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Eva Fuentes Lozano
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1 REPÚBLICA ARGENTINA COMISIÓN NACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA INFORME N- 123 Separación Cromatográfica en Capa Deidad de Vitamina 1) y Sustancias Relacionadas por A. E. A. Milla, A. Trojjarevsky y M. L. P. de TroparcYsky BUENOS AIRES 1964

Vitamina 1) y Sustancias Relacionadas por A. E. A. Milla, A.

3 SEPARACIÓN CROMATOGRAPICA EN CAPA HELGADA DE VITAMINA D Y SUSTANCIAS RELACIONADAS A.E.A.Mitta, A.Troparevsky y M.L.P.de Troparevsky INTRODUCCIÓN La cromatografía en papel de vitamina D y esteróles reía clonados se encuentra dificultada por el carácter hidrófobo de estas sustancias. Para obviar este inconveniente se utilizaron papeles impreganados con diversos productos entre ellos "quilón" (comple_ jo de ácido crómico y ácido esteárico) (l). parafina (2); jabo nes de aluminio (3); hidróxido de aluminio (4-)» etc. La impreg nación de papeles con estos productos crea problemas por la distribución no uniforme de impregnantes en distintas zonas del papel y por la variación de la cantidad de impregnantes en dis_ tintas zonas del papel y por la variación de la cantidad de impregnante por unidad de superficie de un papel a otro. Trabajos posteriores (5) y (6) emplearon la técnica de la cromatografía en placa delgada desarrollada por Stahl, consi tente en placas de vidrio recubiertas por una capa uniforme de sílice con un aglutinante especial (yeso, almidón, etc.) y la aplicaron al estudio del insaponificable de ciertas grasas don de pudieron identificar la presencia de colesterol. Estos resultados nos inclinaron a ensayar esta técnica para la separación de vitamina D y productos relacionados. En el presente trabajo se estudia la separación por croüía tografía en capa delgada de mezclas de vitamina D, colesterol y productos derivados de la irradiación de las provitaminaa D. Los resultados obtenidos indican que es posible lograr una buena separación de todas las sustancias ensayadas, cor. la excepción de las vitaminas Dg y Dj, que en todos los disolventes probados presentan prácticamente el mismo RP. Una evaluación cuantitativa de las vitaminas D y del colejs terol indica, respectivamente, una recuperación de 90-92$ y 35-90#, lo que ofrece buenas perspectivas para su determina ción cuantitativa en mezclas. Trabajo presenta al 8 o Buenos Aires. Congreso Latinoamericano de Química

parafina (2); jabo nes de aluminio (3); hidróxido de aluminio (4-)» etc.

4 4 PARTE EXPERIMENTAL Para la preparación de las placas seguimos la técnica(7), ligeramente modificada como se indica i Se mezclan 30 gramos de sílice pura y seca, previamente tamizada por malla 200 ASTM con 3 gramos de almidón bien molido. Se agregan en frío 54 mi de agua destilada y se empasta, todo bien. Se coloca la pasta en baño de agua C, agitando has. ta que se espese(unos dos minutos), se deja enfriar, agitando, y una vez frío se agregan 10 mi de agua y se agita fuertemente, para evitar grumos, con un agitador mecánico. Se extiende la pasta con un aparato apropiado que permita obtener un espesor uniforme de 0,25 ra sobre placas de aproximadamente 15x40 cm. Las placas se dejan al aire y antes de usarlas ae las activa por calentamiento en estufa a C durante 30 minutos. Luego de la activación por el calor se las deja enfriar en desecador y se las utiliza antes de 24 horas de activadas. Los cromatogramas se desarrollan en forma ascendente durante unas dos horas de modo que el frente del disolvente al, canee unos 30 centímetros. Para la identificación de las diversas zonas, el cromato, grama previamente calentado a unos 60 C, se somete a una pulve, rizacián con solución de cloruro de antimonio anhidro al 40$ en cloroformo libre de alcohol y agua. Luego se calienta el cromatograma de diez a quince minutos en estufa a 80 C con co lores desde el pardo amarillento al rosado. Los datos obtenidos con algunos disolventes se resumen en el cuadro siguiente de valores de Rf: DISOLVENTES Producto A 3 C D E F Vit. D , Vit. D , Lumisterol Pitosterol Colesterol 10 39,5 25, Dehidrocolesterol

ta que se espese(unos dos minutos), se deja enfriar, agitando, y una vez frío se agregan 10 mi de agua y se agita fuertemente, para evitar grumos, con un agitador mecánico.

