EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA HIPOXIA EN LA SUPERVIVENCIA DE CELULAS TUMORALES Y ENDOTELIALES SOMETIDAS A RADIACIONES IONIZANTES

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1 IX Latin American IRPA Regional Congress on Radiation Protection and Safety - IRPA 2013 Rio de Janeiro, RJ, Brazil, April 15-19, 2013 SOCIEDADE BRASILEIRA DE PROTEÇÃO RADIOLÓGICA - SBPR EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA HIPOXIA EN LA SUPERVIVENCIA DE CELULAS TUMORALES Y ENDOTELIALES SOMETIDAS A RADIACIONES IONIZANTES Adriana Agudelo 2, Oscar Ortega 2, Paulo Quintero 1,3, Alejandro Ondo 2, Maria Cristina Plazas 1, Ruth Garzón 2 1 Universidad Nacional de Colombia (UN) Facultad de Ciencias Maestría en Física Médica Av. Carrera 30 con calle Bogotá D.C. pquinterome@unal.edu.co 2 Universidad del Rosario Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas Calle 12C No Bogotá D.C. ojavieror@gmail.com 3 Centro de Control de Cáncer Ltda. Carrera 16 A No. 83 A 11 Bogotá D.C. pquinterome@unal.edu.co ABSTRACT This study analyse the effects of previous hypoxia states in cell survival of cervical and colon tumor lines when are subjected to ionizing radiation. We used different kinds of radiation and energy provided by a clinical linear accelerator. Using survival curves were assessed the implications for cellular cultures response in hypoxic environments. Differences were found by varying the type of radiation (photons or electrons) and energy. Further, we relate the results to endothelial cells due their importance in the response of healthy and cancerous tissues when subjected to the effects of ionizing radiation.. 1. INTRODUCCION El objetivo de la radioterapia en oncología es destruir las células tumorales sin afectar los tejidos sanos. Para ello es necesario maximizar la dosis absorbida, así como su eficacia biológica en el tumor minimizando, al mismo tiempo, el efecto en los tejidos sanos. La eficacia del tratamiento es diferente para cada tipo de radiación y, además, depende de factores físicos, químicos y biológicos. Por tanto, para cuantificarla se introduce un parámetro relativo que se conoce con el nombre de Efectividad Biológica Relativa (EBR). El efecto de las radiaciones ionizantes sobre las células, tanto tumorales como adyacentes sanas, es múltiple. La acción directa de las radiaciones ionizantes sobre el ADN produce rupturas en la cadena, que inducen procesos de inhibición del ciclo celular, apoptosis y muerte celular [9]. Adicionalmente, existe un efecto indirecto causado por la formación de

2 especies reactivas de oxígeno (ROS) por radiólisis del agua, el cual lleva también a la ruptura de la cadena de ADN y a la muerte celular. La combinación del efecto directo e indirecto hace de las radiaciones ionizantes una herramienta muy útil para el tratamiento del cáncer [19]. Un factor a tener en cuenta en radioterapia está dado por las condiciones ambientales del tumor y directamente por la reducción en la concentración de oxígeno (o hipoxia). El oxígeno molecular, como aceptor de electrones, es esencial en el metabolismo celular [1]. En condiciones normales, la concentración de oxígeno ambiental es de aproximada ente 21%; sin embargo, la mayoría de tejidos de mamíferos existen en condiciones de 2 a 9% de oxígeno. Se consideran condiciones hipóxicas concentraciones de O 2 por debajo del 2% e hipoxia extrema (o anoxia) concentraciones por debajo del 0.02%. Las condiciones de hipoxia celular dependen del tipo de tejido y ocurren como consecuencia directa de una vascularización insuficiente. Una masa tumoral, que inicialmente se desarrolla en un ambiente vascularizado, puede presentar hipóxica como resultado de su expansión masiva que la aleja de los vasos sanguíneos y por consiguiente del suficiente aporte de oxígeno [7]. Las adaptaciones celulares a este nuevo ambiente incluyen cambios compensatorios que permiten a las células sobrevivir a la disminución de oxígeno (por ejemplo, incremento en el metabolismo anaeróbico e iniciación de la respuesta al estrés celular) y respuestas diseñadas para incrementar la entrega local de oxígeno (producción de factores angiogénicos) [14]. Mientras que la hipoxia severa crónica puede causar la muerte celular, la hipoxia menos severa puede proteger contra daños posteriores, un fenómeno conocido como acondicionamiento hipóxico [15, 16]. De igual forma, las condiciones hipóxicas por sí mismas tienen efectos profundos sobre las funciones endoteliales. La respuesta de la célula endotelial depende del grado y la duración de la deficiencia de oxígeno. Primero, la hipoxia aguda activa rápidamente las células endoteliales para liberar mediadores inflamatorios y factores de crecimiento; segundo, largos períodos de hipoxia incrementan la expresión de genes específicos que hacen parte de una respuesta celular inespecífica al estrés, induciendo la síntesis y/o secreción de citoquinas, factores de crecimiento, factores pro-angiogénicos y genes involucrados en la glicólisis[17], por esta razón, incluir células endoteliales en los estudios de células cancerosas puede ser de gran importancia para entender mejor los procesos asociados a la hipoxia y a la planeación en radioterapia. Las curvas de supervivencia son una representación de la relación entre la muerte celular y la dosis de radiación recibida. La forma de caída continua de una curva de supervivencia es fácilmente ajustada por un polinomio de segundo orden con un término constante para que la fracción de supervivencia (SF) a cero dosis sea igual a 1. Esta es la formulación con la que parte el modelo lineal cuadrático (LQ-M), que si bien es una definición meramente matemática se ha podido incorporar mecanismos radiobiológicos a este modelo. La supervivencia se define entonces como: 2 ln( SF) D D. (1)

