ESTUDIO MICROBIOTICO DE LAS BACTERIAS Y SISTEMAS DE COLORACIÓN (INFORME)

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1 ESTUDIO MICROBIOTICO DE LAS BACTERIAS Y SISTEMAS DE COLORACIÓN (INFORME) 2004

2 INTRODUCCIÓN Las bacterias son seres generalmente unicelulares que pertenecen al grupo de los protistos inferiores. Son células de tamaño variable cuyo límite inferior está en las 0,2 y el superior en las 50 ; sus dimensiones medias oscilan entre 0,5 y 1. Las bacterias tienen una estructura menos compleja que la de las células de los organismos superiores: son células procariotas. Igualmente son muy diferentes a los virus, que no pueden desarrollarse m s dentro de las células y que s lo contienen un ácido nucleico. Las bacterias juegan un papel fundamental en la naturaleza y en el hombre: la presencia de una flora bacteriana normal es indispensable, aunque gérmenes son patógenos. Análogamente tienen un papel importante en la industria y permiten desarrollar importantes progresos en la investigaci n, concretamente en fisiolog a celular y en genética. Para hacer un estudio de estos microorganismos, se suele recurrir a técnicas especiales que van a permitir el acondicionamiento del material para dicho estudio. Los colorantes y coloraciones se usan en estudios macro y microscópicos, por ejemplo: para estudios de la actividad bioquímica de los microorganismos, clasificación de los microorganismos, etc. Para efectuar una observación del microorganismo, los métodos de coloración son diversos y además, constituyen un ítem más que posibilita realizar una clasificación, es decir, que hay técnicas que permiten hacer un diagnóstico informando cómo reacciona una célula microbiana a ciertas manipulaciones físicas y químicas con los colorantes (ej: métodos de Gram-Nicole, ácido-alcohol resistencia, etc.). El descubrimiento del microscopio de contraste de fases y el uso del microscopio electrónico para exámenes de microorganismos, han dejado de lado muchas de las técnicas de coloración. A pesar de ello, los colorantes y las coloraciones se siguen usando en trabajo de diagnóstico y de investigación por ser de un manipuleo sencillo y de fácil comprensión e interpretación. A continuación realizaremos un estudio microbiótico aplicando algunas técnicas de coloración.

3 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Preparar frotis a partir de cultivos bacterianos en diferentes medios, y realizar una determinada tinción para la identificación de la estructura, forma, disposición, etc., de las bacterias. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Clasificar las bacterias en grampositivas y gramnegativas. Identificar la importancia que tiene cada una de las coloraciones utilizadas en el estudio de las bacterias. Identificar las formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción.

4 1. TEORÍA RELACIONADA Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscópicas, hongos microscópicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El término microorganismo no tiene un significado taxonómico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscópicas (< 0.1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre si. Así por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. También difieren notablemente en el tamaño aunque sean todos microscópicos; en una escala comparativa tenemos: Protozoarios > levaduras > bacterias > virus Bacterias Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguientes: - elipsoidal o esférica - cilíndrica o en forma de bastón - espiral o helicoidal. Las bacterias esféricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupación que derivan de los diversos planos de división celular. Así tenemos: * cocos en pares (diplococos) Ej. Neisseria * cocos en cadena Ej. Streptococcus * cocos en racimo Ej. Staphylococcus * cocos en tétradas Ej. Pediococcus * cocos en cubos Ej. Sarcina * cocos sin distribución especial Las células bacterianas cilíndricas se denominan BACILOS o BASTONES y presentan otros modelos de agrupación. Así tenemos: * bastones en cadena Ej. Bacillus * bastones en letras chinas o empalizadas Ej. Corynebacterium * bastones sin distribución especial Las bacterias helicoidales se presentan en general como células individuales, independientes; pero las células de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, número y amplitud de las espiras y rigidez de la pared. La observación y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales: observando los microorganismos vivos sin teñir. observando las células fijadas, teñidas con colorantes.