5 5 Slsolvsntaa Utilizados! A: é*ter de petróleo C / benceno 1:1 B: cloroformo C: 'benceno / cloroformo 4-si D: 'benceno / cloroformo 1:1 E: metil etil cetona / benceno 1:1?: metil etil cetona / benceno / cloroformo 1:2:1 Determinación Cuantitativa: Cuando el examen cualitativo indica separación efectiva de la vitamina D2 y D3 o del colesterol de loa productos que los acompañan puede procederse a su determinación cuantitativa. Para el caso de la vitamina D2 o D3.ue tienen práctica mente el mismo Rf y la misma respuesta a la reacción colorime trica utilizada para su valoración, se deposita sobre la placa delgada una muestra que contenga alrededor de 10 a 20 microgramos y se los desarrolla paralelamente a patrones de vitamina puras. Las zonas correspondientes se eluyen con 3mi de clorofor mo, se decanta para separar la sílice, se evapora el clorofor mo a presión reducida y el residuo se toma con dos mi de cl roformo exento de alcohol y de agua. Se agregan 2 mi del reactivo de Nield (8) y se lee la ab sorvancia a 500 mu en un fotocolorímetro utilizando cubetas de 1 cm. Este método permite, en el caso de utilizar cantidades del orden de los indicados, recuperaciones de 90-92^. Para la determinación del colesterol se procede similar mente pero se requiere, para obtener los mejores resultados, que la muestra contenga de microgramos. En este caso evaporado el cloroformo se agrega al residuo seco, 0,4ml de ácido acético glacial, se lo coloca en baño a50-60 hasta di. solución y luego de frío se le añade 0.7 mi de reactivo de Schoenheimer y Sperry (9). Se lee la absorvancia a 624 mu paralelamente a patrones de colesterol puro desarrollados en la misma placa. El error de la determinación de colesterol para cantidades del orden de 20 microgramos es de Í por defecto.

acompañan puede procederse a su determinación cuantitativa. Para el caso de la vitamina D2 o D3.

6 6 RESUMEN Se ha estudiado la separación por cromatografía en placas delgadas de vitaminas D, colesterol y productos relacionados. Experiencias realizadas haciendo correr sustancias puras, vitaminas D y colesterol, indicaron que se recupera, respecti, vamente 90-92$> y 85-90#. Multiplicando los ensayos se estima posible establecer un adecuado factor de corrección para la evaluación cuantitativa de muestras incógnitas.

Experiencias realizadas haciendo correr sustancias puras, vitaminas D y colesterol, indicaron que se

7 7 BIBLIOGRAFÍA. 1. DAVIS R.B.; Me MAHON JJÍ.; KALNITSEf G.-U. Am. Chem. Soo. 74,4483 (1952). 2. KDDICEK E.; ASHBY D.R. - Biochem. J. 51 XII (1954). 3. KISS P.; SZELL T. - Naturwiss 4, 448 (1956). 4. HJSH I.E. - Biochem. J. 0, 370 (1952). 5. MANGO LD H.E.; MALLÍN S D.C. - J. Am Oil. 4 Chem. Soc. 3J7, 383 (1960). 6.-MALLDTS D.C. - J. Am Oil. * Chem. Soc. J, 576 (1960). 7. FRYDIÍAN B.J.; MONTES A.L.; TOPAREVSKY A. - Anales Asoc. Quim. Argentina 45_ (4) 428 (1957). 8. NLELD et al. - J. Biol. Chem. 136, 73 (1940). 9. SCH0E5HEIMER S. y SPERRY W. - J. Biol. Chem. 106, 745 (1944).

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