,VHC y VIH y las prácticas sexuales de riesgo, así como de otras enfermedades de transmisión parenteral. El material educativo del folleto fue accesible a todos los niveles culturales de la población para lograr la sensibilización de los potenciales donantes acerca de la importancia de la donación sanguínea y de proporcionar información veraz. Una vez que el folleto es revisado, los potenciales donantes deben contestar un cuestionario que permite la autoexclusión de los sujetos, previamente a realizar la donación, al identificar antecedentes de riesgo de infecciones virales. Los donantes que continuaron el proceso de donación fueron evaluados por un médico que realizó la historia clínica para la identificación de factores de riesgo de las infecciones virales para Hepatitis B, Hepatitis C y Virus de la Inmunodeficiencia Humana con base en la Norma Oficial Nacional. Para validar y comparar los resultados obtenidos del tamizaje serológico realizados mediante la metodología serológica clásica y la metodología molecular. 65

84 3.6 Consideraciones éticas Aprobación del protocolo por el Instituto Superior de Postgrado, autorización del Hemocentro Cruz Roja Ecuatoriana. La confidencialidad de datos se garantiza al identificar al donante con código de donación y no con datos personales. No es necesario consentimiento informado. 3.7 Validez y Confiabilidad Es un instrumento apropiado para ayudar a obtener conclusiones válidas, para otorgarle a los instrumentos y a la información recabada, exactitud y consistencia necesarias para efectuar las generalizaciones de los hallazgos, derivadas del análisis de las variables en estudio. 66

85 CAPITULO IV MARCO ADMINISTRATIVO 4.1 Recursos. RECURSOS CANTIDAD COSTO UNITARIO COSTO TOTAL HUMANOS Investigadores 2 (autores) Director de Tesis 1 Asesor 1 Metodológico TÉCNICOS Internet 300 horas $ 1.00 $ Computador 2 Impresora 1 Movilización 60 $ 4.00 $ (visitas) INSUMOS Papel 3 resmas $ 5.00 $ Copias 500 $ 0.05 $ Memory flash 2 $ $ Ajuste Monetario 2 $ $ UCE Total (USD) $ Cuadro 7. Recursos 67

86 4.2 Cronograma de Actividades Cuadro 8. Cronograma 68

87 CAPITULO V RESULTADOS 5.1 Características generales de la población de estudio Durante el año 2011, donaciones fueron sometidas tanto a la técnica serológica clásica de tercera generación, para la detección de marcadores virales de Hepatitis B por medio de HBsAg, Infección de VIH a través de la detección de anticuerpos anti-vih, e infección de Hepatitis C por la detección de anticuerpos anti-vhc, como a la técnica molecular de ácidos nucleicos (NAT), la cual es una prueba cualitativa in vitro para detección directa y conjunta de los tres marcadores sin diferenciación individual, del ARN del grupo M del virus de inmuno deficiencia humana tipo I, ARN del grupo O del virus de la inmuno deficiencia humana tipo I, ARN del virus de la inmuno deficiencia humana tipo II, ARN del virus de la hepatitis C y el ADN del virus de la hepatitis B, en plasma humano. La técnica NAT, está diseñada como una prueba de cribado para donantes de sangre, donantes de órganos y tejidos. En general los donantes sometidos simultáneamente a estos dos tipos de técnicas, fueron en su mayoría hombres (60%), y la mayor parte de ellos fueron jóvenes menores de 33 años (56%). Alrededor de una cuarta parte tenía formación profesional, otra cuarta parte eran estudiantes y otra cuarta parte de donantes eran empleados privados, la gran mayoría eran casados (85%). Alrededor de los dos tercios de los donantes del año 2011 fueron voluntarios, seguidos de voluntarios repetitivos, mientras que una minoría de los donantes fueron de tipo compensatorio (7%) ya sea de primera vez o repetitivo. Estas características se encuentran detalladas en la tabla N 1. 69

88 CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS DONANTES CATEGORIAS RESULTADOS % GENERO Masculino ,6 Femenino ,4 TOTAL EDAD Edad * media, (rango) 33,7 17,7 18 a ,8 26 a ,5 34 a ,1 42 a ,2 50 a ,4 PROFESIÓN Quehaceres Domésticos Profesional ,6 Estudiante ,4 Empleado Privado ,1 Empleado Público 803 4,2 Obrero ,7 ESTADO CIVIL Casado ,3 Soltero Divorciado 285 1,5 Viudo 55 0,3 Unión Libre 242 1,3 Desconocido 121 0,63 TIPO DE DONACIÓN Voluntario ,3 Compensatorio ,4 Voluntario Repetitivo ,5 Compensatorio Repetitivo 351 1,8 Tabla 1. Características generales de los donantes de sangre del Hemocentro durante el año Se muestran los números totales y porcentajes entre paréntesis. Solamente edad (*) se muestra la media y rango. 70

89 CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS DONANTES Masculino; 59,6 Edad Media (rango); 17,7 18 a 25; 31,8 Femenino; 40,4 Quehaceres Domésticos; 9 34 a 41; 18,1 42 a 49; 13,2 50 a 70; 12,4 26 a 33; 24,5 Profesional; 23,6 1 Empleado Público; 4,2 Obrero; 11,7 Estudiante; 25,4 Empleado Privado; 26,1 Casado; 85,3 Divorciado; 1,5 Viudo; 0,3 Soltero; 11 Unión Libre; 1,3 Desconocido; 0,63 Compensatorio; 5,4 Compensatorio Repetitivo; 1,8 Voluntario Repetitivo; 26,5 Voluntario; 66, Porcentaje Gráfico 10. Características generales de los donantes de sangre del Hemocentro durante el año

