INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS TESIS

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS EFECTO ANTIFÚNGICO IN VITRO E IN SITU DEL QUITOSANO Y ACEITES ESENCIALES SOBRE Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN CIENCIAS EN MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES PRESENTA ALEJANDRA MARÍA ALVARADO HERNÁNDEZ YAUTEPEC, MORELOS, NOVIEMBRE DE 2009

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5 Este trabajo se realizó en el Laboratorio de postcosecha, del Departamento de Interacción planta-insecto en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la asesoría de la Dra. en C. Laura Leticia Barrera Necha y el Dr. en C. Miguel Velázquez Del Valle Para la realización de los estudios se conto con el apoyo económico de CONACyT (becario No ) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaría de investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento otorgado por los proyectos de la SIP (No ) y CONACYT (No ).

6 AGRADECIMIENTOS Le estoy inmensamente agradecida a la M. en C. Leticia Bravo Luna por toda la paciencia que ha tenido para conmigo, por su atención, y todos los conocimientos que me ha compartido y que me atrevo a decir que no solo encontré a una maestra si no también a una gran amiga. Al Dr. Montes porque me enseño muchas cosas, porque me ha brindado su apoyo y me ha otorgado confianza, gracias por los conocimientos que ha compartido conmigo. A la Maestra Ely le agradezco las enseñanzas en el laboratorio, el apoyo, la confianza y sus puntos de vista que siempre me hacían discernir. A mis compañeros y amigos Claudia, Saúl, Erika, Edith y Areli que compartieron conmigo, por el apoyo que recibí de ellos, por las experiencias vividas y las cosas que me enseñaron durante mi estancia en el CeProBi. Al Dr. Miguel y a la Dra. Laura, que me permitieron realizar mi trabajo de tesis y me dieron la oportunidad de alcanzar uno de mis objetivos profesionales. A mis sinodales, la Dra. Gaby Trejo, la Dra. Kalina, la M. en C. Lety, la Dra. Laura Barrera, el Dr. Miguel, a la Dra. Silvia, por las aportaciones hechas al trabajo.

7 Dedicado con cariño: A mi familia en general: Porque han creído siempre en mí, me han alentado a seguir el camino que he elegido, me han apoyado en todos los aspectos, han hecho que mi vida sea más placentera y llena de cosas buenas, además por que sin ellos yo no estuviera donde ahora estoy. A mi madre; Juventina Aine, que nunca ha dejado de consentirme con sus caricias, que me ha dado confort con sus palabras, que siempre está atenta a mis quejas y festeja mis aciertos, porque es un ejemplo de vida que siempre llevaré en mi corazón. A mi padre; Alejandro, porque siempre está al pendiente de mí, porque me saca de apuros, me escucha, me orienta, por que ha sido uno de mis grandes pilares y le estaré inmensamente agradecida. A mi hermana Dulce María, por mantenerme con los pies en la tierra, saber escuchar y decir siempre con acierto lo que me hace seguir adelante, por que además es mi amiga y mi psicóloga, por su atención aunque muchas veces no me la merezca. A mi hermana Diana María, que es la niña mas latosa que he conocido, pero que si no fuera por eso muchas cosas en mi vida no tendrían sentido, porque a pesar de sus regaños, siempre me ha apoyado, ha sido atenta conmigo y porque es uno de mis tesoros. A mi pequeña hermana Ana María, que con tan solo 3 años de edad, ha sido el angelito que me inspira para salir adelante, por sus juegos y sus alegrías que comparte a diario conmigo, porque creo que sin ella las cosas nunca serian como son. Al amor de mi vida Juan Manuel, por ser paciente, por darme todo ese amor que me ha dado y porque siempre ha creído en mi.

8 ÍNDICE Capítulo Contenido pág. INDICES Índice de cuadros IV Índice de figuras V RESUMEN VII ABSTRACT VIII 1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES Importancia de los productos hortofrutícolas Causas de las pérdidas postcosecha Condiciones que favorecen a las enfermedades postcosecha Principales enfermedades postcosecha Control de las enfermedades postcosecha Rhizopus stolonifer como agente causal de la pudrición blanda Condiciones óptimas de crecimiento Características morfológicas de R. stolonifer Mecanismos de infección de R. stolonifer Síntomas de la pudrición blanda causada por R. stolonifer Control de R. stolonifer El jitomate como producto de interés en México Producción de jitomate en el estado de Morelos Generalidades del jitomate Importancia nutricional del jitomate Aceites esenciales Aceite esencial de canela Aceite esencial de clavo Aceite esencial de tomillo Quitosano Efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS Objetivo general. 31 I

9 ÍNDICE Capítulo Contenido pág Objetivos particulares MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico Evaluación del quitosano y los aceites esenciales in vitro Elaboración de los medios de cultivo Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales Crecimiento micelial Esporulación Germinación Elaboración de la suspensión de esporas Evaluación de la germinación Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ Prueba de patogenicidad de R. stolonifer cepa R Evaluaciones en jitomate Elaboración de los tratamientos empleados in situ Acondicionamiento de los frutos de jitomate para el bioensayo Almacenamiento Desarrollo de la escala de daño para evaluar índice de severidad Índice de severidad Porcentaje de infección Pérdida de peso Análisis estadístico RESULTADOS Y DISCUSIÓN Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales Crecimiento micelial Esporulación Germinación. 62 II

10 ÍNDICE Capítulo Contenido pág Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ Escala de daño Evaluaciones en jitomate Porcentaje de infección e índice de severidad Pérdida de peso CONCLUSIONES PERSPECTIVAS LITERATURA CITADA 91 III

11 No. ÍNDICE DE CUADROS Pág. 1 Principales enfermedades postcosecha causadas por hongos. 8 2 Composición química por cada 100 g de jitomate crudo Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites esenciales para evaluar el efecto in vitro sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R. stolonifer Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites esenciales aplicados in situ contra R. stolonifer Tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer con los tratamientos individuales Tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer con los tratamientos combinados Porcentaje de germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos individuales y las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg ml -1 con los AE a 100 µg ml Porcentaje de infección e índice de severidad en jitomates inoculados con R. stolonifer después de la aplicación de quitosano combinado con los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300µg ml y dicloran. 79 IV

12 No. ÍNDICE DE FIGURAS Pág. 1 Morfología microscópica y colonial de R. stolonifer Esquema general del trabajo experimental Capacidad infectiva de R. stolonifer al inicio del experimento Capacidad infectiva de R. stolonifer después de 72 h de incubación Sistema de almacenamiento empleado para el bioensayo 45 6 Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de la aplicación de los aceites esenciales a tres concentraciones Dinámica de crecimiento micelial de R. stolonifer al ser incubado en quitosano y Aceites esenciales a Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de incubación con los tratamientos combinados de quitosano y aceites esenciales Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos individuales Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos combinados de quitosano y los AE a 100 µg ml Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos individuales a las 9 h de incubación Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos combinados a las 9 h de incubación Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos combinados a las 9 h de incubación Escala de daño propuesta para determinar el índice de severidad Frutos de jitomate en dos estados de madurez infectados por R. stolonifer a las 96 h de incubación Desarrollo de la pudrición blanda durante la incubación. 78 V

13 No. ÍNDICE DE FIGURAS Pág. 17 Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de R. stolonifer con los aceites esenciales a 300µg ml -1 y los controles Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de R. stolonifer con las diferentes combinaciones de quitosano con los aceites esenciales a 300 µg ml -1 y dicloran. 19 Pérdida de peso de los frutos de jitomate inoculados con R. stolonifer, después de aplicar quitosano a 10mg ml -1 y las combinaciones de quitosano con aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300 µg ml VI

14 RESUMEN El jitomate es uno de los cultivos hortícolas más importante en México. Sus frutos son afectados por hongos como Rhizopus stolonifer agente causal de la pudrición blanda, enfermedad postcosecha que ocasiona pérdidas económicas importantes. Durante varios años los fungicidas sintéticos han sido utilizados para controlar las enfermedades postcosecha; sin embargo, diversos estudios han demostrado que los compuestos empleados en estos fungicidas representan un riesgo potencial para el ambiente y la salud humana. Por lo tanto, ha aumentado la búsqueda de alternativas naturales de control. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo individualmente y combinados sobre R. stolonifer. Se evaluó quitosano a dos concentraciones 2 y 10 mg ml -1, aceites esenciales a 100 y 300 μg ml -1 y combinaciones de quitosano con los aceites esenciales sobre el desarrollo in vitro de R. stolonifer (crecimiento micelial, esporulación y germinación). Se utilizaron frutos de jitomate para evaluar el efecto antifúngico del quitosano y los aceites esenciales in situ (porcentaje de infección, índice de severidad y pérdida de peso). Los resultados de los experimentos in vitro demostraron que los tratamientos más efectivos fueron obtenidos con los aceites esenciales (clavo, canela y tomillo) a 300 μg ml -1 y con quitosano a 10 mg ml -1, así como las combinaciones de estos en donde se observó un efecto aditivo en la mayoría de los tratamientos y un efecto sinérgico en la combinación de quitosano con el aceite esencial de tomillo. Los experimentos in situ mostraron que el quitosano a 10 mg ml -1 fue el tratamiento más efectivo para reducir la pudrición fúngica y la pérdida de peso de los frutos de jitomate. In situ no se observó efecto sinérgico con ninguna combinación de quitosano y aceites esenciales, mientras que in vitro se presentó efecto aditivo e incluso en algunos casos hasta sinérgico. Los resultados mostraron que el quitosano ofrece una alternativa natural a los fungicidas sintéticos para controlar la pudrición blanda en frutos de jitomate. VII

15 ABSTRACT The tomato is one of the most important horticultural crops in Mexico. Fruits are affected by fungi such as Rhizopus stolonifer causal agent of soft rot, postharvest disease that causes important economic losses. During a number of years synthetic fungicides have been used to control postharvest diseases; however, several studies have been shown that the compounds used in these fungicides representing a potential risk for the environment and human health. Therefore, the search of natural alternatives for the control has been improved. The aim of this work was to evaluate the antifungal effect of chitosan and essential oils of clove, cinnamon and thyme, individually and in combination on Rhizopus stolonifer. Two chitosan concentrations 2 and 10 mg ml -1, essential oils at 100 and 300 μg ml -1 and combinations of chitosan with essential oils were evaluated on the in vitro development of R. stolonifer (mycelial growth, sporulation and germination). Tomato fruits were used to evaluate antifungal effect of chitosan and essential oils in situ (percentage of infection, severity index and weight loss). The results of the in vitro experiment demonstrated that the most effective treatments were obtained with the essential oils (clove, cinnamon and thyme) at 300 μg ml -1 and with chitosan at 10 mg ml -1, as well as the combinations of these where it was observed an effect additive in the majority of the treatments and a synergic effect in the combination of quitosano with the essential oil of thyme. The in situ experiment established that chitosan at 10 mg ml -1 was the most effective treatment to reduce fungal decay and weight loss of tomato fruits. In vitro no synergistic effect was observed with any combination of chitosan and essential oils. Results show that chitosan offers a natural alternative to synthetic fungicides to control soft rot in tomato fruits. VIII

16 1. INTRODUCCIÓN México es uno de los países con alto potencial agrícola, produciendo una amplia gama de frutas y verduras en diferentes épocas del año. La actividad hortícola es una de las más dinámicas en la agricultura mexicana y con mayor capacidad de exportación (Carrillo, 2004), México se considera como uno de los más importantes exportadores al mercado estadunidense, el cultivo de jitomate es uno de los productos hortícolas que sobresale (SAGARPA 2006, 2007). Este producto tiene importancia para la salud del humano, ya que de ellos se obtienen nutrientes esenciales, vitaminas y minerales; además de proveer compuestos antioxidantes y un alto contenido de agua (Spadaro y Gullino, 2004; Candelas-Cadillo et al., 2005; De la Torre-Ibarra et al., 2008). El jitomate es uno de los productos económicamente más importantes en México, se producen más de 2 millones de toneladas y de éstas se exportan más de (SAGARPA, 2006a), sin embargo, se ha reportado que 30% de la cosecha se pierde primordialmente por pudriciones causadas por microorganismos fitopatógenos; el 80% de estas pérdidas son ocasionadas por Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. y Alternaria alternata (Nees) (Hahn, 2006). R. stolonifer causa la enfermedad denominada pudrición blanda, afectando al jitomate así como a una gama de productos hortofrutícolas, generando pérdidas económicas considerables en poco tiempo (Bonaterra et al., 2003; Zhang et al., 2004 y Hahn, 2006). Estas pérdidas se producen en un periodo de aproximadamente 4 a 6 días, debido a que este hongo tiene un crecimiento rápido y es de fácil transmisión por heridas producidas 1

17 durante la manipulación del fruto, principalmente en frutos maduros (Northover y Zhou, 2002; Bonaterra et al., 2003; Hahn, 2006; Hernández-Lauzardo et al., 2008; Velázquez del Valle et al., 2008). Tradicionalmente se han usado fungicidas químicos sintéticos como dicloran (Botran), iprodione, fludioxonil (Scholar 50WP), tebuconazol (Elite) entre otros, para controlar las pudriciones causadas por R. stolonifer con los beneficios y riesgos que implica el uso de los mismos (Adaskaveg et al., 2005). Actualmente, se buscan alternativas naturales que no afecten la salud del humano y al medio ambiente; algunas de ellas son el uso de quitosano y aceites esenciales (AE), los cuales se han utilizado de manera individual en diferentes áreas (Bautista-Baños et al., 2006; Lárez, 2006). Algunos estudios han demostrado que ambos productos por separado presentan actividad antifúngica; en el caso de quitosano se ha probado contra Botrytis cinerea Pers.:Fr., Aspergilus flavus Link, Rhizoctonia solani Kûnh, Fusarium oxisporum Link: Fr., Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. In Penz, Penicillum spp entre otros (El Ghaouth et al., 1992a; Barrera- Necha et al., 2008; Barrera-Necha y García-Barrera, 2008). Mientras que los AE se han evaluado sobre el desarrollo de hongos como B. cinerea, Fusarium spp, A. flavus, Alternaria spp., Curvularia spp., Cercospora spp. y Monilinia fructicola Honey (El Ghaouth et al., 1992b; Rabea et al., 2003; Tripathi et al., 2004; Kishore y Pande, 2007; Xu et al., 2007). Sin embargo, el efecto que han tenido sobre estos hongos no ha sido suficiente para su control, por lo que en este trabajo se pretendió aumentar el efecto de los productos empleados, mediante la combinación de quitosano y aceites esenciales para combatir a R. stolonifer y evitar la pudrición blanda en frutos de jitomate. El objetivo de 2

