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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A01H 4/00 A01H 17/00 A01G 7/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Proceso para el desarrollo de un nuevo tipo de plantas con capacidad de fijación de nitrógeno incluso en sus hojas. kprioridad: HU 12 18/92 73 k Titular/es: Piacfejlesztesi Alapitvany Hatvani U Budapest, HU Szilárd Sándor Varga k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Varga, Szilárd Sándor k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Gil Vega, Víctor ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Proceso para el desarrollo de un nuevo tipo de plantas con capacidad de fijación de nitrógeno incluso en sus hojas. Esta invención se refiere a un proceso para desarrollar un nuevo tipo de plantas capaces de fijar nitrógeno incluso en sus hojas. Se sabe que el nitrógeno es el principal factor de limitación del cultivo agrícola de plantas debido a que aunque el suministro de nitrógeno por fertilización es eficiente es muy costoso y acompañado por una extrema polución del entorno. El concepto del cultivo extendido a nivel mundial, la concepción de desarrollo viable da preferencia a la producción basada en los recursos internos en lugar de utilizar los externos. Según esto, es conveniente proporcionar el suministro de nitrógeno a las plantas aprovechando las posibilidades implicadas en la fijación biológica de nitrógeno en lugar del uso de fertilizantes [Plant and Soil 141, 1-12 (1992)]. Sin embargo, solamente algunas procariotas (diazotrofos) son capaces de fijar el gas nitrógeno atmosférico. La así llamada bacteria de fijación de nitrógeno aerobia, los elementos del género Azomonas, Azotobacter, Beijerinckia y Derxia que pertenecen a la familiade lasazotobacteraceae [Bergey s Manual of Determinative Bacterology, 8th ed., Williams and Wilins, Baltimore, página 23 (1974)] que son capaces de fijar el nitrógeno de forma efectiva incluso con niveles de oxígeno atmosféricos, en la naturaleza no pueden incorporarse en los espacios internos de tejido de las plantas [Azotobacteraceae: the Taxonomy and Ecology of the Aerobic Nitrogen-fixing Bacteria, Academic Press, New York (1979)] y no son capaces de extenderse en los espacios intercelulares aunque se pudo comprobar que al depositarse en las raíces o en las superficies externas de las hojas, estas especies son capaces de proporcionar el nitrógeno requerido por algunas plantas en un alcance importante o total [J. Gen. Microbiol. 71, (1972); J. Gen. Appl. Microbiol. 2, (1979); Can. J. Bot. 69, (1991)]. Los así llamados diazotrofos microaerofílicos que fijan el nitrógeno con bajos niveles de oxígeno, solamente son capaces de formar una endosimbiosis intercelular [Nitrogenfixing Bacteria in Nonleguminous Crop Plants, Sci. Tech. Publishers/Springer-Verlag, Madison, WI, páginas (1987)] la cual, sin embargo, puede fijar el gas nitrógeno solamente en las raíces, es decir lejos del sitio de fotosíntesis. De la US-A se conoce un proceso para la fijación sintética, aséptica, simbiótica de nitrógeno en forma de gas que consiste especialmente en los pasos de: a. proporcionar un medio de cultivo nutriente líquido compuesto esencialmente de células vegetales vivas no diferenciadas de la familia de Leguminosae; b. inocular de forma aséptica las células vegetales sin diferenciar en el medio de cultivo líquido con microorganismos simbióticos vivos del género Rhizobium; c. mantener el medio de cultivo líquido en condiciones asépticas en presencia de nitrógeno en forma de gas para permitir que los microorganismos entren y ocupen las células vegetales no diferenciadas; d. lavar de forma aséptica las células vegetales para eliminar microorganismos extracelulares y los productos metabólicos, y e. mantener las células vegetales lavadas y los microorganismos contenidos en los mismos en un medio nutriente líquido que no tiene substancialmente ninguna actividad de estimulación del crecimiento sobre dichas células vegetales, para permitir que las células vegetales que incluyen los microorganismos fijen el nitrógeno en forma de gas. Hasta la fecha, se han realizado dos estudios para cocultivar la especie de Azotobacter con células vegetales bajo condiciones in vitro. En el primer experimento [Nature 22, (1974)] se cocultivó una cepa mutante de Azotobacter vinelandii adenina-auxotrópica con células de zanahoria en un