90 5.2 Prevalencia de la seropositividad a los marcadores serológicos para Hepatitis B, Virus de la Inmuno Deficiencia Adquirida y Hepatitis C. Un total de 26 muestras de donantes fueron reactivas para el antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (HBsAg) representando una prevalencia de 0.14%, (95% de intervalo de confianza de 0.09% hasta 0.19%). Una cantidad similar de muestras fue reactivo para el virus de Hepatitis C, en total 27 muestras, es decir una prevalencia de seropositividad del 0.14% % (95% de intervalo de confianza de 0.09% hasta 0.19%), mientras que 42 muestras de donantes fueron reactivas para el marcador serológico de infección por el virus de la inmuno deficiencia adquirida VIH, lo que significa una prevalencia de infección de 0.22%, (95% de intervalo de confianza de 0.15% hasta 0.29%). Estos resultados pueden verse en la tabla N 2. SEROPREVALENCIA DE MARCADORES SEROLÓGICOS SEROLOGÍA MARCADOR VIRAL RESULTADOS N DE CASOS % IC 95% HBsAG VIH VHC No reactivo ,9 Reactivo 26 0,14 0,09-0,193 No reactivo ,8 Reactivo 42 0,22 0,154-0,286 No reactivo ,9 Reactivo 27 0,14 0,09-0,193 Tabla 2. Seroprevalencia de los marcadores virales HBsAg, VIH y VHC tamizado por microelisa, en donantes de sangre del Hemocentro durante el año

91 En conjunto, la reactividad de los donantes a cualquiera de los 3 marcadores serológicos estuvo presente en 94 donantes de 19245, que significa un 0.5% de prevalencia. Solamente una muestra fue reactiva para dos marcadores concomitantemente, para el marcador HBsAg y para VIH (0.01%). SEROPREVALENCIA DE MARCADORES SEROLÓGICOS HBsAg 99.9% No reactivo ; % Reactivo; 26 VIH 99.8% No reactivo ; % Reactivo; 42 VCH 99.9% No reactivo ; % Reactivo; 27 Grafico 11 Seroprevalencia de marcadores serológicos de HBsAg, VIH, VCH 73

92 5.3 Análisis univariable entre factores analizados y reactividad de los marcadores serológicos Factores asociados a la reactividad del marcador de Hepatitis B (HBsAg) En cuanto al estado civil, se puede observar que todos los reactivos pertenecen a la variable casados. Así también se observa que el mayor número de reactivos corresponde a la variable donante voluntario repetitivo. No existieron asociaciones significativas entre las variables analizadas (género, ocupación) con la reactividad de HBsAg en el suero de los donantes del año Estas asociaciones pueden verse en la tabla N 3. 74

93 CATEGORIAS HEPATITIS B HBsAg-MARCADORES SEROLOGICOS N N % REACTIVO TOTAL N NO REACTIVO VALOR - P GENERO Masculino , Femenino , ,55 EDAD Edad * media, (rango) 33,7 30,6 0,17(*) 18 a , a , a , a , a , ,42 PROFESIÓN Quehaceres Domésticos , Profesional , Estudiante , Empleado Privado , Empleado Público Obrero , ,38 ESTADO CIVIL Casado , Soltero Divorciado Viudo Unión Libre Desconocido ,48 TIPO DE DONACIÓN Voluntario , Compensatorio , Voluntario Repetitivo , Compensatorio Repetitivo ,52 TIPO DE DONACIÓN II Voluntario , Compensatorio , ,51 Tabla 3. Asociaciones entre las variables recolectadas y la reactividad al HBsAg- Marcadores serológicos. El valor p es calculado para la prueba de Chi cuadrado en todas las asociaciones excepto para edad en donde para T-test. 75

94 El factor edad presenta un mayor porcentaje de reactividad 0.2% en el grupo de donantes comprendidos entre los 18 a 25 años, sin embargo el valor p< 0.42 no tiene significancia estadística. Factor edad y reactividad a marcadores serológicos de HBsAg ,2 0,13 0,14 0,08 0,04 Valor P< 0.42 Grafico 12. Seroprevalencia del factor edad asociado a la reactividad HBsAg- Marcador serológico Factores asociados a la reactividad del marcador de VIH: Cuando el tipo de donación fue analizado en 4 categorías no se evidencio una asociación entre tipo de donación y reactividad al VIH, sin embargo cuando el tipo de donación fue analizado categorizando únicamente aquellos donantes compensatorios (ya sea primera vez o repetitivos) en comparación con los donantes voluntarios (ya sea primera vez o repetitivos) tuvieron una prevalencia mayor aunque no significativa estadísticamente, (Valor p<0.08). A pesar de las diferencias encontradas, no se encontraron asociaciones significativas entre género, ocupación y estado civil con la reactividad de VIH en el suero de los donantes del año Estas asociaciones pueden verse en la tabla N 4. 76