18 este trabajo fue determinar el efecto del quitosano y de los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo de manera individual y combinada sobre el crecimiento micelial, la esporulación y la germinación de R. stolonifer así como evaluar el porcentaje de infección, el índice de severidad y la pérdida de peso en frutos de jitomate. 3

19 2. ANTECEDENTES 2.1. Importancia de los productos hortofrutícolas. Además de la importancia económica, los productos hortofrutícolas tienen una gran relevancia en la salud del humano. Se considera que tanto frutas como verduras, son parte importante en la dieta, porque de ellas se obtienen nutrientes esenciales, vitaminas y minerales; además de proveer otro tipo de compuestos como los antioxidantes (Spadaro y Gullino, 2004; De la Torre-Ibarra et al., 2008), la mayoría de estos productos son reconocidos como alimentos básicos, que al consumirlas contribuyen al buen estado de salud, reforzando el sistema inmunológico, reduciendo el daño celular por efectos de radicales libres, además de reducir el riesgo de sufrir enfermedades crónico-degenerativas como cardiopatías, cáncer, diabetes y obesidad (Zhuang y Barth, 2003; Albert et al., 2002; Pomerleau et al., 2004). Las hortalizas contienen gran cantidad de agua, generalmente entre el 85% y el 95% de su peso total y que su valor calórico suele ser bajo, pues no supera las 50 calorías por cada 100 g de parte comestible. También se consideran una fuente importante de vitaminas, ya sean hidrosolubles (vitamina B y C) o liposolubles (Vitaminas A, D, E y K) y de minerales como potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro, fósforo, yodo, cromo, selenio entre otros (Anaya y Romero, 1999; Zhuang y Barth, 2003; Salinas-Hernández, 2007; Bautista-Baños et al., 2008). Debido a estas características, las hortalizas son altamente consumidas; es por eso que resulta importante que estos productos sean totalmente inocuos. Sin embargo, la mayoría 4

20 de los productos hortícolas son afectados por una gran cantidad de microorganismos a lo largo de la cadena postcosecha, debido a la susceptibilidad que presentan por sus características nutrimentales, por su alto contenido de agua o bien por un mal manejo postcosecha (Agrios, 2007) Causas de las pérdidas postcosecha. Las frutas y hortalizas frescas son los alimentos más perecederos debido a sus características relacionadas al contenido de agua y a su actividad metabólica aún después de la cosecha, generando pérdidas postcosecha que es uno de los principales problemas para que estos productos lleguen a los consumidores y aunque estas pérdidas no pueden ser calculadas con precisión, se estima que el 25 % del total de los productos en países industrializados se pierden durante el almacén, el transporte y la comercialización; mientras que en países subdesarrollados las pérdidas exceden del 50% (Spadaro et al., 2004). Se cree que la mayor causa de las pérdidas identificadas se debe a una mala manipulación y/o mala aplicación de tecnologías postcosecha así como la clasificación y conservación de los productos (Vero et al., 2002; Neri et al., 2006). El deterioro de los productos hortofrutícolas se clasifican de acuerdo al tipo de alteración que se presenta en los productos, que pueden ser alteraciones fisiológicas o patológicas. Las alteraciones fisiológicas son determinadas por anomalías en los procesos metabólicos ya sea por el mismo proceso de envejecimiento del vegetal, que incluye sus actividades metabólicas, como la respiración, la transpiración, la biosíntesis de etileno o bien por 5

21 factores exógenos como temperaturas inadecuadas, nutrición, evaporación, almacenamiento etc. (Zaccari, 2003) Las alteraciones físicas son aquellas producidas por agentes mecánicos, que provocan machucones, heridas, así como el manejo inadecuado que causa aberturas en los productos, entre otras circunstancias. Y las alteraciones patológicas que son originadas por agentes bióticos como hongos, bacterias, virus, ácaros e insectos (Spadaro y Gullino, 2004; Rivera, 2008; Zaccari, 2003). Se debe destacar que las alteraciones físicas favorecen la manifestación de las alteraciones patológicas, ya que se sabe que diversos hongos principalmente se ven favorecidos por las lesiones físicas que sufren los productos ocasionando lesiones más graves, hasta producir enfermedad en dichos productos (Zaccari, 2003). Es importante resaltar que el mayor porcentaje de pérdida de los productos postcosecha se debe a las alteraciones patológicas, primordialmente a las pudriciones causadas por hongos y bacterias fitopatógenas (Vero et al., 2002). El grado de daño depende de la especie hortícola, de los organismos patógenos y de las condiciones del almacenamiento; lo que causa una gama diferente de enfermedades (Agrios, 2007). Los hongos fitopatógenos son los que generan mayor cantidad de pérdidas en los productos hortofrutícolas, hasta ahora se conocen más de 100 especies responsables de la mayoría de las enfermedades postcosecha (Tripathi y Dubey, 2004). 6

22 2.3. Condiciones que favorecen las enfermedades postcosecha. Diversos hongos de la fase postcosecha están presentes en los productos desde antes de la cosecha, sin que éstos presenten algún signo o síntoma referente al patógeno que les invade, esto sucede porque en la mayoría de las ocasiones las condiciones ambientales se vuelven favorables para el patógeno (Rivera, 2008). Los productos hortícolas cambian su metabolismo a lo largo de su vida, sobre todo en la fase postcosecha, generando metabolitos secundarios que al ser secretados pueden favorecer que el patógeno invada al producto; o bien el simple envejecimiento natural puede disminuir las defensas naturales que se presentan durante su estado inmaduro. Las condiciones ambientales cambian cuando los productos son recolectados, lo que da lugar a una tasa de respiración más alta, una transpiración elevada, pérdida de agua etc. La temperatura de almacenamiento es determinante para que se presente la enfermedad, ya que la mayoría de los hongos pueden desarrollarse a temperaturas ambientales con condiciones de alta humedad. Los hongos causantes del deterioro postcosecha muestran crecimiento óptimo de 20 a 25 C. En general, las temperaturas máximas que toleran los hongos para su crecimiento fluctúan entre los 32 a 38 C y la temperatura mínima es de 15 C ya que por debajo de esta, usualmente se inhibe el desarrollo de los hongos fitopatógenos aunque existen algunas excepciones como Penicillium spp. y B. cinerea que pueden crecer a temperaturas de 4 C (Rivera, 2008). 7

23 2.4. Principales enfermedades postcosecha. Los hongos más comunes que causan enfermedades postcosecha en una variedad de productos son; A. alternata, B. cinerea, Fusarium oxisporum, Geotrichum spp., Penicillium spp, Sclerotinia spp., C. gloesporiodes y R. stolonifer (cuadro 1). Cuadro 1. Principales enfermedades postcosecha causadas por hongos Pudriciones Hongo Producto postcosecha Literatura citada -Pudrición de los limones -Pudrición negra -Pudrición de los tomates -Pudrición de los tubérculos -Pudrición del moho gris Alternaria alternata Limón, naranja, tomate, pimientos, berenjenas, manzanas, pepinos, calabaza, melones, col, cerezas, uva y fresas. Papa, camote, etc. Botrytis cinerea Fresa, cebolla, lechuga, vid, manzana, peras, manzanas, cítricos, tomates, cebollas entre otros. -Agrios, Bruton, Maass, Hahn, Adaskaveg et al., Bartz, Chu et al., El Ghaouth et al., 1992ª Pudrición café (mohos rosados) Fusarium oxysporum Naranjas, limones, papá, bulbos de ornamentales, raíces, cucurbitáceas y tomates. -Barrera-Necha et al., Pudriciones ácidas Geotrichum spp. Tomates, zanahorias, entre otros frutos y hortalizas. -Pudrición del moho azul -Pudrición del moho verde -Pudrición algodonosa -Pudrición blanda aguanosa Antracnosis Penicillium digitatum Penicillum expansum Sclerotinia spp. Colletotrichum gloeosporioides Todo tipo de cítricos; manzanas, peras, membrillos, uvas, cebollas, melones, higos, camotes etc. Limones Frijol, crucíferas, cucurbitáceas, fresas, entre muchas más. Papaya, berenjena, tomate, cucurbitáceas, mango, plátano Pudrición blanda R. stolonifer Fresas, camotes, duraznos, cerezas, papaya, cacahuates, maíz, tomate, jitomate, melón, zanahoria, sandía, frijol, chícharo, berenjena, ciruela, plátano, mango, aguacate, uva etc., -Bruton, Neri et al., Palou, Bruton, Maass, Bautista-Baños et al., Abd Alla et al., El Ghaouth et al., 1992ª -Hahn, Mari et al., Zhang et al.,

24 Los diferentes tipos de pudriciones que se presentan en los productos hortofrutícolas causan las pérdidas de mayor importancia. Uno de los principales hongos fitopatógenos que causa pudrición es R. stolonifer ya que afecta a una gama amplia de productos hortofrutícolas, como son ciruela, uva, plátano, mango, frijol, melón, zanahoria, por mencionar algunos productos, así como jitomate (Bonaterra et al., 2003; Zhang et al., 2004 y Hahn, 2006). Los cuales pueden ser afectados en poco tiempo por las características del hongo, originando la pérdida total del producto y por consecuente pérdidas económicas considerables. En México se calcula el 30 % de la cosecha de jitomate se pierde debido a las enfermedades postcosecha y aproximadamente el 80% del total de las pérdidas se deben primordialmente a dos hongos; Alternaria alternata y R. stolonifer (Hahn, 2006) Control de las enfermedades postcosecha La pérdida de productos por las enfermedades postcosecha, genera pérdidas económicas importantes, por lo que el hombre ha tratado de evitar este tipo de problemas usando diferentes métodos de conservación, uno de ellos es el uso de compuestos químicos sintéticos que se utilizan como un método principal. Anualmente se aplican 23 millones de Kg de estos compuestos a frutas y verduras (Tripathi et al., 2004), que son incorporados comúnmente antes y durante la cosecha, por lo que el hombre está directamente expuesto a estos productos, siendo una de las razones más importantes para evitar el uso de fungicidas químicos sintéticos, ya que presentan efectos nocivos a la salud como; la carcinogénesis, la teratogénesis así como toxicidad residual cuando se consumen frutas y 9

25 verduras que han sido expuestas y prontamente consumidas, como es el caso de los productos para el consumo en fresco, siendo una problemática la aplicación de agroquímicos que resulta especialmente importante durante la fase postcosecha, ya que es cuando el producto está más próximo al consumidor; además se han desarrollado cepas fúngicas resistentes y han ocasionado contaminación ambiental (Bautista-Baños et al., 2000; Cia et al., 2007; Spadaro et al., 2004, Tripathi et al., 2004; Vero et al., 2002). Por lo que actualmente se buscan alternativas que sean menos riesgosas para la salud y el medio ambiente, pero efectivas para el control de las enfermedades postcosecha. Muchos estudios postcosecha sugieren el empleo de métodos físicos como el curado, la irradiación, la conservación frigorífica, el uso de atmósferas controladas, entre otros; algunos más proponen el control biológico o bien el uso de sustancias naturales o de síntesis química, que presenten los mínimos efectos secundarios sobre el medio ambiente y los seres vivos (Burt, 2004; Hussain et al., 2008; Kordali et al., 2008; Spadaro y Gullino, 2004; Lurie, 2001; Wisniewski et al., 2001; Tripathi y Dubey, 2004 y Vero et al., 2002 ). Esto ha dado lugar a que se estudien sustancias presentes de forma natural tanto en plantas como en animales e incluso de microorganismos. Las sustancias naturales obtenidas de las plantas, son primordialmente metabolitos secundarios obtenidos como extractos vegetales, aceites esenciales, fitoalexinas y compuestos aromáticos, entre otros. Ya que se ha observado que éstos presentan efectos fungicidas e insecticidas (Win et al., 2007; Kordali et al., 2008; Domingo y López-Brea, 2003). Con lo que respecta a las sustancias obtenidas de los animales podemos mencionar a algunos péptidos 10

26 antimicrobianos, proteínas, e incluso polímeros como el quitosano que presentan actividad antifúngica contra diversos patógenos postcosecha (González-Candela et al., 2001). El uso de los diferentes métodos antes mencionados difícilmente cubre el espectro de acción, los niveles de efectividad y la persistencia que proporcionan los fungicidas químicos sintéticos convencionales. Así que actualmente se dedican esfuerzos para evaluar la integración de varios métodos o tratamientos que sean compatibles o complementarios entre sí. Buscando dos tipos de efecto; un efecto sinérgico o aditivo (efecto curativo) y un efecto persistente (efecto preventivo) haciendo que el tratamiento combinado controle las infecciones en el momento y a lo largo de la cadena postcosecha (Palou, 2007). Lo que contribuiría a disminuir el uso de los fungicidas químicos sintéticos y así reducir su efecto nocivo y residual; y poder integrar los tratamientos combinados a un manejo de tecnología postcosecha. De manera que en este trabajo se emplea la combinación de dos sustancias naturales como el quitosano (de origen animal) y los aceites esenciales (origen vegetal), para inhibir la pudrición blanda causada por R. stolonifer en jitomate, de los cuales se sabe que tienen efecto fungicida, que no causan daño a la salud del humano ni al medio ambiente de acuerdo a Velázquez del Valle et al. (2008). 11

