Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus bajo condiciones

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN Determinación de la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus bajo condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro. PARA OBTENER TESIS EL GRADO DE: DOCTORA EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS. PRESENTA: M. EN C. KARINA CRUZ PACHECO. DIRECTOR DE TESIS: DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO. DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS. UPIBI-IPN México, D.F., a 20 de julio 1 de 2010.

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4 Me siento satisfecho con el misterio y eternidad de la vida, con el conocimiento de una ínfima parte de la maravillosa estructura del mundo real y con la devota lucha por comprender una fracción, aunque sea mínima, de la Razón que se manifiesta en la naturaleza. Las leyes de la naturaleza manifiestan la existencia de un espíritu superior al hombre, ante el cual, con nuestros modestos poderes debemos ser humildes. Ciencia sin religión es sinónimo de invalidez; religión sin ciencia es ceguera. A. Einstein 4

5 Agradecimientos Este trabajo de investigación se realizó gracias al apoyo financiero del Programa de Formación de Investigadores (PIFI) SIP , , y del Instituto Politécnico Nacional. Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Bioconversiones de la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI) del Instituto Politécnico Nacional. 5

6 A mis padres, Ma.Teresa y J. Guadalupe, y a mi hermano Omar Gracias a mis padres por su ejemplo, paciencia y cariño que siempre me han brindado. Gracias a mi familia porque siempre ha estado conmigo. A mi director de tesis, Dr. Enrique Durán Páramo Gracias por haber dirigido este trabajo de investigación. Gracias por todo el apoyo que me has brindado, por la comprensión y todos tus consejos, los cuales me ayudaron a saltar obstáculos y llegar al final de esta etapa tan importante para mí. Gracias por brindarme tu confianza y amistad!!. A la comisión revisora de este trabajo: Dra. Ma. del Carmen Oliver Salvador, Dr. Gustavo Valencia del Toro, Dr. Jorge Yáñez Fernández y Dr. Ramón Villanueva Arce Gracias a todos por su apoyo, por el tiempo dedicado la revisión de este trabajo, así como todas sus contribuciones para enriquecerlo. 6

7 A mis amigas Verónica Chávez Infante, Mariana Ramírez Mandujano y la maestra Madga, por todo el apoyo y ayuda que me brindaron. A mis tíos Ali, Amador, Socorro yenrique por su apoyo y confianza y en especial a Raúl Miranda por tus lecciones de filosofía que no se olvidan y por ser mi amigo Gracias!. Al Dr. Miguel A. Aguilar Frutis del Lab. de Pruebas Físicas del CICATA- IPN, gracias por su apoyo para la realización de algunos experimentos. A mi gran amigo Cesar Estrada Casillas, porque has estado presente sin importar la distancia y en los momentos difíciles siempre has tenido las palabras para ayudarme a seguir adelante. Gracias por enseñarme que el título más importante es la humildad. A los Dres. Efrén Parada Arias, José Gpe. Trujillo Ferrara y Heberto Balmori Ramírez, Gracias por formar parte de esta etapa de mi vida, y por todas sus enseñanzas!! A mis amigos que formaron parte importante en esta etapa: Ma. del Carmen Cruz, Pilar Bremauntz, Leticia Aguilar, Ymazool Meza, Isabel Torres, Yanik Astudillo, Erika Peralta, Ana María, Mariana, C. Mercela, Carlos Tellez, Gil Santomé, Itzamá Y., Oscar M., Héctor Jiménez y Miguel Espartaco. 7

8 INDICE GENERAL ÍNDICE DE CAPÍTULOS... i ÍNDICE DE CUADROS... v ÍNDICE DE FIGURAS... vii PÁGINA INDICE DE CAPÍTULOS RESUMEN... 1 SUMMARY... 2 I. INTRODUCCIÓN... 3 II. ANTECEDENTES Bacterias ácido lácticas (BAL) Propiedades fisiológicas y hábitat de las BAL BAL aplicadas en productos comerciales El yogurt, su valor nutrimental y su importancia en la salud Efecto de los probióticos en el organismo humano Prebióticos Aparato digestivo humano y BAL probióticas Estómago e intestino delgado humano Colon humano El intestino humano, la microflora y la adhesión de bacterias probióticas La microflora intestinal Proliferación de las bacterias en el intestino humano La colonización de bacterias en el intestino humano Función de la microflora en los mecanismos de defensa del organismo humano i

9 Importancia de la barrera mucosa en las defensas del organismo humano Inmovilización celular Atrapamiento celular Soportes utilizados en la inmovilización por atrapamiento Simulación gastrointestinal in vitro y estudios de viabilidad bacteriana III. JUSTIFICACIÓN IV. OBJETIVOS Objetivo general Objetivos específicos V. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales Formulaciones del medio MRS y del buffer BPS Cepa Cultivo Técnica de inmovilización celular por atrapamiento Determinación de viabilidad celular por conteo en placa Sistema de simulación gastrointestinal in vitro Pruebas de estabilidad del soporte de inmovilización (libre de células), en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro Cinéticas de pérdida de viabilidad bacteriana (modificado de Mainville, 2005; Ganong, 2002 y De Boever et al., 2000) Determinación de viscosidad Técnica de adhesión de células de Lactobacillus delbrueckii en mucosa de intestino delgado de rata Análisis estadístico VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Desarrollo del sistema de simulación gastrointestinal in vitro Pruebas del soporte de inmovilización en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro PÁGINA ii

10 Evaluación cualitativa de las esferas de alginato de calcio tratadas en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro Pérdida de volumen (desgaste) de las esferas de alginato de calcio y de las cápsulas contenidas en la bebida láctea fermentada Yoplus (yogur comercial), tratadas en condiciones gastrointestinales in vitro Pérdida de volumen (desgaste) de las esferas de alginato de calcio tratadas en condiciones gástricas, e intestinales (intestino delgado y grueso) in vitro Fuerza de deformación de las esferas de alginato tratadas en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro Selección de las muestras de alimento y bebidas, para evaluar su efecto sobre la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii Viscosidad de las muestras de alimento Células de Lactobacillus delbriueckii inmovilizadas en esferas de alginato de calcio Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de muestras de alimento y bebidas Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de leche con almidón al 8% Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de muestra de comida típica mexicana Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y presencia de muestra de café negro 1% PÁGINA iii

11 Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y presencia de muestra de cerveza con alcohol 4.5% Adhesión de células de Lactobacillus delbrueckii en la mucosa de intestino delgado de rata Células libres de Lactobacillus delbrueckii adheridas en la mucosa de intestino delgado de rata Células de Lactobacillus delbrueckii liberadas de las esferas de alginato de calcio y adheridas en la mucosa de intestino delgado de rata 77 VII. CONCLUSIONES VIII. PERSPECTIVAS IX. PRODUCTOS DE INVESTIGACIÓN X. REFERENCIAS XI. ANEXO (ARTÍCULO CIENTÍFICO) iv

12 ÍNDICE DE CUADROS 1. Cepas de Lactobacillus usadas en yogurt o alimentos tipo yogurt Microorganismos considerados como probióticos Efecto benéfico de bacterias y levaduras probióticas Compuestos prebióticos y simbióticos Medio MRS líquido Buffer BPS Evaluación cualitativa de la dureza de las esferas de alginato de calcio después del tratamiento en condiciones gastrointestinales in vitro Fuerza de deformación de las esferas de alginato de calcio, tratadas con jugos gástricos e intestinales in vitro, almacenadas en solución de cloruro de calcio 0.3 M y en solución salina 0.9% a 8ºC Viscosidad de la solución de almidón, leche con almidón y comida típica a 100 rpm y 23ºC Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres tratadas en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro y en presencia de muestras de alimento y bebidas Velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres bajo condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de alimento y bebidas Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de leche con almidón Velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas, tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de leche con almidón PÁGINA v

13 PÁGINA 14. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de comida típica Velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de comida típica Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de café negro 1% Velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de café negro 1% Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de cerveza con alcohol 4.5% Disminución de células libres de Lactobacillus delbrueckii durante la cinética de adhesión en la mucosa de intestino delgado de rata Células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de calcio y células liberadas del alginato de calcio al medio MRS con intestino delgado de rata vi

14 ÍNDICE DE FIGURAS PÁGINA 1. Intestino delgado y grueso humano Esquema de las capas de tejido del intestino humano Esquema de las defensas del intestino humano. Fuente: Bourlioux et al., Estructuras simplificadas de glicoconjugados. GlcNAc, N- acetilglucosamina; NeuNAc, ácido N-acetilneuraminico. Fuente: Bourlioux et al., Estructura del alginato de sodio. Fuente: Nussinovitch, Modelo de egg-box de la formación del gel de alginato. Fuente: Nussinovitch, a) Colonias de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crecidas en agar MRS. b) Tinción Gram de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Cultivos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en incubación Equipo para inmovilizar por atrapamiento Esquema de la técnica de determinación de viabilidad por conteo en placa Esquema del sistema de simulación gastrointestinal humano in vitro Diagrama de bloques de las etapas del estómago e intestino delgado humano simuladas in vitro Disección de rata hembra, cepa Wistar Corte longitudinal del intestino delgado de rata Intestino delgado de rata colocado en caja Petri con buffer BPS Cultivo de células de Lactobacillus delbrueckii en intestino delgado de rata a) Biorreactor de vidrio con tapa desmontable y seguros tipo brida de acero inoxidable. b) Tapa desmontable del biorreactor vii

15 PÁGINA 18. a) Baño con control de temperatura; b) Parrilla de agitación magnética; c) Potenciómetro c/electrodo de ph Sistema de simulación gastrointestinal in vitro Pérdida de volumen de las esferas de alginato de calcio en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro Estabilidad de las cápsulas de gel del producto comercial Yoplus en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro Pérdida de volumen de las esferas de alginato de calcio en condiciones gástricas y de intestino delgado y grueso simuladas in vitro Consumo de yogurt en la población estudiantil de la UPIBI Imágenes de esferas de alginato de calcio sin tratamiento, tomadas con microscopio estereoscopico a)sección de esfera de alginato de calcio. b) y c) Lactobacillus delbrueckii inmerso en el alginato de calcio Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de muestras de alimento y bebidas Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de leche con almidón Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de comida típica Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de café negro 1% viii

