UNIDAD V: METODOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRAFICOS

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2 UNIDAD V: METODOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRAFICOS Introducción a las separaciones: principio, velocidad de migración de los solutos, eficacia de la columna cromatográfica mejoramiento de la columna cromatográfica. Cromatografía de gases (GC). Principio, instrumentación: sistema de gas portador, sistema de inyección de la muestra, configuraciones de columna y hornos, sistema de detección (FID,TCD, ECD, termoiónicos, detector de Hall, fotoionización, AED, FPD,MS) columnas para cromatografía de gases y fases estacionarias: aplicaciones análisis cualitativo y análisis cuantitativo. Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) principio, tipos de cromatografía de líquidos; instrumentación: recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento del solvente, sistemas de bombeo, sistemas de inyección de muestras, columnas para HPLC; tipos de rellenos de la columna, detectores (basados en una propiedad de la fase móvil y basados en una propiedad del soluto) Aplicaciones de la cromatografía de reparto. Electroforesis capilar: principio de la electroforesis capilar, electroósmosis capilares, instrumentación básica, modos de separación, variable de la CE, volúmenes de inyección, detección, análisis de datos y aplicaciones INTRODUCCIÓN La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. Una fase es estacionaria y la otra móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la muestra. La columna de separación es el corazón del cromatógrafo. Proporciona versatilidad en los tipos de análisis que pueden realizarse. Esta característica, debida a la amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un sentido amplio, la distribución de un Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 2

3 soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersión del tipo London. En cromatografía de intercambio iónico, las fuerzas en las moléculas del soluto son sustancialmente de naturaleza iónica; pero incluyen también fuerzas polares y no polares. Definición de cromatografía En 1906 Tswett definió la cromatografía como: Método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente. Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia como: Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc... Se utiliza el término general de lecho para definir las distintas formas en que puede encontrarse la fase estacionaria. Las separaciones cromatográficas se consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser: 1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 3

4 5.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS La fase móvil puede ser un gas o un líquido, mientras que la fase estacionaria sólo puede ser un líquido o un sólido (Tabla 2 l) dando lugar a la cromatografía de gases y a la cromatografía líquida En la cromatografía líquida, cuando la separación involucra predominantemente un reparto simple entre dos fases líquidas inmiscibles, una estacionaria y la otra móvil, el proceso se llama cromatografía líquido-líquido (LLC). Cuando en la aptitud retentiva de la fase estacionaria intervienen principalmente fuerzas físicas de superficie, el proceso se denomina cromatografía líquido-sólido (LSC, de liquid-solid Chromatographic) (o de adsorción). Otros dos métodos de cromatografía líquida difieren un poco en su modo de acción, En cromatografía de intercambio iónico (IEC, de ionic-exchange Chromatographic), los componentes iónicos de la muestra se separan por el intercambio selectivo con contraiones de la fase estacionaria. En cromatografía de exclusión (EC, de exclusión cromatography), la fase estacionaria proporciona una clasificación de moléculas basadas en su mayor parte en la geometría y el tamaño molecular. Este método también se llama cromatografía de permeación en gel, en la química de los polímeros, y de filtración en gel, en la bioquímica Cuando la fase móvil es un gas, los métodos se llaman cromatografía gas líquido (GLC), y cromatografía gas sólido (GSC). Los métodos que implican fases móviles gaseosas y líquidas, serán tratados en forma individual. Aun cuando hay pocas razones fundamentales para estudios separados, las diferencias en las técnicas de operación y en el equipo justifican su análisis en capítulos individuales. Tabla 5.1. Métodos cromatográficos Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 4

5 5.2. COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO DE LOS SOLUTOS El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas formas. Para cromatografía en columna, el volumen de retención, VR, (o el correspondiente tiempo retención, tr) y la razón de reparto, k', son los términos que se utilizan con más frecuencia. Variando las combinaciones de fase estacionaria - fase móvil y varios parámetros operación, el grado de retención se puede cambiar de cerca de la retención total hasta estado de migración libre Comportamiento de retención El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase móvil y estacionaria. La Fig. 5.1 muestra la separación de dos alquenos isoméricos. El volumen de fase móvil necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de inyección a través de la columna, hasta el detector (en el máximo del pico del soluto) se define como volumen de retención, VR. Se puede obtener directamente del cromatograma multiplicando el tiempo de retención correspondiente, tr, por el gasto o flujo volumétrico, Fc expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo: VR = tr Fc De marcada influencia en el flujo volumétrico es la porosidad total del relleno (empaque) de la columna. La porosidad expresa la razón del volumen intersticial del relleno respecto al volumen de su masa total. Para empaques sólidos la porosidad total es , mientras que para empaques porosos es de En las columnas capilares el valor de la porosidad, es la unidad. La velocidad lineal promedio, u, de la fase móvil, u = L/tM Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 5

6 Donde tm representa el tiempo de tránsito de un soluto no retenido, (L representa la longitud de la columna). En cromatografía interactiva ningún Figura 5.1. Separación de 2-metil-1-buteno y 2-metil-2-buteno por cromatografía de gases material puede eluir antes de este tiempo. Cuando se convierte a volumen, VM representa lo que se conoce como espacio muerto, volumen vacío o de retraso de la columna. Incluye las contribuciones efectivas del volumen del inyector, de cualquier tubería de conexión, de la columna en sí y del detector. El volumen, V R o el tiempo, t R de retención ajustados, están dados por: V R = VR - VM y t R = tr tm Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 6

7 Coeficiente de distribución o de reparto Cuando un soluto entra al sistema cromatográfico inmediatamente se reparte o distribuye entre la fase móvil y la estacionaria. Si la fase móvil se para en cualquier momento, el soluto establece un equilibrio de distribución entre las dos fases. La concentración en fase está dada por el coeficiente termodinámico de reparto: K = CS/CM Donde CS, y CM son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y móvil, respectivamente. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. El coeficiente de reparto determina la velocidad promedio de cada zona de soluto conforme la fase móvil avanza a lo largo de la columna Factor de capacidad El factor de capacidad k es la cantidad más importante en cromatografía en columna. Relaciona el equilibrio de distribución de la muestra dentro de la columna con las propiedades termodinámicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto dado de parámetros de operación, k es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relación con el tiempo transcurrido en fase móvil. Se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase móvil: k = (CS V(S)/ (CMVM ) = K VS / VM La razón volumétrica de fases VM / VS, se denota usualmente por. Así, k' =K/. Dicho de otra forma, el factor de capacidad es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, en comparación con un soluto no retenido (para el cual k =0), dividido entre el tiempo de elución de una banda no retenida: Para valores de k' mayores que 10 se desperdicia tiempo analítico valioso. Los valores menores que la unidad no proporcionan una resolución adecuada entre los solutos de elución temprana. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 7

8 Retención relativa o factor de selectividad La retención relativa o factor de selectividad, de dos solutos, donde el soluto 1 eluye antes del soluto 2, es = k 2 / k 1 = K2 / K1 = V R,2 / V R,1= t R,2/ t R,1 La retención relativa depende de 1) la naturaleza de las fases estacionaria y móvil, y 2) la temperatura de operación de la columna. Al escoger un par de fases para los solutos adyacentes más difíciles de separar se debe ser tan selectivo como sea posible EFICIENCIA DE LA COLUMNA Y RESOLUCIÓN Bajo condiciones de operación donde el reparto del soluto entre la fase estacionaria y móvil es lineal (esto es se sigue la ley de Henry), K y k' son independientes de la concentración total de soluto. Después de 50 o más repartos entre las fases, el perfil resultante de la banda se aproxima muy de cerca al dado por una curva de distribución gaussiana (Fig. 5.2). De todas maneras, conforme la banda de soluto pasa a través de la columna cromatográfica se ensancha y la concentración en el máximo del pico disminuye. Este ensanchamiento finalmente afecta la resolución de las bandas de soluto adyacentes Altura de plato y número de platos Una característica importante de un sistema cromatográfico es su eficiencia, expresada como una cantidad adimensional y llamada número efectivo de platos, Nef. Refleja el número de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a través de la columna. El número efectivo de platos se puede definir del cromatograma de una sola banda, como Nef = L/H = (t R/ ) 2 Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 8

9 Figura 5.2. Perfil de una banda de soluto Donde L es la longitud de la columna, H es la altura del plato, t R es el tiempo ajustado para la elución del centro de la banda y es la variancia de la banda en unidades de tiempo. El ancho en la base del pico, (determinado con las intersecciones de las tangentes a los puntos de inflexión con la línea base), es igual a cuatro desviaciones estándar suponiendo una distribución gaussiana ideal (Fig. 5.2). La porción superior del pico determina la línea tangente, lo que minimiza cualquier contribución de un segmento con coleo (o cabeceo). Frecuentemente es más sencillo medir el ancho a la mitad de la altura del pico W1/2. y de ahí obtener =0.425 W1/2 La medición del ancho del pico a la mitad de su altura es menos sensible a la asimetría del pico, ya que el coleo frecuentemente se muestra por debajo de la localización de la medida. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 9

10 El número de platos es solamente una indicación de si ha sido bien rellenas una columna; no puede predecir adecuadamente el rendimiento de la columna bajo todas las condiciones. Está diseñado para ser principalmente una medida de las contribuciones cinéticas al ensanchamiento de la banda. Otras contribuciones al ancho del pico como los efectos extra columna y factores termodinámicos (como el coleo de los picos que se discutirá a continuación), pueden desempeñar un papel importante. La altura del plato H, es la distancia que el soluto se mueve mientras se lleva a cabo un reparto. La altura del plato es una buena forma de expresar la eficiencia de la columna en unidades de longitud, sin especificar la longitud de la columna. Desde un punto de vista teórico la altura del plato puede relacionarse directamente a las condiciones experimentales y los parámetros de operación. Para una columna eficiente H es un número pequeño Asimetría de la banda Una queja común entre los cromatografistas es la presencia de bandas asimétricas. Afortunadamente, lo que las causa es bien conocido y con frecuencia es posible diagnosticar 1as razones de la asimetría de una banda en una separación en particular. Las bandas simétricas, se observan normalmente sólo con muestras que no exceden un máximo de tamaño, usualmente 1 mg de muestra por gramo de fase estacionaria (0.1 mg/g para empaques peliculares). Si k es mayor a concentraciones más bajas de soluto, entonces el ala de baja concentración del pico eluyente se mueve más lentamente que el ala de alta concentración. Conforme una banda inicialmente simétrica se mueva a lo largo de la columna se volverá sesgada y, finalmente, desarrollará un frente agudo y una cola larga que da lugar al coleo del pico. La solución en este caso es disminuir el tamaño de la muestra hasta el punto en que el perfil de todas las bandas se vuelva simétrico y los tiempos de retención constantes Resolución El grado de separación o resolución de dos bandas adyacentes se define como la distancia entre los picos de las bandas (o centros) dividida entre el ancho promedio de las bandas. Si la retención y el ancho de la banda se miden en unidades de tiempo, como en la Fig. 5.3, la resolución está dada por: Rs = (t R,2 - t R,1)/(0.5 (W2+W1)) Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 10

11 Figura 5.3. Definición de la resolución Las bandas de soluto se ensanchan gradualmente conforme emigran a través de la columna cromatográfica. La resolución de los solutos individuales en bandas discretas ocurre solamente si las bandas se ensanchan en menos medida que lo que se separan los máximos de los picos. Los valores en la línea base de los anchos de bandas adyacentes son casi constantes, esto es, W2 = W1. Puesto que el ancho de la banda en la línea base es igual a cuatro desviaciones estándar, para una banda dada la resolución también se puede expresar como: Rs = (t R,2 - t R,1)/(4 ) Si es inadecuada, la resolución de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la separación ente los picos o disminuyendo los anchos de los picos individuales. Esto involucra la selectividad de la columna cuando se alejan más los picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico. Mejorar la selectividad implica alterar la termodinámica del sistema cromatográfico. Mejorar la cinética del sistema aumenta la eficiencia de la separación. Como se muestra en la Fig. 5 4 (cromatograma superior), una columna puede tener una selectividad adecuada pero mostrar poca eficiencia (comparada con el cromatograma de en medio). El cromatograma inferior Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 11

12 muestra una eficiencia excelente, pero podría tener una mejor selectividad. Probablemente en este caso los valores de k' son muy pequeños. Cualquier criterio para la resolución sería de algún modo arbitrario. Para una exactitud cuantitativa razonable los máximos de los picos deben estar separados al menos 4. Si es así, entonces RS = 1.0, que corresponde aproximadamente a un 3% de sobre posición (contaminación cruzada) de las áreas de los picos. Un valor de RS = 1.5 (para 6 ) representa esencialmente una resolución completa, con sólo 0.2% de sobre posición de las áreas de los picos. Una advertencia: estos criterios son válidos para concentraciones de soluto aproximadamente iguales. Se requerirá una mayor resolución cuando una banda de un componente mayor es adyacente a una banda de un constituyente menor. En la vida real hay muchos casos en los que la resolución hasta la línea base para todos los componentes es inalcanzable. La separación es satisfactoria cuando la pareja menos resuelta de componentes puede ser determinada cuantitativamente en un grado aceptable. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 12

13 Figura 5.4. Selectividad, eficiencia y razón de reparto para columnas La resolución es una función de tres factores separados: 1) un factor de la selectividad de la columna que varía con, 2) una velocidad de migración o factor de capacidad que varía con k' y 3) un factor de eficiencia que depende de L/H (o el número de platos teóricos). Cada factor puede ser calculado directamente del cromatograma registrado y se puede ajustar en forma más o menos independiente. Los primeros dos factores son por esencia termodinámicos, mientras que el término L/H está principalmente asociado a los aspectos cinéticos de la cromatografía. Los cambios en y k' se logran seleccionando diferentes fases estacionarias y móviles o variando la temperatura y (con menor frecuencia) la presión. Adicionalmente, k' puede variarse cambiando las cantidades relativas de las fases móvil y estacionaria dentro de la columna. Cuando se optimiza una separación en particular el término de k' debe ser considerado en primer lugar. El intervalo óptimo de valores de k' va de 1 hasta 10. Por desgracia, en una mezcla compleja con muchos componentes, a menudo sólo es posible optimizar las condiciones de separación para un par de ellos. La única solución efectiva de este problema cuando se trabaja con muestras complejas reales es la programación de k. En cromatografía de gases se puede obtener un valor óptimo de k variando la temperatura. En cromatografía líquida usualmente se suele variar de manera sistemática la composición de la fase móvil. Si la resolución es todavía un problema se debe buscar un aumento en o en L/H. El término L/H se ajusta para proporcionar la máxima eficiencia compatible con un tiempo de análisis razonablemente corto. Los valores más altos de L/H siempre darán una mejor resolución, siendo los demás factores iguales. La resolución puede mejorarse aumentando la longitud de la columna, pero sólo conforme a la raíz cuadrada de la longitud de aquélla. La altura del plato debe disminuirse por medio de las características cinéticas de la operación de la columna, quizá disminuyendo el flujo de la fase móvil (pero no por debajo de un mínimo). Cualquier acción que aumente la eficiencia de la transferencia de masa de los solutos entre las fases estacionaria y móvil disminuirá la altura del plato y por lo tanto mejorará la resolución. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 13