27 2.6. Rhizopus stolonifer como agente causal de la pudrición blanda Rhizopus stolonifer, significa Que en el pie de la raíz lleva un vástago, su significado proviene del griego rhíza ριζα (raíz) y poûs πους (pie) y del latín stolo-onis (vástago, retoño) y fero (portar) (Pontón et al., 2002). Se encuentra clasificado dentro del Phylum: Zygomycota; Orden: Mucorales; Familia: Mucoraceae; Género: Rhizopus; Especie: Rhizopus stolonifer (Pontón et al., 2002; Agrios 2007). R. stolonifer es conocido también como moho negro del pan, se considera como un hongo que provoca una importante enfermedad postcosecha en frutos maduros, en todas las áreas de producción alrededor del mundo. Se han registrado pérdidas desde un 50 hasta el 100 % en el área de producción (Ogawa, 1995). Además de que es un hongo que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza (Northover y Zhou 2002; Zhang et al., 2004). Comúnmente vive como saprófito y en ocasiones como parásito (Carlile y Watkinson 1994). A pesar de eso puede afectar a un gran número de productos agrícolas Condiciones óptimas de crecimiento. R. stolonifer es uno de los mucorales más frecuentes que tiene una distribución amplia en todo el planeta. Su temperatura de crecimiento varía desde los 10 hasta los 33 C, con una temperatura óptima de 25 C. Este hongo se ve afectado severamente por temperaturas menores de 5 C. Con frecuencia se encuentra en suelos con arena, en la composta, en el polvo de las casas, en la pulpa de la madera, estiércol, panales de abejas, nidos y plumas de aves, así como en diferentes frutos y semillas (Pontón et al., 2002). Las esporas de R. 12

28 stolonifer no son abundantes en el aire libre, aunque su frecuencia aumenta en lugares donde hay humedad y se acumula vegetación muerta (Velázquez del-valle et al., 2008). Cuando se establece en los productos agrícolas aprovecha las lesiones que provocan algunos insectos o que fueron provocadas por el mal manejo de los productos. Una vez establecido, el hongo coloniza rápidamente a su hospedero dando lugar al establecimiento y desarrollo de la enfermedad, lo que provoca que de 4 a 6 días se hayan contaminado la mayoría de los productos y se tengan considerables pérdidas postcosecha (Velázquez-del Valle et al., 2008) Características morfológicas de R. stolonifer. R. stolonifer es un hongo filamentoso, presenta un micelio que carece de septos y produce esporangióforos largos, aéreos sin ramificar (Carlile y Watkinson 1994; Agrios, 2007), de color pardo oscuro que nacen de un nudo de rizoides bien desarrollado, hasta formar en la punta los esporangios, que son esféricos pequeños con columnela y contienen en su interior a las esporangiosporas (Figura 1), que pueden ser de diferentes formas como; elipsoidales, globosas y angulares, en la superficie presenta ornamentaciones, que son estriadas y lisas, se encuentran a lo largo de la espora y son de color oscuro (Bartz, 2003; Hernández-Lauzardo et al., 2006). Cuando estos esporangiosporas se encuentran sobre una superficie que mantiene las condiciones adecuadas para la germinación y desarrollo del hongo, las esporas germinan y se forman los estolones que son hifas que se adaptan a la superficie y que junto con los rizoides 13

29 forman puntos de contacto con la superficie y se da lugar a la formación de más estolones que se desarrollan en todas direcciones (Villanueva, 2004; Agrios, 2007). Produce esporas sexuales denominadas, zigosporas que tienen una pared celular gruesa, rugosa y de color negro, representan la etapa latente o invernante del hongo, que cuando germina forma el esporangióforo, esporangio y gran cantidad de esporas (figura 1e). Generalmente lo esporangióforos se unen en grupos de tres (figura 1a y 1b) (Villanueva, 2004; Agrios 2007). Actualmente se conocen 13 especies del género Rhizopus, algunos saprófitos y otros parásitos de frutas y otros órganos vegetales (Smith, 1992; Abe et al., 2006; Jennessen et al., 2008) Mecanismos de infección de R. stolonifer Generalmente la infección por R. stolonifer en frutos y vegetales ocurre primordialmente durante la fase postcosecha, dado que en esa fase los productos sufren lesiones que permiten la entrada del hongo (Bartz, 2003; Bautista-Baños et al., 2008). Es importante que las heridas sean recientes para que las esporas germinen. Una vez germinadas las esporas se producen hifas, estas secretan enzimas pectinolíticas que degradan y disuelven las sustancias pécticas de la lámina media en las células, dando lugar a la perdida de cohesión entre ellas, provocando que las rodee una sustancia líquida, lo que da como resultado la pudrición blanda. Posteriormente, secreta enzimas celulolíticas que provocan la completa desintegración de las células de los tejidos vegetales (Maass, 1998; Barkai-Golan, 2001). 14

30 Síntomas de la pudrición blanda causada por R. stolonifer Una vez que el hongo se ha establecido en el producto, la zona de infección se torna oscura, como si estuviese embebida en agua, por consecuencia se torna blanda y acuosa. Mientras las células vegetales no hayan muerto el micelio crece intercelularmente sin invadirlas hasta que mueran, los productos infectados rápidamente se colapsan y derraman un líquido claro, de lo que resulta una grave contaminación para los productos vecinos cuando alcanzan su maduración, así la pudrición avanza con gran rapidez (Maass, 1998; Bartz, 2003; Abd Alla et al., 2008). En poco tiempo las hifas del hongo crecen hacia fuera a través de las heridas del fruto y cubren las zonas afectadas con la producción de esporangióforos; el hongo se extiende hasta la superficie de las porciones sanas de los frutos afectados; al principio se desprende un olor ligeramente agradable y posteriormente un olor a rancio; finalmente los órganos vegetales se momifican, se degradan o desintegran formando una masa aguanosa (Ogawa et al., 2004; Agrios 2007). 15

31 Figura 1. Morfología microscópica (40 X) y colonial de R. stolonifer. 1a) esporangióforos (Es) aéreos agrupados en tres, 1b) Esporangios de color negro (Eo), 1c) Columnela (Co), 1d) Rizoides (Ri), 1e) Zigosporas (Z), 1f) Esporangiosporas (Ep) y 1g) Colonia de R. stolonifer ocupando toda la superficie de una caja con PDA. 16

32 Control de R. stolonifer Se sabe qué R. stolonifer es capaz de afectar a una gran cantidad de frutas y hortalizas, como ya se ha mencionado anteriormente, por lo que para su control se debe tomar en cuenta el tipo de fruta u hortaliza que está siendo afectado. En el caso del durazno se han empleado tres prácticas principales, primero el tratamiento pre cosecha con un fungicida químico sintético aplicado en aerosol, posteriormente puede emplearse la cosecha temprana o bien un tratamiento pre almacenamiento y en tercer lugar un tratamiento en frío después del almacenamiento, tratando los frutos conjuntamente con cera antes del embalaje (Northover y Zhou, 2002). En otras frutas y hortalizas como camote, papaya jitomate entre otros se han aplicado las dos primeras prácticas de control. Los fungicidas químicos comúnmente utilizados son el dicloran, iprodione, fludioxonil y tebuconazol (Adaskaveg et al., 2002). El dicloran ha sido considerado muy eficaz contra la pudrición causada por R. stolonifer, se ha utilizado tanto en la fase pre cosecha en forma de aerosol (ajo, algodonero, apio, batata, berenjena, cacahuate, calabacín, cebolla, endibia, fresa, frutales de hueso, frutas de caña, girasol (para multiplicación de simiente), judía, lechuga, ornamentales, patata, pepino, pimiento, tomate, vid, zanahoria, etc.), como en la fase postcosecha sumergiendo los frutos (ciruela, tomates, jitomates, nectarinas, duraznos, cítricos, fruta de hueso y pepita etc.) en una solución con este agente químico; aunque es un fungicida residual, lo que da lugar a que los frutos tratados presenten residuos color amarillo que hace que a la vista del consumidor tengan un mal aspecto. El iprodione también es considerado como un 17

33 fungicida eficaz contra R. stolonifer. En Canadá ha sido utilizado durante la pre cosecha con resultados aceptables. Se considera que el tebuconazol y el propiconazol (Orbit) son tan represivos contra este fitopatógeno, como el iprodione y el dicloran durante 6 días, pero su control es inferior después de 8 días de incubación a temperaturas de C (Adaskaveg et al., 2002; Northover y Zhou, 2002). También se ha utilizado la combinación de dos o más fungicidas químicos sintéticos, siendo que en la actualidad se ha registrado la resistencia de las cepas a los diferentes tratamientos químicos antes expuestos, además de que la mayoría son residuales y por lo tanto pueden causar efectos secundarios en el consumidor. Por esto se han hecho varios estudios para combatir a R. stolonifer de manera natural. Esto incluye el uso de métodos físicos como son las atmósferas controladas, tratamientos con calor y las radiaciones. También se han usado alternativas naturales como control biológico usando algunas levaduras propias de los frutos o productos hortícolas (Qing y Shiping, 2000). De la misma manera se ha evaluado el uso de sustancias provenientes de plantas que presentan características fungicidas, como algunos extractos, aceites esenciales, acetaldehído, etc. así como el quitosano (Northorver y Zhou, 2002; Hernández-Lauzardo et al., 2007; Abd Alla et al., 2008) El Jitomate como producto hortícola de interés en México. A nivel mundial el jitomate ocupa el segundo lugar entre las hortalizas; y aunque México ocupa el décimo lugar en producción, le corresponde el tercero en comercialización del fruto. En México el jitomate es considerado como la segunda especie hortícola más 18

34 importante por la superficie sembrada y como la primera por su valor de producción (Arrellano y Gutiérrez, 2006). En el periodo comprendido a los años la producción de jitomate fue de dos millones 160 mil toneladas (SAGARPA 2006a; Martínez-Romero et la., 2008), de las cuales se exportaron a los mercados internacionales más de 902 mil 515 toneladas de esta hortaliza, lo que representó divisas por el orden de mil 131 millones de dólares durante el 2005 (SAGARPA, 2006b). En el 2007, México exportó jitomate a EU con un valor cercano a los 1,200 millones de dólares, lo que representó el 8% de las exportaciones totales de productos agropecuarios del país que equivale al 80% del jitomate que importa EU (Martínez-Romero et al., 2008). Finalmente la rentabilidad del cultivo está en función entre otros factores de la vida postcosecha, pues de ella depende el éxito de comercialización, que es generalmente largo y el consumidor es exigente (Arellano y Gutiérrez, 2006). Igualmente el jitomate es la hortaliza más importante para procesamiento en términos de valor, volumen y actividad, que redunda en la generación de empleos (Chauvet y Massieu, 1996) Producción de jitomate en el estado de Morelos En el estado de Morelos, el jitomate se produce a cielo abierto; ya sea en temporal o de riego y en invernadero; su producción representa 2 mil 591 hectáreas cultivadas a cielo abierto en el ámbito estatal, con una derrama económica de 170 mil pesos por ha. Con base en los registros realizados por el Distrito de Desarrollo Rural Zacatepec-Galeana en el 19

35 año 2002, en el estado de Morelos se produce jitomate en 18 municipios, entre los que destacan: Atlatlahuacan con hectáreas, Tepoztlán (136 ha), Cuautla (69 ha) y Cuernavaca (51 ha). En estos cuatro municipios se encuentra el 80% de la superficie sembrada y se obtiene el 80% de la producción de jitomate del estado (León y Guzmán, 2004). La producción de jitomate bajo condiciones de riego se localiza en los Municipios de Cuautla (69 ha), Ayala (47 ha) Tepalcingo (47 ha) y Coatlán del Río (35 ha), principalmente. La diferencia con las zonas de temporal es más marcada en rendimiento por hectárea que en el precio de venta; en este sentido, en algunos municipios se registran rendimientos mayores hasta en 100% con respecto a la producción en temporal (Morelos-POA, 2008). En el estado de Morelos, la producción de jitomate se mantiene durante todo el año, con incrementos en los meses de agosto, septiembre y octubre; tiempo en que se cosecha el jitomate que se produce a cielo abierto (León y Guzmán, 2004; Morelos-POA, 2008; SAGARPA, 2003c) Generalidades del jitomate El jitomate o tomate rojo es una planta originaria de América tropical, cuyo origen se localiza en la región de los Andes (Chile, Colombia, Ecuador, Bolivia y Perú), en donde encuentra la mayor variabilidad genética y abundancia de tipos silvestres (Peralta y Spooner, 2007). México al igual que Perú se considera a nivel mundial como el centro más importante de domesticación del jitomate. Esta hortaliza fue llevada a Europa en

36 empezando a comercializarse en Estados Unidos hacia el año 1835 (Peralta y Spooner, 2007). El jitomate se clasifica en el orden Solanales, familia Solanaceae; género Solanum y especie Solanum lycopersicum L., también conocido como Lycopersicum esculentum Mill., es una planta herbácea perenne que produce una baya que va de un color amarillo hasta rojo y que por sus características nutritivas es altamente consumida alrededor del mundo (Peralta y Spooner, 2007). La palabra jitomate procede del náhuatl xictli, ombligo y tomātl, tomate, que significa tomate de ombligo. Como una curiosidad, debe notarse que aunque la palabra tomate viene del náhuatl tomatl, en el sur de México el tomate es conocido como jitomate, mientras que se le llama tomate al tomatillo o tomate verde (Physalis ixocarpa L.) Importancia nutricional del jitomate. El jitomate es un alimento con escasa cantidad de calorías, la mayor parte del peso del fruto es agua y el segundo constituyente en importancia son los hidratos de carbono, los que le confieren un sabor dulce, también contiene algunos ácidos orgánicos que le proporcionan el sabor ácido característico; el jitomate es una fuente importante de minerales como el potasio y el magnesio, tienen vitaminas como la B1, B2, B5 y la vitamina C, también presenta carotenoides como el licopeno (pigmento rojo). La vitamina C y el licopeno son excelentes antioxidantes que pueden tener una función protectora para el organismo (Ejechi-Bernard et al., 1998; Gebhardt y Thomas, 2002). Este último es 21

37 un compuesto que además de poseer propiedades antioxidantes, actúa protegiendo a las células humanas del estrés oxidativo, producido por la acción de los radicales libres que son uno de los principales responsables de las enfermedades cardiovasculares, del cáncer y del envejecimiento. Además, actúa modulando las moléculas responsables de la regulación del ciclo celular y produciendo una regresión de ciertas lesiones cancerosas (Gebhardt y Thomas, 2002). Cuadro 2. Composición química por cada 100g de jitomate crudo Componente Cantidad Componente Cantidad Agua 94g Carbohidratos 4.3 g Calcio 7.0 mg Sodio 1.2 mg Magnesio 10 mg Fibra 0.5 g Fierro 0.4 mg Grasa 0.2 g Fósforo 23 mg Proteínas 0.9 g Potasio mg Acido ascórbico 17.6 mg Provitamina A 0.38 mg Glúcidos 2.8 g Vitamina B mg Vitamina B mg Vitamina B mg Vitamina C 0.7 mg Energía 19.0 Kcal Fuente: Ensmigner et al., 1995 Se sabe que por cada 100 g de tomate se consumen solamente 18 Kcal. En el cuadro 2 se provee información sobre los principales constituyentes nutritivos del jitomate. Por otro lado, el jitomate inmaduro contiene solanina que resulta ser tóxica para el humano, por lo que no debe consumirse en ese estado de madurez (Peralta y Spooner, 22