16 PÁGINA 30. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de cerveza con alcohol 4.5% Disminución de células libres de Lactobacillus delbrueckii durante la cinética de adhesión en la mucosa de intestino delgado de rata a) Sección de intestino delgado de rata con células de Lactobacillus delbrueckii adheridas en la mucosa. b) Colonias de Lactobacillus delbrueckii recuperadas de la mucosa de rata y crecidas en agar MRS. c) Células de Lactobacillus delbrueckii adheridas a la mucosa intestinal de rata Células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas y liberadas al medio MRS Colonias de Lactobacillus delbrueckii recuperadas de la mucosa de rata y crecidas en agar MRS ix

17 RESUMEN Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es una bacteria ácido láctica probiótica utilizada en la elaboración de productos lácteos como el yogurt. El ph ácido en el estómago y la bilis hepática en el duodeno humano, son factores del sistema digestivo humano que resultan agresivos para la viabilidad de las bacterias probióticas. Con el propósito de evaluar el efecto de las condiciones gastrointestinales sobre la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii, se diseñó un sistema de simulación gastrointestinal in vitro, el cual consistió de dos reactores en donde se simularon las condiciones del estómago (jugo gástrico simulado a ph 2) e intestino delgado humano (jugo pancreático simulado y bilis a ph 6.8). Con la finalidad de proteger a las células de Lactobacillus delbrueckii de las condiciones gastrointestinales simuladas in vitro y mantener su viabilidad, se utilizó la técnica de inmovilización celular por atrapamiento en alginato de sodio al 2%. Además, se evaluó el efecto de algunas muestras de alimento y bebidas sobre la viabilidad bacteriana. Las células inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii tratadas en condiciones gastrointestinales in vitro con adición de una muestra de leche de vaca con almidón al 8%, mantuvieron su viabilidad 24 veces más que las células libres. Las células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii tratadas en condiciones gastrointestinales in vitro con adición de una muestra de comida típica mexicana no presentaron diferencias significativas de viabilidad (p>0.05). La viabilidad de las células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii tratadas en condiciones gastrointestinales in vitro, con adición de una muestra de café negro 1% no presentó diferencia estadística significativa (p>0.05). La adición de una muestra de cerveza contenido alcohol al 4.5%, ocasionó la pérdida total de las células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii tratadas en condiciones gástricas in vitro. De acuerdo con los resultados obtenidos, la adición de una muestra de comida típica mexicana contribuyó en el mantenimiento de la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii, por el contrario una muestra de bebida con alcohol 4.5% ocasionó la pérdida de viabilidad bacteriana. En este trabajo se desarrollo una técnica para determinar la adhesión de células de Lactobacillus delbrueckii en mucosa de intestino de rata, lográndose la adhesión de células libres y células liberadas del soporte de inmovilización en la mucosa. Se demostró que las células liberadas del soporte conservaron su capacidad de adhesión a la mucosa y por ende podrían realizar su efecto probiótico. 1

18 SUMMARY Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus is a probiotic acid lactic bacterium used in the production of functional foods like the yogurt. However, the human gastrointestinal tract has some aggressive conditions such as the acid medium in the stomach and the bile in the duodenum, that can affect the Lactobacillus delbrueckii s viability. An in vitro gastrointestinal system was designed to evaluate the bacterial viability under in vitro gastrointestinal conditions. The human stomach conditions (gastric juice, ph 2) and small intestine conditions (pancreatic juice, ph 6.8) were simulated using two biorreactors. In order to protect the Lactobacillus delbrueckii cells from the simulated gastrointestinal juices a cellular immobilization technique by entrapment in 2% sodium alginate solution was applied. In addition, the effect of meal and beverage samples on the viability of this bacterium was evaluated. Immobilized Lactobacillus delbrueckii cells in sodium alginate preserved their viability 24 times more than free cells, both treated in gastrointestinal conditions in vitro with a cow milk with 8% starch. Free and immobilized Lactobacillus delbrueckii cells treated in gastrointestinal conditions in vitro with a Mexican typical food sample did not display significant differences of viability (p>0.05). Immobilized and free Lactobacillus delbrueckii cells lost their viability during the treatment in gastric conditions in vitro with beer. Free and immobilized Lactobacillus delbrueckii cells treated in gastrointestinal conditions in vitro with a 1% black coffee sample did not display significant differences of viability (p>0.05). The results showed that the Lactobacillus delbrueckii s viability was significantly preserved when a meal sample was added into the system, on the other hand, the addition of an alcoholic beverage sample provoked the loss of viability. Finally, an adhesion technique was developed to determine the level of Lactobacillus delbrueckii cells adhesion in mucus (of rat small intestine). Free cells and released cells from immobilization support got adhered at the mucus. It was demonstrated that released cells from support remained their adhesion capacity at mucus and they could exert their probiotic effect. 2

19 I. INTRODUCCIÓN Las bacterias probióticas son de gran importancia para el hombre debido a su efecto benéfico en la salud humana, el cual se relaciona con la disminución de la intolerancia a la lactosa (Isolauri, 2004) y la estimulación del sistema inmune (Aattouri et al., 2001) por citar dos ejemplos. Los géneros más representativos de bacterias lácticas probióticas son los lactobacilos y las bifidobacterias, estas ejercen su efecto protector o terapéutico mediante la secreción de compuestos antimicrobianos como lactocinas, helveticinas, lactacinas, nisina, bifidocinas, por mencionar algunos (Dodd y Gasson, 1994; Gibson, 1999; Gibson y Wang, 1994; Isolauri, 2004) y la competencia por los sitios que ocupan los patógenos en el intestino (Gibson, 1999; Isolauri, 2004; Kailasapathy y Chin, 2000), además se ha encontrado que participan en el metabolismo del colesterol (Isolauri, 2004). Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es una bacteria láctica probiótica de gran importancia para la industria de lácteos, ya que interviene en el proceso de elaboración del yogurt, además de proporcionarle ciertas propiedades organolépticas (sabor y aroma). Las bacterias lácticas probióticas, se han adicionado en algunos productos lácteos (yogur y bebidas fermentadas) con la finalidad de contribuir en el tratamiento de problemas gastrointestinales humanos. Sin embargo, hay estudios que demuestran que estos microorganismos pueden perder su viabilidad antes de llegar a su sitio de acción, el colon humano. Tal pérdida de viabilidad puede ocurrir durante la etapa de almacenamiento del producto (Nighswonger et al., 1996; Kailasapathy y Rybka, 1997; Ouwehand y Salminen, 1998) e incluso durante su paso por el tracto gastrointestinal humano. Factores como el jugo gástrico y la bilis hepática presentes en el estómago y duodeno humano respectivamente, pueden ocasionar la pérdida de viabilidad de estas bacterias, autores como Pochart et al., (1992), mencionan que durante su tránsito por el intestino delgado, las bacterias lácticas pueden perder su viabilidad debido al movimiento peristáltico presente en este sitio. Como una manera de proteger a las bacterias lácticas del efecto nocivo de la bilis hepática y del ph muy ácido debido a la presencia de jugo gástrico en el estómago humano, puede aplicarse la técnica de inmovilización celular por atrapamiento (Cruz, 2007). De esta manera, las bacterias lácticas contenidas en una matriz de soporte orgánico como alginato de sodio, al ser tratadas bajo condiciones gastrointestinales simuladas in vitro pueden resistir de manera más exitosa el efecto nocivo de la bilis y del 3

20 ácido clorhídrico, lo que puede verse reflejado en un incremento de la viabilidad bacteriana. Dada la importancia de las bacterias lácticas probióticas para el organismo humano y el efecto de las variadas condiciones fisicoquímicas que presenta el tracto gastrointestinal humano sobre la viabilidad de las bacterias lácticas probióticas, en este proyecto se evaluó la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libre e inmovilizado en alginato de sodio tratado bajo condiciones gastrointestinales simuladas in vitro. Para tal fin, se diseñó un sistema de simulación gastrointestinal in vitro. Además, se evaluó el efecto de la presencia de algunas muestras de alimento similar al que consume la población mexicana, sobre la viabilidad de las células libres e inmovilizadas. 4

21 II. ANTECEDENTES 2.1. Bacterias ácido lácticas (BAL) En 1892, Döderlein propusó la existencia de una asociación benéfica de microorganismos (bacterias lácticas) alojados en el organismo humano específicamente en la vagina, los cuales podían prevenir o inhibir el crecimiento de bacterias patógenas por medio del ácido láctico que producían a partir de azúcares. Más tarde en 1989, Fuller llamo probióticos a los suplementos alimenticios microbianos vivos que afectan benéficamente al huésped mejorando su balance microbiano intestinal. En 1908, Élie Metchnikoff mencionó que la longevidad de la población caucásica se debía al consumo frecuente de leches fermentadas. Además, propusó que los microorganismos productores de ácido en los productos lácteos fermentados eran capaces de prevenir enfermedades del intestino grueso y con ello prolongar la vida del consumidor, por tales motivos es considerado el padre de los probióticos. El término probiótico significa para vivir, es una palabra de origen griego. En 1965, Lilly y Stillwell fueron los primeros en utilizar este concepto, definieron a los probióticos como sustancias secretadas por un microorganismo el cual estímula el crecimiento de otro, es decir,...microorganismos que promueven el crecimiento de otros microorganismos. Parker en 1974, fue el primero en utilizar el concepto de probiótico como hoy se conoce y los define así: organismos o sustancias que contribuyen en el balance microbiano intestinal. Más tarde en 1989, Fuller hace una modificación al concepto de probióticos de Parker y define a los probióticos como un suplemento alimenticio microbiano que afecta benéficamente al huésped mejorando su balance microbiano intestinal. En esta definición introduce el requerimiento de viabilidad y el efecto benéfico en el huésped. En 1992, Havenaar y Huis in t Veld ampliaron la definición de probióticos introduciendo el hábitat especificando el huésped, por lo que los probióticos son definidos como: un cultivo o mezcla de cultivos de microorganismos que aplicados en animales o humanos, lo afectan benéficamente mejorando su flora nativa. Salminen y Schaafsma en 1996, hicieron algunas adaptaciones al término probióticos, sin embargo se han hecho algunas revisiones al respecto ya que no quedaron bien definidos términos como la nutrición del huésped, introducido por Salminen. De acuerdo con las revisiones hechas por Schrezenmeir y Vrese en 2001, la definición más completa de probióticos es aquella que los define como una preparación o un producto conteniendo microorganismo definidos y viables en número suficiente, los cuales 5