14 5.4. CONDICIONES CROMATOGRAFICAS Procesos en la columna y ensanchamiento de la banda Existen varios procesos que tienen lugar en la columna durante una separación cromatográfica y que contribuyen a la variancia del pico, 2, o ensanchamiento de la banda. Las teorías de la dispersión de la banda en cromatografía de gases y de líquidos son prácticamente idénticas. La altura del plato expresa en términos simples la magnitud del ensanchamiento de la banda y los factores que lo afectan. Es una función de procesos termodinámicos y cinéticos dentro de la columna. Estos son (1) irregularidades del flujo que provocan mezclado convectivo, (2) difusión transversal y longitudinal en la fase móvil y (3) una velocidad finita en el equilibrio del soluto entre las fases estacionaria y móvil (transferencia de masa) Difusión por remolinos. La inhomogeneidad en las velocidades de flujo y en la longitud de los caminos alrededor de las partículas del empaque es el primero de los factores. Deben existir caminos de flujo de longitud desigual a través de cualquier empacado que no sea perfecto. Algunas moléculas de soluto de una especie única pueden ser barridas a través de la columna cerca de la pared, donde la densidad del empacado es comparativamente baja, en particular en columnas de diámetro pequeño. Otras moléculas del soluto pasan por el centro de la columna, con un empacado más compacto y a una correspondiente menor velocidad. Las moléculas que siguen un camino más corto eluyen antes que aquellas que siguen caminos más erráticos (y largos). Esto provoca para cada soluto un ensanchamiento de la banda de elución. Para minimizar el efecto, las partículas del empaque deben tener un diámetro promedio tan pequeño y deben ser empacadas tan uniformemente como sea posible. Por supuesto, conforme las partículas son más pequeñas, la presión necesaria para impulsar la fase móvil a través de la columna será mayor y más difícil será empacar la columna de manera uniforme. De todas formas, debido a la mayor eficiencia que se obtiene con partículas de menor diámetro, la longitud de la columna puede reducirse en alguna medida. Debe establecerse un compromiso entre el tamaño de las partículas, la longitud de la columna y la presión requerida. En cromatografía gas-líquido, cuando se utilizan películas en el interior de las columnas capilares el término es despreciable. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 14

15 Difusión longitudinal. DEPARTAMENTO DE QUIMICA La difusión longitudinal, o axial -esto es, movimiento molecular aleatorio dentro de la fase móvil (que no se ilustra en la Fig. 5.5). es un segundo proceso que produce ensanchamiento del pico. La contribución de la difusión longitudinal a la altura del plato es significativa sólo a velocidades bajas de fase móvil. Entonces, las velocidades altas de difusión del soluto en la fase móvil pueden causar que las moléculas se dispersen axialmente mientras emigran lentamente a través de la columna. Si esto pasa se produce ensanchamiento del pico. Figura 5.5. Contribuciones al ensanchamiento de banda Transferencia de masa La resistencia a la transferencia de masa del soluto en la superficie de la fase estacionaria (Fig. 5.5b) es otro factor que contribuye al ensanchamiento del pico. El movimiento molecular lento dentro de la fase estacionaria significa un mayor tiempo de residencia en esta fase de una molécula de soluto, mientras que otras moléculas avanzan con la fase móvil. Conforme la fase móvil se mueva más rápidamente a través de la columna y más lenta sea la transferencia de masa, más ancha será la banda del soluto que eluye de la columna. Se deben escoger líquidos no viscosos para la fase Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 15

16 estacionaria de manera que el coeficiente de difusión no sea indebidamente pequeño. Es benéfico reducir el espesor de la fase estacionaria, aunque disminuye la capacidad de la columna. Otro término que afecta a la anchura de banda es el correspondiente a la resistencia a la transferencia de masa radialmente entre líneas de corriente de fase móvil adyacentes (Fig. 5.5c). Disminuir el tamaño de las partículas de la fase estacionaria siempre es útil para reducir la altura del plato En cromatografía líquida en columna, en contraste con la cromatografía gaslíquido, las mayores diferencias provienen de (1) la disminución en un factor de en el valor del coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil cuando la fase móvil está constituida por un líquido en lugar de un gas y (2) la presencia de zonas de fase móvil estancada, atrapada dentro de los poros y canales de la fase estacionaria. Las moléculas de soluto se mueven por difusión hacia dentro y hacia afuera de estos poros (Fig. 5.5d). Estas moléculas se retrasan en su movimiento hacia adelante, relativo a la banda principal de un soluto dado, y nuevamente se produce un aumento en la dispersión molecular. También la velocidad de la fase móvil difiere entre un punto y otro debido a las perturbaciones provocadas por las partículas de soporte. Las líneas de corriente del líquido de la fase móvil cercanas a los límites de las partículas se mueven lentamente, mientras que las líneas de corriente cercanas al centro entre partículas se mueven más rápidamente. Por difusión lateral las moléculas de soluto se transfieren constantemente a una línea de corriente diferente. Por lo tanto, la obstrucción del camino de una molécula de soluto se debe tanto a la difusión entre líneas de corriente, como a la necesidad de viajar alrededor de las partículas de la fase estacionaria. El efecto de zonas estancadas se puede minimizar de varias formas. La estructura interna del empaque se puede hacer impenetrable; un ejemplo son los empaques peliculares con un núcleo sólido y la superficie recubierta. La reducción del diámetro de las partículas es muy efectivo. También se puede elegir soportes que tengan poros muy amplios, de forma que el líquido fluya fácilmente hacia dentro y hacia afuera y aun a través de los canales de los poros. Las contribuciones individuales de los cuatro términos comentados anteriormente se muestran gráficamente en la Fig En ambas, cromatografía gas-líquido y líquida en columna la difusión longitudinal es un factor significativo sólo con velocidades de fase móvil menores que el mínimo en las curvas compuestas. Idealmente un operador deseará utilizar una velocidad correspondiente a la mínima altura del plato. De hecho, la altura del plato en la región a la derecha del mínimo aumenta sólo gradualmente para la mayoría de las columnas de cromatografía gas-líquido o líquida en columna. Consecuentemente se puede negociar, una pequeña Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 16

17 perdida en la eficiencia de la columna por un menor tiempo de análisis cuando se utilizan velocidades algo mayores que uopt. Figura 5.6. Curva típica de altura de plato en función de la velocidad promedio en una columna de cromatografía líquida Tiempo de análisis y resolución Las discusiones anteriores han apuntado un parámetro importante de interés para el analista -a saber, el tiempo de retención requerido para efectuar una separación. Puede demostrarse que el tiempo de retención mínimo requerido es aquel cuando k = 2, esto es cuando tr= 3 tm. Hay poco aumento en el tiempo de análisis cuando k está comprendido entre 1 y 10, a condición de que k no tenga efecto en las demás variables. Con un aumento al doble en la velocidad de la fase móvil esperaremos disminuir el tiempo de análisis a la mitad. Sin embargo, esto no es estrictamente cierto porque H aumentará, como se muestra en las Figs De todas maneras es deseable utilizar velocidades mayores que uopt, con el correspondiente aumento en la longitud de la columna, por lo menos hasta que los requisitos de presión a la entrada de la columna se vuelvan excesivos. Aun cuando se necesita una columna mayor, el tiempo de análisis puede ser menor. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 17

18 Tabla 2.2. Parámetros cromatográficos experimentales y relaciones de interés NOMBRE CALCULO RELACION CON LOS PARÁMETROS Velocidad de la fase U= L/tM móvil Volumen de fase móvil VM= tm.f Factor de capacidad K = (tr tm)/ tm K = KVs/VM Coeficiente de distribución K= KVM/Vs K =Cs/CM Factor de selectividad (tr)b - tm K B KB α= α= = (tr)a - tm K A KA Resolución Número de paltos 2[(tR)B - tr)a] Rs= WA + WB tb 2 N= W N (α-1) K B Rs= α 1+ K B α 1 + K B 2 N = 16R 2 s α 1 K B Altura de plato L H = N Tabla 5.3. Ecuaciones y parámetros relacionados de interés Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 18

19 5.5. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA Determinaciones cualitativas: datos de retención para la caracterización de la muestra En un sistema cromatográfico estable, el tiempo de retención de un soluto particular es constante, y por lo tanto puede utilizarse para identificar ese soluto. Así, aunque la cromatografía es primordialmente una técnica de separación, es posible identificar los compuestos separados de una mezcla compleja por medio de sus tiempos de retención. Los tiempos de retención pueden predecirse a partir de los tiempos conocidos de otros miembros de la serie homóloga. La probabilidad de una coincidencia exitosa en los valores de los tiempos de retención depende del conocimiento previo de la muestra, y por tanto de la aptitud para prever la presencia de compuestos específicos. El éxito también depende de la disponibilidad de compuestos de referencia a propósito. El método de las adiciones estándar se puede utilizar para verificar el tiempo de retención del compuesto en cuestión. El tiempo de retención del pico en la muestra no debe cambiar después de efectuada la adición con respecto al valor original si ambos compuestos (el problema y el estándar añadido) son el mismo Cuando no se tienen disponibles los compuestos de referencia debe recurrirse a la información estructural independiente que proporcionan otras técnicas espectroscópicas. En muchos casos la identificación de compuesto puede hacerse aislando el pico durante la obtención del cromatograma y analizándolo a continuación por un método suplementario. La espectrometría de masas se ha acoplado con éxito a la cromatografía tanto de gases como líquida. La información que se puede obtener incluye el peso molecular y la fórmula empírica, información estructural y confirmación de la estructura Determinaciones cuantitativas En cromatografía en columna la señal analógica generada por el detector se registra en la forma familiar de los picos cromatográficos. El área bajo estos picos puede integrarse en una variedad de maneras y los datos resultantes relacionarse con la composición de muestras desconocidas Integración del área del pico: Integrador computarizado Los sistemas de datos basados en computadoras en línea permiten una automatización completa. Esto incluye la adquisición y reducción de datos en forma automática y la impresión de los resultados analíticos. La señal cromatográfica, inicialmente analógica, se digitaliza por medio de un convertidor digito analógico. Con programas se puede entonces detectar la Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 19

20 presencia de picos, hacer correcciones por la desviación de la línea de base, calcular áreas y tiempos de retención, determinar la concentración de los componentes utilizando factores de calibración almacenados y generar un informe completo del análisis (Fig. 5.7). Las cuentas del área del pico se acumulan cuando la señal abandona la línea base. Este alejamiento de la línea base usualmente se determina por medio de la medición de la pendiente de la señal. El tiempo de retención y las alturas de la señal en el máximo de cada pico se detectan con un programa almacenado en la memoria. El final del pico de un componente se establece cuando la señal regresa a la línea base. Durante cromatograma isotérmicos los programas pueden aumentar automáticamente con el tiempo la sensibilidad a la pendiente, asegurando su habilidad para detectar los picos agudos iniciales y los picos bajos y chatos más retardados con la misma precisión. En el caso de picos fusionados es posible asignar el área a cada componente proyectando perpendicularmente el mínimo del valle a la línea base corregida (Fig. 5.8). Algoritmos especiales distribuyen el área de componente en el caso de picos sobrepuestos. También en el caso de picos sobre colas de otros picos es posible distribuir las áreas de cada pico de forma coherente (Fig. 5.9). Habitualmente se utilizan identificadores como los mostrados en la figura 5.10 para conocer el modo en que el ordenador ha integrado cada pico. Figura 5.7. Impresión parcial de un cromatograma Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 20

21 5.8. Integración de picos no resueltos Figura Figura: 5.9. Integración de picos sobre colas de un pico mayoritario Figura Símbolos utilizados en algunos sistemas cromatográficos para identificar el modo en que son integrados los picos Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 21

22 Métodos de evaluación Los tres métodos principales de evaluación son: 1) Normalizaciones del área 2) Calibración con patrones o estándar 3) Patrón interno. Cada uno tiene su lugar, dependiendo de la naturaleza del análisis. Normalización del área. Cuando se sabe que el cromatograma representa la muestra completa, que todos los componentes se han separado y que cada pico se ha resuelto completamente; se puede utilizar la normalización de las áreas para la evaluación. Para utilizar este método, se mide el área bajo cada pico individual. Sumando todas estas áreas de los picos se obtiene el área total calculada. El porcentaje en volumen de los componentes individuales se obtiene multiplicando el área calculada individual por 100 y luego dividiéndola entre el área total calculada. El método sólo es válido si el factor de respuesta de todos los componentes es el mismo, es decir iguales cantidades de distintos componentes dan la misma área. En otro caso las áreas deberían ser corregidas por un factor de respuesta de cada componente Calibración con estándares (método del patrón externo). Cuando el volumen de la muestra es conocido con frecuencia se utiliza la calibración con estándares o patrones. Tiene la ventaja de que sólo se necesita, medir las áreas de los picos de interés. Es un requisito que cada vez se inyecte la misma cantidad de muestra. Los estándares necesarios deben analizarse bajo las mismas condiciones de operación que la muestra En la práctica, se preparan las soluciones estándar de(los) componentes de interés y se inyectan en el cromatógrafo. Para cada componente se obtiene la gráfica: área del pico en función de cantidad de componente. Después, para el cálculo de una concentración desconocida, se obtiene el cromatograma de la muestra problema y el área de cada pico se utiliza con la gráfica anterior para obtener la cantidad. Método del patrón interno. El método del patrón interno permite que varíen las condiciones de operación entre muestra y muestra y no requiere de respetabilidad en las inyecciones. El patrón interno debe ser un compuesto que pueda resolverse completamente de los picos adyacentes, que no esté presente en la muestra problema y que no produzca ningún efecto interferente. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 22

23 Como en el caso anterior se preparan estándares que contienen los componentes de la muestra a analizar. A cada uno de ellos se añade una cantidad conocida del llamado patrón interno que obviamente no es uno de los componentes que se quiere analizar. Se obtienen los cromatogramas de cada estándar y se obtiene la gráfica: cociente entre el área de componente y área del patrón interno frente a cociente entre cantidad de componente y cantidad de patrón interno. Entonces se añade una cantidad conocida del patrón interno a la mezcla desconocida. Se obtiene el cromatograma, y con el cociente entre las áreas del pico de componente a determinar y la de patrón interno en la muestra problema se obtiene (con la gráfica anterior determinada con estándares) el cociente entre cantidad de componente y cantidad de patrón interno. Como la cantidad de patrón interno añadida a la muestra problema es conocida puede calcularse la cantidad desconocida de componente. Cualquier variación en el tamaño de la muestra se evidenciará inmediatamente al comparar el área del pico del patrón interno en cromatogramas diferentes pero no afectará al resultado CROMATOGRAFÍA DE GASES En cromatografía de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte, y a diferencia de la mayoría de los tipos de Cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases: a) La cromatografía gas - sólido (GSC) b) La cromatografía gas-líquido (GLC). La cromatografía gas - líquido tiene gran aplicación en todos los campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente como cromatografía de gases (GC). La cromatografía gas - sólido se basa en una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los analitos como consecuencia de la adsorción física. La cromatografía gas - sólido ha tenido una aplicación limitada debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elución con colas (una consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorción), de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 23