38 2007). Aunque el jitomate en estado maduro es altamente recomendable para el consumo humano además de que se puede consumir fresco y procesado Aceites esenciales Los aceites esenciales son líquidos oleosos, aromáticos, volátiles, obtenidos de diferentes partes de la planta, como tallos, flores, hojas, raíces, semillas, frutos etc. Pueden obtenerse por diferentes métodos pero el más común es por destilación utilizado primordialmente para la producción (Burt, 2004; Al-Bayati, 2008). Se estima que aproximadamente se conocen más de 3000 aceites esenciales y que 300 de ellos tienen importancia comercial, ya que se usan en diferentes productos ya sean de belleza, en alimentos, como condimentos o sabores entre otros usos (Burt, 2004; Maguna et al., 2006; Tullio et al., 2007). Se sabe que algunos aceites esenciales tienen efecto antibacteriano, antifúngico, antiviral, insecticida y además poseen propiedades antioxidantes así como antiinflamatorias (Chericoni et al., 2005; Kordali et al., 2008; Inoyue et al., 2006; Maguna et al., 2006; Matan et al., 2006). Los aceites esenciales están constituidos por una mezcla compleja de compuestos, principalmente terpenos, alcoholes fenólicos como es el caso del timol, carvacrol, eugenol; alcoholes no fenólicos como el geraniol, linalol, aldehídos, cetonas, ácidos y ésteres, entre otros y cada planta puede tener hasta 100 sustancias químicas distintas en diferentes cantidades y que en conjunto proporcionan al aceite esencial características propias (Tripathi et al., 2004; Ortuño, 2006). Se considera que de manera natural juegan 23

39 un papel importante en los mecanismos de defensa de la planta en contra de microorganismos fitopatógenos, algunos tienen efecto antifúngico; reducen el crecimiento de las hifas, inducen la lisis provocando la evacuación citoplásmica del hongo e involucra cambios en la composición de la célula, ruptura de la membrana plasmática, desorganización estructural de la mitocondria e interferencia de las reacciones enzimáticas de la membrana mitocondrial (Kishore y Pande, 2007). Además de que los aceites esenciales son compuestos naturales y por consecuencia son biodegradables, no son residuales y no afectan al ambiente (Tripathi et al., 2004). De ahí la importancia del uso de los aceites esenciales para el control de enfermedades fúngicas. En este trabajo se evaluaron los aceites esenciales de canela (Cinnamomum zeylanicum Blume), tomillo (Thymus vulgaris L.) y clavo (Syzygium aromaticum L.), los cuales se eligieron por su capacidad antifúngica mostrada con diferentes hongos de acuerdo a Barrera-Necha et al. (2008) Aceite esencial de canela. La canela es de la familia Lauraceae, del género Cinnamomum que comprende aproximadamente 250 especies, él árbol es nativo de la India e Indochina, las tres especies importantes de donde se obtienen AE de interés son C. zeylanicum, C. cassia Blume y C. camphora L. La canela tiene efectos biológicos como la analgesia, es antiséptico, antiespasmódico, afrodisiaco, astringente, carminativo, hemostático, insecticida y parasiticida (Jayaprakasha et al., 2003; Santos et al., 2008). 24

40 El aceite de esta especie se puede extraer de la hoja, del tallo o de la raíz, lo que da lugar a diferencias en sus características de aroma, sabor y composición química principalmente (Jayaprakasha et al., 2007). El uso más común es la perfumería, así como saborizantes en la industria de los alimentos, en farmacéuticos, preparaciones dentales y bebidas, entre otros productos, además, se caracteriza por que tiene un aroma dulce, picante y de gran alcance (Kubeczka y Formacek, 2002; Santos et al., 2008). Dentro de los principales constituyentes del aceite de canela se tienen al cinnamaldehído, linalol, eugenol y en menor cantidad terpenos hidrocarbonados, varios aldehídos aromáticos y ésteres (Jayaprakasha et al., 2006; Santos et al., 2008) Aceite esencial de clavo. El clavo (Syzygium aromaticum) es un árbol tropical, originario de las islas Molucca, las islas Zanzíbar y en las islas vecinas de Bemba, pertenece a la familia Myrtaceae, se cultiva en muchas ciudades de clima tropical, es una especie herbolaria muy conocida, por su amplio uso como condimento, principalmente en el arte culinario o bien para elaborar productos como cremas, jabones, perfumes así como en el área médica (Santos et al., 2008; García-González y Vázquez-Sánchez, 2006). El clavo comprende de un 14-21% de aceite esencial, el cual es más denso que el agua y fácilmente se oscurece al contacto con el aire, además tiene un olor fuerte, aromático y picante. El aceite esencial de clavo comprende principalmente fenoles (78-98%), como el eugenol y el acetileugenol, también contiene sesquiterpernos, algunos ésteres, cetonas y alcoholes (Kubeczka y Formacek, 2002; García-González y Vázquez-Sánchez, 2006). 25

41 Aceite esencial de tomillo. El tomillo es de la familia Lamiaceae, es un arbusto herbáceo perenne, es una planta nativa de la región del mediterráneo pero es cultivada en distintas regiones como España, Grecia, Italia, algunas ciudades del centro de Europa, Turquía, Israel, Norte América solo por mencionar algunas; en Irak es usado como expectorante, antibroncolítico, antiespasmódico, antihelmíntico, carminativo y como antidiurético (Al- Bayati, 2008). El tomillo es una especie comúnmente usada de diversas maneras, una de ellas es como aceite esencial el cual es ampliamente utilizado como saborizantes de alimentos, preparación farmacéutica, enjuagues, desinfectantes además algunas veces como perfumes (Ortuño, 2006). El aceite esencial contiene como componentes principales al timol y carvacrol; en menor cantidad es el p-cimeno, limoneno, carvacrol, linalol carbolifeno, etc. (Murray, 2000; Tripathi et al., 2004) Quitosano La quitina (del griego tunic, envoltura) se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y después de la celulosa es el segundo polisacárido de mayor abundancia, sus fuentes principales son el exoesqueleto de muchos crustáceos, alas de insectos, paredes celulares de hongos, algas etc., de la quitina se deriva el quitosano que a su vez se puede encontrar de forma natural en paredes celulares de algunas plantas y hongos. Sin embargo, su fuente más importante a nivel industrial lo constituye la quitina, mediante el proceso de desacetilación química o enzimática se ha producido a gran escala. El 26

42 quitosano, polímero constituido fundamentalmente por unidades de glucosamina (2- amino-2-desoxi-d-glucosa) con uniones β (1-4), presenta propiedades policatiónicas que le confieren características únicas de funcionalidad, además de ser biodegradable y no tóxico, aspectos que le dan un gran potencial de aplicación en diferentes áreas; en la agricultura, en la medicina, tratamientos de aguas, cosméticos, biosensores, etc. (Bautista- Baños et al., 2006; Lárez, 2006). El quitosano se ha empleado como película comestible siendo una alternativa de conservación en cultivos agrícolas durante la fase postcosecha (Hernández-Muñoz et al., 2006) Efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales. El quitosano y los aceites esenciales nos interesan principalmente por una de sus características; su efecto fungicida. Se sabe que estos productos presentan actividad contra diferentes microorganismos. A continuación se describen algunas investigaciones realizadas con los productos de interés para este trabajo, con la finalidad de conocer cómo se comportan el quitosano y los aceites esenciales (AE). Recientemente, Hernández-Lauzardo et al. (2008) estudiaron el efecto del quitosano con diferentes pesos moleculares sobre el desarrollo in vitro de R. stolonifer; los autores reportaron que el quitosano de bajo peso molecular fue más efectivo para inhibir el crecimiento micelial, mientras que el quitosano de alto peso molecular afectó la producción y germinación de las esporas. Por otra parte, se analizó el efecto del quitosano en el control de la pudrición blanda producida por R. stolonifer en jitomates almacenados 27

43 a 14 C durante 48, 72 y 96 h, observándose que la presencia de este polímero retrasó el desarrollo de la pudrición (Bautista-Baños y Bravo-Luna, 2004). Asimismo, el recubrimiento con quitosano en fresas y cerezas durante su almacenamiento, mostró no sólo reducción en la enfermedad, sino que incrementó la actividad de algunas enzimas relacionadas con la inducción de resistencia vegetal (quitinasas y 1-3 glucanasas) (Zhang y Quantick, 1998). De todos los AE que se han estudiado, destacan los aceites de clavo (Syzygium aromaticum), canela (Cinnamomum zeylanicum) y tomillo (Thymus vulgaris); entre otros como los de epazote, menta, ajo, lima y eucalipto, observándose que los últimos tres aceites mencionados inhibieron el crecimiento micelial y la esporulación de los conidios de C. gloeosporioides, a concentraciones de 200, 250 y 300 µg ml -1. De la misma manera, se observó un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de Fusarium oxisporum f. sp. gladioli (Massey) Snyder and Hansen, con los mismo AE a las mismas concentraciones (Barrera- Necha et al., 2008; Barrera-Necha et al., 2009). García-Camarillo et al. (2006), evaluaron el efecto del AE de canela sobre A. flavus utilizando una dosis mínima de 100 ppm y una máxima de 500 ppm. Dimitra-Daferera et al. (2003), observaron que el aceite de tomillo presentó uno de los mejores efectos inhibitorios sobre Fusarium spp. y B. cinerea, así como en el control de la pudrición por moho gris en fresas (Chu et al., 1999) y en el control de la pudrición café causado por M. fructicola (Chu et al., 2001). Rasooli y Razzaghi (2004), reportaron a nivel in vitro la actividad fungicida e inhibitoria de la producción de aflatoxinas en A. parasiticus Speare con el AE de tomillo; Plotto et al. 28

44 (2003), determinaron el efecto de varios AE, incluyendo tomillo y canela para el control de enfermedades en tomate y observaron que el AE de canela fue uno de los mejores para el control de B. cinerea. Tsao y Zhou (2000), reportaron que el timol (constituyente del AE de tomillo) presenta actividad fungistática sobre B. cinerea y M. fructicola. 29

45 3. JUSTIFICACIÓN Los productos hortofrutícolas son afectados por pudriciones postcosecha que tradicionalmente se han controlado mediante el empleo de fungicidas sintéticos con los beneficios y riesgos que implica el uso de los mismos. Actualmente, se buscan alternativas naturales que no afecten a la salud del humano y al medio ambiente. Hasta el momento los AE y el quitosano se han utilizado de manera individual y se ha visto que presentan resultados favorables en contra de hongos postcosecha, sin embargo, se busca amplificar el efecto para tener el control de estos hongos, evitando grandes pérdidas postcosecha. De manera que el quitosano y los aceites esenciales utilizados de forma individual o combinada representan alternativas interesantes para inhibir in vitro e in situ el desarrollo de R. stolonifer. Además de que no existen reportes previos del uso de esta combinación (quitosano-aceites esenciales) para inhibir el desarrollo de R. stolonifer in vitro o en frutos de jitomate. 30

46 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general Determinar in vitro e in situ el efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo, de manera individual y combinada sobre Rhizopus stolonifer Objetivos particulares Evaluar in vitro el efecto del quitosano y de los aceites esenciales de tomillo, clavo y canela sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R. stolonifer Evaluar in vitro el efecto antifúngico de las combinaciones de quitosano-aceites esenciales de clavo, canela y tomillo sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R. stolonifer. Evaluar el efecto antifúngico del quitosano y aceites esenciales de manera individual y combinada contra R. stolonifer en frutos de jitomate. 31

47 5. MATERIALES Y MÉTODOS Figura 2. Esquema general del trabajo experimental. El cual se divido; in vitro, en donde se evaluaron al quitosano y a los AE utilizados individualmente y combinados; e in situ donde se evaluaron los mejores tratamientos obtenidos in vitro 32

48 5.1. Material biológico Se empleó la cepa de R. stolonifer R3 aislada de frutos de jitomate (Lycopersicon esculentum) del tipo Saladette provenientes de Yautepec, Morelos (Hernández-Lauzardo et al., 2006). Los aceites esenciales para las evaluaciones con R. stolonifer, se obtuvieron de forma comercial en la compañía de aceites y esencias S.A. de C.V., México, D.F.; se utilizaron tres aceites esenciales que son tomillo, canela, y clavo. Se utilizaron frutos de jitomate del tipo Saladette, los cuales fueron seleccionados con las siguientes características; tamaño uniforme, estado rojo maduro, sin lesiones y ausencia de enfermedad, los frutos fueron cultivados y cosechados en Tlayacapan, Morelos en una huerta familiar Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in vitro Elaboración de los medios de cultivo. Los medios de cultivo, Papa Dextrosa Agar (PDA) y Caldo de Papa Dextrosa (PDB) se elaboraron de acuerdo a las condiciones indicadas por el fabricante (Bioxon). Se utilizó quitosano de bajo peso molecular para los medios de PDA adicionados con quitosano los cuales se prepararon a dos concentraciones 2 y 10 mg ml -1. Para ello se elaboró una solución stock de quitosano a una concentración de 20 mg ml -1 ; se pesaron 2 g de quitosano y se disolvieron en 2 ml de ácido acético glacial, con 50 ml de agua destilada, se agitó durante 24 h posteriormente se ajustó el ph a 5.6 con NaOH 0.1 N (Hernández- 33