5 Las bacterias vivas, en suspensión acuosa tienen propiedades ópticas similares a las del agua y, por lo tanto, son difíciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de contraste con el medio que las rodea. Aunque las bacterias no difieren en sus propiedades ópticas del medio externo, si son muy diferentes desde el punto de vista químico; esto es lo que permite distinguir las bacterias por tinción, pues generalmente el colorante reacciona con la célula bacteriana pero no lo hace con el medio. La coloración de las bacterias tiene como fines: * aumentar el contraste de las células con el medio que las rodea. Esto implica mejorar la visualización de las bacterias y permitir la distinción de formas y tamaño. * diferenciar grupos bacterianos por su reacción frente a determinados colorantes. * revelar la presencia de distintas estructuras internas. Colorantes Son compuestos químicos que poseen un grupo cromóforo que otorga color a la molécula y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electrolíticamente y por lo tanto, formar sales. El grupo auxocromo es el que facilita la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica. Los colorantes se clasifican como colorantes naturales y sintéticos. Los colorantes naturales son utilizados principalmente con fines histológicos. La mayoría de las tinciones bacterianas son realizadas con colorantes sintéticos, en su mayoría anilinas, las cuales derivan del benzeno. Colorantes ácidos, básicos y neutros. Los colorantes más usados son sales, las cuales están constituidas por un ión cargado positivamente y un ión cargado negativamente. Por ejemplo, azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul de metileno. a) Tinción básica es aquella en que el color está dado por el ion cargado positivamente. b) Tinción ácida es aquella en que el color está dado por el ion cargado negativamente. c) Tinción neutra es aquella resultante de mezclas entre soluciones acuosas de ciertos colorantes ácidos y básicos. Una reacción de tinción se debería a una combinación de reacciones físicas y químicas. El ph del medio tiene gran influencia en la tinción ya que permite una mayor o menor disociación electrolítica del grupo auxocromo, permitiendo de esta manera una mayor o menor afinidad por los grupos químicos sobre los cuales se une.

6 Si se aumenta el ph del medio existe una mayor afinidad del colorante por la bacteria, sucediendo lo contrario si el ph se hace más ácido. La fijación de colorantes a la célula bacteriana se facilita con el uso de mordientes, con los que forman compuestos insolubles (yodo, fenol, ácido tánico, oxalato de amonio, etc.). Algunos de los colorantes más empleados en microbiología son: azul de metileno, violeta de genciana, fucsina básica, safranina, verde de malaquita, etc. Tinciones Las tinciones pueden clasificarse en: tinciones simples, diferenciales y especiales. a) Tinciones simples. Son aquellas en que se utiliza un solo colorante. Las bacterias se tiñen en forma homogénea de la misma coloración. La utilidad de esta tinción es relativa, ya que sólo es factible observar forma y agrupación celular. b) Tinciones diferenciales. Permiten establecer diferencias tintoriales entre grupos de bacterias, debido a ello son las más utilizadas en la identificación de bacterias. Estas tinciones se basan en la aplicación de dos colorantes en etapas sucesivas entre las que se aplican mordientes y compuestos químicos decolorantes; de esta forma las bacterias de diferente afinidad tintorial se observan teñidas de distinto color. c) Tinciones especiales. Permiten poner de manifiesto alguna estructura especial de la célula bacteriana, ej.: material nuclear, membrana citoplasmática, flagelos, cápsulas, esporas, etc. d) tinciones negativas: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina) En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación.