24 peso molecular. Es por ello que se trata sólo brevemente en la final de este tema. La cromatografía gas - líquido se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte. El concepto de cromatografía gas - líquido fue enunciado por primera vez, en 1941, por Martin y Synge, quienes fueron también los responsables del desarrollo de la cromatografía de distribución líquido - líquido. Más de una década tuvo que pasar, sin embargo, antes de que la importancia de la cromatografía gas - líquido se demostrara experimentalmente. Tres años más tarde, en 1955, apareció en el mercado el primer aparato comercial para cromatografía gas - líquido. Desde entonces, las aplicaciones de esta técnica han crecido de una forma espectacular DESCRIPCION DEL CROMATOGRAFO DE GASES Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados para: 1) Proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase móvil) 2) Permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye 3) Contener la longitud apropiada de fase estacionaria 4) Mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura) 5) Detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna, y 6) Proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente. Los módulos del instrumento se muestran esquemáticamente en la Fig Sistemas de inyección de muestra El modo estándar, adecuado para aproximadamente 95% de las aplicaciones de las columnas empacadas (o empaquetadas), es la inyección directa. La muestra es inyectada con una jeringa hipodérmica a través de un septum de goma (o hule) de silicona auto sellante, a un alineador de vidrio (glass insert) contenido en un bloque metálico, donde es vaporizada y barrida hacia la columna (Fig. 5.12). Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 24

25 El bloque se calienta a una temperatura que se fija en un valor suficientemente alto para convertir prácticamente en forma instantánea la muestra líquida en vapor. La cantidad de muestra inyectada es del orden de L para líquidos y algo superior para gases. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 25

26 Figura Esquema de un cromatógrafo de gases

27 Figura Esquema de un puerto de inyección por vaporización instantánea típico Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 27

28 Las muestras, líquidas y gaseosas, también pueden introducirse con un lazo (o bucle) calibrado, introduciéndolas después a la corriente del gas que fluye por medio de una válvula (Fig. 5.13). Figura Válvula rotatoria de seis vías Inyección en columnas capilares. Es necesaria una reducción del volumen de la muestra cuando se trabaja con columnas capilares. Esto se logra mediante un inyector divisor (inyección en Split), donde generalmente se inyecta una muestra de 1 L pero sólo entra al capilar 0.01 L; el resto es desechado. Esta técnica impide la sobrecarga de la columna, pero desperdicia una porción significativa de la muestra, Cuando se realizan análisis en cantidades pequeñas de muestra con algunos componentes en concentraciones del orden de milésimos de parte por millón, se introduciría muy poco material en la columna si para estas muestras se utiliza el divisor. Para ellas se requiere de solvente o inyección sin división (inyector en splitless). La muestra completa, incluyendo el disolvente, se inyecta en la columna tubular abierta, a través de un vaporizador instantáneo caliente. Se evita un coleo pronunciado del disolvente abriendo hacia la atmósfera el puerto de inyección después de algún tiempo (quizá unos 30s), cuando la mayor parte del disolvente, y esencialmente toda la muestra, entraron en la columna. El tiempo apropiado antes de esa descarga es crítico; si es demasiado corto se produce la pérdida de los componentes de la muestra, mientras que si es demasiado largo se produce un pico del disolvente más grande del necesario, que puede sepultar algunos de los picos de interés.

29 Muestreador automático. Un muestreador automático reproduce las inyecciones y medidas manuales. Los frascos para las muestras son de vidrio, desechables, con tapones de septum con sellado para vapores. El muestreador enjuaga la jeringa con una muestra nueva para lavar las trazas de la muestra anterior, bombea la muestra nueva para humedecer la jeringa y eliminar por completo cualquier burbuja, toma una cantidad de muestra medida con precisión, la inyecta al cromatógrafo de gases. Los muestreadores automáticos tienen reproducibilidad mecánica y son consistentemente más precisos que un cromatografista experimentado. También, la operación que no requiere atención personal libera al operador para otras actividades, Muestreo de la cabeza gaseosa. Más allá del análisis convencional de gases y líquidos de baja viscosidad por CG (cromatografía de gases), algunos casos se manejan más eficazmente con muestreo de la cabeza gaseosa (vapor sobrenadante, o headspace). Esto es válido cuando sólo interesa el vapor sobre la muestra, como en el caso de los perfumes o los productos alimenticios; con los constituyentes orgánicos volátiles de muestras, como la orina, la respiración del hombre y muestras ambientales; cuando la muestra es un líquido que normalmente requeriría de algún tratamiento antes de la inyección, como la sangre, aguas residuales o agua potable, Los picos de los disolventes son mucho más pequeños de lo que serían al inyectar la muestra líquida tal cual. El muestreo de la cabeza gaseosa puede efectuarse sobre muestras con cualquier matriz, siempre y cuando el coeficiente de reparto permita que exista una cantidad suficiente del analito en la fase gaseosa. Desorción térmica y purga y trampa. Los constituyentes orgánicos volátiles de una muestra (sólida o líquida) se pueden purgar o extraer de ella haciendo pasar a través de la misma una corriente de He y atraparlos en una trampa adsorbente que forma parte del sistema de inyección del cromatógrafo y que puede ser de Tenax, carbón activo u otro adsorbente a la temperatura ambiente. En el caso de muestras gaseosas estos compuestos pueden ser atrapados en un tubo de vidrio externo al cromatógrafo, relleno de adsorbente por el que se hace circular mediante bombeo el gas a analizar y que después son colocados en el sistema de inyección del cromatógrafo. En el primero de los casos se trata de sistemas de purga-trampa y en el segundo de desorción térmica. Calentando esta trampa se desorben los Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 29

30 volátiles hasta una precolumna enfriada con nitrógeno líquido. Una vez se ha producido toda la desorción adsorción, se calienta en pocos segundos esta precolumna que está unida a la columna cromatográfica de CG y se inicia el análisis. Algunos ejemplos de compuestos analizados por purga y trampa son los de los constituyentes orgánicos de la orina, fruta, quesos. Ejemplos de deserción térmica son los análisis de la respiración humana y del aire ambiental. Pirolisis. La cromatografía gas - líquido alcanza su límite práctico cuando la cantidad de energía necesaria para vaporizar la muestra es igual a la que se requiere para romper un enlace carbono-carbono. La técnica de pirolisis (o fragmentación térmica controlada) extiende los análisis por cromatografía de gases a compuestos de tan baja volatilidad como el caucho (o hule), polímeros, películas de pintura, resinas, microorganismos, suelos, carbones, textiles y organometálicos. La muestra se introduce en un pirolizador que la calienta a temperatura muy elevada y suficiente para llevar a cabo la descomposición. Se forman fragmentos volátiles y se introducen automáticamente en el cromatógrafo para el análisis Configuraciones de columna y hornos Columnas En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empaquetadas, o de relleno y las tubulares abiertas, o capilares. Hasta la fecha, la mayor parte de la cromatografía de gases se ha realizado con columnas de relleno, Sin embargo, en la actualidad esta situación está cambiando rápidamente, y parece probable que en un futuro próximo, excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno serán sustituidas por las más eficaces y rápidas columnas capilares. Las columnas cromatográficas varían en longitud desde menos de 2 hasta 50 m, o más. Se construyen de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida, o Teflón. A fin de poder colocarse en el interior de un termostato, normalmente se configuran como helicoides con diámetros de 10 a 30 cm. En una sección posterior se encuentra una discusión detallada acerca de las columnas, rellenos de columna y fases estacionarias. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 30

31 Hornos (o estufas) DEPARTAMENTO DE QUIMICA La temperatura de la columna es una variable importante que para un trabajo preciso ha de regularse a las décimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. En la práctica, con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullición promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elución razonables (2 a 30 min). Para muestras con un amplio intervalo de ebullición, a menudo es conveniente emplear una programación de temperatura, con lo que se aumenta la temperatura de la columna bien de forma continua bien por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar la separación. En la Figura 5.14 se muestra la mejora de un cromatograma ocasionada por la programación de temperatura. Figura Efecto de la temperatura sobre los cronogramas. a) Temperatura programada. b) Isotermo Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 31

32 Las columnas cromatográficas se enrollan y sujetan en una canasta que se monta en el interior de un horno. El horno de la columna debe poder ser calentado y enfriado rápidamente. Esto requiere de un sistema de flujo de aire adecuado y bien diseñado. En la mayoría de los diseños el chorro de aire pasa a través de las resistencias de calentamiento, después por medio de deflectores que conforman la pared interior del horno, pasan por la columna y de vuelta al ventilador para recalentarse y recircular. Los hornos se construyen usualmente con acero inoxidable delgado. Para la programación de temperatura es deseable disponer de un intervalo de velocidades de programación desde 0. 1 hasta 50ºC/min. Debe ser posible sostener la temperatura en cualquier momento dentro del programa durante un tiempo. En general, la resolución óptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la consecuencia de una reducción de temperatura es un aumento en el tiempo de elución, y por tanto del tiempo que se necesita para completar un análisis. Las temperaturas iniciales subambientales son útiles cuando se trabaja con columnas capilares. Las temperaturas se deben mantener alrededor de la temperatura deseada con precisión de ± 1ºC en el caso de trabajo isotérmico y de ± 2ºC. durante la programación de temperatura Detectores Durante el desarrollo de la cromatografía de gases se han investigado y utilizado docenas de detectores. En las secciones que siguen a continuación, se describen los utilizados más frecuentemente. En cromatografía de gases, un detector ideal tiene las siguientes características: 1. Adecuada sensibilidad. Lo que constituye una adecuada sensibilidad no se puede evaluar de forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los detectores que se van a describir difieren por un factor de Aunque todos se utilizan extensamente y son adecuados en ciertos casos; sin embargo, en algunas aplicaciones los menos sensibles no resultan convenientes. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10-8 a g de analito/s. 2. Buena estabilidad y reproducibilidad. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 32

33 3. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios órdenes de magnitud. 4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400ºC. 5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal. 6. Alta fiabilidad y manejo sencillo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos. 7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos. 8. No destructivo de la muestra. De hecho, no hay detector que reúna todas esas características, y tampoco parece probable que pueda llegar a diseñarse nunca Detector de ionización de llama (FID) En cromatografía de gases, el detector de ionización de llama (FID) es uno de los detectores más extensamente utilizado y, por lo general, uno de los más aplicables. En un quemador, el efluente de la columna se mezcla con hidrógeno y con aire para luego encenderse eléctricamente. La mayoría de los compuestos orgánicos, cuando se pirolizan a la temperatura de una llama de hidrógeno/aire, producen iones y electrones que pueden conducir la electricidad a través de la llama. Entre el extremo del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama, se aplica una diferencia de potencial de unos pocos cientos de voltios, y para la medición de la corriente que resulta (de unos A) se utiliza un amplificador operacional de alta impedancia. La ionización en la llama de los compuestos que contienen carbono no es un proceso bien establecido, aunque se observa que el número de iones que se produce es aproximadamente igual al de átomos de carbono transformados en la llama. El detector de ionización de llama debido a que es un detector que responde al número de átomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo, es un detector sensible a la masa, más que un sistema sensible a la concentración. En consecuencia, este detector tiene la ventaja de que los cambios en el caudal de la fase móvil tienen poco efecto sobre la respuesta del detector. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 33

34 Grupos funcionales, tales como carbonilo, alcohol, halógeno y amina, originan en la llama pocos iones o prácticamente ninguno. Además, el detector es insensible a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO2, y NOx. Esas propiedades hacen del detector de ionización de llama uno de los detectores generales más utilizado para el análisis de la mayoría de compuestos orgánicos, incluyendo aquellos que están contaminados con agua y con óxidos de nitrógeno y de azufre. El detector de ionización de llama posee una elevada sensibilidad (del orden de g/s), un gran intervalo lineal de respuesta (de 10 7 ), y un bajo ruido. Por lo general, es resistente y fácil de utilizar. Una desventaja del detector de ionización de llama es que se trata de un detector destructivo de la muestra Detector de conductividad térmica (TCD) Uno de los primeros detectores que se utilizaron en cromatografía de gases, y uno de los que todavía tiene una gran aplicación, se basa en los cambios en la conductividad térmica de la corriente de gas ocasionados por la presencia de las moléculas de analito. Este dispositivo se denomina a veces un catarómetro. El sensor de un catarómetro consiste en un elemento calentado eléctricamente cuya temperatura, a una potencia eléctrica constante, depende de la conductividad térmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino, oro o tungsteno, o también, un termistor semiconductor. La resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad térmica del gas. Para la configuración de los componentes del detector se emplean dos pares de elementos, uno de los pares se coloca en el flujo del efluente de la columna, y el otro en la corriente de gas previo a la cámara de inyección de la muestra. Alternativamente, la corriente de gas se puede dividir en dos corrientes una de las cuales atraviesa el inyector y la otra no. En cualquier caso, el efecto de la conductividad térmica del gas portador se compensa, y se minimizan los efectos de la variación de caudal, presión y potencia eléctrica. Las resistencias de los pares de detectores gemelos se comparan entre sí, incorporándolos en un circuito sencillo de puente de Wheatstone. Las conductividades térmicas del helio y del hidrógeno son aproximadamente de seis a diez veces mayores que las de la mayoría de los compuestos orgánicos, de modo que, incluso en presencia de pequeñas cantidades de materia orgánica, tiene lugar una disminución relativamente grande de la Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 34

35 conductividad térmica del efluente de la columna y, en consecuencia, el detector experimenta un marcado aumento en la temperatura. Las conductividades de los otros gases portadores son más parecidas a las de los constituyentes orgánicos y por esta razón con un detector de conductividad térmica debe usarse hidrógeno o helio como gas portador. Las ventajas del detector de conductividad térmica son su simplicidad, su amplio rango dinámico lineal (aproximadamente 10 5 ), su respuesta universal tanto a especies orgánicas como a inorgánicas, y su carácter no destructivo, lo que permite recoger los solutos tras la detección. Una limitación del catarómetro es su sensibilidad relativamente baja (aproximadamente 10-8 g de soluto/ml de gas portador). Otros detectores son de 10 4 a 10 7 veces más sensibles. Debería subrayarse que la baja sensibilidad de los detectores de conductividad térmica, hace imposible con frecuencia su utilización con columnas capilares, debido al pequeño tamaño de muestra con el que estas columnas operan Detector termoiónico de llama (FTD) El detector termoiónico (FTD) es un detector selectivo de los compuestos orgánicos que contienen fósforo y nitrógeno. Su respuesta a un átomo de fósforo es aproximadamente 10 veces mayor que a un átomo de nitrógeno, y de 10 4 a 10 6 veces superior que a un átomo de carbono. En comparación con el detector de ionización de llama, el detector termoiónico es unas 500 veces más sensible para los compuestos que contienen fósforo y unas 50 veces más sensible a las especies nitrogenadas. Estas propiedades hacen de la detección termoiónica un sistema particularmente útil para la detección y determinación de muchos pesticidas que contienen fósforo. Un detector termoiónico tiene una configuración similar al detector de llama. El efluente de la columna se mezcla con hidrógeno, pasa a través de la llama, y se quema. El gas caliente fluye alrededor de una bola de silicato de rubidio calentada eléctricamente, la cual se mantiene a unos 180 V con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800º C. Lo que ocurre exactamente en el plasma, que hace que se produzcan insólitamente una gran cantidad de iones a partir de las moléculas que contienen fósforo o nitrógeno, realmente no está bien establecido, pero el resultado es una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la determinación de compuestos que contienen esos dos elementos. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 35