49 Martínez, 2005), finalmente la solución se aforó a 100 ml con agua destilada. Para obtener las concentraciones de 2 y 10 mg ml -1, se diluyó el quitosano con el medio de cultivo, no sin antes haberlos esterilizado por separado a 15 lb pul 2 durante 15 min, finalmente en condiciones controladas de esterilidad se mezclaron y se vaciaron en cajas Petri de 100X 15 mm. Por separado se pesaron los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo para obtener las concentraciones de 100, 200 y 300 µg ml -1 a evaluar y se disolvieron en 1 ml de agua destilada con tween 20 (Aldrich) en una relación 1:6 (1 parte de tween en 5 partes de aceite); posteriormente, por separado se llevaron a un volumen final de 150 ml de medio de cultivo (PDA) y se esterilizaron a 15 lb pul 2 de presión durante 15 min, finalmente se vaciaron en cajas Petri de 100 X 15 mm. Para los medios combinados, se colocó el quitosano en un matraz de 50 ml y se esterilizó a 15 lb pul 2 durante 15 min. Por otro lado los aceites esenciales se pesaron y se diluyeron con tween en 1 ml de agua destilada, posteriormente se agregaron por separado al PDA y se esterilizaron (Kumar et al., 2008). Finalmente se mezcló el quitosano con el PDA adicionado con los aceites esenciales, todo en condiciones de esterilidad y contínua agitación, el medio combinado se vació en cajas Petri de 100 X 15 mm y se dejaron solidificar. Una vez solidificados los medios con los tratamientos se sometieron a prueba de esterilidad, la cual consistió en dejarlos en incubación a 25 C durante 24 h. 34

50 Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales. Las concentraciones de AE de canela, clavo y tomillo utilizadas en los ensayos, se determinaron a partir de tres diferentes concentraciones evaluadas, que fueron 100 µg ml -1, 200 µg ml -1 y 300 µg ml -1, las cuales presentan antecedentes de efecto antifúngico, que ya han sido descritos anteriormente en este trabajo. Los AE se incorporaron al medio de cultivo PDA como se describió en el punto , después de la prueba de esterilidad se colocó un inoculo de R. stolonifer de 6 mm de diámetro, en la parte central de la caja Petri, durante la incubación se determinó el crecimiento micelial con ayuda de un Vernier cada 8 h durante 48 h de incubación. Finalmente se eligieron solo dos concentraciones; 100 µg ml -1 y 300 µg ml -1, que fueron utilizadas en los ensayos posteriores Crecimiento micelial A partir de un cultivo de R. stolonifer con 72 horas de incubación se obtuvieron discos de 6 mm de diámetro con un horadador, los discos se colocaron en el centro de las cajas Petri con los diferentes tratamientos (referidos en el punto ). Las cajas Petri con PDA fueron utilizadas como control positivo y las cajas con PDA más dicloran a 1 mg ml -1 representaron al control negativo. Aquí cabe mencionar que se preparó una solución Stock de dicloran a 10 mg ml -l de acuerdo a las condiciones del fabricante (Gowan) posteriormente se diluyó con agua destilada hasta obtener una concentración de 1 mg ml - 1. Las cajas con PDA más tween, se utilizaron como control para descartar que el tween 35

51 tenga efecto sobre el hongo. Para los tratamientos combinados también se utilizaron controles con tween al adicionarlo a los medios con quitosano. Se utilizaron seis cajas por cada tratamiento y se hicieron 3 repeticiones por experimento, teniendo finalmente 14 tratamientos individuales y 17 tratamientos combinados (Cuadro 3), es importante mencionar que primero se hizo el experimento con los tratamientos individuales y posteriormente el experimento con los tratamientos combinados. Los medios inoculados se incubaron a temperatura ambiente (25-28 C), registrando cada 8 h la lectura del diámetro de la colonia con un Vernier digital, hasta que el control positivo cubrió por completo la superficie de la caja. De cada lectura obtenida del diámetro de la colonia se restaron 6 mm del diámetro del inoculo inicial. Con los datos obtenidos de crecimiento micelial, se calculó el índice antifúngico para cada tratamiento con la siguiente fórmula (Guo et al. (2006): (IA) = 1-(Da/Db) X 100 Donde IA es índice antifúngico, Da es el diámetro de la zona de crecimiento de R. stolonifer en los tratamientos probados y Db es el diámetro de la zona de crecimiento de R. stolonifer en la caja control. También con los datos de crecimiento micelial se obtuvo la tasa de crecimiento de R. stolonifer con cada uno de los tratamientos e incluso con los controles. 36

52 Cuadro 3. Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites esenciales (a diferentes concentraciones), para evaluar el efecto in vitro sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R. stolonifer. Tratamientos individuales PDA (control) PDA-Tween 1 mg ml -1 Quitosano 2 mg ml- 1 (Q2) Quitosano 10 mg ml- 1 (Q10) Canela 100 μg ml- 1 (Ca100) Tratamientos combinados PDA (control) PDA-Tween Q2-Ca100 Q2- Cl100 Q2 -To100 Clavo 100 μg ml- 1 (Cl100) Q2-Ca 300 Tomillo 100 μg ml- 1 (To100) Canela 200 μg ml- 1 (Ca200) Clavo 200 μg ml- 1 (Cl200) Tomillo 200 μg ml- 1 (To200) Canela 300 μg ml- 1 (Ca300) Clavo 300 μg ml- 1 (Cl300) Q2- Cl300 Q2-To300 Q2-Tween Q10-Ca100 Q10-Cl100 Q10-To100 Tomillo 300 μg ml- 1 (To300) Q10-Ca 300 Dicloran 1 mg ml -1 (D 1) Q10-Cl300 Q10-To300 Q10-Tween D 1 37

53 Esporulación Una vez evaluado el crecimiento micelial se continuaron incubando las cajas de Petri hasta 72 h para evaluar la esporulación, se utilizaron las seis cajas procedentes del ensayo anterior, cada una de ellas con sus respectivos tratamientos, posteriormente se les adicionó 10 ml de agua destilada estéril y las colonias se rasparon con una varilla de vidrio acodada para recuperar todas las esporas posibles. La suspensión de esporas obtenida se colocó sin filtrar en un matraz de 50 ml, a esta se le adicionaron siete gotas de lactofenol para evitar que las esporas germinaran y se hizo el conteo de esporas para cada tratamiento, tomando de cada matraz previamente agitado una alícuota de 20 µl de la suspensión de esporas que se colocaron en la cámara de Neubauer y se cubrió con un cubreobjetos. Se contaron las esporas de los cuatro cuadrantes de las esquinas de la cuadrícula y el cuadrante central de la cámara. Con los datos obtenidos se hicieron los cálculos correspondientes y se obtuvo el número de esporas por ml para todos los tratamientos. Las suspensiones que no se contaron inmediatamente se guardaron a 4 C para posteriormente hacer su conteo Germinación La germinación se evaluó en PDB adicionado con quitosano, con cada uno de los aceites esenciales o con dicloran, según el tratamiento evaluado; como control positivo se utilizó simplemente PDB. Los tratamientos utilizados fueron los mismos que se evaluaron para crecimiento micelial y esporulación, colocados en tubos Eppendorf de 1 ml. Para esta 38

54 evaluación se requirió de una suspensión de esporas de R. stolonifer de concentración conocida Elaboración de la suspensión de esporas A partir de tres cajas Petri con R. stolonifer de 72 h de incubación se hizo la suspensión de esporas; a cada caja se le agregaron 10 ml de agua destilada estéril y se raspó la colonia con una varilla de vidrio acodada, de manera que todas las esporas posibles fueran colectadas. Los lavados resultantes de las tres cajas se recogieron en un matraz de 50 ml, que se mantuvo en constante agitación. Posteriormente, las esporas se contaron en la cámara de Neubauer y a partir de ahí la suspensión se diluyó hasta ajustarla a una concentración de 1X10 6 esporas por mililitro. Esta suspensión de esporas se hizo en el momento en que se realizó el experimento, para evitar que las esporas ya estuviesen germinadas Evaluación de la germinación Una vez obtenida la suspensión de esporas, se tomaron alícuotas de 50 μl y se colocaron en los tubos Eppendorf que contenían 450 μl de PDB y PDB más cada uno de los diferentes tratamientos. Los tubos se agitaron en un vórtex y se incubaron en agitación a 100 rpm a temperatura ambiente (25 ± 3 C). Para cada tratamiento se utilizaron seis repeticiones por tratamiento. Después de la incubación se tomaron alícuotas de 10 µl, de cada tubo Eppendorf previamente agitado en un vórtex, la alícuota se colocó en un portaobjetos y se le agregó una gota de lactofenol, posteriormente se cubrió con un cubreobjetos y se contaron 100 esporas bajo el microscopio óptico con el objetivo 40X. 39

55 Esto se repitió a las 0, 3, 6, 9, y 12 h después de la inoculación de las esporas, se tomo una alícuota por repetición es decir, 6 alícuotas por tratamiento. Se consideró a una espora germinada cuando el tubo germinal fue igual o mayor al tamaño de la espora (El Ghaouth, 1992). También se hicieron observaciones a las 9 h de incubación de la forma de las esporas de R. stolonifer. Con estos datos se obtuvo el porcentaje de esporas germinadas para cada tratamiento. % de germinación= Esporas totales X Esporas germinadas

56 5.3. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ Prueba de patogenicidad de R. stolonifer cepa R3 Se evaluó la capacidad de esta cepa para infectar frutos de jitomate del tipo Saladette. Se preparó una suspensión de esporas de R. stolonifer (1X10 6 esporas ml.1 ) de acuerdo al punto , se colocó dentro de un atomizador y se mantuvo en agitación hasta la inoculación de los frutos. 20 frutos de jitomate se lavaron y se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 15 min, se enjuagaron tres veces y se dejaron secar a temperatura ambiente (25 ± 3 C) sobre papel absorbente. Posteriormente en condiciones de esterilidad se lesionaron con una aguja de disección, en la parte ecuatorial del fruto, el tamaño de la lesión fue de 2 mm de diámetro por 2 mm de profundidad. Se asperjaron diez frutos con la suspensión de esporas de R. stolonifer, los otros diez no fueron asperjados (Figura 3). Todos los frutos se colocaron de manera individual en cámaras con alto contenido de humedad, con entrada y salida de aire. Se incubaron a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas y se determinó el porcentaje de infección. El experimento se repitió 2 veces. La cepa de R. stolonifer R3 fue recuperada a partir de frutos de jitomate infectados artificialmente con la misma cepa. Al inicio del experimento los frutos de jitomate presentaban un estado de madurez rojo maduro, sin lesiones y sin presencia de alguna enfermedad. Al final del experimento (96 h) los frutos presentaron signos de la pudrición blanda causada por R. stolonifer y con un daño visual importante (figura 3 y 4). A partir de los frutos infectados, se volvió a aislar la cepa R3 y con esta se infectaron nuevamente 41

57 frutos de jitomate; se requirieron varias reinfecciones de la cepa R3 a los fruto, para que finalmente nueve de diez frutos inoculados artificialmente con R. stolonifer se infectaran, y la cepa recuperara su patogenicidad. Posteriormente, se volvió a purificar y a verificar las características morfológicas de la cepa R3 de acuerdo a lo reportado por Hernández- Lauzardo et al. (2008) correspondientes a R. stolonifer (cepa R3). Figura 3. Capacidad infectiva de R. stolonifer al inicio del experimento. 3A) Jitomates inoculados con 1X10 5 esporas ml -1. 3B) Jitomates sin inocular. Figura 4. Capacidad infectiva de R. stolonifer después de 72 h de incubación. 4A) Jitomates inoculados con 1X10 5 esporas ml -1. 4B) Jitomates sin inocular. Al final del experimento 42

58 Evaluaciones en jitomate Se utilizaron por separado jitomates ¾ sazón y jitomates totalmente maduros, se lavaron con agua corriente y jabón, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 15 min, se enjuagaron con agua destilada tres veces y se dejaron secar a temperatura ambiente (25 ± 3 C), cada uno de los frutos fueron marcados y pesados en una balanza digital. En cada tratamiento se emplearon 10 frutos como unidad experimental y tres repeticiones de cada una. Los tratamientos aplicados se observan en el cuadro 4. Cuadro 4. Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites esenciales aplicados in situ contra R. stolonifer. Tratamientos individuales Agua destilada estéril Quitosano 2 mg ml- 1 (Q2) Quitosano 10 mg ml- 1 (Q10) Tratamientos combinados Agua destilada estéril Q10- Cl300 Q10 To300 Canela 300 μg ml- 1 (Ca100) Q10-Ca 300 Clavo 300 μg ml- 1 (Cl100) Dicloran 1 mg ml -1 Tomillo 300μg ml- 1 (To100) Dicloran 1 mg ml Elaboración de los tratamientos empleados in situ Para los tratamientos individuales se procedió de la siguiente manera; a partir de una solución stock de quitosano de 20 mg ml -1 se obtuvo quitosano a una concentración de 10 43

59 mg ml -1 que se diluyó con agua destilada a un volumen final de 500 ml. Los aceites esenciales se pesaron para obtener una concentración de 300 μg ml -1 y se diluyeron con Tween (1:6) en 1 ml de agua destilada posteriormente se llevaron a un volumen final de 500 ml. Todos los tratamientos se esterilizaron a 15 lb pul 2 durante 15 min. Con respecto a los tratamientos combinados se preparó la cantidad de quitosano necesaria para tener una concentración de 10 mg ml -1 y los aceites diluidos con tween se colocaron en el agua destilada. Todas las soluciones se esterilizaron y después se mezclaron para tener un volumen final de 500 ml. Se dejaron enfriar a temperatura ambiente en matraces de 1 L, de la misma manera se hizo una solución de dicloran a 1 mg ml Acondicionamiento de los frutos de jitomate para el bioensayo. Las soluciones preparadas se colocaron en vasos de precipitado y finalmente se procedió a tratar los frutos. Los frutos lavados y desinfestados se hirieron en la parte ecuatorial del jitomate con una aguja de disección en condiciones de esterilidad, la lesión fue de 2 mm de profundidad por 2 mm de ancho. Posteriormente se sumergieron los diez frutos de cada tratamiento, uno por uno en el vaso de precipitado que contenía el tratamiento a evaluar, de manera que quedaran totalmente cubiertos con la solución durante 5 segundos e inmediatamente se retiraron. Posteriormente se colocaron en una superficie lisa dentro de la campana de flujo laminar se dejaron secar durante 5 minutos y se asperjaron con la solución de esporas. Lo mismo se hizo con el control negativo en donde los frutos no fueron inoculados, pero si fueron sumergidos en agua destilada estéril al 44