medio con contenido de sucrosa libre de nitrógeno o que contenía nitrógeno en una cantidad insuficiente para el crecimiento de la planta. Los cultivos mixtos de callo así obtenidos crecieron durante 18 meses, mostraron una actividad de fijación de nitrógeno y la bacteria pudo observarse entre las células vegetales vivas. Este método, sin embargo, tiene varios inconvenientes: se utiliza una cepa mutante auxotrópica de la especie Azotobacter que se aísla con dificultad debido a su alto número de cromosomas [J. Bacteriol., 138, (1979)]; el crecimiento de los cultivos es lento; el sistema no es estable en presencia de nitrógeno; no fue posible regenerar ninguna planta; la aplicabilidad del método se limita a algunas pocas especies estudiadas a fondo debido al bajo número de cepas auxotrópicas. En el otro experimento [z. Pflanzenphysiol. 9, (1979)] la bacteria se tragó eltejido de la planta destruyéndolo. Así, fue imposible cultivar durante un largo período y desarrollar una planta que fijara el nitrógeno. El propósitodelapresenteinvención es eliminar los inconvenientes de los procesos conocidos en la técnica y desarrollar un proceso mediante cuyo uso se hace posible de forma simple desarrollar bajo condiciones in vitro una planta capaz de fijar el nitrógeno, incluso en sus hojas, y que contiene también en sus espacios interiores una bacteria que pertenece a la familia de las Azotobacteraceae. La invención se basa en el descubrimiento que bajo condiciones in vitro es posible incorporar bacterias prototrópicas, de rápido crecimiento que pertenecen a la familia de las Azotobacteraceae, capaces de fijar el nitrógeno, incluso con niveles de oxígeno atmosféricos, en los espacios internos de la planta y formar colonias en los espacios interiores cuando se añaden fuentes nutrientes que proporcionan una alimentación nutritiva menos favorable en lugar de la alimentación nutritiva óptima que se utiliza en la práctica para las células vegetales. Es decir, se ha descubierto que mediante el uso de tal suministro nutritivo, las células vegetales y de bacteria pueden crecer uniformemente y de forma bien equilibrada mientras

3 3 ES T3 4 que con los medios tradicionales utilizados para cultivar substancias vegetales in vitro, debidoa su coeficiente de crecimiento que es algo superior, la bacteria sobrepasa en crecimiento a los tejidos de la planta huésped destruyéndolos. La invención se basa, además,eneldescubrimiento que el crecimiento bien equilibrado de ambas partes puede mantenerse durante el cultivo in vitro utilizando una fuente de carbono principal que puede ser únicamente metabolizada por la planta, es decir que es metabolizada por las células vegetales y solamente se pueden utilizar los productos del metabolismo de planta para el crecimiento bacteriano en un alcance requerido para el desarrollo simultáneo. Este descubrimiento es sorprendente debido a que en el cocultivo el crecimiento de los cultivos es proporcionado por las fuentes de carbono utilizadas por las células de planta solamente en un grado menor y que se utilizan prácticamente solamente para examinar el metabolismo y únicamente en ocasiones para cultivos de plantas in vitro. La invención se basa además en el descubrimiento que el suministro de una fuente de nitrógeno óptima en el medio nutriente también es necesario para material de plantas cocultivado con una bacteria de fijación de nitrógeno con el fin de desarrollar una planta completa a partir de los cultivos con una alta probabilidad y en gran número. Esto significa que no se necesita ninguna relación simbiótica in vitro para la formación de una relación simbiótica in vivo por lo que se puede alcanzar el objetivo arriba indicado también por cocultivo no simbiótico. Este descubrimiento es sorprendente puesto que hasta la fecha predominaba la opinión que en el caso de un cocultivo de este tipo los cultivos de plantas se cultivaban en medios libres de nitrógeno o en medios con un bajo contenido de nitrógeno, para hacer que el crecimiento de los tejidos vegetales dependiera de la fijación de nitrógeno por la bacteria. Finalmente, la invención se basa en el descubrimiento que elementos del género Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia y Derxia pueden utilizarse de preferencia para desarrollar un nuevo tipo de plantas de fijación de nitrógeno. Este descubrimiento es sorprendente, debido a que, según nuestros conocimientos