36 Detector de captura de electrones (ECD) El detector de captura de electrones (ECD) opera casi de la misma forma que un contador proporcional para la medida de radiación X. En este caso el efluente de la columna pasa sobre un emisor, como níquel-63 o tritio (adsorbido sobre una lámina de platino o de titanio). Un electrón del emisor provoca la ionización del gas portador (con frecuencia se trata de nitrógeno) y la producción de una ráfaga de electrones. De este proceso de ionización, en ausencia de especies orgánicas, resulta una corriente constante entre un par de electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de moléculas orgánicas que tiendan a capturar los electrones. La respuesta es poco lineal, a no ser que el potencial a través del detector se aplique en forma de impulsos. El detector de captura de electrones es de respuesta selectiva, siendo muy sensible a las moléculas que contienen grupos funcionales electronegativos tales como halógenos, peróxidos, quinonas, y grupos nitro; en cambio, no es sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e hidrocarburos. Una aplicación importante del detector de captura de electrones es la detección y determinación de insecticidas clorados. Los detectores de captura de electrones son altamente sensibles y tienen la ventaja de no alterar la muestra de manera significativa (a diferencia del detector de llama). Por otra parte, su intervalo lineal de respuesta normalmente se limita a unos dos órdenes de magnitud Detector de emisión atómica (AED) El detector más reciente, para cromatografía de gases, se basa en la emisión atómica. En este dispositivo, el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido con microondas, que se acopla a un espectrómetro de emisión con series de diodos. El plasma es suficientemente energético como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos, y así obtener sus espectros de emisión característicos. Esos espectros son recogidos en un espectrómetro que utiliza una serie de diodos configurados en un plano móvil, que es capaz de detectar la radiación emitida desde 170 a 780 nm. La serie de diodos movible es capaz de controlar simultáneamente de dos a cuatro elementos en cada posición. Hasta el momento, el programa de tratamiento de datos suministrado con el detector permite medir la concentración de 15 elementos. Presumiblemente, un futuro software permitirá también la detección de otros elementos. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 36

37 La Figura 5.15 ilustra las posibilidades de este tipo de detector. En este caso la muestra es una gasolina que contiene una pequeña concentración de metil-terc-butiléter (MTBE), un agente antidetonante, además de varios alcoholes alifáticos a bajas concentraciones. El espectro superior, se obtuvo controlando la línea de emisión del carbono a 198 nm, y está constituido por una miríada de picos que sería imposible resolver e identificar. Por el contrario, cuando se utilizó la línea del oxígeno a 777 nm para obtener el cromatograma Figura Ejemplo de un cromatograma para una gasolina que contiene una pequeña cantidad de MTBE y varios alcoholes alifáticos. a) Monitorización de la línea para el carbono; b) monitorización de la línea para el oxígeno (Figura 5.15b), los picos de varios alcoholes y del MTBE se evidenciaron claramente y se identificaron con facilidad. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 37

38 Otros tipos de detectores Un espectrómetro de masas unido directamente al cromatógrafo es otro medio de llevar a cabo la detección de los compuestos separados cromatográficamente. A esta forma de detección se le dedicará un tema posteriormente. El detector fotométrico de llama se ha utilizado extensamente para el análisis de contaminantes del aire y del agua como los pesticidas y los hidrocarburos. Se trata de un detector selectivo que sobre todo es sensible a los compuestos que contienen azufre y fósforo. En este detector, el eluyente se hace pasar a través de una llama hidrógeno/aire a baja temperatura, la cual convierte parte del fósforo a una especie HPO que emite bandas de radiación centradas alrededor de 510 y 526 nm. El azufre de la muestra se convierte simultáneamente en S2, el cual emite una banda centrada en 394 nm. Para aislar esas bandas se emplean los filtros adecuados, y sus intensidades se registran fotométricamente. Con la fotometría de llama se han detectado otros elementos entre los que se incluyen los halógenos, nitrógeno y diversos metales, como el estaño, cromo, selenio y germanio. En el detector de fotoionización, el eluyente de la columna se irradia con un haz intenso de radiación ultravioleta de energía variable desde 8.3 a 11.7 ev ( = 149 a 106 nm), la cual provoca la ionización de las moléculas. Al aplicar un potencial a través de una celda que contiene los iones producidos, se origina una corriente de iones, la cual es amplificada y registrada COLUMNAS Y FASES ESTACIONARIAS PARA GLC Tipos de columnas Históricamente, los primeros estudios en cromatografía gas-líquido a principio de los años cincuenta se llevaron a cabo en columnas de relleno, en las cuales la fase estacionaria era una película delgada de líquido colocada en la superficie de un soporte sólido inerte y finamente dividido. Sin embargo, de los estudios teóricos realizados en este período inicial, se puso de manifiesto que las columnas no empaquetadas con diámetros interiores de unas pocas décimas de milímetro deberían proporcionar separaciones mucho mejores que las columnas de relleno, tanto en rapidez como en eficacia de columna. En estas columnas capilares, la fase estacionaria era una película uniforme de líquido con unas pocas décimas de micrómetro de grosor que recubría uniformemente el interior del tubo capilar. Este tipo de columnas abiertas se construyeron a finales de los años cincuenta, y las características de Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 38

39 funcionamiento predichas se confirmaron experimentalmente en distintos laboratorios, describiéndose la utilización de columnas abiertas con platos o más. En 1987, Chrompack International Corporation de Holanda, estableció un récord del mundo en longitud y número de platos teóricos de una columna capilar, que se inscribió en el Libro Guinness de los Récords. La columna era de sílice fundida fabricada en una sola pieza y con un diámetro interno de 0.32 mm y una longitud de 2100 m. La columna se recubrió con una película de 0.1 m de polidimetilsiloxano. Una sección de 1300 m de esta columna contenía sobre los dos millones de platos. A pesar de las características de funcionamiento tan espectaculares, no se generalizó el uso de las columnas capilares hasta más de dos décadas después de su aparición. Las razones de esta demora fueron diversas, entre ellas su capacidad, limitada a muestras pequeñas, la fragilidad de las columnas, algunos problemas mecánicos relacionados con la introducción de muestra y la conexión de la columna al detector, dificultades en la reproducibilidad del recubrimiento de la columna, columnas mal preparadas y de corta duración, tendencia de las columnas a obturarse, y las patentes, que limitaron el desarrollo comercial a un único fabricante (la patente original expiró en 1977). A finales de los años setenta esos problemas en parte habían dejado de serlo, y varias compañías suministradoras de instrumentación comenzaron a ofrecer columnas capilares a un precio razonable. Como consecuencia de ello, en los últimos años ha tenido lugar un considerable aumento de las aplicaciones de estas columnas. Actualmente, la mayoría de los análisis por cromatografía de gases/espectrometría de masas se realizan con columnas capilares Columnas de relleno Las actuales columnas de relleno se fabrican con tubo de vidrio, metal (acero inoxidable, cobre, aluminio), o de Teflón, con una longitud característica de 1 a 3 m y un diámetro interno de 2 a 4 mm. Estos tubos se empaquetan densamente con un material de relleno sólido, finamente dividido y homogéneo, que se recubre con una delgada capa (0,05 a 1 m) de la fase estacionaria líquida. Con objeto de poder introducirlas en un horno termostatizado, los tubos se configuran en forma helicoidal con un diámetro aproximado de unos 15 cm. Materiales de soporte sólidos. El soporte sólido en una columna de relleno sirve para retener y ubicar la fase estacionaria, de tal forma que haya la mayor superficie de contacto posible con la fase móvil. El soporte ideal consiste Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 39

40 en partículas esféricas, pequeñas, y uniformes con una buena resistencia mecánica y una superficie específica de al menos 1 m 2 /g. Además, el material debería ser inerte a elevadas temperaturas, y poder humectarse homogéneamente con la fase líquida. Todavía no se dispone de ninguna sustancia que reúna perfectamente todas esas características. En la actualidad, el material de soporte utilizado con más frecuencia se prepara a partir de tierras de diatomeas de procedencia natural, que están constituidas por esqueletos de miles de especies de plantas unicelulares que habitaban antiguos mares y lagos. Estas plantas tomaban sus nutrientes y eliminaban sus residuos por difusión molecular a través de sus poros. Como consecuencia, sus restos resultan muy adecuados como materiales de soporte, debido a que la cromatografía de gases se basa también en este tipo de difusión molecular. Tamaño de partícula de los soportes. La eficacia de la columna en cromatografía de gases, aumenta rápidamente cuando disminuye el diámetro de partícula del relleno. Sin embargo, la diferencia de presión que se requiere para mantener un determinado caudal de gas portador, varía inversamente con el cuadrado del diámetro de la partícula; esto último ha condicionado el límite inferior del tamaño de las partículas que se utilizan en cromatografía de gases, dado que no es conveniente trabajar con diferencias de presión superiores a los 4 bares. Como resultado, las partículas del soporte son, por lo general, de 60 a 80 mesh (250 a 170 m) o de 80 a 100 mesh (170 a 149 m) Columnas capilares Las columnas capilares, o capilares abiertas, son de dos tipos básicos, denominados capilares de pared recubierta (WCOT) y capilares con soporte recubierto (SCOT). Las columnas de pared recubierta son simplemente tubos capilares con la pared interna recubierta de una fina capa de fase estacionaria. En las columnas abiertas con soporte recubierto, la superficie interna del capilar está revestida de una fina capa (de unos 30 m) de un material soporte, tal como tierra de díatomeas. Este tipo de columnas contiene varias veces la fase estacionaria de una columna capilar de pared recubierta y, por tanto, tienen una mayor capacidad de carga. Generalmente, la eficacia de una columna SCOT es menor que la de una columna WCOT, pero es sensiblemente mayor que la de una columna de relleno. Al principio, las columnas WCOT se construían de acero inoxidable, aluminio, cobre o plástico, posteriormente se utilizó el vidrio. Con frecuencia las columnas de vidrio se trataban químicamente para transformarlas en una su- Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 40

41 perficie rugosa, donde la fase estacionaria se unía más fuertemente. Las nuevas columnas WCOT, que se introdujeron en 1979, son columnas tubulares abiertas de sílice fundida (columnas FSOT). Los capilares de sílice fundida se fabrican a partir de sílice especialmente purificada con un contenido mínimo de óxidos metálicos. Estos capilares tienen las paredes mucho más delgadas que sus equivalentes de vidrio. La resistencia de los tubos se refuerza con un recubrimiento externo protector de poliimida, el cual se aplica en el momento de la obtención del tubo capilar. Las columnas que resultan son flexibles y pueden doblarse en forma helicoidal con un diámetro de varios centímetros. Las columnas capilares de sílice están disponibles en el comercio, y ofrecen importantes ventajas tales como resistencia física, una reactívidad mucho menor frente a los componentes de la muestra y flexibilidad. En la mayoría de las aplicaciones, han sustituido a las antiguas columnas de vidrio WCOT. Las columnas capilares de sílice más frecuentemente utilizadas tienen diámetros internos de 320 y 250 m. También se venden columnas de alta resolución, con diámetros de 200 y 150 m. La utilización de estas columnas es más problemática y son más exigentes con respecto a los sistemas de detección y de inyección. Por ejemplo, se ha de utilizar un divisor de muestra para reducir el tamaño de la muestra inyectada en la columna, y se requiere un sistema de detección más sensible con un tiempo de respuesta rápido. En la Tabla 5.3 se comparan las características de funcionamiento de las columnas capilares de sílice fundida con las de otros tipos de columnas como las de pared recubierta, y también las de soporte recubierto y las de relleno. Adsorción sobre los rellenos de la columna o las paredes de capilar. Uno de los problemas que siempre ha afectado a la cromatografia de gases, ha sido la adsorción física de los analitos polares o polarizables sobre las superficies de silicato de los soportes de las columnas o de las paredes del capilar. La adsorción da como resultado picos distorsionados, los cuales se ensanchan y a menudo presentan cola. Se ha demostrado que la adsorción se produce como consecuencia de los grupos silanol que se forman en la superficie de los silicatos debido a la humedad. Los grupos SiOH presentes en la superficie del soporte tienen una gran afinidad por las moléculas orgánicas polares, y tienden a retenerlas por adsorción. Los materiales soporte pueden desactivarse por sililación con dimetilclorosilano (DMCS) seguido de un lavado con alcohol. Las superficies Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 41

42 sililadas de los soportes todavía pueden mostrar una adsorción residual, que al parecer se produce debido a las impurezas de óxidos metálicos presentes en la tierra de diatomeas. Un lavado ácido previo a la sililación elimina estas impurezas. La sílice fundida que se utiliza para la fabricación de columnas tubulares abiertas está en gran parte libre de este tipo de impurezas; en consecuencia, con las columnas de sílice fundida se tienen menos problemas de adsorción. Tabla 5.3. Propiedades y características de las columnas para cromatografía de gases La fase estacionaria En una columna cromatográfica de gas-líquido las propiedades deseables para una fase líquida inmovilizada incluyen: 1.- Baja volatilidad (idealmente, el punto de ebullición del líquido debe ser al menos 100º C mayor que la temperatura de trabajo máxima de la columna) 2.- Estabilidad térmica 3.- Químicamente inerte; (4) características de disolvente tales que los valores de k' y de los solutos a resolver estén dentro de un intervalo conveniente. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 42

43 Durante el desarrollo de la cromatografía gas-líquido se han propuesto miles de disolventes como fases estacionarias. Por ahora, sólo un puñado -tal vez una docena o menos son suficientes para la mayoría de aplicaciones. La elección adecuada entre esos disolventes es una etapa crítica para el éxito de la separación; de hecho existen guías cualitativas para realizar la elección, pero al final, la mejor fase estacionaria solamente se puede determinar en el laboratorio. El tiempo de retención de un soluto en una columna depende de su coeficiente de distribución, el cual a su vez está relacionado con la naturaleza química de la fase estacionaria; es por ello que, para ser útil en cromatografía gas-líquido, el líquido inmovilizado ha de originar diferentes coeficientes de distribución para los distintos solutos. Además, estos coeficientes no deben ser ni extremadamente grandes ni extremadamente pequeños, dado que los primeros producen tiempos de retención prohibitivamente largos y los últimos dan como resultado tiempos tan cortos que las separaciones son incompletas. Para que una especie tenga un tiempo de residencia razonable en la columna, debe poseer cierto grado de compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria, Aquí, se aplica el principio de «semejante disuelve semejante», donde «semejante» se refiere a las polaridades del soluto y del líquido inmovilizado La tabla 3.2 relaciona en orden de polaridad creciente las fases estacionarias más frecuentemente utilizadas en columnas de cromatografía de gases, tanto de relleno como capilares. Probablemente, esos seis líquidos pueden proporcionar separaciones satisfactorias para el 90% o más de las muestras con que se puede encontrar el científico. La figura 5.16 ilustra alguna de las aplicaciones en columnas capilares de las fases ilustradas en la tabla 5.4. Fases estacionarias polimerizadas y enlazadas. Las columnas comerciales están disponibles con fases estacionarias polimerizadas y/o enlazadas. El enlace y el entrecruzamiento tienen por objeto la preparación de una fase estacionaria de larga duración, que se pueda limpiar con un disolvente cuando la película se contamine. Con el uso, las columnas que no han sido tratadas pierden lentamente su fase estacionaria debido al «sangrado», en el cual una pequeña cantidad de líquido inmovilizado es arrastrada fuera de la columna durante el proceso de elución. El sangrado se acentúa cuando una columna debe limpiarse con un disolvente para eliminar los contaminantes. La unión química y el entrecruzamiento inhiben el sangrado. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 43