22 alteran la microflora (por implantación o colonización) en un compartimiento del huésped y ejercen efectos benéficos en el huésped, dada por Havenaar y Huis In t Veld en Propiedades fisiológicas y hábitat de las BAL Las bacterias lácticas son gram positivas, no esporulan y reaccionan negativamente a la prueba de la catalasa. No tienen citocromos y viven en ambientes anaeróbicos aunque algunas de ellas pueden crecer en presencia de oxígeno, son ácido-tolerantes esto les permite eliminar la competencia de la mayoría de las otras bacterias en ambientes que son ricos en nutrientes, y seguir creciendo durante las fermentaciones lácticas naturales con valores de ph inferiores a 5, son estrictamente fermentativos (Stanier, 1996; Holzapfel et al., 2001) Orla-Jensen en 1919, subdividió las bacterias lácticas en los géneros Betabacterium, Thermobacterium, Streptobacterium, Streptococcus, Betacoccus, Tetracoccus y Microbacterium. Actualmente, todos los microorganismos probióticos utilizados en alimentos probióticos o suplementos alimenticios pertenecen a los géneros Lactobacillus, Enterococcus o Bifidobacterium. Con excepción de Streptococcus thermophillus, el género Streptococcus esta formado por microorganismos patógenos. El hábitat de estas bacterias se encuentra en ambientes ricos en nutrientes como los alimentos, también pueden encontrarse en la tierra, agua, abono, agua residual y ensilaje. Particularmente, las bacterias lácticas habitan la cavidad oral, el tracto intestinal y la vagina y pueden tener efectos benéficos en estos ambientes (Holzapfel et al., 2001). Las bacterias lácticas presentan requerimientos nutricionales complejos, necesitan vitaminas del grupo B, así como un número considerable de aminoácidos, bases púricas y pirimidínicas. Las bacterias lácticas emplean azúcares como la glucosa y la lactosa para producir ácido láctico mediante fermentación. Los géneros más representativos de las bacterias lácticas son Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium y Leuconostoc. 6

23 BAL aplicadas en productos comerciales En la elaboración de productos lácteos fermentados se utilizan lactobacilos principalmente (Cuadro 1); sin embargo, se han encontrado cepas de enterococos, pediococos y leuconostoc en el queso (Cogan et al., 2007). Beresford y Williams (2004), identificaron en más de 50 variedades de queso lactobacilos homofermentativos facultativos (LHF) como L. casei, L. plantarum, L. curvatus y en menor grado lactobacilos heterofermentativos como L. brevis. Este tipo de bacterias requieren de aminoácidos para su crecimiento, por lo cual para poder crecer en leche es indispensable que puedan hidrolizar la caseína. La importancia industrial de las BAL radica en que contribuyen en una gran variedad de reacciones bioquímicas que proporcionan las características organolépticas de los productos lácteos como quesos, leches ácidas y yogures. Por ejemplo, son responsables de convertir el L-lactato a D-lactato durante la maduración del queso, teniendo como resultado la precipitación del Ca D-lactato en concentraciones elevadas de D-lactato. El succinato es un potenciador de sabor del queso Emmental y se encuentra en concentración de 0.8 a 1.4 mg/g. Lactobacillus y pediococcus son capaces de producir acetato y CO 2 de lactato en presencia de O 2 durante la maduración del queso Cheddar (Cogan et al., 2007). En quesos tradicionales del Mediterráneo se han identificado Enterococcus faecalis, E. faecium y E. casseliflavus (aproximadamente 10 7 UFC/g), los cuales tienen gran influencia en el sabor y aroma (Franz et al., 1999). Los productos lácteos fermentados como el yogurt conteniendo bacterias lácticas han sido comercializados desde 1970 en Estados Unidos. La primera generación de estos productos fue elaborada con concentrados de Lactobacillus acidophilus, posteriormente, fueron adicionadas bifidobacterias. El éxito de estos productos radica en su efecto benéfico en la salud del consumidor, el cual se atribuye a las bacterias probióticas que contienen (Sanders et al., 1996). Es importante que las bacterias lácticas probióticas utilizadas en la elaboración de los productos lácteos fermentados no tengan efectos adversos en el sabor y aroma del producto final, deben de sobrevivir en número suficiente y se bebe garantizar su estabilidad física y genética durante el almacenamiento del producto. Como se mencionó anteriormente, Lactobacillus acidophilus es utilizado para elaborar leche ácida y dulce. En la elaboración del yogurt clásico se utilizan Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, sin embargo, el yogurt también puede ser elaborado empleando algunas especies de lactobacilos como Lactobacillus acidophilus. Otro producto lácteo fermentado de gran importancia es el kefir, el cual es elaborado con 7

24 especies de bacterias lácticas aisladas de la flora nativa como Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei y Lactobacillus reuteri (Heller, 2001). En países como Brasil se elaboran las bebidas lácticas fermentadas, son productos lácteos preparados con una mezcla de yogurt, suero de leche, pulpa o jugo de fruta y algunos otros aditivos (Penna et al., 2001) sin embargo, el proceso aún no está bien caracterizado. Cuadro 1. Cepas de Lactobacillus usadas en yogurt o alimentos tipo yogurt. Cepa probiótica 1 Tipo de producto Identificación de especie 2 L. acidophilus LA-1 Yogurt L. johnsonii L. acidophilus LA-7 Yogurt L. acidophilus L. acidophilus L1 Yogurt para beber L. crispatus L. acidophilus LA-H3 Yogurt dietético L. acidophilus L. acidophilus Yogurt L. crispatus L. acidophilus Yogurt L. acidophilus L. casei Actimel Yogurt para beber L. paracasei L. casei Shirota Bebida probiótica L. paracasei L. casei GG Yogurt para beber L. rhamnosus L. casei LC-H2 Yogurt dietético L. casei L. casei Yogurt L. paracasei L. casei Yogurt L. paracasei Fuente: Holzapfel et al., cepa indicada por el industrial. 2 cepa identificada por análisis de su DNA El yogurt, su valor nutrimental y su importancia en la salud El yogurt es uno de los alimentos más conocidos que contienen probióticos, de acuerdo con el Codex Alimentarius el yogur es un producto lácteo coagulado resultante de la fermentación de la leche, llevada a cabo por las bacterias Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Bourlioux y Pochart, 1988). Recientemente, L. acidophilus, L. casei, L. crispatus, L. rhamnosus, L. gasseri, L. reuteri, L. johnsonii, Bifidobacterium spp., B. bifidum, B. longum y B. infantis han sido adicionadas al yogurt. Con la finalidad de incrementar el número de BAL que sobreviven al bajo ph del estómago humano, algunas han sido aisladas de la flora intestinal para utilizarlas en la producción de yogurt. Es requisito indispensable que al término de su elaboración el 8

25 producto tenga una concentración de BAL >10 8 UFC/mL (Chandan y Shahani, 1993; Oliveira, 2002) y deben permanecer viables al término de la fecha de caducidad. La composición nutrimental del yogurt esta basada en la leche a partir de la cual se elaboró y ésta a su vez depende de varios factores: genética de los mamíferos, alimentación, etapa de lactación, edad y factores ambientales como las estaciones del año. Posteriormente, algunas condiciones del tratamiento de la leche que pueden afectar el valor nutrimental del yogurt son: la temperatura, la presión y las condiciones de almacenamiento. Una característica distintiva y final de las propiedades organolépticas del yogurt es debida a los cambios que ocurren durante la fermentación realizada por las BAL utilizadas (Adolfsson et al., 2004). En general los productos lácteos han sido considerados una excelente fuente de proteínas de alta calidad, calcio, potasio, fósforo, magnesio, zinc y vitaminas como riboflavina, niacina, B6 y B12 (Buttriss, 1997). Durante el proceso de elaboración del yogurt, ocurre una gran pérdida de vitaminas más que de minerales, esto se debe principalmente a que éstas son muy sensibles a factores como la pasteurización, la ultrafiltración, agitación y las condiciones de oxidación. Las BAL pueden influir en el contenido de vitaminas del yogur, ya que requieren vitaminas del grupo B como la B12 (Reddy et al., 1976; Shahani y Chandan, 1979) para su crecimiento, pero algunas cepas son capaces de sintetizar esta vitamina (Kneifel y Mayer, 1991). La lactosa es el disacárido más importante que se encuentra en los productos lácteos, antes de su absorción en el intestino es hidrolizada por la enzima -galactosidasa (lactasa) en glucosa y galactosa, estos monosacáridos son absorbidos y utilizados como fuente de energía. El contenido de lactosa en el yogurt antes de la fermentación es aproximadamente 6% (Chandan y Shahani, 1993), Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus son capaces de hidrolizar del 20 al 30% del contenido de lactosa (Bourlioux y Pochart, 1988) posteriormente, una parte es absorbida en forma de glucosa y galactosa y el resto de la glucosa se convierte en ácido láctico. El producto final tiene un bajo contenido de lactosa, lo cual explica porque este tipo de alimento es tolerado por personas que padecen intolerancia a la lactosa. El yogurt tiene un contenido de proteína alto comparado con la leche, debido a la adición de leche descremada y la concentración del producto al final del proceso. Algunos autores (Rasic y Kurmann, 1978; Shahani y Chandan, 1979) mencionan que la proteína del yogurt es digerida más fácilmente respecto a la proteína de la leche porque esta predigerida por las bacterias. Esto lo confirma la evidencia de un alto contenido de aminoácidos libres 9

