"EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PARA VERIFICAR SU REPRODUCTIBILIDAD Y SELECTIVIDAD"

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1 ESTUDIAR PARA PREVER Y PREVER PARA ACTUAR CERTIFICADO BAJO LA NORMA ISO 9001:2008 IMNC-RSGC-617 R SEP Institutos Tecnológicos Dirección General de Educación Superior Tecnológica Instituto Tecnológico de Colima "EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PARA VERIFICAR SU REPRODUCTIBILIDAD Y SELECTIVIDAD" OPCIÓN X MEMORIA DE RESIDENCIA PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOQUÍMICO PRESENTA JANETTE ESMERALDA CAMPOS RADILLO ASESOR DR. ARGELIA JUÁREZ ALCARAZ Villa de Álvarez, Col., Noviembre de 2013 P R E M I O a la INTRAGOB 2006 S G C S N E S T IMNC-RSGC RSGC INICIO: TERMINO: ISO 9001:2008 PROCESO EDUCATIVO

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4 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA MISIÓN VISIÓN POLÍTICA DE LA CALIDAD SERVICIOS PROBLEMÁTICA A RESOLVER ALCANCES Y LIMITACIONES FUNDAMENTO TEÓRICO PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS CONSERVACIÓN DE CEPAS A MEDIANO PLAZO EN ACEITE MINERAL CRITERIOS DE CALIDAD EN LA EVALUACIÓN FÍSICA Y BIOLÓGICA DE MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS SELECTIVOS PRUEBA ECOMÉTRICA EN AGARES SELECTIVOS, DIFERENCIALES E INDICADORES PRUEBA DE TOXICIDAD DEL DILUYENTE PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN BACTERIANA EN AGARES PARA CUENTA EN PLACA RESULTADOS CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES ANEXO ANEXO GLOSARIO REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS I

5 1. INTRODUCCIÓN Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas que fueron ideadas para favorecer el crecimiento, la reproducción o identificación de microorganismos. Los requisitos nutricionales de las bacterias reflejan su capacidad biosintética, y la célula puede obtener sus nutrientes para desarrollarse tomándolos directamente del medio o sintetizándolos a partir de otros materiales. Las necesidades nutricionales de los microorganismos pueden ser: elementales, energéticas o específicas. Las elementales consisten en aquellas sustancias que necesitan para su composición celular, como los ácidos nucleicos, glúcidos y lípidos; estas necesidades son comunes para todas las bacterias, pero existen diferencias en la forma de utilizar tales sustancias para simulación, dependiendo de la capacidad de degradación y de síntesis de cada especie. Los elementos necesarios son carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; en menor cantidad potasio, magnesio y fierro, además de otros oligoelementos como manganeso, zinc, cobre, cobalto y molibdeno. Las fuentes de carbono pueden ser el CO 2 atmosférico, compuestos simples como el citrato o sustancias más complejas como azúcares y aminoácidos. El nitrógeno pueden obtenerlo algunas bacterias del aire, pero la mayoría lo requieren en forma de nitratos, sales de amonio o compuestos orgánicos de nitrógeno. El azufre lo obtienen de compuestos orgánicos como la cisteína o inorgánicos como sulfuros o tiosulfatos. Las necesidades energéticas de las bacterias las satisfacen las reacciones de óxido-reducción, como la oxidación o fermentación de azúcares o ácidos orgánicos. Las sustancias específicas son compuestos como aminoácidos, vitaminas, bases púricas, carbohidratos, etc. que deben ser proporcionados, debido a que no se encuentran en operación sus vías sintéticas. Además de los nutrientes, los 1

6 medios de cultivo deben reunir condiciones físico-químicas específicas de actividad de agua, ph y potencial de óxido reducción. El contenido de agua es un factor muy importante para el desarrollo bacteriano, ya que esta sustancia interviene en muchas de las reacciones químicas dentro de la célula y es indispensable para disolver los compuestos que atraviesan la pared celular. Es muy importante el ajuste del ph del medio para un buen desarrollo bacteriano. La mayoría de las bacterias crece a un ph cercano a la neutralidad; sin embargo, hay microorganismos que requieren ph ácido o alcalino. Durante la esterilización, el oxígeno disuelto se libera, bajando el potencial de óxido-reducción; al enfriarse el medio, el oxígeno se re-disuelve. Por esta causa, se calientan los medios para sembrar bacterias anaerobias. Posteriormente se deberá aislar el medio del oxígeno atmosférico mediante capas de vaselina, aceite o agar, o inactivarlo agregando sustancias productoras como tioglicolato o cisteína [1]. 2