7 2. FLUJOGRAMAS Frotis. A partir de un cultivo en medio líquido. Esterilizar asa redonda Tomar una gota del cultivo líquido Colocarla en el portaobjetos Extender la gota uniformemente Secar al aire Fijar por calor Dejar enfriar Teñir A partir de un cultivo en medio sólido. Colocar gota de solución salina en el portaobjetos Esterilizar asa en punta Tomar una colonia de cultivo sólido Colocarla sobre la gota de solución salina Mezclar y extender en el portaobjetos Secar al aire

8 Fijar por calor Enfriar Teñir Frotis de secreción faringea. Visualizar el área de las amígdalas con el bajalengua Tomar una muestra de secreción faringea con el escobillón Extender uniformemente la muestra sobre el portaobjetos Secar al aire Frotar y hacer presión sobre la zona Fijar con calor Colorear Coloraciones o tinciones. Coloración con azul de metileno. Realizar frotis de secreción faringea Fijar con calor Cubrir la lamina con azul de metileno por 2 min. Lavar con agua destilada

9 Secar al aire Observar al microscopio con objetivo de inmersión Reportar la morfología y disposición de las bacterias Coloración de Gram. Muestra (medio sólido o líquido) Secar al aire Fijar con calor Cubrir el portaobjeto con cristal de violeta 1 min. Lavar con agua destilada Adicionar lugol 1 min. Lavar con agua destilada Decolorar con alcohol acetona 1 min. Lavar con agua destilada Cubrir la lamina con fucsina básica 30 seg. Lavar con agua destilada Secar Observar al microscopio con objetivo de inmersión

10 Reportar la morfología y disposición de las bacterias Coloración de Zielh-Neelsen (ácidos alcohol resistentes) Realizar frotis muestra de tierra Secar al aire Fijar con calor Cubrir portaobjetos con fucsina básica Calentar 10 min. Enfriar Lavar con agua destilada Adicionar ácido metileno 2min Lavar con agua destilada Secar Observar al microscopio con objetivo de inmersión Reportar la morfología y disposición de las bacterias Coloración de Schaeffer-Fulton (esporas) Realizar frotis cultivo Bacillus sp h.

11 Secar Fijar con calor Cubrir portaobjeto con verde de malequita Calentar 30seg Enfriar Lavar con agua destilada Adicionar safranina al 5% 1 min. Lavar con agua destilada Secar Observar al microscopio con objetivo de inmersión Reportar lo observado Coloración de Hiss (cápsula) Realizar frotis Secar Cubrir portaobjetos Lavar cultivo de Klebsiella pneumonie de 36-48h. con colorante de Hiss o solución acuosa de 1% de cristal violeta Solución acuosa al 20% de sulfato de Cu.

12 Secar Observar al microscopio con objetivo de inmersión Reportar lo observado 3. RESULTADOS Coloración con azul de metileno Las bacterias se observaron de color azul, en forma de una mezcla de bastones y esferas. Coloración de Gram Las bacterias para los dos frotis (cultivo en medio sólido y líquido) se observaron de color rojo-fucsia, tenían forma de esferas en racimos. Coloración De Zielh-Neelsen (Ácido Alcohol Resistentes) Los bacilos ácido alcohol resistente se ven rojos o fucsias, los demás se ven azules. Coloración De Shaeffer-Fulton (Esporas) Solo se pudo apreciar esferas de color rojo. Coloración de Hiss (Cápsula ) La cápsula se observa como un halo alrededor de la bacteria de color violeta pálido, la bacteria se ve violeta intensa o morado. 4. ANÁLISIS DE RESULTADOS Coloración con azul de metileno