anteriores, las así llamadas bacterias de vida libre no formaban colonias en los espacios interiores de la plantas bajo condiciones in vivo ynotendían a formar tales asociaciones fijas bajo condiciones naturales [Azotobacteraceae: The Taxonomy and Ecology of the Aerobic Nitrogen-fixing Bacteria; Academic Press, New York (1979)]. Así la ampliación de las simbiosis de fijación de nitrógeno a nuevas especies de plantas puede conseguirse no solamente por el desarrollo de las simbiosis naturales conocidas y las asociaciones endofíticas cerradas [Plant Soil 141, (1992)]. En base a las consideraciones arriba expuestas, la invención se refiere a un proceso para desarrollar plantas de un tipo nuevo que son capaces de fijar el nitrógeno, incluso en sus hojas. De acuerdo con la invención se inoculan los protoplastos, las células, los tejidos, los embriones u órganos crecidos y/o tratados bajo condiciones in vitro con la bacteria que pertenece a la familia de las Azotobacteraceae, para cocultivar a continuación el cultivo así obtenido a una temperatura de 1 a 3 C y propagarlo y/o regenerar la planta completa con la misma temperatura bajo condiciones in vitro en un medio de cultivo que contiene nitrógeno en una cantidad óptima y la(s) fuente(s) principales de carbono solamente utilizable(s) por las células vegetales y que constituyen un suministro nutritivo de carbono menos favorable que el suministro nutritivo de carbono óptimo utilizado en la práctica, así como otros aditivos opcionales. De preferencia se utilizan las especies del género de Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia o Derxia que pertenecen a la familia de las Azotobacteraceae como bacteria heterotrópica capaz de fijar el nitrógeno con niveles de oxígeno atmosféricos. Para la inoculación se utilizan de preferencia las células vegetativas, los quistes y formas que carecen parcial o totalmente de la pared celular de bacteria. De preferencia se emplean como fuente(e) principal(es) de carbono que solamente puede(n) ser utilizada(s) por las células vegetales, la lactosa, maltosa, galactosa, celobiosa, el almidón, la rafinosa y/o el sorbitol. Esta(s) fuente(s) principal(es) se añade(n) convenientemente en concentraciones de, como mínimo, g/litro, de preferencia a g/litro al medio de cultivo. En caso de que las bacterias carecen parcial o totalmente de su pared celular, la(s) fuente(s) principal(es) de carbono se utiliza(n) de forma adecuada en una concentración de 0,3 a 0,7 M. En el proceso de la invención los valores ph del medio de cultivo se ajustan de preferencia a un valor óptimo para el crecimiento de la bacteria, siendo este valor de, a 9, para el género Azotobacter, Azomonas y Derxia y de 3 a 9, para el género Beijerinckia. En el proceso de la invención la demanda adicional de Ca 2+ requerida para el crecimiento de algunas especies del género Azotobacter o Azomonas, se proporciona de preferencia por la adición de carbonato cálcico y/o cloruro de calcio al medio de cultivo, de preferencia en una cantidad de 0,1 a 0, g/litro y de 0,0 a 0,2 g/litro respectivamente. De preferencia se utilizan para el desarrollo y la propagación del nuevo tipo de plantas de fijación de nitrógeno las técnicas in vitro conocidas en el sector técnico y que se utilizan normalmente para el tratamiento, el cultivo o la micropropagación respectivamente de protoplastos, células, tejidos de callos, embriones o brotes. También se pueden utilizar en el proceso como aditivos asimismo aprovechables por las bacterias, fuentes de carbono suplementarias, de preferencia sucrosa o glucosa, así como vitaminas, amino ácidos y agentes promotores del crecimiento. La figura 1 es una fotografía de microscopio electrónico en una ampliación x que muestra células de Azomonas agilis incorporadas en los espacios intercelulares de tallos de hojas de la planta de la zanahoria. La figura 2 es una fotografía de microscopio electrónico en ampliación x que muestra células de insignia incorporadas en los espacios 3