3 La curva de supervivencia depende de la relación α/β para definir el comportamiento de la supervivencia relacionando altas y bajas dosis entre sí y indica la dosis en la cual la contribución de los daños letales provocados por la radiación, es decir la componente linear en escala semilog, es igual a los daños subletales que corresponde a la componente cuadrática. El modelo lineal cuadrático es ampliamente usado por su buena descripción de la supervivencia celular en ensayos in vitro e in vivo [19] además que permite una interpretación sencilla de la muerte celular por impactos únicos (exp(αd)) e impactos múltiples (exp(βd 2 )). 2. MATERIALES Y MÉTODOS Las líneas celulares utilizadas fueron proporcionadas por el Laboratorio de Bioquímica de la Universidad del Rosario. Los aceleradores lineales y la fuente radiactiva de Co-60 fueron proporcionados por el Instituto Nacional de Cancerología, el Centro Control del Cáncer y la Clínica Fundación Santa Fe. Se emplearon en total 2 tipos de líneas celulares, HeLa (ATCC No. CCL-2 )- Línea celular epitelial de adenocarcinoma de cérvix humano, y HT-29 (ATCC No. HTB-38)- Línea celular epitelial de adenocarcinoma colorectal. Las células fueron irradiadas con energías de 1,25 MeV para fotones mediante una unidad de 60Co de referencia Theratron 780, 6 y 18MV para fotones X y 6 y 18MeV para electrones provenientes de aceleradores lineales de uso clínico de referencias Clinac 2100, Clinac 600 y Clinac ix. Para efectos prácticos se realizó un cubo de parafina para depositar tubos con el medio de cultivo, al cual se le tomó una tomografía computarizada (CT) con cortes de medio centímetro ubicando fiducias metálicas de posicionamiento respecto a las coordenadas del acelerador (Figura 1). Las imágenes de CT se tomaron para calcular el tiempo de radiación de la máquina (unidades monitor) necesario para depositar una dosis deseada mediante el sistema de planeación dosimétrica Eclipse R haciendo uso de 2 campos laterales (Figura 1). Figura 1. Sistema de irradiación de células e imagen de tomografía computarizada del simulador usado en la irradiación de las células.

4 Para el conteo del número de colonias se usó el software ImageJ R, el cual requiere la imagen digital de las cajas de petri, que fueron obtenidas mediante un escáner común permitiendo una mayor homogeneidad de iluminación al fondo de las cajas (Figura 2), lo cual era un factor primordial a la hora de calibrar cada imagen por separado. Esta calibración corresponde a establecer el umbral de intensidades para una imagen de 8bits que son tomadas de ROIs (regiones de interés), así como se muestra en la figura 2. Figura 2. Imagen escaneada de la caja de petri para diferentes dosis junto con una selección de la caja de 0Gy transformada en una imagen de 8bits de 400x400 píxeles. Una vez se tiene seleccionada el área de interés se transforma la imagen de 8bits y se dispone de la interfaz gráfica del software para ir variando el umbral máximo de intensidad que corresponda con las colonias teñidas, cuando se haya llegado a una calibración satisfactoria se aplican los cambios en la imagen de referencia (Figura 3). Figura 3. Conteo de células sobre la imagen escanead y resultados de los conteos Para la construcción de las curvas de supervivencia celular se buscó conocer el número aproximado de células que se depositan en los tubos de ensayo donde son irradiadas 6, debido a que la formulación de la supervivencia s (ecuación 2) parte del número de células que sobreviven N(d) tras la dosis recibida d y su relación con el número de células inicial N 0 o de control que no reciben radiación. S N( d) N. (2) 0