7 2. JUSTIFICACIÓN El presente proyecto se elaboró con la finalidad de mejorar el control en los distintos factores que pudiesen repercutir o afectar de manera directa o indirectamente a los medios de cultivo que son utilizados para llevar a cabo las determinaciones y análisis realizados en el Laboratorio Estatal, además de garantizar una mejor calidad y veracidad de los resultados obtenidos, por medio del control de calidad de los medios de cultivo. 3. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar cada uno de los procedimientos específicos establecidos en el área de control de calidad de medios, para verificar la reproducibilidad y selectividad de los medios de cultivos utilizados en el Laboratorio Estatal de Salud Pública 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Confirmar que los medios de cultivo adquiridos en forma deshidratada comercialmente y utilizados en el área de preparación de medios cumplan con la función requerida de Productividad y Selectividad. Establecer los lineamientos para garantizar que las cepas microbianas obtenidas de las áreas microbiológicas del Laboratorio Estatal cumplan con las características de viabilidad, pureza y estabilidad. 3

8 4. CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA Este proyecto se llevó a cabo en el Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Colima (LESP), dentro del departamento de Control Ambiental, en el Área de Control de Calidad de Medios de Cultivo. El Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Colima (LESP), es una organización dependiente de la Secretaría de Salud, que enfoca su servicio principalmente a la vigilancia Epidemiológica y Salud ambiental, adoptando para esto, una cultura de calidad como forma de trabajo en beneficio de la población colimense. La Secretaría de Salud es la dependencia del ejecutivo federal que tiene fundamentalmente como objetivo proteger la salud de la población. En el departamento de Control Ambiental su objetivo es brindar apoyo a las actividades de vigilancia sanitaria con métodos de laboratorio. 4.1 MISIÓN Somos el Laboratorio de Referencia del Estado de Colima que realiza análisis especializados, oportunos y confiables a los usuarios del Sector Salud y a la población del Estado de Colima, en las áreas de epidemiología y de protección contra riesgos sanitarios. 4.2 VISIÓN Ser un Laboratorio Acreditado del Sistema Nacional de Salud, que aplique tecnología de vanguardia y un marco analítico que dé satisfacción a las necesidades de la población, contribuyendo a mejorar la salud de nuestra comunidad. 4

9 4.3 POLÍTICA DE LA CALIDAD Quienes trabajamos en el Laboratorio de Salud Pública de Colima estamos comprometidos en lograr la satisfacción de nuestros usuarios aplicando las buenas prácticas de laboratorio, nos capacitamos para garantizar nuestra competencia técnica y aplicamos la mejora continua de nuestros Sistemas de Gestión de Calidad. 4.4 SERVICIOS Analizar las muestras recibidas del programa de control sanitario enviadas por la dirección de regulación sanitaria y las jurisdicciones sanitarias I, II, y III. Asesorar al personal de regulación sanitaria y de las jurisdicciones cuando lo soliciten. Colaborar con el departamento de vigilancia epidemiológica en caso de brotes de enfermedades vehiculizadas por alimentos. Apoyar a las instituciones del sector salud para el análisis de aguas, alimentos y superficies vivas e inertes en centros de desarrollo infantil. Capacitar y/o asesorar al personal de la red de laboratorios para que realice el monitoreo ambiental de las salas quirúrgicas y toco quirúrgicas de los hospitales de la Secretaría de la Salud. Realizar análisis microbiológico e investigación de Vibrio cholerae en aguas negras y blancas, recolectadas por la comisión de agua potable y alcantarillado de manzanillo (CAPDAM), así como las jurisdicciones sanitarias, I, II, III y hospitales privados y del sector salud. Ofrecer análisis microbiológicos y fisicoquímicos de alimentos, sal, vísceras de res, aguas de red, de pozo, de tanque, de fuentes naturales, aguas purificadas y/o bebidas no alcohólicas, hielo en barra y/o purificado a clientes particulares que requieran el servicio. Capacitar y adiestrar a prestadores de servicio social y prácticas profesionales. 5

10 Realizar los estudios microbiológicos en apoyo al programa de vigilancia de diarreas y agua limpia. 5. PROBLEMÁTICA A RESOLVER Hoy, más que nunca, el laboratorio necesita soluciones rápidas, fiables y de gran calidad. El control de la calidad en la preparación y evaluación de los medios de cultivo es considerado como una esencial y buena práctica de laboratorio, necesaria para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica microbiológica. En el Laboratorio Estatal de Salud Pública no se cuentan implementados los procedimientos para la evolución de medios de cultivo. Este es un proceso continuo que se extiende desde las materias primas, a través del productor hasta el producto final utilizado en las áreas posteriores. Por esta razón, se le confiere una gran importancia y está considerado como uno de los puntos críticos de control en el análisis microbiológico, del cual depende la seguridad de los resultados que emiten los laboratorios de ensayo. 6. ALCANCES Y LIMITACIONES El presente trabajo tendrá como propósito evaluar los medios de cultivo sólidos, semisólidos y líquidos elaborados en el área de preparación de medios. Se aplicaran cada uno de los procedimientos establecidos por el área de control de calidad, se realizara el respectivo reporte y se establecerán los formatos correspondientes de cada técnica donde se aprobara o rechazara el medio evaluado. Se adquirirá la habilidad para el manejo del equipo requerido para la ejecución de la técnica mencionada en el Laboratorio Estatal. 6