4 ES T3 6 intercelulares de los tallos de hojas de la planta de la zanahoria. Las principales ventajas del proceso de acuerdo con la invención se pueden resumir como sigue: a) la planta que fija el nitrógenoyhasidopreparada según el proceso de la invención es capaz de fijar el nitrógeno incluso en sus hojas, por lo que no requiere ninguna o muy poca fertilización con nitrógeno. b) se pueden utilizar tanto las bacterias auxotrópicas como las prototrópicas. c) se pueden aplicar técnicas tradicionales in vitro. d) se mantiene el crecimiento bien equilibrado tanto de la planta como de las bacterias. e) la endosimbiosis de planta/bacteria puede desarrollarse con relativa rapidez. f) se puede utilizar en el proceso cualquier especie de planta y cualquier parte de la planta. g) la simbiosis desarrollada puede propagarse rápidamente mediante la aplicación de métodos in vitro, de preferencia micropropagación. h) la eficacia de la nueva planta que fija el nitrógeno puede aumentarse mediante el uso de un mutante bacteriano de sobreproducción de una enzima de nitrogenasa y/o liberación de una gran cantidad de nitrógeno fijo. El proceso de acuerdo con la invención se explica más en detalle por los siguientes ejemplos sin constituir una limitación de la misma: Ejemplo 1 Después de eliminar los restos de sucrosa mediante lavado, se inoculó una suspensión de células de zanahoria con una suspensión de células ( 6 a 8 células/ml; células vegetativas y quistes) de Azotobacter vinelandii (DSM 87); a continuación se preparó un cultivo de las células recogidas a 17 a 22 C en un medio de cultivo MS de formación de callo solidificado de agar [ph = 6,2; Physiol. Plant 1, (1962)] que contenía 0, mg/litro de ácido 2,4-dicloro-fenoxi-acético (2,4-D) como hormona vegetal, y g/litro de lactosa como simple fuente de carbono. La masa de callo así crecida se transfirió aunmedioms similar que no contenía ninguna hormona 2,4-D y se continuó el cultivo bajo condiciones idénticas. Las plantas así regeneradas se plantaron en tierra ydespués de 2 meses se determinó el contenido bacteriano de las hojas después de esterilizar la superficie (solución al 0,2 % de HgCL 2 durante 1, min.) y después de la homogeneización. Las hojas tenían un contenido de 4 a de bacterias/g de peso de hoja fresca. Se repitió el mismo experimento en el mismo medio MS con la diferencia que el medio de cultivo no contenía la hormona 2,4-D, es decir la suspensión de células vegetales se inoculó con una suspensión de células de Azotobacter vinelandii (DSM 87) y se cultivó a17a22 Cenelmedio de cultivo MS solidificado de agar que no contenía 2,4-D. Las plantas así regeneradas se examinaron de la misma forma que en el caso de las plantas regeneradas a partir de la masa de callo crecida en el medio de cultivo con contenido de hormona. El contenido bacteriano de las hojas era prácticamente el mismo, es decir 4 a de bacterias/g de peso de hoja fresca. La fijación de nitrógeno en las hojas se demostró por la comprobación de la reducción de acetileno en una atmósfera que contenía un % sobre volumen de acetileno sin esterilización de superficie (7 nanomoles de C 2 H 4 /g de hojas frescas/24 horas) o después de la esterilización de superficie ( nanomoles de C 2 H 4 /g de hojas frescas/24 horas) mediante la incubación de las hojas ensayadas durante 14 horas de luz (10 lux) y horas de oscuridad a 2 C. El medio de cultivo contenía 0,1 g/l de carbonato cálcico como fuente suplementaria de Ca 2+. Ejemplo 2 Se inoculó callo de zanahoria según se describe en el ejemplo 1 con células de Azomonas Agilis (DSM 37), después se cocultivaron las plantas y regeneraron a 27 a 32 C en un medio de cultivo (ph = 7,3) con contenido de g/litro de lactosa como fuente principal de carbono y 0,1 g/litro de sucrosa como fuente suplementaria de carbono. Las bacterias regeneradas e incorporadas en la planta se contaron después de la esterilización de superficie ( a 6 bacterias/g de raíz fresca y 6 a 7 bacterias/g de hoja fresca) y se mostraron por microscopio electrónico. En la fotografía de microscopio electrónico de la figura 1 se pueden ver los microorganismos 2 incorporados en el espacio intercelular 1 rodeados por las células vegetales vivas con contenido de cloroplastos 2. Después de la esterilización de superficie, 1 g de la hoja redujo 278 nanomoles de acetileno a etileno en un díamientrasque1gderaíz redujo 266 nanomoles de acetileno en un día. Ejemplo 3 Una suspensión de células de zanahoria se inoculó concélulas insignia de Azomonas (ATCC- 1223) de la misma forma que la descrita en el Ejemplo 1. El medio de cultivo contenía g/litro de galactosa como fuente principal de carbono y 2, g/litro de glucosa como fuente suplementaria de carbono (ph = 8,3, 27 a 33 C, 0,1 g de cloruro de calcio). El contenido bacteriano de la planta regenerada se