44 El enlace implica la unión, mediante una reacción química, de una capa mono molecular de la fase estacionaria a la superficie de sílice de la columna. En las columnas comercializadas, la naturaleza de las reacciones que se utilizan normalmente es objeto de patente. Grosor de película. Las columnas comercializadas están disponibles con fases estacionarias cuyo grosor varía de 0.1 a 5 m. El grosor de la película afecta principalmente a las características de retención y a la capacidad de la columna. Las películas gruesas se utilizan con analitos muy volátiles, debido a que tales películas retienen más tiempo a los solutos, y así proporcionan un mayor tiempo para que pueda tener lugar la separación; por otra parte, las películas delgadas son útiles para separar especies de baja volatilidad en un tiempo razonable. Para la mayoría de las aplicaciones con columnas de 0.25 o 0.32 mm, se recomienda un grosor de película de 0.25 m. Con columnas macrocapilares se utilizan películas de 1 a 1.5 m Tabla 5.4. Algunas fases estacionarias comunes en cromatografía gas-líquido Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 44

45 Figura Cromatogramas característicos obtenidos con columnas capilares recubiertas con a) 5% OV-1, b) 5% OV-3, c) 50% OV-17, d) 50% OV-210, e) polietilenglicol y f) OV APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO Para evaluar la importancia de la GLC, es necesario distinguir entre los dos papeles que desempeña la técnica. El primero como herramienta para realizar separaciones; en este sentido, resulta inmejorable cuando se aplica a muestras orgánicas complejas, a organometálicos y a sistemas bioquímicos. El segundo, una función claramente distinta, es el de proporcionar un medio para llevar a cabo un análisis. En este caso se emplean los tiempos o volúmenes de retención para la identificación cualitativa, mientras que las alturas de los picos o sus áreas dan información cuantitativa. Con fines cualitativos, la GLC es una técnica mucho más limitada que otros métodos. En consecuencia, una tendencia importante en este campo ha consistido en la combinación de las notables cualidades para el fraccionamiento que tiene la GLC con las mejores Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 45

46 propiedades para la identificación que tienen algunos instrumentos como los espectrómetros de masas, infrarrojo y NMR Análisis cualitativo Los cromatogramas se utilizan a menudo como criterio de pureza de compuestos orgánicos. Los contaminantes, si están presentes, se manifiestan por la aparición de picos adicionales; las áreas de estos picos proporcionan una estimación aproximada del grado de contaminación. La técnica también es útil para evaluar la efectividad de los procedimientos de purificación. En teoría, los tiempos de retención deberían servir para la identificación de los componentes de una mezcla. Sin embargo, la aplicabilidad de tales datos está limitada por el número de variables que han de controlarse para obtener resultados reproducibles. No obstante, la cromatografla de gases es un medio excelente para confirmar la presencia o ausencia de un supuesto componente en una mezcla, siempre que se disponga de un patrón. Tras la adición del compuesto conocido a la muestra, el cromatograma no debe presentar ningún pico nuevo, y debe observarse el aumento de alguno de los picos existentes. La prueba es particularmente convincente si el resultado se repite con columnas diferentes y a distintas temperaturas, Factores de selectividad Si se elige una sustancia patrón B, entonces el factor de selectividad puede proporcionar un índice para la identificación del compuesto A, el cual es en gran parte independiente de las variables de la columna excepto la temperatura; esto es, pueden obtenerse tablas numéricas de factores de selectividad para compuestos puros relativos a un estándar común, y entonces utilizarse para la caracterización de solutos. Desafortunadamente, no es posible encontrar un patrón universal que permita obtener factores de selectividad de una magnitud razonable para todos los tipos de analitos. Así, el conjunto de factores de selectividad disponibles actualmente en la literatura es limitado Índice de retención El índice de retención I fue propuesto por primera vez por Kovats en 1958 como un parámetro para identificar solutos a partir de los cromatogramas. El índice de retención para un soluto dado puede deducirse del cromatograma de una mezcla del soluto y de al menos dos alcanos normales (de cadena lineal) que tengan unos tiempos de retención tales, que el del soluto Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 46

47 considerado quede entre los mismos. Esto es, los alcanos normales son los patrones en los que se basa la escala de índices de retención. Por definición, el índice de retención para un alcano normal es igual a 100 veces el número de carbonos del compuesto sin considerar el relleno de la columna, la temperatura u otras condiciones cromatográficas. El índice de retención para todos aquellos compuestos que no sean alcanos normales varía, a menudo varios cientos de unidades de índice de retención, con las variables de la columna. Es bien conocido que en una serie homóloga al representar el logaritmo del tiempo de retención ajustado frente al número de átomos de carbono se obtiene una gráfica lineal. Los índices de retención de un compuesto se deducen por interpolación a partir de un cromatograma de una mezcla del soluto de interés y dos o más alcanos. patrón. Es importante subrayar que el índice de retención para un alcano normal es independiente de la temperatura y del relleno de la columna. Así, I para el heptano, por definición, siempre es 700. Por el contrario, los índices de retención de los demás solutos con frecuencia pueden variar considerablemente de una columna a otra. Por ejemplo, el índice de retención del acenafteno en una fase estacionaria de polidimetilsiloxano polimerizado, a 140 ºC es Con 5% fenil polidimetilsiloxano como fase estacionaria, a la misma temperatura resulta ser 1500, mientras que con poli etilenglicol como fase estacionaria, el índice de retención es El sistema de índices de retención tiene la ventaja de basarse en materiales de referencia disponibles fácilmente que cubren un amplio intervalo de puntos de ebullición. Además, la dependencia de los índices de retención con la temperatura es relativamente pequeña Análisis cuantitativo La señal del detector de una columna cromatográfica gas-líquido se ha utilizado generalmente para análisis cuantitativos y semicuantitativos. En condiciones cuidadosamente controladas se consigue una exactitud (relativa) del 1 %. Como con la mayoría de los instrumentos analíticos, la fiabilidad se relaciona directamente con el control de las variables; la exactitud también depende en parte de la naturaleza de la muestra. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 47

48 La discusión general del análisis cuantitativo cromatográfico, dada anteriormente, se aplica tanto a la cromatografia de gases como a otros tipos; por esta razón no se hacen aquí más consideraciones sobre este aspecto CROMATOGRAFÍA GAS-SÓLIDO La cromatografía gas-sólido se basa en la adsorción de sustancias gaseosas sobre superficies sólidas. Los coeficientes de distribución son generalmente mucho mayores que en el caso de la cromatografía gas-líquido. En consecuencia, la cromatografía gas-sólido es útil para la separación de especies que no se retienen en columnas de gas-líquido, tales como los componentes del aire, sulfuro de hidrógeno, disulfuro de carbono, óxidos de nitrógeno, monóxido de carbono, dióxido de carbono y los gases nobles. La cromatografía gas-sólido se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en capilares. En estas últimas, se fija en las paredes del capilar una delgada capa de adsorbente; estas columnas a veces se denominan columnas tubulares abiertas de capa porosa, o columnas PLOT. Se encuentran dos tipos de adsorbentes: los tamices moleculares y los polímeros porosos. Tamices moleculares. Los tamices moleculares son intercambiadores de iones de silicato de aluminio, cuyo tamaño de poro depende del tipo de catión presente. Los preparados comerciales de estos materiales están disponibles en tamaños de partícula de mesh a mesh. Los tamices se clasifican de acuerdo con el diámetro máximo de las moléculas que pueden entrar en los poros. Los tamices moleculares comerciales se encuentran con tamaños de poro de 4, 5, 10 y 13 Angstroms; las moléculas más pequeñas penetran en el interior de las partículas donde tiene lugar la adsorción; para estas moléculas el área superficial disponible es enorme cuando se compara con el área disponible para las moléculas más grandes. Por ello, los tamices moleculares se pueden utilizar para separar las moléculas pequeñas de las grandes. Por ejemplo, un relleno de 5 Angstroms y 180 cm, a temperatura ambiente separará fácilmente una mezcla de helio, oxígeno, nitrógeno, metano y monóxido de carbono en este orden. La Figura 5.17 muestra un -típico cromatograma obtenido con tamices moleculares. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 48

49 Polímeros porosos. Las bolas de polímeros porosos de tamaño uniforme se fabrican a partir de estireno polimerizado con divinilbenceno. El tamaño de poro en estas bolas es uniforme y se controla por el grado de polimerización. Los polímeros porosos han encontrado una gran aplicación en la separación de especies polares gaseosas tales como sulfuro de hidrógeno, óxidos de nitrógeno, agua, dióxido de carbono, metanol y cloruro de vinilo. Figura 5.17 Ejemplos típicos de cromatografía gas sólido. a) Columna de 1.5 m x 3 mm,b) columna PLOT de polímero poroso de 30 m x.5 mm 5.7. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN En esta parte trata de los cuatro tipos básicos de cromatografía en los que la fase móvil es un líquido: (1) cromatografía de reparto (2) cromatografía de adsorción, o líquido-sólido (3) cromatografía iónica (4) cromatografía de exclusión por tamaños, o en geles En una primera etapa la cromatografía de líquidos se realizaba en columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 49

50 este tipo de columnas realizó Tswett sus trabajos originales. Para asegurar unos caudales razonables, el diámetro de las partículas de la fase estacionaria sólida por lo general era de 150 a 200 m. Incluso así, los caudales eran bajos, llegando a unas pocas décimas de mililitro por minuto. En consecuencia, los tiempos de separación eran largos -a menudo de varias horas-. Los intentos para acelerar el procedimiento clásico mediante la aplicación de vacío, o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba un aumento de la altura de plato por encima del mínimo característico que se observa en las gráficas de la altura de plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia. En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografía de líquidos, los científicos se dieron cuenta de que se podían conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tamaño de las partículas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta finales de los años sesenta cuando se desarrolló la tecnología adecuada para producir y utilizar rellenos de tamaño de partícula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnología requiere una instrumentación sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografía de líquidos clásica. Para distinguir estos procedimientos más nuevos de los métodos básicos, que todavía se utilizan con fines preparativos, se emplea la denominación de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Es incuestionable que la cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la cifra de cientos de miles de millones de pesetas. Las razones de la popularidad de esta técnica son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies organometálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas. La Figura 5.18 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la cromatografía de líquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de aplicación se refiere. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 50

51 Así, para solutos con masas moleculares superiores a , a menudo se utiliza la cromatografía de exclusión, aunque ahora también es posible tratar estos compuestos con cromatografia de reparto en fase inversa. Para especies iónicas de baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografia de intercambio iónico. Figura Aplicaciones de la cromatografía de líquidos Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 51

52 Los métodos de reparto se aplican a las especies poco polares pero no iónicas. Además, este procedimiento se utiliza muchas veces para la separación de los integrantes de una serie homóloga. La cromatografia de adsorción se elige con frecuencia para separar compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifáticos de los alcoholes alifáticos. Por otro lado, la discusión sobre el ensanchamiento de banda del tema 2 es aplicable a la cromatografia de líquidos. A continuación se ilustra el importante efecto del tamaño de partícula del relleno y se describen otras dos causas del ensanchamiento de zona, que a veces son de notable importancia en cromatografia de líquidos, Efectos del tamaño de partícula del relleno. El coeficiente de transferencia de masa de la fase móvil es función inversa del cuadrado del diámetro de las partículas que constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de una columna de HPLC debería mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamaño de partícula. Por ejemplo una reducción del tamaño de partícula de 45 a 6 m origina una disminución de diez o más veces de la altura de plato. Ensanchamiento de banda extra columna en cromatografía de líquidos. En cromatografia de líquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de banda extra columna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a través de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección, en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de la diferente velocidad de flujo que hay entre las capas de líquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve con más rapidez que la periferia. En cromatografia de gases la difusión compensa la dispersión extra columna. Sin embargo, la difusión en los líquidos es significativamente menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente. Cuando se utilizan columnas de pequeño diámetro, el ensanchamiento extra columna puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de orientarse a la reducción del radio de los tubos del sistema externos a la columna. Efecto del tamaño de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de muestra ( g de muestra/g de relleno) también afecta a la eficacia de la columna. Para las aplicaciones con columnas de reparto y adsorción, la eficacia decrece notablemente con la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia es mucho más pequeño. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 52

53 INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografía de líquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografia. La Figura 5.19 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico. Cada uno de los componentes se trata en los párrafos que siguen a continuación. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 53

54 Figura Esquema de un aparato de HPLC

55 Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 ml de un disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos -en general oxígeno y nitrógeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura 5.19, sistemas de difusión que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vacío a través de un filtro de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la materia en suspensión. Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se denomina una elución isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación se aumenta notablemente por una elución con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo están equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una velocidad que varía continuamente y la relación de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo. La Figura 5.19 ilustra la ventaja de una elución con gradiente en la separación de una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elución isocrática con metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elución con gradiente, que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la concentración de metanol un 8%/min. Obsérvese que la elución con gradiente acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la resolución de los primeros picos. Nótese también que la elución

56 con gradiente produce unos efectos similares a los producidos por la programación de temperatura en cromatografía de gases Sistemas de bombeo Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen: (1) La generación de presiones por encima de 400 kg/cm 2 (2) Un flujo libre de pulsaciones (3) Un intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min (4) El control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo (5) Componentes resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o teflón). Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosión, debido a que los líquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema sólo supone una pérdida de disolvente. Es evidente que esta pérdida puede suponer un riesgo de incendio. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 56

57 Figura Mejora de la eficiencia de la separación mediante la elución con gradiente. Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1% Permaphase ODS. Muestra: 5 L de bencenos clorados en isopropanol. Detector: fotómetro de UV (254 nm). Condiciones: temperatura 60ºC, presión 80 kg/cm 2. (a) Elución con gradiente: metanol 40% / agua 60% e incremento de la proporción de metanol a una velocidad de un 8% / min (b) Elución isocrática con metanol 50% / agua 50% Tipos de bombas Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante. Las bombas recíprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una pequeña cámara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas recíprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la línea base en el cromatograma. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 57