13 Los microorganismos adquirieron un color azul, por su forma los podemos clasificar en staphilococos, streptococos y cocobacilos.(ver anexo 1) Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. Coloración de Gram Los microorganismos adquirieron un color rojo lo que indica que son gramnegativos, estos adquieren esta coloración debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy diferente a la de los microorganismos Gram positivos, que adquieren un color violeta. En cuanto a la forma, se puede decir que eran Staphilococos.(ver anexo 2) En todas las tinciones ordinarias se sabe que la pared celular no se tiñe, sino solo el protoplasma fuertemente reducido por el proceso de fijación. Nota: Al realizar la tinción de Gram, se debe tener la precaución de no utilizar cultivos bacterianos muy viejos, ya que los resultados obtenidos pueden inducir a error; así en cultivos bacterianos relativamente viejos de bacterias Gram(+), algunas se observan como Gram(-), ello se debe a la acidificación paulatina del cultivo, disminuyendo la afinidad tintorial. Coloración De Zielh-Neelsen (Ácido Alcohol Resistentes) La diferencia en la coloración no se debe a reacciones químicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura física de la misma. La ácido-alcohol resistencia es conferida por la presencia de grandes cantidades de esas sustancias céreas sobre la pared celular, a la que se unen estrechamente las moléculas del primer colorante que se hace actuar y resisten los lavados con ácidos inorgánicos diluídos (HCl, H 2 SO 4, HNO 3 ) y alcohol, pues los lípidos residuales están unidos fuertemente a la pared y no toman el segundo colorante de contraste.(ver anexo 3) Coloración De Shaeffer-Fulton (Esporas) Debido a la coloración roja se puede decir que presentaban células vegetativas, además debido a su forma clasificamos a la bacteria como Staphilococos. (ver anexo 4) Los datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloración son: presencia o ausencia de esporas deformación o no del cuerpo celular posición dentro del cuerpo celular

14 En base a la posición de la espora dentro de la célula se las clasifica en: terminales (espora en el extremo del cuerpo celular) centrales (espora en el centro del cuerpo celular) centrales a terminales o subterminales (posición intermedia) Coloración de Hiss (Cápsula ) (ver anexo 5) 5. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS Fundamento químico celular de la coloración de Gram Tinción de Gram. Se considera hasta el momento como la tinción bacterias más importante. Permite una primera clasificación de las bacterias en gram-positivas, teñidas en azul-violeta, y gram-negativas, organismos rojos. Se encuentra en el principio de toda investigación bacteriológica puesto que de su resultado depende la marcha ulterior para el aislamiento e identificación del germen. El mecanismo de la tinción de gram aun no se entiende del todo. Se supone que se basa en una diferencia de permeabilidad entre las paredes celulares de los organismos grampositivos y gramnegativos: el yodo forma con el cristal violeta un barniz que se une al protoplasto. Este barniz no es soluble en agua, pero si lo es en alcohol-acetona. En la decoloración la pared celular de las bacterias grampositivas no permite la salida del colorante, mientras que esto es lo que sucede en las gramnegativas. Los gérmenes gramnegativos quedan sin teñir después del lavar con alcohol y se tiñen de rojo con el colorante de contraste, fucsina, mientras los grampositivos mantienen el color violeta. Se ha deducido que la pared celular desempeña un papel importante para la tinción de gram por las siguientes observaciones: si se tratan células grampositivas con lisocima estas se transforman en protoplastos. Los protoplastos se tiñen con el violeta de genciana, pero pierden el color al lavar con alcohol, puesto que no hay pared celular que lo impida. De este modo los gérmenes grampositivos cuya estructura de pared celular ha llegado a desintegrar se hacen gramnegativos; finalmente es de importancia para el diagnóstico saber que los clostridios grampositivos que tienden a la autolisis, es decir a la alteración de la pared celular, se vuelven gramnegativos en los cultivos viejos. Cuál es la finalidad de fijar con calor los frotis bacterianos?