60 igual que el control positivo a diferencia de que este último fue lesionado y asperjado con la suspensión de esporas. Una vez tratados y asperjados los frutos con las esporas de R. stolonifer se incubaron Almacenamiento. El bioensayo in situ se realizó en un sistema de almacenamiento que permitió de manera práctica el desarrollo del experimento, el cual se llevo completamente al azar, además facilitó que todos los tratamientos tuvieran las mismas condiciones de iluminación, temperatura, humedad, favoreciendo de la mejor manera las condiciones del bioensayo (figura 5). Figura 5. Sistema de almacenamiento empleado para el bioensayo con los frutos de jitomate, el cual consistió en a) unidades que se podían estivar una sobre otra, b) a cada agrupación se le colocó una malla y c) cada unidad contenía una cama de polipapel, una cama de algodón y una cama de papel absorbente. 45

61 Este sistema consistió de contenedores individuales que se estibaron, por lo que facilitó el manejo de cada una de las unidades para hacer las mediciones correspondientes. Los frutos tratados se colocaron dentro de los contenedores de plástico previamente dispuestos para cada tratamiento, como se muestra en la figura 5. En cada contenedor se colocaron diez jitomates del mismo tratamiento a una distancia de 2 a 3 cm. En total se tenían diez contenedores, cada uno con un tratamiento diferente. Cada tratamiento se hizo por triplicado por lo que finalmente se tuvieron 30 contenedores. Todos estos se colocaron con las mismas condiciones de luz, temperatura, humedad y se dispusieron al azar. Se hicieron las observaciones cada 24 h hasta las 96 h de incubación a temperatura ambiente (25-28 C), monitoreando la fluctuación de la temperatura mediante mediciones continuas con un termómetro de mercurio y manteniendo constante la humedad al humedecer frecuentemente las camas de algodón, además las unidades se cambiaron de posición durante el experimento para igualar las condiciones en todos los tratamientos. Durante este periodo de incubación se evaluó el porcentaje de infección, índice de severidad y pérdida de peso. 46

62 Desarrollo de la escala de daño para evaluar índice de severidad. Se desarrolló una escala de daño en frutos de jitomate, que permitió evaluar el índice de severidad. Se emplearon 20 jitomates completamente maduros, se lavaron y se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1%, se dejaron secar a temperatura ambiente, después a todos los frutos se les hizo una lesión de 2 mm de profundidad por 2 mm de ancho en la parte ecuatorial del fruto, con una aguja de disección previamente esterilizada. Solo diez frutos fueron asperjados con una suspensión de esporas con 1X10 5 esporas por ml, estos se colocaron en un contenedor de plástico con las condiciones de humedad, luz y temperatura adecuadas para que se favoreciera la infección. De la misma manera todos los frutos no asperjados se colocaron en otro contenedor, en las mismas condiciones. Ambos se incubaron a temperatura ambiente. Se hicieron observaciones en los frutos a las 0, 12, 24, 36, 48 56, 64 y 72 h de incubación. Se midieron los diámetros de las lesiones presentadas en los diez frutos asperjados a los diferentes tiempos de incubación. De las diez repeticiones se obtuvieron los valores máximos y mínimos así como la media para cada tiempo observado y se hizo una relación con respecto al daño presentado y el tamaño total de cada fruto. A partir de esos datos se obtuvo la escala de daño en porcentaje, además se realizó un diagrama pictográfico que se utilizó en cada experimento (Figura 14). 47

63 Índice de severidad Para el cálculo de índice de severidad (IS), se empleó la escala de daño establecida en el punto la cual presenta las siguientes categorías; 0= 0%, 1= 1-5%, 2= 6-15%; 3= 16-45%, 4= 46-75% y 5= % de daño visual por fruto y se determinó el índice de severidad mediante la siguiente ecuación (Pérez et al., 1995): Índice de severidad = Xi (0) + Xi (1) + Xi (2) + Xi (3) + Xi (4) + Xi (5) /N En donde Xi = Número de frutos enfermos por cada grado de daño 0, 1, 2, 3, 4, 5= Grado de daño en la escala utilizada N = Número de frutos por unidad experimental Porcentaje de infección Para determinar el porcentaje de infección se contaron los frutos infectados a lo largo del periodo de incubación, registrando el número de frutos infectados por día durante 4 días, tomando en cuenta que el 100 % corresponde al número total de frutos que se evaluaron en cada tratamiento Pérdida de peso Se pesaron todos los frutos individualmente en una balanza digital al inicio y al final del experimento, se calculó la diferencia entre esas dos mediciones y se obtuvo la pérdida de peso de cada fruto durante los 4 días de incubación. 48

64 5.4. Análisis estadístico En todos los experimentos se utilizó un diseño experimental completamente al azar en arreglo simple. En los ensayos in vitro los datos obtenidos de crecimiento, micelial y esporulación se analizaron de acuerdo a un ANOVA de una vía y la comparación de medias se hizo con la prueba de Tuckey utilizando el programa Sigma Stat 3.5., cabe destacar que se analizaron todos los datos diferentes de cero. También se calculó la tasa de crecimiento en mm h -1 a partir de los datos de crecimiento micelial; mediante regresión lineal de cada una de las repeticiones (6 repeticiones), se obtuvo la F, para cada tratamiento. En los ensayos in situ mediante un análisis de varianza (ANOVA) a excepción del índice de severidad para el cual se hizo la prueba de Kruskal wallis con el programa Sigma Stat versión 3.5. Cabe destacar que se analizaron todos los datos que fueron diferentes de cero. 49

65 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1. Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales. De acuerdo con los resultados, se observo que a 100 µg ml -1 se presentó el mayor crecimiento micelial del hongo con respecto a las otras dos concentraciones. Mientras que a 300 µg ml -1 no hubo crecimiento micelial y a 200 µg ml -1 se presentó un efecto intermedio (figura 6). Figura 6. Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de la aplicación de los aceites esenciales a tres concentraciones. Cl= clavo, Ca=canela y To= tomillo a 100 µg ml -1 (1), 200 µg ml - 1 (2) y 300 µg ml -1 (3). También se observó que conforme aumentó la concentración de los AE, el efecto de inhibición sobre el crecimiento micelial es mayor, esto significa que se presentó un efecto dependiente de la concentración. Esto coincide con los resultados obtenidos por Barrera- Necha et al., (2008) que utilizaron los AE de clavo, canela y tomillo a concentraciones de 50

66 100, 150, 200, 250 y 300 µg ml -1 sobre C. gloeosporioides, observando que conforme aumentó la concentración de los AE la inhibición del crecimiento micelial fue mayor. García-Camarillo et al. (2006), observaron que existe una relación entre el incremento de la concentración del AE y la inhibición en la producción de aflatoxinas por A. flavus, en nuez pecanera. Con los resultados de este ensayo se decidió utilizar solo las concentraciones de 100 y 300 µg ml -1. La concentración de 300 µg ml -1 se utilizó para asegurar que en las combinaciones de quitosano con los AE, el efecto sobre el hongo fuera significativo; inclusive se potenciara el efecto y se presentara un efecto fungicida; mientras que la concentración de 100 µg ml -1 permitiera ver el efecto aditivo o sinérgico al hacer las combinaciones de los AE con el quitosano Crecimiento micelial Los resultados mostraron que R. stolonifer fue susceptible a casi todos los tratamientos, ya sean individuales o combinados. Se observó que el crecimiento micelial dependió de la concentración de cada tratamiento, se destaca que en los tratamientos más concentrados así como en las combinaciones de AE con quitosano, el crecimiento micelial de R. stolonifer en algunos fue escaso, mientras que con otros tratamientos no se presentó crecimiento micelial. En la figura 7A, se observa el comportamiento del crecimiento micelial de R. stolonifer con los tratamientos individuales, en donde se incluye el tratamiento con tween 20, el cual no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento micelial de R. stolonifer. Con esto se 51

67 descarta la posibilidad de un efecto fungicida del tween y se tiene la certeza de que el efecto presentado se debió al quitosano y a los AE. En casi todos los tratamientos se inhibió el crecimiento micelial de R. stolonifer con diferencias estadísticas (P 0.001) respecto al control, la inhibición de crecimiento se observó desde el inicio del experimento. Para cada tratamiento se presentó un comportamiento diferente, principalmente a causa de la concentración del quitosano y de los AE, destacando que conforme aumentó la concentración, el efecto inhibitorio sobre el crecimiento micelial fue mayor (figura 7). De manera que con los AE a 300 µg ml -1 y el dicloran, se observó una inhibición total del crecimiento micelial durante el periodo de incubación, teniendo un índice antifúngico del 100 %. En la figura 7A solo es posible visualizar la línea que representa al tratamiento con dicloran y el efecto obtenido con los AE 300 µg ml -1. En los tratamientos combinados de quitosano con los AE a 300 µg ml -1, no hubo crecimiento micelial, por lo que solo se representan los datos obtenidos de las combinaciones de quitosano con los AE a 100 µg ml -1. En la figura 7B se muestra una disminución considerable del crecimiento micelial de R. stolonifer, aún mucho menor que con los tratamientos individuales a concentraciones mayores (quitosano a 10 mg ml -1 y AE a 300 µg ml -1 ). Existen diversos estudios con AE de diferentes especies vegetales, que muestran que a mayores concentraciones hay mayor efecto sobre el crecimiento del hongo, como es el 52

68 caso de A. parasiticus con el AE de tomillo, en donde este afecta el crecimiento del hongo, la producción de aflatoxinas, y el desarrollo de las esporas a una concentración de 250 ppm (Rasooli y Owlia, 2005). A B Figura 7. Dinámica de crecimiento micelial de R. stolonifer al ser incubado en quitosano y AEs a 28 C. 7A) Tratamientos individuales. 7B) Tratamientos combinados de quitosano con los AE a 100 µg ml -1. Media de seis repeticiones. 53

69 En el caso de A. flavus y A. parasiticus se observó un resultado similar con el AE de anís a 500 mg ml -1 (Bluma et al., 2007). Destacando que en ambos estudios a mayor concentración de los AE mayor fue el efecto sobre el hongo. La tasa de crecimiento y el índice antifúngico se obtuvo solo de los tratamientos en donde aún hubo crecimiento micelial de R. stolonifer, que incluyó al quitosano en sus dos concentraciones (2 y 10 mg ml -1 ) y los AE a 100 µg ml -1, de estos, la menor tasa de crecimiento fue con quitosano a 10 mg ml -1 (Q10) con 0.05 mm h -1, mientras que la tasa de crecimiento con canela a 100 µg ml -1 (Ca 100) no presentó diferencias con respecto al control (0.24 mm h -1 ), siendo el IA bajo comparado con los demás tratamientos (cuadro 5). Con los AE a la concentración de 300 µg ml -1, R. stolonifer no presentó crecimiento, su tasa de crecimiento fue de cero y su IA fue del 100%. Seguido de estos tratamientos destacó el quitosano a 10 mg ml -1 (Q10) con un 77% de IA, mientras que el quitosano a 2 mg ml -1 (Q2) y los AE de clavo (Cl) y tomillo (To) a 100 µg ml -1 presentaron los IA más bajos, aún con diferencias respecto al control. Se destaca el AE de tomillo de los otros dos AE, ya que tuvieron más del 30% de IA a 100 µg ml -1, mientras que los AE de clavo y canela a la misma concentración presentaron un menor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial. 54

70 Cuadro 5. Crecimiento micelial, tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer con los tratamientos individuales; quitosano (2 y 10 mg ml -1 ) y aceites esenciales (100 µg ml -1 ). Tratamiento Crecimiento micelial Tasa de crecimiento F Índice antifúngico (mm) (mm/h) (%) Control 78 a Canela (Ca) 74.60±2.61 a Clavo (Cl) 69.75±0.97 b Tomillo (To) 52.08±3.83 c Quitosano ± 2.07d Quitosano ±0.90 e Letras diferentes en la misma columna representan diferencias estadísticas. F= gl= 5, 30 P< n=6 Suhr y Nielsen (2003), observaron que los aceites de clavo, canela y tomillo afectaron el crecimiento de A. flavus, Endomyces fibuliger Lidner, Penicillum roqueforti Thom, P. corylophilum Diercks y Eurotium spp. de manera significativa a la mayor concentración empleada en su estudio (250 µl L -1 ), empleando un sistema de volatilización a diferentes tiempos de incubación del hongo. Además se observó que el AE de tomillo a 250 µl L -1 presentó un 70 a un 100 % de IA, dependiendo del hongo fitopatógeno. Mientras que en este estudio se utilizó el AE de tomillo a 300 µg ml -1, obteniendo un IA de 100%. De la misma manera se observó que los AE de clavo, canela y tomillo presentaron una inhibición significativa en hongos como Aspergillus spp., Erotium spp., Penicillum spp. A. alternata y 55

71 Botryodiploidia entre otros; destacando especialmente el efecto del AE de tomillo sobre el desarrollo de los hongos (Guynot et al., 2003; Kumar et al., 2008) incubados en cajas con agar flúor por 48 días a 25 C, con mejor efecto a concentraciones altas pero menores que los demás AE utilizados. En la figura 7B, se aprecia un efecto aditivo del crecimiento micelial de R. stolonifer entre las combinaciones de quitosano con los AE, incluso se puede hablar de un efecto sinérgico en el caso del quitosano y el AE de tomillo. Ya que el crecimiento micelial de R. stolonifer en quitosano a 2 mg ml -1 fue de 42.6 mm a las 48 h con un IA de 45.4 %, mientras que en la combinación de quitosano a esta concentración con el AE de tomillo a 100 µg ml -1 se presentó menos de 30 mm de crecimiento micelial, una valor parecido al obtenido con las demás combinaciones con canela y clavo, mientras que con los tratamientos individuales de los AE se obtuvo un crecimiento micelial parecido al control de PDA (cuadro 5). De los tratamientos combinados el máximo crecimiento micelial, se observó con quitosano a 2 mg ml -1 en combinación con el AE de tomillo a 100 µg ml -1, en donde el crecimiento fue de 23.7 mm de diámetro (Cuadro 6). Y aunque no existen reportes de las combinaciones de quitosano con AE, estos resultados se esperaban, debido que a los resultados de los tratamientos individuales, indican que existe un efecto antifúngico. Así como en la mayoría de los estudios previos con quitosano y AE, que proponen que las combinaciones de éstos con diferentes métodos o productos podrían resultar un mejor método para controlar enfermedades por fitopatógenos, ya que la mayoría de los estudios utilizan estos productos por separado obteniendo resultados favorables, sin embargo se 56