58 Entre las ventajas de las bombas recíprocas se pueden citar su pequeño volumen interno (35 a 400 ml), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm 2 ), su fácil adaptación a la elución con gradiente, y sus caudales constantes, que son prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del disolvente Amortiguadores de pulsos Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de flujo. Un método sencillo de amortiguación contiene un fuelle flexible o un gas compresible en la porción superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energía de pulsación. Cuando la bomba se rellena esta energía se libera para ayudar a suavizar la pulsación de presión. Los amortiguadores electrónicos de pulsos proporcionan una carrera hacia delante corta y rápida del pistón, y enseguida la carrera rápida de recarga de la bomba. El pequeño impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando disolvente a la presión del sistema Control del caudal y sistemas de programación Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudal mediante la determinación de la caída de presión a través de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la señal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba. Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la composición del disolvente bien sea de una forma continua o bien de forma escalonada Sistemas de inyección de muestra A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños, de unas pocas décimas de micro litro a tal vez 500 L. Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. En cromatografía de líquidos el método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la Figura Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 58

59 Estos dispositivos están normalmente integrados en el equipo cromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm 2 con una precisión relativa de unas décimas por ciento. También existen válvulas de inyección de micromuestras, con bucles con volúmenes de 0,5 a 5 L. Figura.5.21 Bucle de muestra para cromatografía de líquidos Columnas para cromatografía de líquidos Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de diámetro interno uniforme. Cientos de columnas empaquetadas que difieren en tamaño y relleno se comercializan por distintos fabricantes y su coste oscila, según el país de compra Columnas analíticas La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud entre 5 y 30 cm. Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 m. Tal vez la columna más frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro interno, y empaquetada con partículas de 5 m. Estas columnas tienen de a platos/metro. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 59

60 También, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener diámetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partículas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo consumo de disolvente. La última propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son muy caros Precolumnas En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. Además, en cromatografía líquido-líquido, la precolumna sirve para saturar la fase móvil con la fase estacionaria y así minimizar las pérdidas de ésta en la columna analítica. La composición del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión Termostatos En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas décimas de grado centígrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las décimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 ºC. Para poder controlar con precisión la temperatura, las columnas también se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un baño a temperatura constante Tipos de rellenos de la columna En cromatografía de líquidos se han utilizado dos tipos básicos de rellenos, pelicular y de partícula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros característicos de 30 a 40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o de una resina de intercambio iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por adsorción. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 60

61 Las bolas también se pueden tratar químicamente para obtener una capa superficial orgánica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas analíticas. Los típicos rellenos de partículas porosas de cromatografía de líquidos están formados por micropartículas porosas con diámetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersión posible para un tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina o resinas de intercambio iónico, aunque la sílice es el material más común. Las partículas de sílice se sintetizan aglomerando partículas de sílice de tamaños inferiores al micrón en unas condiciones tales que se forman partículas mayores con diámetros muy uniformes. Las partículas que resultan se recubren muchas veces con películas orgánicas, que se unen química o físicamente a la superficie Detectores A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionización de llama y de conductividad térmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores. Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda. Los detectores en cromatografia de líquidos son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil. En la Tabla 5.4 se indican los detectores más comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades más importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos publicados en los que tenía un papel importante la cromatografia de líquidos, reveló que el 71 % se utilizaban en la detección de la absorción UV, el 15% la fluorescencia, el 5,4% el índice Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 61

62 de refracción, el 4,3% empleaba medidas electroquímicas y el 4,3% restante otras medidas Detectores de absorbancia La Figura 5.22 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la medida de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatográfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volúmenes se limitan por lo común de 1 a 10 L y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilización de cubetas de este tipo está restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm 2. Tabla 5.4. Características de los detectores de HPLC Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 62

63 Figura 5.22 Celda de detector ultravioleta en HPLC Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoeléctricos contrastados. También se utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la absorbancia. Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. Lo más común en estos casos es aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos también se pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a alguna de estas longitudes de onda. Algunos grupos funcionales orgánicos y diversas especies inorgánicas exhiben una banda ancha de absorción a una o más de esas longitudes de onda. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 63

64 Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores. La mayoría de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que consisten en un espectrofotómetro de barrido con óptica de red. Algunos se limitan a la radiación ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiación ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente, cuando los picos que eluyen están suficientemente separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. En este caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se desean los espectros completos con fines de identificación, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el barrido de la región de longitud de onda que interesa. Los detectores espectrofotométricos de ultravioleta más potentes son los instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos, que permiten recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente un segundo. De esta forma, los datos espectrales para cada pico cromatográfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo de la columna. Una de las formas de presentación de los datos espectrales, que resulta útil para la identificación de las especies y para elegir las condiciones de la determinación cuantitativa, consiste en un gráfico tridimensional tal como el que se muestra en la Figura 5.23 En este caso, los espectros se obtuvieron a intervalos de cinco segundos. La aparición y desaparición de cada uno de los esteroides en el efluente de la columna resulta evidente. Detectores de absorbancia en el infrarrojo. Comercialmente se ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro semicirculares. El segundo, mucho más sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier. Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiación ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volúmenes de 1.5 a 10 L. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 64

65 Los instrumentos de infrarrojo más sencillos pueden trabajar a una o más longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elución. Los instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera análoga a los instrumentos de series de diodos para las medidas de absorbancia ultravioleta que se han descrito en la sección anterior. Figura Espectros de absorción del efluente de una columna de HPLC tomados a intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides. Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de absorción infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prácticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones Detectores de fluorescencia Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorímetros y espectrofluorímetros. En la mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 65

66 fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia probablemente se basarán en el uso de fuentes de láser sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y selectividad. Una ventaja inherente a los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser más de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografía de líquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separación y determinación de los componentes fluorescentes de las muestras Detectores de índice de refracción Estos detectores miden la diferencia de índice de refracción, entre el disolvente que en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el efluente de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación de un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variación de la señal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma. Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografia de gases. Además, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente Detector de dispersión de luz Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la HPLC, el detector de dispersión de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las finas gotitas se llevan a través de un tubo de conducción a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase móvil, lo que origina unas finas partículas de analito. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz láser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada perpendicularmente al flujo. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 66

67 Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no volátiles. Además es notablemente más sensible que el detector de índice de refracción Detectores electroquímicos Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores electroquímicos. Estos dispositivos se basan en cuatro métodos electroanalíticos que incluyen la amperometría, la voltamperometría, la coulombimetría y la conductimetría TIPOS DE CROMATOGRAFÍA HPLC Cromatografía de reparto La cromatografia de reparto ha llegado a ser el tipo de cromatografia de líquidos más ampliamente utilizado. En el pasado, la mayoría de las aplicaciones se han referido a compuestos polares no iónicos de baja a moderada masa molecular < 3000). Sin embargo, recientemente se han desarrollado algunos métodos que han extendido las separaciones de reparto a los compuestos iónicos. La cromatografia de reparto se puede subdividir en cromatografia líquido-líquido y cromatografía con fases unidas químicamente (enlazadas). La diferencia entre estas técnicas radica en la forma como se retiene la fase estacionarla sobre las partículas soporte del relleno. En líquido líquido, la fase estacionaria líquida se retiene sobre la superficie del soporte por adsorción física. En fase unida químicamente, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. La cromatografia de reparto, al principio era del tipo líquido-líquido; sin embargo, en la actualidad los métodos de fase enlazada son los que predominan debido a las desventajas de los sistemas líquido-líquido. Una de esas desventajas es la pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil, lo que hace necesario un periódico recubrimiento de las partículas del soporte. Por otra parte, el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide el uso de los rellenos de fase líquida en la elución con gradiente. La discusión se centrará exclusivamente en la cromatografia de reparto con fases unidas químicamente. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 67

68 Columnas para cromatografía con fases unidas químicamente En cromatografia de reparto, los soportes para casi todos los rellenos con fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones constituidas básicamente por sílice. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 m. La superficie de la sílice totalmente hidrolizada está constituida por grupos SiOH químicamente reactivos. Las superficies de sílice características contienen cerca de 8 mol/m 2 de grupos SiOH. Los recubrimientos de fase enlazada más utilizados son los siloxanos, que se forman por reacción de la superficie hidrolizada con un organoclorosilano. Rellenos de fase inversa y de fase normal. En relación con las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria, se distinguen dos tipos de cromatografia de reparto. Inicialmente, la cromatografía de líquidos utilizaba fases estacionarias de elevada polaridad tales como el agua o el trietilenglicol colocadas sobre partículas de sílice o alúmina. Por razones históricas, a este tipo de cromatografia se le conoce ahora como cromatografía en fase normal. En la cromatografía en fase inversa (o reversa), la fase estacionaria es no polar, con frecuencia se trata de un hidrocarburo, y la fase móvil es relativamente polar (como el agua, el metanol o el acetonitrilo). En cromatografia en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente es el más soluble en la fase móvil y un aumento de la polaridad de la fase móvil provoca una disminución del tiempo de elución. Por contraste, en los métodos en fase inversa, los componentes más polares aparecen primero, y un aumento de la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución. Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento unido químicamente tiene un carácter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Tal vez las tres cuartas partes de toda la cromatografía de líquidos de alta resolución se llevan a cabo normalmente con rellenos de fase inversa. Por lo general, el grupo R del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (n-octadecilo). En estas preparaciones, los grupos de hidrocarburo de cadena larga se alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partícula, dando una estructura semejante a una brocha o a un cepillo. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 68

69 La Figura 5.24 ilustra el efecto de la longitud de la cadena del grupo alquilo sobre la eficiencia. Como se esperaba, las cadenas más largas originan rellenos que muestran una mayor retención. Además, una mayor longitud de la cadena permite una mayor cantidad de muestra. En la mayoría de las aplicaciones de la cromatografia en fase inversa, la elución se lleva a cabo con una fase móvil de elevada polaridad como es el caso de una solución acuosa conteniendo concentraciones diversas de disolventes como metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. Se ha de procurar que el ph sea menor de, aproximadamente, 7,5 porque si no puede tener lugar la hidrólisis del siloxano, lo que originaría la degradación o destrucción del relleno. Con rellenos de fase enlazada en fase normal, R en la estructura del siloxanos es un grupo funcional polar como es el caso de los grupos ciano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH20H), amino (-C3H6NH2) y los dimetilamino (-C3H6N(CH3)2. Las polaridades de estos materiales de relleno varían en un gran intervalo, siendo el tipo ciano el menos polar y el tipo amino el más polar. Los rellenos de diol son de una polaridad intermedia. Con los rellenos de fase normal, la elución se realiza con disolventes relativamente no polares, tales como el etiléter, el cloroformo y el n-hexano. Figura5.24. Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia de las columnas de siloxano en fase inversa empaquetadas con partículas de 5 m. Fase móvil: 50/50 metanol/agua. Caudal 1 ml/min Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 69

70 Establecimiento del método en cromatografía de reparto En Cromatografia de líquidos, el establecimiento del método tiende a ser más complejo que en Cromatografia de gases, debido a que cuando la fase móvil es líquida, los componentes de la muestra interaccionan con ambas fases, la estacionaria y la móvil. Por el contrario, en la cromatografía de gases, la fase móvil se comporta como un gas ideal y no contribuye al proceso de separación; sólo sirve como portador de los componentes de la muestra a través de la fase estacionaria. Es decir, en cromatografía de gases, el que la fase móvil sea helio, nitrógeno o hidrógeno no afecta significativamente a la separación. Muy al contrario, el éxito de una separación cromatográfica de reparto depende de que la fase móvil sea acetonitrilo, hexano o bien dioxano. Selección de la columna en las separaciones cromatográficas de reparto. Una buena cromatografía con fases móviles interactivas, requiere un equilibrio adecuado entre las fuerzas intermoleculares existentes entre los tres participantes activos en el proceso de la separación -el soluto, la fase móvil y la fase estacionaria. Estas fuerzas intermoleculares se describen cualitativamente en términos de polaridad relativa de cada uno de los reactivos. Las polaridades en orden creciente para varios grupos funcionales del analito son: hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes. El agua es más polar que cualquier compuesto que contenga alguno de los anteriores grupos funcionales. Al elegir una columna para una separación cromatográfica de reparto, la polaridad de la fase estacionaria ha de ser bastante similar a la de los analitos, y para la elución se utiliza entonces una fase móvil con una polaridad considerablemente distinta. Este procedimiento por lo general resulta más adecuado que si las polaridades del soluto y de la fase móvil son parecidas pero difieren mucho con respecto a la fase estacionaria. En este caso, la fase estacionaria a menudo no puede competir efectivamente por los componentes de la muestra, y los tiempos de retención se hacen demasiado cortos para las aplicaciones prácticas. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 70

71 En el otro extremo, por supuesto, se encuentra el caso de que las polaridades del soluto y de la fase estacionaria sean demasiado parecidas y totalmente distintas de la fase móvil; en estas circunstancias, los tiempos de retención se hacen excesivamente largos. En resumen pues, si se quieren obtener buenas separaciones en un tiempo razonable, las polaridades del soluto, de la fase móvil y de la fase estacionaria se han de armonizar cuidadosamente. Por desgracia, las teorías que relacionan las interacciones de la fase móvil y la fase estacionaria con una serie determinada de componentes de una muestra son imperfectas, y en el mejor de los casos, un científico sólo puede elegir la fase estacionaria de una manera general. Una vez hecha la elección, el científico ha de realizar una serie de ensayos tentativos obteniendo los cromatogramas con varias fases móviles hasta que se llega a una separación satisfactoria. Si la resolución de todos los componentes de la mezcla resulta imposible, se ha de elegir otro tipo de columna. Selección de la fase móvil en la cromatografía de reparto De los tres métodos para mejorar la resolución de una columna cromatográfica basados en la variación del número de platos, factor de capacidad k y factor de selectividad, en cromatografia de líquidos, el factor de capacidad k es el que más fácilmente se puede manipular de los tres, debido a que este parámetro depende considerablemente de la composición de la fase móvil. Tal como se ha subrayado anteriormente, para una eficiencia óptima, k debería estar en el intervalo comprendido entre 2 y 5; sin embargo, para mezclas complejas, este intervalo se ha de extender tal vez de 0.5 a 20 para que todos los picos de los componentes tengan tiempo de aparecer. En algunas ocasiones, el ajuste de k' no es suficiente para obtener picos individuales sin superposición y entonces se ha de recurrir a la variación de los factores de selectividad. De nuevo en este caso, la forma más simple de producir variaciones en es modificando la composición de la fase móvil, procurando sin embargo, mantener k dentro de un intervalo razonable. Alternativamente, se puede cambiar eligiendo un relleno de columna distinto. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 71

72 Efecto de la fuerza del disolvente sobre los factores de capacidad. Los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos a menudo se les denomina disolventes «fuertes» o disolventes polares. Para describir cuantitativamente la polaridad de los disolventes, se han desarrollado varios índices. El más útil para la cromatografía de reparto parece ser el índice de polaridad P desarrollado por Synder. Este parámetro se basa en las medidas de la solubilidad para la sustancia en cuestión en tres disolventes: dioxano (un aceptor de protones de dipolo débil), nitrometano (un aceptor de protones de dipolo intenso) y el etanol (un donador de protones de dipolo intenso). El índice de polaridad es una medida numérica de la polaridad relativa de varios disolventes. La Tabla 5.52 lista los índices de polaridad (y otras propiedades) para varios disolventes que se utilizan en cromatografia de reparto. Obsérvese que el índice de polaridad varía de 10.2 para un compuesto muy polar como el agua hasta 2 para los fluoroalcanos muy poco polares. Cualquier índice de polaridad que se desee entre esos límites se puede conseguir por mezcla de dos disolventes adecuados. Anteriormente se ha subrayado que la forma más fácil de mejorar la resolución cromatográfica de dos especies es manipulando el factor de capacidad k, el cual puede a su vez modificarse cambiando el índice de polaridad del disolvente. En este caso, el control de P se consigue con facilidad utilizando fases móviles consistentes en mezclas de dos disolventes. Por lo común, un cambio de 2 unidades en P origina (muy aproximadamente) una variación de diez veces en k Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 72