15 Cualquier tinción precisa una fijación previa de la preparación que en la mayoria de los casos se hace en la llama. Con la fijación se pretende adherir fuertemente la preparación al portaobjetos, matar al germen, conservar las estructuras visibles de la célula y mejorar su capacidad de tinción. Importancia del lugol en la técnica de Gram El lugol es importante debido a que se utiliza como mordiente, para fijar el colorante sobre el sustrato. Este refuerza la acción de un colorante. Qué son los colorantes ácidos y básicos? Cómo actúan? COLORANTES BÁSICOS Son sales, que están en relación con el componente básico de su molécula. Su grupo aminado forma una sal con un ácido, el cual es soluble en agua; tiñe estructuras ácidas (lacas de hematoxilina, fucsina básica, azul de metileno, verde de metileno). Existen sustancias tales como las Basofilas, que muestran afinidad por colorantes básicos alcalinos. COLORANTES ÁCIDOS (colorante aniónico) Son sales que están con relación con el componente ácido de su molécula; tiñe estructuras básicas, contenidas en el citoplasma celular (eosina, fucsina ácida), son colorantes citoplasmáticos. Además, se dan sustancias tales como las ácido filas, las cuales logran la afinidad por medio de este tipo de colorantes. Dependiendo de la fracción cromógena (generadora de color) el colorante será ácido (cuando posee carga negativa) o básico (cuando posee carga positiva) Durante la coloración las fracciones cromógenas se ligan a componentes tisulares de carga contraria. Qué otras técnicas de coloración se conocen para observar estructuras o tipos de microorganismos? RODAMINA-AURAMINA Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los

16 microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica. NARANJA DE ACRIDINA El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del ph y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios ha demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos. BLANCO DE CALCOFLÚOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice. TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN) Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés.

17 TINCIÓN DE KÖSTER PARA LA DIFERENCIACIÓN DE BRUCELAS. La preparación fijada se tiñe con safranina alcalina, se decolora con ácido sulfúrico diluido y finalmente se tiñe en contraste con azul de metileno. Las brucelas y las rickettsias también se presentan como pequeñas estructuras cocoides rojas, en grupos porque se encuentran localizadas intracelularmente, ante un fondo azul claro. Esta tinción tiene un valor extraordinario para el diagnóstico diferencial, puesto que permite la detección de brucelas en la placenta de una vaca que ha abortado, aún cuando exista una contaminación masiva con bacterias de la putrefacción. Es unas de las pocas tinciones que proporciona un diagnóstico puramente microscópico. Un aborto por brucela puede ser diagnosticado microscópicamente en tanto el investigador aplique las precauciones necesarias, teniendo en cuenta la eliminación de Coxiella burnetti. Otra tinción que permite un diagnostico (casi) válido en la tinción capsular de Romanowski-Giemsa para el B. Anthracis, en la que el cuerpo del bacilo aparece azul y la cápsula rosa. Con esta técnica el diagnóstico, en que se requiere gran rapidez, se establece en minutos. Otras tinciones que no se utilizan de modo rutinario pero si para precisar un diagnóstico son la empleadas par la observación de cápsulas, esporas y flagelos. COLORACIÓN DE HONGOS Una de las técnicas más empleadas para observar estos microorganismos, es la de Gueguén, por lo que con ella se pueden observar distintas estructuras presentes. La solución colorante empleada es: Acido láctico g Sudán III... 0,1 g Azul de algodón... 0,1 g Sol. de I2 alcohólica a 30 gotas Algunos de los elementos del hongo aparecen así diferenciados: grasas: color rosa o rojo debido al Sudán III (colorante liposoluble). Esto se debe a que el colorante es más soluble en los lípidos que en el solvente que lo contiene (alcohol) y tiende a abandonar la solución para ser incorporado en el interior de las gotas de lípidos presentes en la preparación (proceso de difusión y solubilidad). glicógeno: aparece de color caoba debido a la presencia del iodo. almidón: aparece de color azul debido al iodo.

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19 CONCLUSIÓN Por medio del anterior laboratorio realizado y con la ayuda de la bibliografía citada podemos concluir los siguientes aspectos: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. La observación y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales: Observando los microorganismos vivos sin teñir. Observando las células fijadas, teñidas con colorantes La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. A los primeros se les denomina básicos, mientras a os segundos como básicos. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

20 BIBLIOGRAFÍA FEY, Hans. Compendio de bacteriología general médica. Ed Acribia. España p Disponible en página web: n coloracion.htm 1/word/Guia_Lab_07_(1).doc