5 La supervivencia se relaciona con el número de colonias formadas después del estrés celular aplicado (radiación) ya que el conteo del número de células resultantes a nivel práctico es muy dispendioso, este valor es llamado eficacia de siembra " (ecuación 3) el cual relaciona el número de colonias formadas (colonias de no menos 50 células) C(d) después de recibir la dosis de radiación d y el número de células sembradas M(d) inicialmente en el cultivo: C( d) M( d). (3) por lo que la ecuación 6.2 se puede expresar como (ecuación 4): S C( d) M ( d) C M (4) 0 0 C 0 ym 0 son el número de colonias y el número de células sembradas para el cultivo de control respectivamente. La información es analizada y procesada ajustando los datos al modelo lineal cuadrático el cual fue adoptado para todas las curvas de supervivencia por su universalidad y fácil manejo. 3. RESULTADOS Se graficaron los datos con la variación de la medida (figura 4.1) para ser ajustada por medio de mínimos cuadrados (figura 4.2) al modelo lineal cuadrático como la suma de dos funciones g(x) = f(x)+y(x), siendo f(x) la componente lineal que da cuenta de los efectos letales y directos mientras que y(x) es la componente cuadrática que como se expuso anteriormente se relaciona con los efectos indirectos y subletales sobre las células. Para las células de HeLa irradiadas con Co-60 el valor del α/β= 3,57 se toma de la intersección de las funciones independientes f(x) y g(x) (figura 5).

6 Figura 4. (a) Datos experimentales de la curva de supervivencia. (b) Ajuste del modelo lineal cuadrático. Figura 5. Representación gráfica del α/β= 3,57 para células Hela irradiadas en una unidad de Co60 Para células HeLa se a continuación se muestran los resultados comparativos para las curvas de supervivencia que se obtuvieron para esta línea celular que fue irradiada en condiciones de normoxia, e hipoxia física. (Figuras 6, 7 y 8)

7 Figura 6. Curva de supervivencia para células HELA irradiadas con fotones de energía de 6MV (a) y electrones de 6MeV (b) Figura 7. Curvas de supervivencia para células HELA irradiadas con fotones de energía de 6MV (a) y electrones de 6MeV (b) ambas en condiciones de hipoxia física. Figura 8. Superposición de las curvas de supervivencia para la línea celular HeLa.

8 Para células HT-29 se a continuación se muestran los resultados comparativos para las curvas de supervivencia que se obtuvieron para esta línea celular que fue irradiada en condiciones de normoxia, e hipoxia física. (figuras 9, 10 y 11) Figura 9. Curvas de supervivencia de células de HT29 irradiadas con fotones de energía de 1.25MV con la unidad de cobalto Theratron780 en condiciones de normoxia Figura 10. Curvas de supervivencia de células de HT29 irradiadas con fotones de energía de 6MV (a) y 15MV(b) en condiciones de normoxia.