73 Tabla 5.5. Propiedades de las fases móviles cromatográficas más comunes Muchas veces, en las separaciones en fase inversa, se emplea una mezcla de disolventes formada por agua y un disolvente orgánico polar. El factor de capacidad se manipula entonces fácilmente variando la concentración de agua. El efecto de estas manipulaciones se puede observar en los cromatogramas de las Figuras 5.25 a y b, donde la muestra es una mezcla de seis esteroides. Con una mezcla del 41 % de acetonitrilo y 59% de agua, k tiene un valor de 5, y los demás analitos se eluyen en un tiempo tan corto (aproximadamente 2 min) que la separación resulta bastante incompleta. Al aumentar el porcentaje de agua a 70, la elución tiene lugar en 7 min, lo que dobla el valor de k. En estas circunstancias el tiempo total de elución es suficiente para permitir la separación, aunque el valor de alfa para los compuestos 1 y 3 no sea lo suficientemente grande para una buena resolución. Influencia de la fase móvil en las selectividades. En muchos casos, ajustar k a un nivel adecuado es todo lo que se necesita para una separación satisfactoria. Sin embargo, cuando todavía se superponen dos bandas, como en la Figura 4.8b, se ha de procurar aumentar el factor de selectividad para las dos especies. Esta variación se puede llevar a cabo convenientemente cambiando la naturaleza química de la fase móvil mientras se mantiene más o menos el mismo valor de k. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 73

74 Para la cromatografía en fase inversa se ha desarrollado un procedimiento de optimización de cuatro disolventes que permite establecer el sistema que, en teoría, resolverá una mezcla dada en el mínimo tiempo. En este caso, se han utilizado tres disolventes compatibles para ajustar los valores de. Se incluyen metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano. El agua se emplea para ajustar la fuerza de la mezcla y de este modo conseguir un valor adecuado de k. La Figura 5.25 ilustra la sistemática empleada para el desarrollo de la separación de seis esteroides por cromatografia en fase inversa basada en cuatro disolventes. Los dos primeros cromatogramas muestran los resultados iniciales para determinar el valor mínimo de k que se requería. Con un k de 10 existe espacio suficiente en la escala de tiempos para la separación de picos; sin embargo, en estas condiciones los valores de para los componentes 1 y 3 (y en menos extensión para 5 y 6) no son suficientemente grandes como para obtener una separación satisfactoria. Con el objetivo de encontrar unos mejores valores de se realizaron ensayos adicionales; en todos los casos la proporción de agua se ajustaba para obtener una k de 10. En las Figuras 5.25 c y d se muestran los resultados obtenidos en los ensayos con las mezclas metanol/agua y tetrahidrofurano/agua. Se realizaron experimentos adicionales variando sistemáticamente los pares de disolventes orgánicos (en cada caso k se ajustaba a 10 mediante el agua). Finalmente, la mezcla mostrada en la Figura 5.25e se eligió como la mejor fase móvil para la separación del grupo particular de compuestos ensayado. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 74

75 Figura Sistemática experimental para la separación de los seis esteroides. En (a) y (b) se muestra el uso del agua para el ajuste de k. Los efectos de la variación de a k constante se muestran en (b), (c), (d) y (e). Columna: 0.4 x 150 mm empaquetada con partículas de 5 m con fase inversa enlazada C 8. Temperatura: 50ºC. Caudal: 3 cm 3 /min. Detector: UV-254 nm. Compuestos: (1) prednisona; (2) cortisona; (3) hidrocortisona; (4) dexametasona; (5) corticosterona; (6) cortoexolona. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 75

76 En fase normal se ha utilizado un sistema de cuatro disolventes similar, en el cual los disolventes para el control de la selectividad son etileter, cloruro de metileno y cloroformo; para el ajuste de la fuerza del disolvente se utiliza n-hexano. Con este sistema de cuatro disolventes, se dice que es posible la optimización con un número mínimo de ensayos Aplicaciones de la cromatografía de reparto Los rellenos con fases unidas químicamente, cuando se utilizan en fase inversa en combinación con disolventes muy polares (a menudo acuosos) se aproximan al sistema ideal y universal para la cromatografía de líquidos. Para investigar la separación de nuevos tipos de muestras, estos son los rellenos que se utilizan en primer lugar debido a su amplio intervalo de aplicabilidad, su adecuación, y a la facilidad con que pueden modificarse k y variando las fases móviles acuosas. La Tabla 5.6 enumera unos cuantos ejemplos característicos entre la gran variedad de aplicaciones de la cromatografia de reparto en diversos campos. La Figura 4.9 ilustra dos de los muchos miles de aplicaciones de la cromatografía de reparto con fases unidas químicamente para el análisis de materiales de consumo e industriales. Tabla 5.5.Aplicaciones de la cromatografia de reparto Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 76

77 Cromatografía de adsorción La cromatografía de adsorción, o líquido-sólido, es la forma clásica de cromatografía de líquidos que introdujo Tswett por vez primera a principios de este siglo. Más recientemente, se ha convertido en un método importante de HPLC. Las únicas fases que se utilizan en HPLC líquido-sólido son la sílice y la alúmina, siendo la primera la que se prefiere para casi todas las aplicaciones debido a su mayor capacidad de carga y a su mayor diversidad de presentaciones. Con pocas excepciones, las características de adsorción de los dos adsorbentes son similares. Con ambos, el orden de tiempos de retención es: olefinas < hidrocarburos aromáticos < haluros = sulfuros < éteres < nitrocompuestos < esteres = aldehídos = cetonas < alcoholes = aminas < sulfonas < sulfóxidos < amidas < ácidos carboxílicos. Figura Aplicaciones de la cromatografía de fase enlazada. (a) Aditivos en bebidas refrescantes. Columna 4.6 x 250 mm empaquetada con rellenos de fase enlazada polares (nitrilo). Disolvente en modo isocrático: CH 3OH 6% / H 2O 94%. Caudal 1 ml/min.(b) Insecticidas organofosforados. Columna 4.5 x 250 mm empaquetada con partículas de 5 m con fase enlazada C 8. Gradiente de CH 3OH 67% / H 2O 33% a CH 3OH 80% / H 2O 20%. Caudal 2 ml/min. En ambos casos la detección UV es a 254 nm. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 77

78 Selección del disolvente en cromatografía de adsorción En cromatografia líquido-sólido, la única variable que se puede utilizar para optimizar k' y es la composición de la fase móvil (por contraste con la cromatografia de reparto, donde el relleno de la columna tiene un efecto acusado sobre ). Afortunadamente, en la cromatografía de adsorción, las modificaciones del disolvente provocan una gran variación en la resolución y en el tiempo de retención, y casi siempre se suele encontrar la fase móvil adecuada. Fuerza del disolvente. En cromatografia de adsorción se ha comprobado que el índice de polaridad P, que se ha descrito anteriormente, puede servir como una guía de la fuerza de los disolventes. Sin embargo, un índice mucho mejor es la fuerza eluyente 0 que es la energía de adsorción del disolvente por unidad de superficie. Este parámetro depende del adsorbente, siendo los valores de 0 para la sílice 0.8 veces los de la alúmina. En la Tabla 4.2, los valores de 0 de la última columna corresponden a la alúmina. Obsérvese que las diferencias entre disolventes con respecto a 0 se corresponden bastante bien con las que se dan entre los valores de P'. Elección de los disolventes. El procedimiento para la elección del disolvente en cromatografía de adsorción es semejante al descrito para las separaciones de reparto. Es decir, se eligen dos disolventes compatibles, uno de los cuales es demasiado fuerte ( 0 demasiado grande) y el otro resulta ser demasiado débil. Variando la relación entre los dos disolventes se puede obtener el valor adecuado para k'. Se ha encontrado que un aumento de 0.05 unidades en el valor de 0 por lo general disminuye 3 o 4 veces los valores de k. De este modo, se pueden conseguir grandes variaciones de k, y casi siempre se puede encontrar un sistema binario entre los disolventes de la Tabla 4.2 que proporcione unos tiempos de retención adecuados para cualquier tipo de muestra. Por desgracia, 0 no varía linealmente con la relación de volúmenes, como era el caso de P' en la cromatografía de reparto; por ello es más difícil calcular la mezcla óptima para la separación. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 78

79 Cuando se presenta una superposición de picos, el cambio de un disolvente fuerte por otro, manteniendo k más o menos constante, permite cambiar los valores de y a menudo obtener la resolución que se desea. Estas pruebas de tanteo son tediosas y a veces resultan inútiles. Figura Aplicación típica de cromatografía de adsorción: separación de cis y trans pirazolina. Columna 100 x 0.3 cm, sílice pelicular. Fase móvil: 50% cloruro de metileno / isooctano. Caudal 0.25 ml/min. Detector UV 254 nm Aplicaciones de la cromatografía de adsorción La Figura 5.27 indica que la cromatografia de adsorción es más adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a Los métodos de cromatografía de adsorción y los de reparto, aunque en algún caso se superponen, tienden a ser complementarios. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 79

80 En general, la cromatografía líquido-sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares, y que por tanto tienen una solubilidad limitada en los disolventes acuosos que son los que se utilizan en los procedimientos de reparto en fase inversa. Como en cromatografía de reparto, los compuestos que tienen distintos grupos funcionales por lo general se pueden separar, Una característica particular de la cromatograrfía de adsorción, que no es compartida por otros métodos, es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros. La Figura 4.10 ilustra una aplicación característica de la cromatografia de adsorción Cromatografía iónica La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y eficaces para la separación y determinación de iones que se basan en el uso de las resinas de intercambio iónico. La cromatografía iónica empezó a desarrollarse a mediados de los años setenta, cuando se demostró que mediante las columnas de HPLC rellenas con resinas de intercambio catiónica o anicónico, se podían resolver fácilmente mezclas de cationes o aniones. Por entonces, la detección se realizaba por lo general con medidas de conductividad. La cromatografia iónica se desarrolló durante el proyecto Manhattan que optimizaba la separación con resinas de intercambio catiónico de los cationes de las tierras raras estrechamente relacionados. Este espectacular trabajo, en el cual se basa la teoría de las separaciones por intercambio iónico, se extendió tras la 2ª Guerra Mundial a muchos otros tipos de materiales y al final condujo a los métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidos y otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empezó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación por intercambio iónico se retrasó debido a la inexistencia de un método general y sensible para la detección de especies como los cationes alcalinos y alcalinotérreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se remedió en 1975 al desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la técnica de supresión del efluente, la cual hace posible la detección conductimétrica de los iones eluidos. Esta técnica se describe posteriormente. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 80

81 Equilibrios de intercambio iónico Los procesos de intercambio iónico se basan en los equilibrios de intercambio entre los iones de una disolución y los iones del mismo signo que están en la superficie de un sólido de elevada masa molecular y esencialmente insoluble. Durante varias décadas se han utilizado intercambiadores iónicos naturales como las arcillas y las zeolitas. A mediados de los años treinta se fabricaron por primera vez resinas de intercambio iónico sintéticas para eliminar la dureza del agua, la desionización del agua y la purificación de las disoluciones. Los puntos activos más comunes en las resinas de intercambio catiónico son los grupos de ácido sulfónico -S03 - H +, un ácido fuerte, y los grupos de ácido carboxílico COO - H +, un ácido débil. Los intercambiadores aniónicos contienen grupos de amina cuaternaria N(CH3)3 + OH - o grupos de amina ternaria primaria NH3 + OH - los primeros son de base fuerte y los últimos de base débil. Cuando un intercambiador iónico de ácido sulfónico se pone en contacto con un disolvente acuoso que contiene cationes M +, se establece un equilibrio de intercambio entre este catión y el H + de los grupos sulfónicos de la resina. De forma semejante, se comporta un intercambiador de ácido débil. En el caso de los intercambiadores aniónicos el equilibrio se establece entre el anión del disolvente acuoso y los OH - de los grupos amina de la resina polimérica. Estos equilibrios pueden ser modelizados usando la constante de equilibrio Kex definida por la ley de acción de masas aplicada a cada uno de los equilibrios de intercambio. Esta Kex representa la afinidad de la resina por los iones en disolución M + relativa a otro ion (en este caso, H + ). Cuando Kex, es un valor alto, la fase sólida tiene una gran tendencia a retener los iones M + y cuando Kex, es pequeña sucede lo contrario. Seleccionando un ion de referencia común como el H +, se pueden comparar experimentalmente las constantes de distribución de distintos iones para una resina dada. Estos experimentos demuestran que los iones polivalentes se retienen mucho más fuertemente que las especies con una sola carga. Sin embargo, dentro de un grupo con la misma carga, se dan diferencias relacionadas con el tamaño del ion hidratado y con otras propiedades. De este modo, para una resina típica de intercambio catiónico con grupos sulfónicos, los valores de Kex, disminuyen según el orden Tl + > Ag + > Cs + > Rb + > K + > NH4 + > Na + > H + > Li +. Para los cationes divalentes, el orden es Ba 2+ > Pb 2+ > Sr 2+ > Ca 2+ > Ni 2+ > Cd 2+ > Cu 2+ > Co 2+ > Zn 2+ >Mg 2+ >U Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 81

82 Para los aniones, Kex, en las resinas de base fuerte disminuye en el orden SO4 2- > C2O4 2- > I - > NO3 - > Br - > Cl - > HCO2 - > CH3CO2 - > OH - > F -. Esta secuencia debería considerarse sólo como una aproximación, pues depende en parte de la resina y de las condiciones experimentales Rellenos de intercambio iónico Históricamente, en cromatografía de intercambio iónico se han empleado pequeñas partículas esféricas porosas que se forman en la copolimerización del estireno y del divinilbenceno emulsionados. La presencia de divinilbenceno (normalmente en un 8%) origina una polimerización entrecruzada que imparte estabilidad mecánica a las bolitas. Con objeto de activar el polímero frente a los iones, a la estructura se le unen químicamente grupos funcionales ácidos o básicos. Los grupos más comunes son el ácido sulfónico y las aminas cuaternarias. Las partículas poliméricas porosas no resultan del todo adecuadas como rellenos cromatográficos debido a la baja velocidad de difusión de las moléculas de los analitos a través de los microporos de la matriz polimérica, y también debido a la compresibilidad de la matriz. Para solventar este problema, se han desarrollado dos nuevos tipos de rellenos que se utilizan más que el tipo de polímero poroso. Uno es el relleno de partícula pelicular en el que la superficie relativamente grande (de 30 a 40 m) de una partícula, esférica y no porosa, de vidrio o polimérica se recubre con una resina sintética de intercambio iónico. Un segundo tipo de relleno se prepara recubriendo micropartículas porosas de sílice, tal como las que se utilizan en la cromatografia de adsorción, con una delgada película del intercambiador. Con cualquiera de ellas, se obtiene un aumento de la eficacia debido a que la difusión en el polímero es más rápida. Por otra parte, la capacidad de carga de estos rellenos es menor, especialmente los de tipo pelicular Aplicaciones inorgánicas de la cromatografía íónica La fase móvil en cromatografía de intercambio iónico ha de tener las mismas propiedades generales que se requieren para los otros tipos de cromatografía. Es decir, ha de solubilizar la muestra, tener una fuerza de disolvente que conduzca a tiempos de retención razonables (valores de k' adecuados), y debe interaccionar con los solutos de tal forma que favorezca la selectividad (valores de adecuados). En cromatografía iónica las fases móviles suelen ser disoluciones acuosas que pueden contener cantidades moderadas de metanol u otros disolventes orgánicos miscibles con el agua; estas fases móviles, a menudo contienen especies iónicas en forma de disolución reguladora. La fuerza Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 82