26 principalmente prolina y glicina en el yogurt. Por otra parte, la actividad de enzimas proteasas y peptidasas es preservada durante el tiempo de vida del producto, lo que implica que durante el tiempo de almacenamiento en refrigeración continúan incrementando la concentración de aminoácidos en el producto. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus durante la fermentación de la leche y almacenamiento del yogurt en refrigeración conserva su actividad proteolítica en comparación con S. thermophillus (Beshkova et al., 1998). Las proteínas del suero y caseínas presentes en el yogurt son de alta calidad biológica, además son ricas en aminoácidos esenciales (Gaudichon et al., 1994). El yogurt tiene una alta concentración de ácido linoleico conjugado, Whigham et al., (2000), reportaron que este ácido tiene propiedades inmunoestimulatorias y anticarcinogénicas. El yogurt es una fuente de calcio y fósforo, debido a que su ph es más bajo que el de la leche, los minerales calcio y magnesio están disponibles en sus formas iónicas, lo cual facilita la absorción de los iones en el intestino (Bronner y Pansu, 1999). Schaafsma et al., (1998) y Kaup et al., (1987), investigaron el efecto de los productos lácteos en la absorción mineral en ratones, reportaron que la lactosa mejora la absorción de calcio, magnesio y zinc y que los ratones alimentados con yogurt mostraron mayor mineralización en huesos en comparación con ratones alimentados con una dieta que contenía solamente carbonato de calcio Efecto de los probióticos en el organismo humano La incidencia de enfermedades en la población que habita en las grandes ciudades ha ido en aumento, debido a factores como el ritmo de vida acelerado, el estrés, una dieta desequilibrada, la administración frecuente de antibióticos o la presencia de agentes infecciosos tales como E. coli, Salmonella enteritidis y virus (Silva et al., 1999); entre las enfermedades más comunes destacan las infecciones del tracto gastrointestinal, el estreñimiento, síndrome de colon irritable, colitis, alergias causadas por alimentos, diarrea ocasionada por ciertos antibióticos, enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer como el de colon. Estos desordenes se han tratado de remediar suministrando antibióticos, incluso se han empleado agentes vivos denominados bioterapéuticos como la levadura Saccharomyces sp. y bacterias probióticas como Lactobacillus sp. (Oyetayo et al., 2003). Actualmente, se sabe que los principales microorganismos que tienen efecto probiótico son los lactobacilos y las bifidobacterias, además, se han incluido especies que 10

27 pertenecen a los géneros Lactococcus, Enterococcus, Saccharomyces (Salminen and von Wright, 1998; Dunne et al., 1999), Propionibacterium (Grant and Salminen, 1998) y Streptococcus thermophillus (Naidu et al., 1999; Sreekumar and Hosono, 2000) (Cuadro 2). Cuadro 2. Microorganismos considerados como probióticos. Especie Lactobacillus Especie Bifidobacterium Otras bacterias ácido lácticas No son bacterias ácido lácticas L. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecalis Bacillus cereus var. toyoi 1,2 L. amylovorus B. animalis Enterococcus faecium Escherichia coli strain nissle L. casei B. bifidum Lactococcus lactis 3 Propionibacterium freudenreichii 1,2 L. crispatus B. breve Leuconstoc mesenteroides Saccharomyces cerevisiae 2 L. gallinarum 1 B. infantis Pediococcus acidilactici 3 L. gasseri B. longum Sporolactobacillus inulinus 1 L. johnsonii L. paracasei L. plantarum B. lactis 4 Streptococcus thermophilus 3 L. reuteri B. thermophilum Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Lactococcus lactis subsp. Cremoris L. rhamnosus L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3 Saccharomyces boulardii 2 L. brevis L. cellobiosus L. curvatus L. casei subsp. rhamosus L. helveticus L. paracasei subsp. paracasei L. fermentum 1 Aplicados en animales. Fuente: modificado de Holzapfel et al., Aplicados principalmente en preparaciones farmacéuticas. 3 Se conoce poco acerca de sus propiedades probióticas o el microorganismo es no probiótico. 4 Probablemente es sinónimo con B. animalis. La viabilidad de los probióticos puede ser considerada como una medida de su actividad probiótica, sin embargo, hay eventos en los cuales la viabilidad celular no se requiere para 11

28 llevar a cabo algunas funciones de actividad probiótica, tales como mejorar la digestión de la lactosa, modular el sistema inmune y cierto efecto contra hipertensión. En este sentido, los efectos positivos de las BAL probióticas en la salud humana han sido ligados a células no viables o componentes celulares, productos de actividad enzimática o fermentación (Sanders and in t Veld, 1999). Para que un microorganismo sea considerado probiótico debe cumplir ciertas características como las siguientes (Sanders y Klaenhammer, 2001; Colum et al., 2001): Ser de origen humano, Ejercer su efecto benéfico en el huésped, No ser patógeno, No ser tóxico, Sobrevivir y metabolizar en el intestino humano, Permanecer viable durante el almacenamiento en refrigeración, Proporcionar propiedades sensoriales a los productos fermentados, Tener capacidad de adherirse en el epitelio intestinal, y Producir sustancias antimicrobianas. Algunos de los efectos benéficos de los probióticos en el organismo humano son: Reducir la severidad y duración de diarrea (Saavedra et al., 1994; Ribeiro y Vanderhoof, 1998; Vanderhoof, 2001.), Reducir la intolerancia a la lactosa (Isolauri, 2004; Jiang et al., 1996), Disminuir la concentración de colesterol en sangre (Isolauri, 2004), Proteger contra microorganismos patógenos (Casas y Dobrogosz, 2000; Isolauri, 2004), Remediar el estreñimiento (Isolauri, 2004; Walker y Duffy, 1998), Estimular el sistema inmune (Goldin y Gorbach, 1980; Majamaa et al., 1995; Kimura et al., 1997; Aattouri et al., 2001; Christensen et al., 2002; Isolauri, 2004). 12

29 En el Cuadro 3, se presentan algunos microorganismos probióticos y levaduras con efectos probados clínicamente. Cuadro 3. Efecto benéfico de bacterias y levaduras probióticas. Cepa Efecto reportado en estudios clínicos Referencia Lactobacillus acidophilus LC1 Mejora el sistema inmune, se adhiere a células intestinales humanas y ayuda en el equilibrio de la microflora intestinal. L. acidophilus NCFO1748 Disminuye la presencia de enzimas fecales, previene la diarrea causada por radioterapia, usado en tratamiento de Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus casei Shirota Lactobacillus gasseri Bifidobacterium bifidum estreñimiento. Trata y previene el rotavirus de diarrea, previene la diarrea aguda, efecto antagónico contra bacterias cancerigenas. Previene problemas intestinales, reduce enzimas fecales, inhibe el cáncer de vejiga, contribuye en el balance de la microflora intestinal. Reduce enzimas fecales, sobrevive en el tracto digestivos, Tratamiento del rotavirus de diarrea, contribuye en el balance de la microflora intestinal, auxiliar en el tratamiento de diarrea viral. Bernet et al., Salminen et al., 1993; Lidbeck et al., Salminen et al., 1993; Raza et al., 1995; Kaila et al., Aso y Akazan, 1992; Spanhaak et al., Pedrosa et al., Marteau et al., Saccharomyces boulardii Previene diarrea ocasionada por C. Castex et al., difficile. Fuente: Modificado de Dunne et al., Intolerancia y mala digestión de la lactosa. En el borde en cepillo en el intestino hay 2 enzimas disacaridasas: la lactasa, que hidroliza a la lactosa y la trehalasa que hidroliza la trehalosa en 2 moléculas de glucosa. La insuficiencia de una o más de las oligosacaridasas en el borde en cepillo (en el intestino) puede producir diarrea, distensión y flatulencia después de la ingestión de azúcar. La diarrea es ocasionada por el incremento en la cantidad de moléculas oligosacáridas osmóticamente activas, que permanecen en el lumen intestinal y generan incremento del volumen del contenido intestinal. Cuando hay bajas concentraciones de lactasa se origina intolerancia a la leche, conocida como intolerancia a la lactosa. Según Adolfsson et al., (2004), más de la mitad de los adultos en el mundo sufren de este padecimiento. La mala digestión de la lactosa es otro padecimiento, en el cual la lactosa permanece en el lumen intestinal y llega al colon en donde es fermentada por la flora colónica. Los bioproductos de esta fermentación son ácidos de cadena corta (lactato, butirato, acetato y propionato), además metano, hidrogeno y dióxido de carbono. Estos ácidos se asocian con los electrolitos y 13

30 conducen a una carga osmótica que puede ocasionar diarrea. La mala digestión de la lactosa ocasiona inflamación, dolor abdominal, diarrea y flatulencia después de la ingesta de leche. Sin embargo, muchas personas pueden ser intolerantes a la lactosa pero soportan pequeñas cantidades (2-10 g) de lactosa en el alimento (Vesa et al., 2000). Diarrea. A principios del siglo XX, se pensaba que las bacterias utilizadas para hacer yogurt tenían beneficios en la prevención y tratamiento de la diarrea (Metchnikoff, 1901). González et al., (1995) utilizó una combinación de lactobacilos y bifidobacterias como bacterioterapia para contrarrestar diarrea infantil causada por E. coli, salmonella y shigella. Bifidobacterias y lactobacilos en forma individual y en combinación han sido adicionados en alimentos para infantes, obteniendose buenos resultados (Bennet et al., 1992; Langhendries et al., 1995). Estudios realizados por Van Neil et al., en 2002, demostraron que el uso de cepas de Lactobacillus es una alternativa efectiva y segura en el tratamiento de infecciones agudas y diarrea en niños, ya que pueden reducir la frecuencia y la duración. Tojo y colaboradores en 1987 observaron que Bifidobacterium breve tiene efecto positivo contra campylobacter en infantes. El mecanismo por el cual las BAL pueden contribuir en el tratamiento contra diarrea es desconocido, sin embargo, se sugiere que este tipo de bacterias tienen la capacidad de reestablecer la microflora intestinal y así incrementar la barrera intestinal y competir contra los microorganismo patógenos por los sitios de adhesión en la mucosa intestinal humana (Adolfsson et al., 2004). Cáncer en colon. Es una de las más importantes causas de muerte, los factores que propician el desarrollo de esta enfermedad son de origen genético y el medio ambiente (interacción entre alimentación, epitelio y flora intestinal). Los productos lácteos fermentados o las bacterias utilizadas para la fermentación de la leche han mostrado tener un efecto positivo en cáncer de colon y otros tumores (Reddy y Rivenson, 1993; Ayebo et al., 1981; Shackelford, 1983). Wollowski et al., (1999), investigaron el efecto protector de diferentes cepas de BAL, utilizaron leche fermentada contra 1,2- dimetilhidrazina (DMH) que es un inductor de cáncer en ratones. Evidenciaron que el tratamiento con Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus durante 4 días protegió el colon del ratón del efecto negativo del DMH, esto no ocurrió cuando se suministró S. thermophilus. 14