72 cree en la posibilidad de que haya un mejor efecto al combinar los diferentes productos evaluados, como extractos vegetales, aceites esenciales, métodos físicos e incluso control biológico (Spadaro y Gullino, 2004; Tripathi y Dubey, 2004; Palou, 1991). Cuadro 6. Crecimiento micelial, tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer con los tratamientos combinados (quitosano 2 y 10 mg ml -1 más los AE a 100 µg ml -1 ) que aun presentaron crecimiento micelial del hongo. Tratamiento Crecimiento micelial Tasa de crecimiento F Índice antifúngico (mm) (mm/h) (%) PDA 78 a Q ± 2.07 b Q2To ± 2.12 cd Q2Ca ± 2.56 c Q2Cl ± 1.86 de Q ± 0.95 e Q10C ± 2.48 f Q10Ca ± 3.16 g Las letras diferentes en la misma columna representan diferencias estadísticas significativas F= , gl= 8,45 P< n=6 Con las combinaciones de quitosano a 10 mg ml -1 y los AE a 100 µg ml -1 se observó crecimiento micelial pero en menor proporción que con las combinaciones anteriores a 2 57

73 mg ml -1. En los tratamientos en los que no hubo crecimiento micelial fue en la mezcla con el AE de tomillo a 100 µg ml -1 y en el tratamiento con dicloran. Por consecuencia la tasa de crecimiento de R. stolonifer en los tratamientos combinados con los AE a 100 µg ml -1 es mucho menor que en los tratamientos individuales, ya que el valor más alto de la tasa de crecimiento obtenido fue con la combinación de quitosano a 2 mg ml -1 con el aceite de tomillo y canela (0.07 mm h -1 ) y el valor más bajo fue con la combinación de quitosano a 10 mg ml.1 con tomillo a 100 en donde no hubo crecimiento. De manera que si comparamos estos resultados con los obtenidos por quitosano a 10 mg ml -1 observamos que al combinarse ambos productos aumenta el potencial antifúngico con respecto al control y a los tratamientos individuales y que esto depende del AE y las concentraciones utilizadas. Estas combinaciones son la referencia de que al combinar al quitosano con los AE puede haber un efecto aditivo o sinérgico. Para corroborar que a mayores concentraciones el comportamiento fue similar se probaron las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg ml -1 con los AE a 300 µg ml -1, las cuales presentaron el 100 % de IA (Figura 8) al igual que dicloran. En estas combinaciones no se pudo evaluar el efecto aditivo, debido a que los AE individuales a concentraciones de 300 µg ml -1 presentaron el 100 % de IA. 58

74 Figura 8. Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de incubación con los tratamientos combinados de quitosano a 2 y 10 mg ml -1 (Q2 yq10) y los aceites esenciales de clavo (Cl3), canela (Ca3) y tomillo (To3) a 300 µg ml Esporulación En la mayoría de los tratamientos se presentó una disminución en la producción de esporas, en los tratamientos en los que no hubo crecimiento micelial no se logró evaluar la esporulación, estos incluyó a los tres tratamientos con AE a 300 µg ml -1, las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg ml -1 con los tres diferentes AE 300 µg ml -1 y la mezcla de quitosano 10 mg ml -1 con el AE de tomillo a 100 µg ml -1. De los tratamientos individuales, los AE de clavo y canela a 100 µg ml -1 (2.4 X10 6 esporas ml -1 ) no presentaron diferencias con respecto al control (R3) con 3.0 X10 6 esporas ml -1 (figura 9). 59

75 Se sabe que el AE de clavo afecta la producción y germinación de esporas de diferentes hongos, esto se examinó en medio líquido utilizando diferentes concentraciones y diferentes intervalos de tiempo, destacando la concentración al 10% de AE de clavo después de 24 h de incubación, además de causar lisis y deformación de los orgánulos (observado mediante microscopia) especialmente la mitocondria en hongos como A. alternata, F. chlamydosporum, Helminthosporium oryzae Breda de Haan y Rhizoctonia bataticola (Taubenh) Butler (Zafar y Ahmad, 2002). Figura 9. Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos individuales. Control, Quitosano 2 (Q2) y 10 mg ml -1 (Q10), los aceites esenciales de canela (Ca), Clavo (Cl) y tomillo (To) a 100 µg ml -1 y dicloran (D). Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas. gl =7,40 F= P=< El AE de tomillo a 100 µg ml -1 redujo notablemente la producción de esporas (3.3X10 4 esporas ml -1 ) con un resultado similar al que se obtuvo con quitosano a 10 mg ml -1 60

76 (3.8X10 4 esporas ml -1 ) y con diferencias significativas con respecto al control. El quitosano a 2 mg ml -1 también redujo la cantidad de esporas (2.9X10 5 esporas ml -1 ) y aunque en menor cantidad también fue diferente al control (3X10 6 esporas ml -1 ), estos tratamientos no fueron diferentes entre sí además de que fueron muy parecidos al dicloran. Los resultados obtenidos en este trabajo con respecto al quitosano son similares a los presentados por Hernández-Lauzardo et al., (2008), y coinciden en el efecto sobre la esporulación y germinación de las esporas de R. stolonifer con quitosano de bajo peso molecular a 2 mg ml -1 así como la inhibición del crecimiento micelial. En otros estudios el quitosano de bajo peso molecular a concentraciones menores del 1 % afectan el crecimiento micelial y la esporulación B. cinerea y P. expansum Link. disminuyendo la cantidad de conidios considerablemente (Liu et al., 2007). También existen reportes con C. gloeosporioides en donde se observó que el quitosano concentración presentó un efecto significativo sobre la disminución del número de conidios (Bautista-Baños et al., 2005). En las combinaciones de quitosano a 10 mg ml -1 y los AE a 100 µg ml -1, no se observó esporulación del hongo, aunque hubo crecimiento micelial. Estos resultados indican que el efecto sobre el hongo está dado por las dosis empleadas, por los tipos de compuestos que se utilizan y por el microorganismo que se quiere controlar. En todas las combinaciones de quitosano a 2 mg ml -1 y los AE a 100 µg ml -1 se observó esporulación. Todos los tratamientos fueron estadísticamente diferentes (P 0.001) al control (figura 10). De estos tratamientos, las combinaciones con el AE de canela y tomillo 61

77 respectivamente, no presentaron diferencias entre sí con una producción de esporas en el orden de 10 3 esporas ml -1, mientras que el control presentó 3 X10 6 esporas ml -1. Figura 10. Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos combinados de quitosano (2 y 10 mg ml -1 ) y los aceites esenciales a 100 µg ml -1. Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas. gl =8,4 F= P=< Comparación de medias con prueba de Tuckey. Media de seis repeticiones. Se considera que al combinar a los tratamientos se presentó un efecto aditivo, potencializando el efecto fungicida sobre el desarrollo de las esporas de R. stolonifer y se deduce que al haber menor número de esporas, la incidencia del hongo puede ser menor y por lo tanto con menos posibilidades de sobrevivir Germinación Todos los tratamientos tantos individuales como combinados afectaron la germinación de las esporas de R. stolonifer. En los tratamientos con quitosano las esporas presentaron un 62

78 engrosamiento, sobre todo a la concentración de 10 mg ml -1, estas observaciones son parecidas a los resultados obtenidos por Hernández-Lauzardo et al. (2008) que reportaron que las esporas de R. stolonifer se deformaron al ser tratadas con quitosano de bajo peso molecular (visto en microscopio electrónico de transmisión). Se sabe que la deformación de las esporas no solo depende de la concentración de quitosano empleada sino también del tipo de hongo, como lo reportaron Hernández-Lauzardo et al. (2007) en donde el quitosano no deformó las esporas de Mucor spp. pero si las de R. stolonifer a la misma concentración utilizada (2 y 1.5 mg ml -1 ), lo cual lo observaron en microscopio óptico a 40X. Otros autores indicaron que el quitosano deforma las esporas a concentraciones mayores y que los cambios morfológicos son proporcionales a la concentración empleada de quitosano (El Ghaouth et al., 1992a; Bautista-Baños y Bravo-Luna, 2004). Aunque nuestros resultados concuerdan con los antes señalados, se observó que en los tratamientos con quitosano a 2 y 10 mg ml -1 combinados con los AE a 300 µg ml -1 no se presentaron esporas germinadas; a diferencia de las combinaciones de quitosano con los AE a la concentración de 100 µg ml -1 en donde se observó engrosamiento de las esporas de R. stolonifer (figura 11). De manera que los AE a concentraciones altas (300 µg ml -1 ), evitan la germinación y deformación de las esporas. 63

79 Figura 11. Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos individuales a las 9 h de incubación. Quitosano 2 y 10 mg ml -1 (Q2 y Q10) To= tomillo, Ca= canela, Cl= clavo y Q= quitosano a 100 y 300 µg ml -1. Microscopio óptico en aumento de 40X Todos los tratamientos presentaron un patrón diferente en la germinación de las esporas de R. stolonifer, en la figura 11 se muestra el comportamiento de la germinación para los tratamientos individuales a las 9 h de incubación. Con el tratamiento de quitosano a 2 mg ml -1, solo algunas esporas germinaron presentando un tubo germinal muy pequeño, de manera que el número de esporas germinadas fue estadísticamente diferente (P 0.001) con respecto al control. Además la 64

80 mayoría de las esporas germinadas y no germinadas se deformaron. Esto sugiere que se atraso la germinación al mismo tiempo que se inhibió. El número de esporas germinadas con quitosano a 2 mg ml -1 es muy parecido al número de esporas germinadas con los AE a 100 µg ml -1 (cuadro 7), sin embargo, el tamaño del tubo germinal observado fue mayor con los AE, incluso igual al tamaño del tubo germinal presentado en el control. Por lo que los AE no retrasaron la germinación, pero si provocaron una disminución en el número de esporas germinadas. Los porcentajes de germinación en ambos tratamientos son diferentes con respecto al control ya que en este último fue de 87.5%. Es importante mencionar que de los AE empleados individualmente destacó el AE de tomillo ya que a 100 µg ml -1 presentó un 22% de esporas germinadas y fue diferente estadísticamente (P 0.001) de los AE de clavo y canela. Con los AE a 300 µg ml -1 se inhibió completamente la germinación de las esporas, mientras que con quitosano a 10 mg ml -1 la germinación fue casi nula. Estadísticamente no fue diferente a la germinación observada en los tratamientos con los AE, pero si con respecto al control. De manera que los tratamientos a las concentraciones mayores son los que resultaron ser los mejores para inhibir la germinación de las esporas de R. stolonifer. 65

81 Cuadro 7. Porcentaje de germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos individuales y las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg ml -1 con los AE a 100 µg ml -1 Tratamiento Germinación Tratamiento Germinación Individual (%) Combinado (%) Control 87.5 a Control 87.5 a Q c Q b Q d Q d Ca b Q2Ca b Ca d Q2Cl b Cl b Q2To c Cl d Q10Ca d To c Q10Cl d To d Q10To d Dicloran 0.0 d gl =9,50 F= P = <0.001 gl =9,50 F= P = <0.001 Letras diferentes representan diferencias estadísticas significativas. n= 6 Los resultados obtenidos con respecto al porcentaje de germinación son parecidos con los reportados por Plotto et al. (2003), que observaron que a 500 µg ml -1 el AE de tomillo inhibió al 100% la germinación y esporulación de B. cinerea y Alternaria, mientras que a R. stolonifer solo lo inhibió en un 80%. En este trabajo la dosis máxima empleada fue de 300 µg ml -1 y se inhibió al 100% la germinación, el crecimiento micelial y la esporulación de R. stolonifer. Barrera-Necha et al. (2008), reportaron que los aceites esenciales de clavo y canela disminuyeron considerablemente la germinación de los conidios de C. gloeosporioides 66

82 destacando sobre los demás aceites evaluados a concentraciones de 250 µg ml -1, también reportaron que el AE de tomillo no presentó efecto sobre la germinación de C. gloeosporioides, mientras que en este estudio el AE de tomillo destacó sobre los AE de clavo y canela, al provocar el menor porcentaje de germinación, esporulación y crecimiento micelial de R. stolonifer. De acuerdo con los resultados obtenidos en los tratamientos combinados, se observó que el quitosano con los aceites esenciales a 100 µg ml -1, redujeron considerablemente el porcentaje de germinación sobre todo con quitosano a 10 mg ml -1 ya que no hubo esporas germinadas, todas presentaron deformaciones y un tubo germinal pequeño (figura 12). Mientras que con quitosano a 2 mg ml -1 más los AE a 100 µg ml -1 la germinación de las esporas fluctuó entre 6 y 22.5 % de germinación (cuadro 7). Es importante destacar que estos resultados presentaron el mismo patrón que los resultados obtenidos con los tratamientos individuales, es decir que las combinaciones a las concentraciones mayores, mostraron un efecto mayor sobre la germinación de las esporas, que con las combinaciones a concentraciones menores. Cabe señalar, que todos los tratamientos son diferentes estadísticamente al control. En este caso también destacaron las combinaciones con el AE de tomillo. 67

83 Figura 12. Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos combinados a las 9 h de incubación. Quitosano a 2 y 10 mg ml -1 con los AE a 100 µg ml -1 (Canela Ca, Clavo Cl y Tomillo To). Microscopio óptico 40X Los resultados obtenidos con los tratamientos combinados presentaron un bajo efecto aditivo ya que el porcentaje de germinación es parecido al de los tratamientos individuales, principalmente con los AE de canela y clavo así como con las combinaciones con estos aceites. El único tratamiento combinado en donde se observó un efecto sinérgico fue con la mezcla de quitosano a 2 mg ml -1 y el AE de tomillo a 100 µg ml -1 con un porcentaje de germinación de 6.8%, mientras que el AE de tomillo a 100 µg ml -1 68

84 empleado de manera individual presentó un 22.5% de germinación y el quitosano a 2 mg ml -1 presentó un 22 %. En las combinaciones con quitosano a 10 mg ml -1 y los AE a 100 µg ml -1 no hubo germinación de las esporas, pero la deformación fue bastante visible con respecto al control (figura 12). Figura 13. Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos combinados a las 9 h de incubación. Quitosano a 2 y 10 mg ml -1 con los AE a 300 µg ml -1 (Canela Ca, Clavo Cl y Tomillo To). Microscopio óptico 40X. 69