83 eluyente y la selectividad se determinan por el tipo y concentración de esos ingredientes añadidos. En general, los iones de la fase móvil compiten con los iones del analito por los puntos activos del relleno del intercambiador iónico. Cromatografía iónica con columnas supresoras. Como se ha señalado anteriormente, la aplicación de la cromatografia iónica para la determinación de especies inorgánicas no se desarrolló debido a la falta de un buen sistema de detección universal, que permitiera la determinación cuantitativa basada en las áreas de los picos cromatográficos. Los detectores de conductividad eran la elección obvia para este objetivo. Estos detectores pueden tener una elevada sensibilidad, son universales para las especies cargadas y, como norma general, responden de una forma predecible a los cambios de concentración. Por otra parte, dichos detectores son simples, baratos de fabricar y mantener, fáciles de miniaturizar, y por lo común son robustos y de prolongada duración. La única limitación de los detectores de conductividad resultó ser un serio problema que impidió su uso generalizado. Esta limitación proviene de la elevada concentración de electrólito que se requiere para eluir la mayoría de los iones analito en un tiempo razonable. En consecuencia, la conductividad de los componentes de la fase móvil tiende a enmascarar la de los analitos, y por ello se reduce considerablemente la sensibilidad del detector. En 1975, el problema de la elevada conductividad del eluyente se resolvió mediante la introducción de la denominada columna supresora que se utiliza inmediatamente a continuación de la columna de intercambio iónico. La columna supresora está rellena con una segunda resina de intercambio iónico, que convierte eficazmente los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas, sin alterar los iones del analito. Por ejemplo, cuando se separan y determinan cationes, se elige en muchas ocasiones el ácido clorhídrico como reactivo eluyente, y la columna supresora es una resina de intercambio aniónico en la forma hidróxido. El producto de la reacción en la columna supresora es agua. Esto es, H + (ac) + Cl - (ac) + Resina + OH - (s) Resina + C1 - (s) + H2O Es evidente que los cationes analito no se retienen en esta segunda columna. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 83

84 Para la separación de aniones, el relleno supresor es la forma ácida de una resina de intercambio catiónico. En este caso, el bicarbonato o carbonato de sodio puede utilizarse como agente eluyente. La reacción en la columna supresora es entonces Na + (ac) + HCO3 - (ac) + Resina - H + (s) Resina - Na + (s) + H2CO3 (ac) En este caso, el ácido carbónico muy poco disociado que se forma no contribuye de manera significativa a la conductividad. Un inconveniente de las columnas supresoras es la necesidad de regenerarlas periódicamente (de ordinario, cada 8 o 10 h) a fin de convertir sus rellenos otra vez a la forma ácida o básica original. Sin embargo, recientemente se dispone de supresores de membrana que operan continuamente. En este caso, el eluyente y la disolución supresora fluyen en direcciones opuestas en ambos lados de unas membranas permeables de intercambio iónico. Para el análisis de aniones, las membranas son resinas intercambiadoras de cationes y para cationes, son intercambiadoras de aniones. Cuando, por ejemplo, se trata de eliminar los iones sodio del efluente de la columna analítica, en la corriente supresora fluye continuamente ácido para la regeneración. Los iones sodio del efluente se intercambian con los iones hidrógeno de la membrana y entonces migran a través de la membrana hasta intercambiarse con los iones hidrógeno del reactivo regenerador. El dispositivo tiene una velocidad de intercambio notablemente alta; por ejemplo, es capaz de eliminar completamente los iones sodio de una disolución 0.1 M de hidróxido de sodio cuando el caudal del eluyente es de 2 ml/min. La Figura 4.11 muestra dos aplicaciones de la cromatografia iónica que utilizan una columna supresora y detección conductimétrica. En cada caso, los iones están presentes al nivel de partes por millón, y el tamaño de las muestras es de 50 L en un caso y de 100 L en el otro. El método es de gran importancia para el análisis de aniones debido a que actualmente no existe un método tan rápido y adecuado para muestras de este tipo. Cromatografía iónica con una sola columna. También se dispone de equipos comerciales para cromatografia iónica en los que no se utiliza una columna supresora. Estos sistemas se basan en las pequeñas diferencias de conductividad que existe entre los iones de la muestra eluidos y los del eluyente que prevalecen. Para amplificar esas diferencias, se utilizan intercambiadores de baja capacidad, con los que es posible la elución utilizando especies de baja conductividad equivalente. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 84

85 La cromatografía con una sola columna tiende a ser algo menos sensible que la cromatografía iónica con columna supresora Aplicaciones orgánicas y bioquímicas de la cromatografía iónica La cromatografia de intercambio iónico se ha aplicado a una variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos incluyendo drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azúcares y preparaciones farmacéuticas. El ejemplo de una de estas aplicaciones se muestra en la Figura 5.28, donde se separan con una columna de intercambio catiónico 1 x 10-8 moles de cada uno de los 17 aminoácidos de una muestra. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 85

86 Figura Aplicaciones típicas de la cromatografía ionica. (a) Separación de aniones en una columna de intercambio aniónico. Eluyente NaHCO M / Na 2CO M. Tamaño de muestra 50 L. (b) Separación de iones alcalinos en una columna de intercambio catiónico. Eluyente: Diclorhidrato de fenilendiamina M / HCl M. Tamaño de muestra 100 L Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 86

87 Figura Separación de aminoácidos con una columna de intercambio iónico. Relleno: intercambiador catiónico con un tamaño de partícula de 8 m Cromatografía de exclusión por tamaños La Cromatografia de exclusión por tamaños, que también se ha denominado cromatografía en geles permeables o de filtración en geles, es una técnica muy valiosa que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular. Los rellenos para la cromatografía de exclusión por tamaños están constituidos por pequeñas partículas (de unas 10 m) poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros en los que pueden difundir las moléculas del soluto y del disolvente. En los poros, las moléculas son atrapadas efectivamente y eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia medio en los poros depende del tamaño efectivo de las moléculas de los analitos. Las moléculas que son más grandes que el tamaño medio de poros del relleno son excluidas y de esta forma, esencialmente no se retienen y, por tanto, son las primeras que eluyen. Las moléculas que tienen diámetros que son significativamente menores que los poros, pueden penetrar a través del laberinto de poros y así resultan atrapadas durante más tiempo; éstas son las últimas en eluir. Entre estos dos extremos, están las moléculas de tamaño intermedio cuya penetración media en los poros depende de su diámetro. Dentro de este grupo, tiene lugar el fraccionamiento, que está directamente relacionado con el tamaño molecular y en cierto modo con la forma molecular. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 87

88 Obsérvese que las separaciones por exclusión por tamaños difieren de los otros procedimientos que se han considerado, en que no implican una interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones dado que originan una mala eficacia de la columna Rellenos de columna En cromatografia de exclusión por tamaños se encuentran dos tipos de rellenos, partículas poliméricas y partículas de sílice, con diámetros de partícula que oscilan de 5 a 10 m. Los últimos tienen la ventaja de una gran rigidez, lo que facilita el empaquetamiento; una mayor estabilidad, lo que permite el uso de una gran variedad de disolventes incluyendo el agua; una equilibración más rápida al cambiar el disolvente; y una buena estabilidad a elevadas temperaturas. Los inconvenientes de las partículas de sílice son su tendencia a retener solutos por adsorción, y su capacidad para catalizar la degradación de las moléculas del soluto. En un principio, la cromatografía de exclusión por tamaños se llevó a cabo fundamentalmente utilizando copolímeros de estireno-divinilbenceno entrecruzados de estructura semejante (excepto en que los grupos sulfónicos están ausentes) a los utilizados en cromatografía iónica. El tamaño de poro en estos polímeros se controla por el grado de entrelazamiento entre las cadenas poliméricas y por tanto con la cantidad relativa de divinilbenceno presente en la fabricación. Como consecuencia, los rellenos poliméricos se han comercializado con distintos tamaños promedio de poro, Los geles de estirenodivinilbenceno son hidrofóbicos y de este modo sólo pueden utilizarse con fases móviles no acuosas. Sin embargo, en la actualidad se dispone de geles hidrofílicos, que hacen posible el uso de disolventes acuosos para la separación de moléculas grandes solubles en agua como los azúcares. Estos geles hidrofílicos son por lo general polímeros de estireno-divinilbenceno con grupos sulfónicos, o poliacrilamidas. Las partículas de vidrio y de sílice porosas, que se comercializan actualmente, tienen tamaños promedio de poro que oscilan entre 40 y 2500 Angstroms. A fin de reducir la adsorción, las superficies de estas partículas se modifican por reacción con sustituyentes orgánicos. En la Tabla 5.6 se indican las propiedades de algunos rellenos comerciales y típicos de la exclusión por tamaños. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 88

89 El intervalo útil de pesos moleculares para un determinado relleno de exclusión por tamaños, se obtiene convenientemente a partir de una curva de calibración. En ella, se representa el peso molecular, que está directamente relacionado con el tamaño de las moléculas de soluto, frente al volumen de retención. El límite de exclusión determina el peso molecular de una especie por encima del cual no existe retención. Todas las especies que tengan pesos moleculares mayores que el límite de exclusión, son tan grandes que no se retienen, y eluyen conjuntamente para dar un mismo pico. El límite de permeabilidad es el peso molecular por debajo del cual las moléculas del soluto pueden penetrar completamente en los poros. Por debajo de este peso molecular, todas las moléculas del soluto son tan pequeñas que eluyen en una sola banda. A medida que los pesos moleculares disminuyen con respecto al límite de exclusión, las moléculas del soluto pasan cada vez más tiempo, de promedio, en los poros de las partículas y de este modo se mueven cada vez con mayor lentitud. Es en la región de permeabilidad selectiva en la que tiene lugar el fraccionamiento, dando lugar a picos de soluto individuales. Las curvas de calibración experimentales se obtienen fácilmente a partir de productos estándar. En muchas ocasiones, estas curvas las suministran los propios fabricantes de los materiales de relleno. Tabla 5.6.Propiedades de los rellenos comerciales Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 89

90 Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaños Los métodos de exclusión por tamaños se subdividen en la cromatografía de filtración en gel y la de gel permeable. En el primer tipo se utilizan disolventes acuosos y rellenos hidrofílicos. En el último, los métodos se basan en disolventes no polares y en rellenos hidrofóbicos. Los métodos son complementarios en el sentido que en un caso se aplican a muestras solubles en agua, y en el otro a sustancias solubles en disolventes orgánicos poco polares. Una de las aplicaciones más útiles del procedimiento de filtración en gel consiste en separar las moléculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de bajo peso molecular y de las sales. Por ejemplo, un gel con un límite de exclusión de varios miles, puede separar bien las proteínas de los aminoácidos y de los péptidos de bajo peso molecular. Una aplicación útil de la cromatografia de gel permeable es la separación de homólogos y oligómeros. Estas aplicaciones se ilustran con los ejemplos que se muestran en la Figura El primero muestra la separación de una serie de ácidos grasos con pesos moleculares entre 116 y 344 mediante un relleno de poliestireno con un límite de exclusión de El segundo es el cromatograma de una resina epoxi comercial; en este caso, n se refiere al número de unidades monoméricos en las moléculas de resina. Figura Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaños. (a) Separación de ácidos grasos. Columna de poliestireno 7.5 x 600 mm con un límite de exclusión de Fase móvil tetrahidrofurano. Caudal 1.2 ml/min. Detector: índice de refracción. (b) Análisis de una resina epoxi comercial (n= número de unidades monoméricas en el polímero). Columna de sílice porosa 6.2 x 250 mm. Fase móvil tetrahidrofurano. Caudal 1.3 ml/min Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 90

91 La Figura 5.31 ilustra una aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaños a la determinación de glucosa, sacarosa y fructosa en cuatro tipos de zumos de fruta. El relleno, con un límite de exclusión de 1000, era un polímero de poliestireno entrelazado de características hidrofilícas por la incorporación de grupos sulfónicos. Una columna de 25 cm con este relleno tenía 7600 platos a una temperatura de trabajo de 80ºC. Otra gran aplicación de la cromatografia de exclusión por tamaños es a la determinación rápida de los pesos moleculares, o de la distribución de pesos moleculares en los grandes polímeros o en los productos naturales. En este caso, se comparan los volúmenes de elución de la muestra con los volúmenes de elución de compuestos estándar que tengan las mismas características químicas. Las ventajas más importantes de los procedirnientos de exclusión por tamaños son: (1) tiempos de separación cortos y bien definidos [todos los solutos salen de la columna entre dos límites] (2) bandas estrechas, que conducen a una buena sensibilidad (3) no hay pérdida de muestra, porque los solutos no interaccionan con la fase estacionaria (4) no se desactiva la columna por interacción del soluto con el relleno. Las desventajas son: (1) debido a que la escala de tiempos en el cromatograma es corta, sólo se pueden acomodar un número limitado de bandas (2) no es aplicable a muestras de componentes semejantes, como las mezclas de isómeros. Para una resolución aceptable se necesita que la diferencia de pesos moleculares sea la menos de un 10%. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 91

92 Figura Determinación de glucosa (G), fructosa (F) y sacarosa (S) en zumos enlatados Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 92

93 GLOSARIO Cromatografía. La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida. Cromatógrafo. El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica. Cromatograma. Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas. Fase Ligada. Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna. Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento. Fase Móvil. Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico). En la cromatografía de gases se puede usar la expresión Gas Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión Eluyente. Eluir. Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas anteriores de cromatografía plana. Efluente. La fase móvil que abandona la columna. Muestra. Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil. Componentes de la Muestra. Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito para un componente de la muestra Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 93

94 Métodos principales DEPARTAMENTO DE QUIMICA Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna fase móvil adicional Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequeña cantidad en un intervalo breve. Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequeña cantidad en un tiempo breve. Clasificación de acuerdo al lecho cromatográfico Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo. Las partículas de fase estacionaria sólida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida, pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase móvil por el centro del tubo (Columna Tubular Abierta). Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. Éste puede ser un papel, que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel), o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina, TLC). A veces a la cromatografía plana se la llama también Cromatografía de Lecho Abierto. Asignatura: METODOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL/ISEMESTRE 2016 Página 94