31 Se ha sugerido que los mecanismos de protección de las BAL contra carcinogénesis en colon se relacionan con la mejora de la respuesta inmune, la supresión de bacterias intestinales dañinas, el secuestro de mutágenos potenciales, la producción de compuestos mutagénicos y la reducción del ph en colon. Así mismo, Pedrosa et al., (1995) demostraron que la alimentación con yogurt o el suministro de Lactobacillus reduce la presencia de enzimas fecales (azoreductasa y nitroreductasa) que tienen la capacidad de producir metabolitos carcinogénicos. Estas bacterias ejercen su efecto protector o terapéutico mediante la secreción de compuestos antimicrobianos como lactocinas, helveticinas, lactacinas, nisina, bifidocinas, por mencionar algunos (Dodd y Gasson, 1994; Gibson y Wang, 1994; Gibson, 1999; Isolauri, 2004) y la competencia por los sitios que ocupan los patógenos en el intestino (Isolauri et al., 1994; Gibson, 1999; Kailasapathy y Chin, 2000; Isolauri, 2004) Prebióticos El término prebiótico fue introducido por Gibson y Roberfroid en 1995, ellos definen a los prebióticos como un ingrediente alimenticio no digerible que afecta benéficamente al huésped selectivamente estimulando el crecimiento y/o actividad de uno o un limitado número de bacterias en el colon". En 2001 Cummings y colaboradores definen a estos ingredientes alimenticios como cadenas largas no digeribles por enzimas digestivas del organismo humano, pero si son digeribles por los probióticos en el intestino grueso (colon). La función de los compuestos prebióticos es estimular de manera selectiva el crecimiento y la actividad de especies de bacterias específicas en el intestino, usualmente bifidobacterias y lactobacilos, beneficiando así la salud humana (Gibson et al., 1995; Gibson, 1999; Kontula et al., 1999; Adhikari et al., 2000; Isolauri, 2004; Rastall, 2004). Recientemente los prebióticos se emplean como simbióticos, una combinación de compuestos prebióticos con microorganismos probióticos, cuya finalidad es potenciar el crecimiento de los probióticos en el organismo humano. En el Cuadro 4, se presentan ejemplos de algunos compuestos utilizados como prebióticos y algunos simbióticos probados en el organismo humano. Dos prebióticos de interés potencial son la inulina y la oligofructosa, se extraen de raíces de achicoria principalmente y no son digeribles por enzimas del tracto digestivo humano, pero si son digeribles por algunas bacterias que 15

32 forman parte de la flora intestinal principalmente, lactobacilos y bifidobacterias (Gibson, 1999). Otro prebiótico importante es la lactulosa que es un derivado de la lactosa y ha sido utilizado desde hace cuarenta años como prebiótico en fórmulas infantiles, con el objetivo de incrementar el número de lactobacilos en el intestino de infantes (MacGillivray et al., 1959). Lactitol es un prebiótico derivado de la lactosa, el cual junto con la lactulosa se ha relacionado su efecto en el tratamiento de enfermedades como encefalopatía, así como remediación del cáncer colorectal (Kontula et al., 1998). En adultos el consumo de fructooligosacáridos tienen un efecto positivo que se ve reflejado principalmente en un incremento de bifidobacterias en las heces (Wang y Gibson, 1993; Buddington et al., 1996; Gibson et al., 1995). Cuadro 4. Compuestos prebióticos y simbióticos. Prebióticos Fructooligosacáridos (FOS) Inulina Oligofructosa Lactulosa Lactitol Galactooligosacáridos (GOS) Simbióticos Bifidobacteria + FOS Lactobacilos + Lactitol Bifidobacteria + GOS 16

33 2.3. Aparato digestivo humano y BAL probióticas Estómago e intestino delgado humano El alimento en el estómago se mezcla con ácido clorhídrico, moco y pepsina, después es liberado a una velocidad controlada hacia el duodeno. La mucosa gástrica contiene muchas glándulas profundas, que secretan moco. Las células de las glándulas gástricas secretan jugo gástrico, el cual contiene diversas sustancias como enzimas (pepsina y lipasa), iones (sodio, cloro, magnesio, hidronio, potasio) y moco. El ácido clorhídrico ayuda en la digestión proteínica, proporciona el ph necesario para activar la pepsina (principal enzima del jugo gástrico), además estimula la salida de la bilis y del jugo pancreático y puede eliminar muchas de las bacterias ingeridas como un mecanismo de defensa (Ganong, 2002). En personas normales la mucosa gástrica no se irrita o digiere, debido a la presencia del moco contenido en el jugo gástrico. El moco esta constituido por glucoproteínas denominadas mucinas, cada mucina tiene cuatro subunidades unidas por puentes disulfuro; el moco forma un gel filante que cubre la mucosa. El estómago presenta valores de ph de 1 a 2, que favorecen el inicio de la digestión de los alimentos en el estómago, además en este intervalo de ph se estimula la secreción de bilis hepática al duodeno, en esta región el ph es > 6.5 (Ganong, 2002). El alimento en el estómago es mezclado y molido gracias al movimiento peristáltico el cual puede durar hasta 10 segundos y presentarse de 3 a 4 veces por minuto. La secreción de la pepsina y del ácido clorhídrico, se atribuye a la influencia cefálica (respuestas mediadas por el vago e inducidas por la actividad en el sistema nervioso central), gástrica (respuestas reflejas locales y la gastrina) e intestinal (reflejos y efectos de la retroalimentación hormonal sobre la secreción gástrica iniciados a partir de la mucosa del intestino delgado). Sin embargo, también existen factores externos como la ingesta de alcohol y cafeína, que actúan directamente sobre la mucosa estimulando la secreción gástrica. En el estómago existen bacterias anaerobias facultativas como lactobacilos y estreptococos en concentración reducida debido al ambiente ácido, así mismo, hay levaduras en una concentración de 100 UFC/mL aproximadamente (Rastall, 2004). El proceso digestivo inicia en la boca y en el estómago, se completa en el lumen y en las células de la mucosa del intestino delgado. En el intestino delgado los contenidos 17

34 procedentes del estómago se mezclan con las secreciones de las células de la mucosa, con el jugo pancreático y la bilis hepática. De tal manera que en el intestino delgado se lleva a cabo la absorción de los productos de la digestión y de las vitaminas y los líquidos. La primera sección del intestino delgado se denomina duodeno, en la primera porción del duodeno hay un ambiente agresivo, debido a que los contenidos del estómago son vaciados en este sitio a través del píloro. La segunda sección del intestino delgado se conoce como yeyuno y comprende aproximadamente el 40% del total de este órgano, finalmente, la tercera sección es el íleon y comprende el 60% del intestino delgado (Figura 1). Figura 1. Intestino delgado y grueso humano. La bilis, el jugo pancreático y los jugos intestinales en conjunto, neutralizan el ácido gástrico, el ph del contenido duodenal es de 6.0 a 7.0 es neutro cuando el quimo llega al yeyuno. La bilis está constituida por sales biliares (sales de sodio y potasio de los ácidos biliares), ácidos biliares, pigmentos biliares, sales inorgánicas y otras sustancias disueltas en una solución electrolítica alcalina, tiene un valor de ph de 6.2 a 8.5. La bilis es clave importante dentro del proceso digestivo, puesto que proporciona los ácidos biliares que emulsionan las partículas de grasa de los alimentos y contribuyen en la absorción de los productos finales de la digestión de las grasas a través de la membrana de la mucosa intestinal. Toda la membrana intestinal se encuentra cubierta por vellosidades de 20 a 40 por mm 2 de mucosa. Cada vellosidad intestinal consiste en una proyección en forma de dedo de 0.5 a 1.0 mm de largo, recubierta por una capa de epitelio columnar que contiene una red de capilares y un vaso linfático. Las extensiones finas del músculo liso de la submucosa corren longitudinalmente hasta la punta de cada vellosidad (Figura 2). Los bordes libres 18

35 de las células del epitelio de las vellosidades están separadas en microvellosidades y el glucocáliz, una capa amorfa abundante en aminoazúcares y azúcares neutros. Las microvellosidades y el glucocáliz constituyen el borde en cepillo, así mismo las células están unidas entre sí mediante uniones estrechas. La capa exterior de la membrana celular de las células de la mucosa contiene muchas de las enzimas involucradas en el proceso digestivo iniciado por las enzimas salivales, gástricas y pancreáticas incluidas diversas disacaridasas, peptidasas y enzimas involucradas en la degradación de los ácidos nucleicos. Se estima que la superficie interna de un cilindro de mucosa del tamaño del intestino delgado es de 3300 cm 2, las vellosidades incrementan esta superficie de contacto a cm 2 y las microvellosidades incrementan esta superficie a cm 2 (Ganong, 2002). Figura 2. Esquema de las capas de tejido del intestino humano. En el intestino delgado se encuentra un gran número de bacterias, principalmente anaerobios facultativos como lactobacilos, estreptococos y enterobacterias; anaerobios como Bifidobacterium sp., Bacteroides sp. y clostridios en una concentración de 10 4 a 10 8 UFC/mL (Rastall, 2004). El peristaltismo empuja el quimo del intestino delgado hacia el intestino grueso (colon). Las contracciones de segmentación son contracciones anulares regulares que ocurren a lo largo del intestino y su función es mover el alimento hacia delante y atrás e incrementar la exposición del alimento a la superficie de la mucosa. 19

36 Colon humano La función de este órgano es la absorción del agua, sodio y otros minerales, en el colon se convierten alrededor de 2 L de quimo isotónico que ingresan a diario del íleon, en 250 ml aprox. de heces sólidas. El diámetro del colon es aproximadamente de 6.5 cm y tiene una longitud de 100 cm en personas vivas (Ganong, 2002; Tortora y Grabowski, 2002). Las glándulas colónicas consisten en proyecciones de la mucosa secretoras de moco. Entre el intestino delgado y el colon se encuentra la válvula ileocecal, cuya función importante es evitar que los contenidos colónicos regresen al íleon. Los movimientos del colon incluyen las contracciones de segmentación y las ondas peristálticas similares a las que ocurren en el intestino delgado. Gracias a estas contracciones los contenidos del colon se mezclan y además, estos son más expuestos con la mucosa de tal manera que la absorción se facilite. En el colon, los ácidos biliares procedentes del intestino delgado tienen efecto antibacteriano inhibiendo el crecimiento de cepas de Escherichia coli, Klebsiella sp., and Enterococcus sp. Cuando se encuentran estos ácidos en forma desconjugada, el efecto es más inhibitorio para bacterias gram positivo (Dunne et al., 2001). En esta región del tracto digestivo es en donde habitan el mayor número de bacterias, en concentración de a UFC/mL. En mayoría se encuentran anaerobios obligados y en menor proporción aerobios facultativos, la microflora está dominada por anaerobios estrictos como Bacteroides sp., clostridios y otras familias en las que se encuentran Clostridium mega-genus, Ruminococcus sp., Butirovibrio sp., Fusubacterium sp., Eubacterium sp., Peptostreoptococcus sp., Bifidobacterium sp., y Atopobium sp. También existen anaerobios facultativos como lactobacilos, enterococos, estreptococos y Enterobacteriaceae. Por último, las levaduras se encuentran en concentración baja de 10 2 a 10 4 UFC/mL (Gibson y Roberfroid, 1995). Además, en las heces pasan grandes masas de bacterias. El colon es estéril en el momento del nacimiento, pero la flora bacteriana se establece en la vida temprana. En el colon se produce y se absorbe amoniaco también, con el suministro de compuestos como lactulosa se puede reducir el contenido en exceso del amoníaco y evitar que se presenten problemas como encefalopatía hepática. 20