detectó por microscopio electrónico ( bacterias/g de hoja fresca/día). En la figura 2 se muestra una fotografía de microscopio electrónico con los microorganismos 2 incorporados en el espacio intercelular y con el cloroplasto 3delascélulas vegetales. Ejemplo 4 El cultivo de brote de tabaco se inoculó a través de una superficie cortada con un cultivo de Azotobacter paspali (ATCC 23833) sin pared celular (forma L) (inducido en un medio de cultivo que contenía 0 ppm de penicilina G, estabilizada con 0, M de glucosa). Los cultivos así obtenidos se cultivaron en un medio de cultivo que contenía 0, M de maltosa, 0 ppm de penicilina G y 0,2 g de carbonato cálcico (ph = 7,3) durante 2 meses. Subsecuentemente, se cultivaron los cultivos sin la penicilina G y después con reducción del contenido de maltosa en el medio de cultivo a g/litro. Después de plantar

5 7 ES T3 8 la planta, se midió la actividad de fijación de nitrógeno en las hojas, después de la esterilización de superficie, con 800 nanomoles de C 2 H 4 /g de hoja fresca/24 horas. Ejemplo Una suspensión de células de zanahoria se inoculó con una suspensión de Beijerinckia mobilis (DSM 2326) según se describe en el Ejemplo 1 y se cocultivaron los cultivos en un medio de cultivo que contenía g/litro de lactosa (ph =,4, sin Ca 2+ suplementario). La actividad de fijación de nitrógeno de las hojas de la planta regenerada se determinó por el ensayo de reducción de acetileno y se midió con 180 nanomoles de C 2 H 4 /g de hoja fresca/24 horas. Ejemplo 6 Después de la inoculación de células de zanahoria con una suspensión de Derxia Gumnosa (ATCC 1994) según se describe en el Ejemplo 3 (ph = 7,2), se pudo demostrar la actividad de fijación de nitrógeno de las hojas de la planta regenerada por el ensayo de reducción de acetileno

6 9 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Un proceso para desarrollar plantas de un nuevo tipo capaces de fijar nitrógeno en sus hojas, caracterizado porque se inoculan protoplastos, células, tejidos, embriones u órganos vegetales crecidos y/o tratados bajo condiciones in vitro con bacterias de la familia de los Azotobacteraceae, y porque después se cocultivan los cultivos así obtenidos a una temperatura de 1 a 3 Cy se propaga y/o regenera la planta completa bajo condiciones in vitro sobre o en un medio de cultivo que contiene nitrógeno en cantidades óptimas y fuente(s) principal(es) de carbono utilizable(s) solamente por las células vegetales, que son un suministro nutritivo de carbono menos favorable que el suministro nutritivo de carbono óptimo utilizadoenlapráctica, así como otros aditivos opcionales. 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza la especie del género Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia o Derxia que pertenecen a la familia de las Azotobacteraceae. 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque se utilizan para la inoculación células vegetativas, quistes o formas que carecen parcial o totalmente de su pared celular de bacterias. 4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza como fuente(s) principal(es) de carbono lactosa, mal- 1 2 tosa, galactosa, celobiosa, almidón, rafinosa y/o sorbitol, que pueden utilizarse solamente por las células vegetales.. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se añade(n) al medio de cultivo la(s) fuente(s) principal(es) de carbono en una concentración mínima de g/litro, de preferencia de a g/litro. 6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se añade al medio de cultivo la fuente principal de carbono en una concentración de 0,3 a 0,7 M para las bacterias que carecen parcial o totalmente de su pared celular. 7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se mantiene el índice ph del medio de cultivo entre, y 9, para las bacterias que pertenecen al género de Azotobacter, Azomonas o Derxia y entre 3 y 9,, respectivamente, para las bacterias del género Beijerinckia. 8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan de 0 a 0, g/litro de carbono cálcico y/ó 0 a 0,2 g/litro de cloruro de calcio como otros aditivos cuando se emplea el género de Azotobacter o Azomonas. 9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan como otros aditivos fuentes de carbono suplementarias, de preferencia sucrosa o glucosa, además vitaminas, amino ácidos y agentes promotores del crecimiento NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 6