85 Mientras que con los tratamientos combinados de quitosano a 2 y 10 mg ml -1 con los AE a 300 µg ml -1 tampoco se presentó germinación de las esporas, además de que en ninguna de estas combinaciones se detectó engrosamiento de las esporas, comparado con las combinaciones con los AE a 100 µgml -1 (figura 13). Los resultados antes expuestos indican que efectivamente tanto el quitosano como los AE de clavo, canela y tomillo, presentan un efecto antifúngico contra R. stolonifer, afectando de manera importante el desarrollo del hongo en las diferentes fases de crecimiento, así como se ha observado con otros hongos. Existe un reporte de Rabea et al. (2005), en donde demuestran que el quitosano genera efectos inhibitorios sobre B. cinerea y Pyricularia grisea (Cooke) Sacc., sin embargo señalan que a una concentración del 0.1% reduce el crecimiento de muchos hongos a excepción de los de la clase zygomicetes, debido a que en su pared celular contienen quitina y quitosano. En este trabajo se demostró que el quitosano a concentraciones de 2 y 10 mg ml -1, presentó efecto antifúngico sobre R. stolonifer a pesar de pertenecer esta clase. También comprobamos que conforme aumentó la concentración del quitosano, el efecto que se presentó sobre el hongo fue mayor, como se observó con quitosano a 10 mg ml -1, con una tasa de crecimiento, esporulación y germinación de esporas menor que con quitosano a 2 mg ml - 1. Otro dato relevante con respecto a la concentración de quitosano, es que se ha distinguido que el crecimiento de diferentes hongos como F. oxysporum, P. digitatum, C. gloeosporioides incluso R. stolonifer, pueden ser inhibidos completamente por quitosano 70

86 a la concentración del 3 % (Bautista-Baños et al., 2003; Bautista-Baños et al., 2006), mientras que en otro estudio a 0.5 % no presentó un efecto antifúngico contra F. oxysporum f. sp. vasinfectum Fov y A. solani Sorauer (Guo et al., 2006, 2008). La actividad antifungica del quitosano está estrechamente relacionada con la naturaleza policatiónica del quitosano ya que está característica le confiere mayor interacción con la membrana del hongo que está cargada negativamente, la longitud de la cadena de este polímero que aumenta la superficie catiónica en contacto con el hongo y el efecto inhibitorio en la síntesis de enzimas macerantes producidas por hongos, como la poligalacturonasa, liasa y celulasa; también por la producción de compuestos fenólicos como el ácido clorogénico, ac. caféico y la formación de barreras estructurales que impiden la penetración de los hongos en el hospedero (Bautista-Baños et al., 2005). En estudios realizados por Palma-Guerrero et al., (2009) con Neurospora crassa Shear & B. O. Dodge, se observó que el quitosano es capaz de permeabilizar la membrana plasmática de forma importante en conidios de este hongo lo que aumenta la salida de calcio, además provocan que los conidios se encojan y presenten vacuolas. Además se observó que dependiendo del tipo de célula (hifa, tubo germinal, conidio etc.), será la sensibilidad al quitosano, como en el caso de la hifa en donde la salida de calcio ocurre más lento y en menor grado que en los conidios, después de ser tratadas con quitosano, alterando significativamente la homeóstasis y produciendo la lisis de las células fúngicas. 71

87 Estos datos son relevantes, ya que pueden explicar los efectos observados sobre la germinación y el crecimiento micelial de R. stolonifer con los tratamientos de quitosano que fueron empleados en este trabajo, ya que se observó que se redujo el crecimiento micelial, y en diferente medida se disminuyó el número de esporas así como el patrón de germinación. Con respecto a los AE aplicados individualmente, observamos que los mejores resultados se presentaron con los AE a 300 µg ml -1 con un efecto antifúngico importante contra R. stolonifer, primordialmente sobre el crecimiento micelial y la esporulación de las esporas, mientras que a concentraciones más bajas el aceite que mejor efecto antifúngico presentó contra R. stolonifer fue el AE de tomillo. La mayoría de los autores que trabajan con AE destacan a los aceites de clavo, canela y tomillo (Velluti, 2003; Tzortzakis, 2007), sobre todo a este último, sin embargo también existen algunos reportes en los que el AE de tomillo no presenta ningún efecto sobre algunos hongos (Barrera-Necha et al., 2008). Aunque existen muy pocos reportes del uso de los AE de clavo, canela y tomillo contra R. stolonifer, los que existen concuerdan que los tres AE presentan efectos antifúngicos importantes. Una de las ventajas que presenta el uso de los AE, es que a bajas concentraciones presentan inhibición en el desarrollo de diferentes hongos, como lo reportan Ranasinghe et al. (2002), que los AE de clavo y canela evaluados in vitro fueron efectivos a bajas concentraciones 0.03 % % contra los fitopatógenos L. theobromae, 72

88 C. musae, F. proliferatum que afectan al plátano. No obstante la relativa actividad de los aceites esenciales pueden no correlacionar con un solo componente pero si con la mezcla de componentes presentes en estos aceites. Es importante señalar que el efecto que se ha observado sobre los hongos fitopatógenos inclusive con R. stolonifer depende de muchos factores, que incluyen la naturaleza de los componentes de los AE en este caso para los aceites de clavo, canela y tomillo abundan compuestos fenólicos, como es el timol y carvacrol (tomillo), eugenol (clavo y canela), entre otros compuestos que se sabe presentan una actividad antifúngica importante (Guynot et al., 2003; Jayaprakasha et al., 2006). A pesar de que no existen reportes de las combinaciones de quitosano con los AE, los resultados obtenidos fueron los esperados, en base a lo que se observó con los tratamientos individuales. Aunque el efecto antifúngico de la mayoría de los tratamientos fue aditivo, es decir la sumatoria de los efectos presentados de manera individual. Este efecto se visualizó mejor con las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg ml -1 más los AE a 100 µg ml -1. Mientras que las combinaciones de quitosano con los AE a 300 µg ml -1 presentaron el mejor efecto antifúngico. Por lo tanto los tratamientos individuales o combinados con el mejor efecto antifúngico se utilizaron para la evaluación in situ (ver inciso 5.3.2). Con la hipótesis de que; al haber presentado un efecto antifúngico estadísticamente diferente al control en la fase in vitro, estos tratamientos podrían inhibir la pudrición blanda en jitomate (in situ). 73

89 6.5. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ Escala de daño De acuerdo con los resultados, se observó que en las primeras horas de incubación, el hongo creció lentamente y que el primer síntoma de infección (ablandamiento del tejido alrededor de la lesión) ocurrió después de las 26 h de la inoculación. Después de las 48 h el hongo presentó un crecimiento acelerado, afectando más de la tercera parte del fruto infectado. Entre las 72 a 96 h de incubación se observó la fase estacionaria del crecimiento del hongo. Con estos datos se estableció la escala de daño tomando en cuenta que los porcentajes presentados en cada nivel se representan como daño visual y que el fruto completo representa el 100% de daño observado. En la figura 14, se muestra el seguimiento de la enfermedad y el porcentaje de daño considerado para cada tamaño de lesión durante el periodo de incubación. Esta escala fue utilizada para determinar el índice de severidad presentado en cada tratamiento de este trabajo. El establecimiento de la escala de daño fue parte importante para determinar de manera precisa el daño presentado en los frutos de jitomate. Sobre todo porque fue una escala específica para este modelo de estudio, lo que permitió que los errores que pudieran haberse presentado se minimizaran. 74

90 Figura 14. Escala de daño propuesta para determinar el índice de severidad. Consta de 6 niveles de acuerdo al progreso de la enfermedad durante 72 h de incubación Evaluaciones en jitomate En la mayoría de los estudios realizados con frutos de jitomate, se han empleado jitomates de ¾ de sazón como es el caso de Hernández-Lauzardo et al., 2007, en donde no se presentó ningún inconveniente al realizar el experimento. En otros estudios, reportan que los jitomates de ¾ de sazón se infectan más rápidamente con R. stolonifer y en mayor porcentaje que los frutos maduros, al evaluar extractos acuosos de guamúchil (Bautista-Baños et al., 2002), estos son datos que no concuerdan con los presentados en este trabajo, aunque no se sabe con certeza a que se debió este efecto, pero se entiende 75

91 que los frutos maduros se encuentran en condiciones óptimas para que se desarrolle el hongo, debido a que presenta menos barreras físicas, así como mayor cantidad de azúcares disponibles para el hongo. Además de que en el mercado la pudrición blanda predomina en frutos maduros. Figura 15. Frutos de jitomate en dos estados de madurez infectados por R. stolonifer a las 96 h de incubación. 15A) Frutos maduros con 90% de infección. 15B) Frutos ¾ de sazón con 20% de infección. Al inicio del experimento se usaron frutos de jitomate en dos estados de madurez; ¾ de sazón y maduros. Pero solo los jitomates en estado maduro respondieron a la infección mientras que los frutos de ¾ de sazón no permitieron la reproducibilidad de la enfermedad ocasionando resultados poco confiables (Figura 15). Se observó que la mayoría de los frutos con ¾ de sazón no presentaron la enfermedad, a pesar de haber transcurrido las 96 horas de incubación, mientras que con los frutos maduros el 80% de ellos se infectaron y resultaron considerablemente dañados. 76

92 Porcentaje de infección e Índice de severidad De acuerdo con la figura 16 A que representa al control positivo, se observó que en las primeras 24 h el fruto no presentó daño, sino 26 h después de la inoculación, pero a partir de las 48 h de incubación cuando la enfermedad progresó rápidamente, y a las 72 h el daño fue más aparente observándose una lesión más severa en el fruto, de manera que al final del experimento (96 h) la lesión abarcó la mayoría del fruto dejándolo casi totalmente macerado, además de que el hongo ya se encontraba en la fase de esporulación. Mientras que en la figura 16 B se muestra el testigo negativo en donde no se observó daño alguno, y el fruto presentaba una apariencia saludable. Los frutos del control positivo inoculados artificialmente, presentaron un 80% de infección con un índice de severidad igual a 3.8. Este valor correspondió al máximo daño producido por R. stolonifer 96 h después de haber sido inoculado. El desarrollo de la enfermedad en todos los tratamientos tuvo la misma tendencia, al principio lento y al final el desarrollo fue más rápido. A pesar de eso en algunos tratamientos el número de frutos infectados fue bajo. Como es el caso del quitosano a 10 mg ml -1 en donde se presentó el menor porcentaje de infección (23 %). Mientras que el mayor porcentaje de infección se presentó con canela a 300 µg ml -1 con un 56.7 % de infección. Lo que indica que casi todos los tratamientos estuvieron por debajo del 50 % de infección. 77

93 A 5 5 B Figura 16. Desarrollo de la pudrición blanda durante la incubación. A) Control positivo, B) Control negativo. 1=0 h, 2=24 h. 3=48 h, 4=72 h y 5= 96 h, después de la inoculación. Esto da lugar a decir que la mayoría de los tratamientos redujeron considerablemente la pudrición blanda causada por R. stolonifer, sin embargo, el único tratamiento que presentó diferencias estadísticas con respecto al control positivo fue quitosano a 10 mg ml -1. Quitosano a 10 mg ml -1 redujo la pudrición, presentando el mejor efecto antifúngico con respecto al control positivo y a los demás tratamientos, incluyendo las combinaciones de quitosano con los AE (cuadro 5). También se observó que en casi todos los tratamientos el índice de severidad fue muy bajo comparado con el testigo sin tratamiento ya que todos los tratamientos presentaron un índice de severidad entre 0.67 a

94 Cuadro 8. Porcentaje de infección e índice de severidad en jitomates inoculados con R. stolonifer después de la aplicación de quitosano combinado con los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300 µg ml -1 y dicloran. Tratamientos Porcentaje de infección Índice de severidad Control + 80±5.77 c 3.47±0.35c Control - 0±0 a 0±0a Dicloran 46.66±8.82 ab 1.33±0.29 ab Q ±8.82 ab 0.67±0.23 ab Ca ±12.02 abc 1.11±0.26 ab Cl ±3.33 bc 1.80±0.33 bc To ±16.70 bc 1.80±0.33 bc Q10 Ca ±3.33 abc 1.33±0.29 ab Q10 Cl ±3.33 abc 1.03±0.28 ab Q10 To ±8.82 bc 1.37±0.28 ab gl= 20,9 P>0.050 H=66.82 P>0.001 Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas Además con lo que respecta al índice de severidad, la mayoría presentaron diferencias estadísticas con respecto al control, el quitosano destaca ya que fue el tratamiento con menor índice de severidad 0.67% (Cuadro 8). Mientras que los AE de clavo y canela no presentaron diferencias estadísticas con respecto al control. En las figuras 17 y 18 se ilustra el daño causado por R. stolonifer en los frutos de jitomate con cada tratamiento, al final del experimento. Como ya se había mencionado en la fase in vitro, se esperaba un efecto aditivo o sinérgico al mezclar el quitosano y los AE, lo cual no 79

95 sucedió, ya que el único tratamiento que presentó un efecto importante fue quitosano a 10 mg ml -1, inclusive fue mejor que el tratamiento con dicloran, lo que indica que es más conveniente el uso del quitosano de forma individual. Los AE no presentaron el efecto esperado, esto pudo deberse a su naturaleza debido a que poseen una gama amplia de compuestos volátiles (Guynot et al., 2003), lo que probablemente con el paso del tiempo permitió que disminuyeran sobre la superficie del fruto, sobre todo para clavo y tomillo ya que el aceite de canela presentó mejor efecto que los otros dos AE; se considera esto porque los frutos tratados permanecieron a temperatura ambiente y se colocaron en recipientes que fácilmente permitieron la entrada y salida de aire. Lo que pudo aumentar la volatilización de los compuestos con efecto antifúngico de los aceites. Esta pudo ser una de las razones por las cuales no se vio el efecto esperado. 80

96 A B C D E Figura 17. Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de R. stolonifer con los aceites esenciales a 300µg ml -1 y los controles. A) Control positivo, B) Control negativo, C) Clavo, D) Canela y E) Tomillo. 81

97 A F F G A H J I J Figura 18. Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de R. stolonifer con las diferentes combinaciones de quitosano (Q10) con los aceites esenciales (Ca, Cl, y To) a 300 µg ml -1 y dicloran (D). A) Control positivo, F) Q10Cl3, G) Q10Ca3, H) Q10To3, I) Q10 y J) D. 82