37 El intestino humano, la microflora y la adhesión de bacterias probióticas Entre los criterios para la selección de bacterias con potencial probiótico se encuentra la capacidad de adhesión de las bacterias a la mucosa gastrointestinal o células epiteliales y la exclusión de los patógenos (Salminen et al., 1999; Ouwehand et al., 2002). Este proceso requiere una fuerte interacción entre las moléculas receptoras de las células epiteliales y la superficie bacteriana (Salminen et al., 1996a). La adhesión de bacterias probióticas previene la adhesión de microorganismo patógenos (Salminen et al., 1996b) y estimula el sistema inmune (Isolauri et al., 1991 y 1995; Rolfe, 2000). La estimulación del sistema inmune se logra por la interacción de los probióticos con las membranas de la mucosa (Salminen et al., 1996b). Los lactobacilos son parte de la flora nativa de los pollos, del estómago de ratón y rata y del íleo humano. Las bacterias para colonizar el intestino deben adherirse firmemente al epitelio de la mucosa y deben adaptarse al entorno del sitio de adhesión (Savage, 1972 y Fuller, 1973). Existen 4 microhabitats que son preferidos por las bacterias probióticas: 1) la superficie de las células epiteliales; 2) las criptas del íleo, intestino ciego y colon; 3) la mucosa que recubre el epitelio y 4) el lumen del intestino. Las criptas son colonizadas principalmente por bacterias móviles y espirales como Borellia, Treponema, Spirillium (Lee, 1980 y 1985) y H. Pylori (Blasér, 1990). El intestino humano es un ecosistema extremadamente complejo que involucra 3 principales componentes que están permanentemente en contacto e interactúan entre ellos: células del intestino, nutrientes y la microflora. La microflora es una importante biomasa viva que juega importantes funciones con los componentes mencionados. Las funciones intestinales incluyen los procesos de digestión de los alimentos, absorción de nutrientes y una serie de actividades que tienen como objetivo establecer una fuerte defensa contra agresiones del ambiente externo. Para llevar a cabo tal defensa se requieren: la microflora, la barrera mucosa y el sistema inmune local (tejido linfoide asociado al intestino) en la Figura 3 se muestra un esquema de estos componentes. 21

38 intestine colon cript a Figura 3. Esquema de las defensas del intestino humano. Fuente: Bourlioux et al., La microflora intestinal La microflora en el cuerpo humano adulto esta formada por una enorme biomasa de más de billones de bacterias que incluyen más de 400 especies diferentes con gran actividad metabólica en el colon y que juegan un importante papel fisiológico en el huésped. La población bacteriana en el estómago es baja debido al ph ácido en este sitio, ya que los ácidos destruyen casi todas las bacterias que pasan por este lugar. Como consecuencia solo un número limitado de bacterias vivas llegan al duodeno, en donde el ph del ambiente es casi neutro y en este sitio las bacterias son atacadas por las sales biliares y las secreciones pancreáticas, factores que reducen aún más el número de bacterias vivas que llegan al colon. Difícilmente las bacterias pueden incrementarse en número en el intestino delgado, ya que el tiempo de tránsito es reducido. En general en las personas sanas el tiempo de tránsito de la boca al intestino grueso va de 4 a 6 h. En cambio en el intestino grueso las bacterias si pueden incrementarse en número, puesto que el tiempo de tránsito de este sitio hasta llegar al recto son de 54 a 56 h, de tal manera que las bacterias pueden alcanzar niveles de a UFC/g. La población esta formada principalmente de bacterias residentes (>10 9 UFC/g) que forman parte de la flora y bacterias transitantes (<10 6 UFC/g) las cuales pueden variar dependiendo del número de bacterias ingeridas en los alimentos. Autores como Reuter y Lerche, estudiaron la asociación de los lactobacilos con el tracto gastrointestinal humano y encontraron que los lactobacilos homofermentativos (producen ácido láctico a partir de glucosa) son típicos del organismo humano, entre ellos se encuentran L. acidophilus, L. gassieri, L. crispatus, L. Johnsonii, L. paracasei y L. 22

39 rhamnosus. También, encontraron algunos lactobacilos heterofermentativos (producen ácido láctico, CO 2 y algunos ácidos orgánicos como fórmico y acético) como L. reuteri y en menor grado L. fermentum, L. oris y L. vaginalis. Los lactobacilos son componentes de la flora microbiana no patógena de los intestinos delgado y grueso (colon), su capacidad para asociarse al tejido del epitelio intestinal es una importante característica que previene del daño causado por patógenos en la mucosa gastrointestinal (Bernet et al., 1994). Clark y Martin (1994), mencionaron que B. longum es una BAL resistente a los efectos del ácido gástrico, por otra parte, B. animalis tiene una tasa de sobrevivencia alta durante su tránsito intestinal en humanos (Duez et al., 2000). Algunos autores mencionan que las BAL probióticas deben de adaptarse al ambiente intestinal del huésped y ser capaces de prolongar su sobrevivencia en el tracto gastrointestinal (Alm y Pettersson, 1980; Robins-Browne et al., 1981; Conway et al., 1987; Pedrosa et al., 1995). Otro factor importante que limita la sobrevivencia de las BAL en el tracto gastrointestinal es la habilidad de los microorganismos para adherirse a las células epiteliales del intestino (Conway et al., 1987). Lu y Walter (2001), establecen que Salmonella enterica typhimurium es una bacteria que puede adherirse a las microvellosidades; Escherichia coli tiene la capacidad de secretar un receptor dentro de la superficie microvellosa y Shigella flexneri puede utilizar células epiteliales foliculares que son conductos fisiológicos de los antígenos para llegar al tejido linfoide, estos son los 3 patógenos más representativos que pueden afectar la mucosa Proliferación de las bacterias en el intestino humano En el colon, las bacterias tienen acceso a los nutrientes que requieren para proliferar. Los cuales incluyen a todos aquellos alimentos que no fueron absorbidos en el intestino delgado como las fibras y los azúcares no digeribles (prebióticos), materia del intestino como mucosa y células muertas, así como metabolitos producidos a partir de la actividad enzimática sobre carbohidratos entre los que están los ácidos grasos de cadena corta como ácido acético, propiónico y butírico. Estos ácidos ejercen un efecto en el metabolismo colónico, en la regulación hepática de azúcares y lípidos y proveen de energía a las células (Cummings, 1997). Otros efectos benéficos son la hidrólisis de proteínas y la producción de vitaminas, sin embargo, la proliferación de bacterias patógenas puede conducir a la producción de sustancias carcinogénicas y metabolitos tóxicos, así como la inactivación de ciertos medicamentos (Wilson, 1993). 23

40 La colonización de bacterias en el intestino humano El intestino del infante es prácticamente estéril al nacer, sin embargo, se coloniza muy rápido siendo la primer fuente de colonización la leche materna, después la flora del medio ambiente. Durante el primer día del nacido el intestino se coloniza con E. coli y Enterococcus sp., esto sucede si la alimentación esta basada en la leche materna, aparecen primero anaerobios como Bifidobacterium sp. junto con algunos Bacteroides sp. Cuando la alimentación es a base de fórmula láctea, el intestino primero se coloniza con Bacteroides sp. y después con algunas Bifidobacterium sp. (Hagiage, 1994 y Walter, 2000). Para llevar a cabo la colonización en el intestino las bacterias deben entrar en contacto con el tejido del huésped. Existe una capa de mucosa producida por células que cubre la superficie de todas las membranas mucosas del cuerpo humano, la cual es secretada por las células superficiales del epitelio en la totalidad de la vía gastrointestinal; por las glándulas de Brunner en el duodeno y por las células caliciformes en los intestinos delgado y grueso (Smith y Podolsky, 1986; Ganong, 2000). La mucosa intestinal actúa como un medio de protección, lubricación y transporte entre los contenidos luminales y la barrera epitelial, además de proteger el tracto gastrointestinal de daños mecánicos, invasión por patógenos, digestión enzimática y agentes carcinógenos. Hay 2 tipos de mucosa en el intestino, el primero es un gel insoluble que se adhiere fuertemente a las células y el segundo es una capa viscosa que es insoluble en agua y cubre el gel. La mucosa esta constituida por mucinas que son glicoproteínas que forman la estructura del gel, éste a su vez atrapa las bacterias. Las mucinas están constituidas por 5 tipos de carbohidratos: galactosa, fructosa, N- acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina y ácidos siálicos, los cuales se combinan para dar diferentes estructuras. Las bacterias entran en contacto con estas estructuras de polisacáridos y juegan un papel importante en los procesos de reconocimiento célulacélula (Smith y Podolsky, 1986). Los sitios potenciales de adhesión se muestran en la Figura 4a, la cual presenta la estructura de un enlace glicoconjugado en la proteína base con un enlace de oxígeno, además la Figura 4b, muestra otros tipos de glicoconjugados que existen en la superficie de las membranas de las células. Aquí el enlace en la proteína base es un enlace con nitrógeno y uno con el azúcar manosa. 24