9 Figura 11. Comparación de las curvas de supervivencia de células de HT29 irradiadas con fotones de energía de 6MV y 15MV. 3. CONCLUSIONS Los resultados obtenidos mostraron un comportamiento coherente de la supervivencia de las células que obedecen al modelo lineal cuadrático para regiones de bajas dosis. Se encontró que el ajuste se pierde cuando se trata de dosis superiores a 5-6Gy siendo necesario un nuevo modelo que describa su comportamiento. Al comparar la hipoxia para una misma línea celular que fue irradiada con diferente tipo de radiación (por ejemplo fotones de 6MV y electrones de 6MeV), no se mostró algún cambio importante en la supervivencia. De igual modo, el efecto de la variación de la energía nominal (por ejemplo fotones de 6 y 15MeV) tampoco produjo un cambio sustancial. Se ha confirmado que la forma de las curvas de supervivencia está estrechamente relacionada con las características propias de cada una de las líneas celulares que son sometidas a la acción de las radiaciones ionizantes. En efecto, al variar la energía de la radiación, su capacidad de penetración en el tejido es también distinta, de modo que los efectos químicos y biológicos sobre las células son diferentes, lo que repercute finalmente en la supervivencia global. Sin embargo, los coeficientes α y β relacionados con la supervivencia celular, son independientes entre sí y no pueden compararse definitivamente con los valores teóricos que se reportan en la bibliografía [19], puesto que las condiciones del medio celular no son exactamente las mismas que las empleadas en los estudios reportados, desde la misma cepa de células, estado químico de los medios de cultivo, hasta el estrés celular inducido al transportarlas desde la incubadora hasta el centro de radioterapia. En conformidad con lo reportado en la literatura, la supervivencia celular responde coherentemente frente a las variaciones en las características de la radiación ionizante utilizada en el estudio, tales como el LET y la energía. Así por ejemplo, puede observarse que al aumentar el LET de la radiación se incrementa el número de daños letales sobre las células, lo cual se traduce en caídas más pronunciadas de las curvas de supervivencia. Por otro lado, se ha encontrado que la hipoxia es en efecto un agente que aumenta la radioresistencia de los volúmenes tumorales, como resultado de la acción de factores bioquímicos que ésta propende en las células para lograr una mayor adaptación al medio. Empero, hay que considerar (se recomienda ser estudiado) el papel que desempeña el tipo de metabolismo de cada línea celular y su relación con la respuesta a la hipoxia, ya que ésta no

10 siempre es la misma, lo cual puede resultar como un factor neto de estrés sin contribuir a la radioresistencia. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a la División de Investigación Bogotá (DIB) por el apoyo económico otorgado (proyecto 13418), a los grupos de investigación de Física Médica de la Universidad Nacional de Colombia, el grupo BIO-BIO de Bioquímica de la Universidad del Rosario, el grupo de Física Médica del Instituto Nacional de Cancerología E.S.E. y a Centro de Control del Cáncer Ltda. por el apoyo y participación que nos brindaron. REFERENCES 1. Albert. Biología molecular de la célula. Barcelona: Omega, Eduard L Alpen. Radioation Biophysics 2nd ed Frank Herbert Attix. Introduction to radological physics and radiation dosimetry. WILEY- VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Rui Medeiros Avelino Fraga, Ricardo Ribeiro. Hipoxia tumoral. papel del factor inducible por hipoxia. Actas urológicas Españolas, 33:941_951, C. Y. Li M. W. Dewhirst B. J. Moeller, Y. Cao. Radiationativates hif-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: 5. Role of reoxigenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell, 5:429 _ 441, L Revesz B Littbrand. The e_ect of oxygen on cellular survival and recovery after irradiation. Br J Radiol, 42:914_924, Mark W. Dewhirst Benjamin J Moeller, Rachel A Richardson. Hypoxia and radiotherapy: opportunities for improved outcomes in cancer treatment. Cancer Metastasis Rev, 26:241_248, Addadi Fagagna F. Campisi J. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol, 8:729_740, J. D. Chapman. The single-hit mechanism of tumor cell killing by radiation. Int. J. Radiat. Biol., 79:71_8, GillespieCJ Chapman JD. Radiation induced events and their time scale in mammalian cells. Adv Radiat Biol, 9:143_98, Klionsky DJ. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat Rev 12. Mol Cell Biol, 8:614_636, Kenneth E Ekstrand. The hug-keller equation as the universall cell survival curve. Phys. Med. Biol., 55:267_273, E. P. Fertil, B. malaise. Inherent cellular radiosensitivity as a basic concept for human tumor radiotherapy. Int. J. Radiat. Biol. Phys, 7:621_629, J. F. Fowler. Nuclear particles in cancer treatment. In Adam Hilger, Bristol, C. et al. Frezza. Metabolic pro_ling of hypoxic cells revealed a catabolic signature required for cell survival. PloS one, 6:e24411, GodheadDT. Energy deposition stochastics and track structure: what about the target? Radiat Prot Dosimetry, 122:3_15, Ebert M Hornsey S scott OC Gray LH, Conger AD. The concentration of oxygen dissolved in radiotherapy.br J Radiol, 26:638_648, Group. Handbook of Radiotheraoy Physics. Taylor and Francis Group, 2007.

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