41 a) b) Figura 4. Estructuras simplificadas de glicoconjugados. GlcNAc, N-acetilglucosamina; NeuNAc, ácido N-acetilneuraminico. Fuente: Bourlioux et al., El lumen intestinal esta literalmente alineado de carbohidratos, esto lo convierte en una zona con sitios potenciales de adhesión para bacterias que entran en contacto y cuentan con estructuras superficiales llamadas adhesinas. La adhesión bacteriana ocurre primero en los sitios de la mucina que actúan como capas solubles e insolubles. Bourlioux et al., (2003) mencionan que las bacterias que constituyen la flora intestinal permanecen en la superficie de la mucosa a la entrada de las vellosidades pero no llegan a las criptas. Hooper y Gordon en 2001, mostraron que hay un mecanismo de adhesión denominado cross-talk (diálogo entre bacterias y el huésped) el cual establece que la flora bacteriana residente envía mensajes a las células del intestino. Estos mensajes interfieren con la expresión o actividad de las enzimas glicosiltransferasas, las cuales inducen cambios en los carbohidratos (sitios de acción) de mucinas. Si los nuevos sitios permiten la adhesión de bacterias no patógenas, entonces el efecto se considera benéfico para el huésped, caso contrario ocurrirá si se adhieren bacterias patógenas. Debido a que existen una gran diversidad y número de bacterias en el colon, también es obvio que existe una gran variedad de interacciones. La capacidad de una bacteria para comunicarse con otra se conoce como quórum sensing (Smith et al., 2000). Esta característica puede ser muy útil en la competencia por nutrientes o la producción de moléculas que son antibióticos. 25

42 Función de la microflora en los mecanismos de defensa del organismo humano Una de las características importantes de la microflora intestinal es que debe ser resistente a la colonización por bacterias patógenas y no patógenas que llegan del exterior. Para llevar a cabo esta función existen diferentes mecanismos: a. competir por el mismo sustrato, b. competir por sitios receptores de adhesión de mucinas, c. producir un medioambiente fisiológicamente restrictivo (ej. producción de metabolitos como las bacteriocinas que actúan contra bacterias gram negativas Todorov y Dicks, 2004), y d. producir genes que codifiquen para moléculas que sirvan para sobrevivencia Importancia de la barrera mucosa en las defensas del organismo humano La mucosa intestinal es el mayor sitio de interacción con sustancias extrañas y microorganismos del ambiente externo. Una gran variedad de poblaciones bacterianas, incluyendo microorganismo potencialmente patógenos y sus productos y una marcada concentración de toxinas endógenas y exógenas constantemente modifican la estructura y función de la superficie de la mucosa, particularmente en el colon. La barrera mucosa es una compleja estructura fisicoquímica que separa el tejido del ambiente luminal. La barrera consiste de componentes celulares del endotelio vascular a las células epiteliales y la capa de la mucosa, un gel formado por la interacción de varias secreciones mucosas, incluyendo glicoproteínas de mucinas, péptidos y fosfolípidos tensoactivos (Kindon et al., 1995; Matsuo et al., 1997 y Lichtenberger, 1995). La capa mucosa constituye una separación física entre el lumen y el epitelio y una importante red para interacciones de bacteria-huésped y bacteria-bacteria. Además, una superficie fuertemente hidrofóbica (debida a la presencia de lípidos tensoactivos secretados por células epiteliales) de la capa mucosa previene que toxinas solubles en agua entren en el epitelio (Lugea et al., 2000). Otro importante mecanismo de defensa de la barrera mucosa son las defensinas que son péptidos microbianos endógenos y son secretados en el lumen por las células de Paneth. Estas células confieren resistencia innata a factores del medio ambiente y microorganismos patógenos. Están presentes en el intestino delgado en promedio de 5 a 15 células en las bases de las criptas intestinales. Las células de Paneth contienen lisozimas, fosfolipasa-a2, DNAsas y tripsina (Porter et al., 2002; Ouellette y Bevins, 2001). 26

43 2.4. Inmovilización celular La inmovilización celular aplicada en células bacterianas puede definirse como células bacterianas físicamente confinadas o localizadas en cierta región definida del espacio, preservando sus actividades catalíticas y que pueden ser utilizadas repetidamente y continuamente" (Chibata, 1978), así mismo, esta región de atrapamiento debe ser una fase sólida que permita el intercambio de los substratos, productos, etc. (Durán, 1997). Cuando las células se encuentran inmovilizadas pueden sufrir alteraciones e incluso pueden morir, sin embargo, sus actividades enzimáticas permanecen. Existen distintas técnicas de inmovilización de células, así como diversos materiales y aplicaciones, de manera general las técnicas se dividen en 2 categorías (Durán, 1997): Unión química Inmovilización celular Retensión física Encapsulación celular sica Atrapamiento celular Unión química: se basa en la unión (adsorción o enlace covalente) de las células microbianas directamente a soportes insolubles en agua. Esta técnica ha sido utilizado para inmovilizar actinomicetos, E. coli, levaduras y hongos. Sin embargo, su principal desventaja es que puede ocurrir lisis celular durante la reacción y liberación de células. Retensión física: como su nombre lo indica consiste en retener a las células en una matriz de soporte que puede ser de origen orgánico o sintético. Es una técnica muy utilizada para inmovilizar bacterias, levaduras y hongos. La técnica utilizada en este estudio fue atrapamiento celular, la cual se describe a continuación Atrapamiento celular En esta técnica las células son retenidas en una red rígida, que evita la salida de las células al ambiente líquido, además permite la difusión de los substratos y productos. Los soportes utilizados pueden ser geles de naturaleza sintética ó biologica. Las ventajas principales de esta técnica son que las reacciones de polimerización son muy suaves y pueden utilizarse soportes biológicos, por lo cual se reduce el riesgo de dañar a las células. Debido a ello, esta técnica es muy utilizada en la industria alimentaria y en la farmacéutica. 27

44 Soportes utilizados en la inmovilización por atrapamiento Como se mencionó anteriormente pueden utilizarse soportes biológicos tales como el agar, la celulosa, el almidón, la gelatina, el alginato, la carragenina, la quitina y el quitosano, por mencionar algunos; y proteínas fibrosas como el colágeno y la queratina (Groboillot y Boadi, 1994). El soporte utilizado en este estudio fue alginato de sodio, el cual es un polisacárido natural extraído de algas café (Laminaria hyperborea, Macrocystis pyrifera y Ascophyllum nodosum). Puede ser sintetizado por Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida en cultivo por lote, a partir de glucosa y fructosa. Incluso, se ha reportado producción de alginato en cultivo por lote empleando Azotobacter vinelandii inmovilizada (Nussinovitch, 1997). El alginato está compuesto por ácido D-manurónico (M) y L-gulurónico (G) (Figura 5), es poco soluble en agua de ahí que forme soluciones viscosas, mismas que son afectadas por factores como la presencia de sales, agentes secuestrantes, cationes polivalentes, tamaño de polímero, temperatura, concentración del soporte así como la presencia de solventes miscibles. En las soluciones de alginato la gelificación es inducida por la presencia de cationes divalentes de calcio Ca 2+ (propiedad ionotrópica). El ph tiene influencia en las soluciones de alginato, de manera general las soluciones de alginato no presentan estabilidad por arriba de ph 10. La viscosidad de las soluciones de alginato puede ser reducida por la adición de agentes secuestrantes o sales monovalentes. El alginato de sodio no es tóxico para el ser humano y puede permitir la liberación de bacterias en el intestino humano (Sheu y Marshall, 1993; Prevost y Divies, 1992; Chandramouli, et al., 2003). Figura 5. Estructura del alginato de sodio. Fuente: Nussinovitch,

45 Grant et al., (1973), proponen el modelo llamado caja de huevo egg-box, para explicar el mecanismo de gelificación del alginato de sodio. La gelificación se lleva entre grupos carboxilos con valencias primarias y grupos hidroxilos con valencias secundarias; proponen la existencia de una cavidad que actúa como un sitio de unión para iones calcio entre dos residuos G (ácido L- gulurónico), produciéndose una estructura tridimensional a la que llamaron caja de huevo. En dicha estructura el calcio interactúa con los carboxilos y con los átomos de oxígeno electronegativos de los grupos hidroxilo (Figura 6). Después de la gelificación las moléculas de agua son físicamente atrapadas en la matriz de alginato, pero conservan su capacidad para migrar. Figura 6. Modelo de egg-box de la formación del gel de alginato. Fuente: Nussinovitch, El alginato tiene varias aplicaciones en alimentos, es utilizado en frutas texturizadas, en la prolongación de la vida de anaquel de patatas, la inmovilización de enzimas de plátano, como aditivo en las empanadas de pescado, en productos cárnicos y otros más (Conttrell y Kovacs, 1980; Nussinovitch, 1993). 29

46 2.5 Simulación gastrointestinal in vitro y estudios de viabilidad bacteriana Dada la importancia de las bacterias lácticas probióticas en el organismo humano, se han diseñado diversas estrategias para estudiar el comportamiento de la viabilidad en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro. Molly y colaboradores en 1993, desarrollaron el simulador del ecosistema microbiano intestinal humano al que denominaron SHIME, el cual inocularon con heces fecales con el propósito de tener la población microbiana más parecida a la que se encuentra en el tracto gastrointestinal humano. Básicamente simularon el sistema con 5 reactores que representaban el intestino delgado y grueso, además del estómago humano. Minekus et al., (1995) desarrollaron el modelo TNO, el cual estaba formado de cuatro compartimentos que simularon el estómago, duodeno, yeyuno e íleon. El ph del estómago fue ajustado de 4.8 a 1.7 con HCl. Posteriormente, Molly et al., (1996), Nollet (1997) y Alander et al., (1999), utilizaron el modelo SHIME para investigar interacciones de bacterias probióticas con la flora intestinal. Por otra parte, en 1999 y 2000 autores como Kontula y Gmeiner estudiaron el efecto de las bacterias probióticas y los productos simbióticos en el tracto gastrointestinal humano simulado in vitro. De Boever y colaboradores en 2000, realizaron estudios de fermentación con flora intestinal, para lo cual diseñaron un sistema de simulación de tracto digestivo in vitro, que consistió de cinco reactores que simularon el estómago, intestino delgado, colon ascendente, transverso y descendente. Por su parte Mainville et al., (2005), desarrollaron un modelo dinámico que simuló el tracto gastrointestinal in vitro para el estudio de bacterias probióticas. El modelo consistió de dos reactores que representaron el estómago y el duodeno, en ambos reactores se controlaron el ph y la temperatura. El ph del estómago fue ajustado a un valor de 2.0 y la concentración de bilis hepática en el reactor fue de 0.3% (p/v) simulando el duodeno in vitro. Así mismo, estudiaron la viabilidad de diferentes especies de bacterias lácticas en forma libre, simulando in vitro el recorrido de dichas bacterias a través del tracto gastrointestinal humano. Con la finalidad de proteger a los probióticos de las condiciones gastrointestinales in vitro y mantenerlos viables durante su paso por el tracto gastrointestinal hasta llegar al colon, se han utilizado técnicas de inmovilización celular como la encapsulación. Existen diversos estudios aplicando esta técnica con distintos materiales así como algunas modificaciones de la misma para encapsular a las bacterias (Jankowski et al., 1997; Kebary et al., 1998; Khalil y Mansour, 1998). Los soportes más comúnmente empleados 30

47 han sido alginato de sodio y calcio, carrageninas, gomas naturales y proteínas por mencionar algunos. Lee y Heo, (2000), realizaron estudios de viabilidad con Bifidobacterium longum inmovilizado, en presencia de jugo gástrico y bilis. Sun y Griffiths, (2000), realizaron estudios de viabilidad de Bifidobacterium infantis inmovilizado en una mezcla de gomas gelana y xantana, en presencia de jugo gástrico simulado in vitro. Guerin et al., (2003), realizaron estudios in vitro para determinar los efectos del ph gástrico y sales biliares sobre la viabilidad de células de Bifidobacterium libres e inmovilizadas en alginato, pectina y proteínas de suero. Lian et al., (2003), estudiaron la viabilidad de Bifidobacterium longum e infantis encapsulado en presencia de bilis y jugo gástrico simulado in vitro utilizando gelatina, goma arábiga, almidón y leche descremada en el sistema de inmovilización; además. Ainsley et al., (2005), evaluaron la viabilidad bacteriana de Lactobacillus rhamnosus inmovilizado por atrapamiento empleando proteínas de suero y Ca 2+ como agente gelificante. Chen et al., (2005) estudiaron a Lactobacillus plantarum encapsulado en alginato y poli-lisina en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro. Por otra parte, las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas por atrapamiento en alginato de calcio presentaron elevada viabilidad después de haber sido tratadas en medio ácido y en presencia de bilis hepática 0.3% (Cruz, 2007). 31

48 III. JUSTIFICACIÓN Actualmente, los desordenes gastrointestinales como la intolerancia a la lactosa, las infecciones intestinales e incluso problemas severos como cáncer en colon, han ido en aumento en años recientes. Con la finalidad de contribuir en la remediación de estos padecimientos se han desarrollado alimentos funcionales como el yogurt, el cual es elaborado con la bacteria ácido láctica Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, bacteria de gran importancia por su efecto probiótico en el organismo humano y por su aplicación en la industria de lácteos, ya que contribuye en las propiedades organolépticas de este tipo de alimentos. Sin embargo, las células de Lactobacillus delbrueckii deben recorrer el tracto gastrointestinal humano hasta llegar al colon y resistir a condiciones agresivas como el ph ácido en estómago y la bilis hepática en duodeno, además de la presencia de enzimas digestivas como la pepsina. La pérdida parcial o total de la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii durante su tránsito por el tracto digestivo humano, puede limitar el efecto benéfico de esta bacteria en el colon humano, lo que reduce la efectividad de este tipo de alimentos en la remediación de ciertos desordenes gastrointestinales humanos. Con el objetivo de minimizar la pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii cuando son tratadas en presencia de condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro, en el presente estudio se utilizó la técnica de inmovilización celular por atrapamiento empleando como soporte alginato de sodio. Para llevar a cabo este estudio fue necesario diseñar un sistema que permitiera la simulación in vitro de las condiciones gastrointestinales humanas (jugo gástrico, jugo pancreático y bilis hepática, enzimas digestivas como pepsina y pancreatina), además, se evaluó el efecto de algunas muestras de alimento y bebidas similares a las que consume la población mexicana (chilaquiles, café, cerveza y soluciones de almidón) sobre la viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii. Con la finalidad de determinar la adhesión de células libres de Lactobacillus delbrueckii y células liberadas del soporte de inmovilización en mucosa intestinal, fue necesario el desarrolló de una técnica de adhesión empleando mucosa intestinal de rata. La capacidad de adhesión de las células en la mucosa es de gran importancia para poder asegurar la colonización y por ende su efecto probiótico en el colon humano. 32

49 IV. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general Evaluar la viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro Objetivos específicos Desarrollar e instalar un sistema de simulación gastrointestinal in vitro que permita el estudio de la viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Comparar la viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libres e inmovilizadas en alginato de calcio, tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro. Evaluar el efecto de algunos alimentos y bebidas sobre la viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libres e inmovilizadas en alginato de calcio, tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro. Desarrollar una técnica que permita determinar la adhesión de células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en mucosa intestinal. 33

50 V. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Materiales El equipo y accesorios requeridos para el sistema de simulación gastrointestinal in vitro fue el siguiente: - 2 biorreactores de vidrio con tapa y enchaquetados de 500 ml de capacidad, - 2 parrillas de agitación magnética, - 2 termómetros, - sistema de recirculación de agua con control de temperatura, - potenciómetro con electrodo de ph, - bomba peristáltica, - frascos de 500 ml para las soluciones de NaOH 1.5 M y de HCl 5 M, - frascos de 100 ml para las soluciones de jugo gástrico y pancreático simulado, - manguera masterflex de 15 mm de diámetro interno, - campana de flujo laminar Formulaciones del medio MRS y del buffer BPS Cuadro 5. Medio MRS líquido. REACTIVOS Glucosa Peptona de caseína CANTIDAD 20 g 10 g Extracto de carne 10 g Extracto de levadura 10 g Acetato de sodio 5 g Citrato de amonio 2 g Fosfato ácido de potasio 2 g Tween 80 1 ml Sulfato de magnesio heptahidratado 200 mg Sulfato de manganeso 50 mg Agua destilada cbp. 1 L Nota: para preparar medio sólido se agregan 12 g de agar bacteriológico. Fuente: Man y Rogosa,

51 Cuadro 6. Buffer BPS. REACTIVOS NaCl KH 2 PO 4 KCl Na 2 HPO 4 Agua destilada cbp. CANTIDAD 8 g 2 g 0.2 g 1.15 g 1 L 5.3. Cepa Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NRRL-734 fue la cepa de estudio, se obtuvo del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de Norteamérica. La cepa se mantuvo en placas Petri con medio MRS sólido en refrigeración a 8ºC. Descripción de las colonias (Figura 7): Tamaño: 1 a 2 mm Color: blanco Forma: circular Borde: entero Gram: positivo Elevación: elevada convexa Superficie: lisa Aspecto: húmedo Consistencia: suave butirosa a) b) Figura 7. a) Colonias de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crecidas en agar MRS. b) Tinción Gram de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. 35

52 5.4. Cultivo Se preparó un cultivo semilla inoculando 2 colonias de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en un matraz con 50 ml de medio MRS y se incubó a 38ºC, 160 rpm durante 24 h. A partir de este cultivo se inoculó un segundo matraz conteniendo 100 ml de medio líquido MRS y se incubó a las mismas condiciones (Figura 8). Al término de la incubación se determinó la viabilidad por cuenta en placa y la biomasa se recuperó por centrifugación (5000 rpm, 5 min, 4ºC) para posteriormente inmovilizarla o realizar cinéticas de pérdida de viabilidad en condiciones gastrointestinales in vitro. Figura 8. Cultivos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en incubación Técnica de inmovilización celular por atrapamiento La Figura 9 presenta el equipo utilizado para la técnica de inmovilización por atrapamiento. La biomasa de las células de Lactobacillus delbrueckii se adicionó a la solución de alginato de sodio 2%. Por medio de una parrilla de agitación la mezcla se homogenizó y posteriormente fue bombeada a través de un inyector utilizando una bomba peristáltica que operó a 12 rpm. Se formaron gotas de alginato de sodio conteniendo las células de Lactobacillus delbrueckii, mismas que gelificaron instantáneamente al entrar en contacto con la solución de CaCl 2, formándose partículas esféricas rígidas de alginato de calcio de 2 mm de diámetro. Al término de 30 min de maduración, se tomó una muestra de células inmovilizadas (1 ml) para determinar la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii. Se utilizó una solución de citrato de sodio 0.1 M, a 37ºC para disolver el soporte y liberar las células y se determinó la viabilidad bacteriana por cuenta en placa. 36

53 Bomba peristáltica 12 rpm Solución de CaCl M, 120 rpm Solución de alginato de sodio con Biomasa Figura 9. Equipo para inmovilizar por atrapamiento Determinación de viabilidad celular por conteo en placa De una solución o muestra se tomó una alícuota (1 ml) y se realizaron diluciones de 10-1 a Alícuotas de 0.1 ml de las diluciones 10-3 a 10-6 se sembraron por extensión en placa en agar MRS. Las placas se incubaron a 37ºC durante 48 h, posteriormente se contaron las colonias y se reportaron como UFC/mL. 1 ml Placas con medio MRS sólido 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml Incubación 37ºC, 48 h. Figura 10. Esquema de la técnica de determinación de viabilidad por conteo en placa. 37

54 5.7. Sistema de simulación gastrointestinal in vitro M M 4 3 Jugo gástrico simulado Muestra de alimento o bebida 1 Biorreactor 1 Estómago humano in vitro 2 Biorreactor 2 Intestino delgado humano in vitro Jugo pancreático simulado + bilis hepática NaOH Figura 11. Esquema del sistema de simulación gastrointestinal in vitro. El sistema de simulación gastrointestinal (Figura 11) fue diseñado para simular in vitro la estancia de las células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas en el estómago (biorreactor 1) y en el intestino delgado humano (biorreactor 2). Las condiciones en las que fueron tratadas las células se presentan de manera general en la Figura 12. Estómago in vitro (etapa 1): Estancia de células libres ó inmovilizadas. jugo gástrico (NaCl, pepsina, mucina) ph 2.0, 37ºC y 50 rpm, 90 min. Tratamiento con muestra de alimento ó bebida. ento muestra y testigo. Intestino delgado (etapa 2): Estancia de células libres ó inmovilizadas. Jugo pancreático y (NaCl, pancreatina, mucina y bilis hepática) ph 6.8, 50 rpm, 37ºC, 150 min. Tratamiento con muestra de alimento ó bebida. Figura 12. Diagrama de bloques de las etapas del estómago e intestino delgado humano simuladas in vitro. 38

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