11 7. FUNDAMENTO TEÓRICO Medios de cultivo: Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la reproducción y la identificación de los microorganismos. Contienen sustancias nutritivas ph adecuado Deben estar estériles. 2. Incubación: Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar. La atmósfera empleada.(aerobio, microaerofílico, anaerobio) Tiempo. Temperatura. Clasificación de medios de cultivo 1. De acuerdo al Manual de recomendaciones generales para la preparación de medios de cultivo (1989), los medios de cultivo pueden clasificarse siguiendo diferentes criterios convencionales; según su consistencia, pueden ser sólidos, líquidos o semisólidos. En base a su uso pueden clasificarse en: - Medios de pre-enriquecimiento. - Medios de enriquecimiento. - Medios selectivos. - Medios diferenciales. - Medios indicadores. - Medios nutritivos (simples o enriquecidos). - Medios para conservación de cepas. Medios de pre-enriquecimiento. Tienen la función de reanimar e iniciar la proliferación de microorganismos potencialmente afectados en su viabilidad, 7

12 permitiendo su recuperación a partir de productos que han sido sometidos a tratamientos como la desecación, congelación, procesos caloríficos, etc., que pueden dañar alguna o algunas de las estructuras celulares. Estos medios no tienen agentes bacteriostáticos y se utilizan en productos con baja carga microbiana. Medios de enriquecimiento. Son medios que favorecen el desarrollo de un grupo particular de microorganismos, para facilitar su aislamiento posterior. En este caso, se utilizan agentes bacteriostáticos que afectan lo menos posible al germen seleccionado, pero inhiben lo suficiente el desarrollo de los microorganismos acompañantes no deseables. Medios selectivos. Son medios que favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos inhibiendo a otros no deseados. Estos medios pueden tener varios grados de selectividad y ésta suele ser inversamente proporcional a su sensibilidad. Medios diferenciales. Son medios sólidos que permiten obtener colonias de aspecto característico, para poder distinguirlas de colonias de microorganismos no deseados que también pueden desarrollarse en el mismo medio. Medios indicadores. Estos medios están constituidos por una base adicionada de una o varias sustancias que permitan poner en manifiesto una o más características fisiológicas del germen. Medios nutritivos (simples o enriquecidos). Son medios que permiten el desarrollo o conservación de microorganismos. Para el aislamiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales, pueden emplearse medios simples adicionados de nutrientes ricos en proteínas, hidratos de carbono, etc. A estas variantes se les conoce como medios enriquecidos. Medios para conservación de cepas. Estos medios son muy variables, pues su composición dependerá de los microorganismos que se van a conservar. Es recomendable que los medios no contengan en lo posible sustancias que al ser metabolizadas pueden afectar la viabilidad de los microorganismos, o en su defecto estos medios deben de contener sistemas reguladores. 8

13 Almacenamiento y conservación de los medios preparados La estabilidad de los medios de cultivo ya preparados es limitada; algunas fórmulas que contienen sustancias inestables tales como antibióticos deben emplearse inmediatamente después de su preparación. En los casos en que el medio conste de una base o sustancias agregadas posteriormente (como Baird- Parker, agar sangre) es preferible preparar la base que puede almacenarse y el día de su uso agregar el complemento inestable. La mayoría de los medios deben de conservarse en refrigeración entre 4 y 10 C durante un tiempo limitado, debido a su deshidratación. Otros medios, como los que contienen tioglicolato o fosfatos se conservan mejor a temperatura ambiente. Es recomendable conservar los medios de cultivo en placa en bolsas de plástico para evitar su deshidratación. Debe permitirse que los medios conservados en refrigeración adquieran a temperatura ambiente antes de su empleo. Garantía de la calidad La exactitud de un informe depende, de manera importante, de la calidad de los medios y reactivos que se emplean en el análisis y del cuidado que se tuvo en su preparación y empleo. El uso extenso de preparaciones deshidratadas de medios de cultivo, ha facilitado enormemente el trabajo de los laboratorios de microbiología, asegurándose entre otras cosas una mayor uniformidad en los constituyentes de las fórmulas. Aunque es responsabilidad del fabricante asegurar la calidad de sus preparaciones deshidratadas, es un hecho que un medio fabricado con el mayor cuidado y sometido a los controles de calidad más estrictos, pierde su valor si el usuario no lee y sigue cuidadosamente las instrucciones de preparación, o si para ésta emplea agua de mala calidad o material sucio; por estos motivos, es ineludible que, para asegurar la calidad del medio preparado, el usuario efectúe un mínimo de pruebas de control que incluyan tanto determinaciones físicas como biológicas. 9

14 Aspecto El primer punto a considerar en la evaluación de calidad de un medio de cultivo preparado es su aspecto: Ciertas características pueden ser indicativas de algunos errores técnicos, de la calidad inadecuada de algún ingrediente o de la preparación incorrecta de los recipientes que lo contengan. Para el caso de caldos, en éstos no debe presentarse turbidez ni precipitación; su existencia puede indicar una mala calidad del agua empleada en su preparación, desde el punto de vista de su contenido de iones, el uso de recipientes sucios, el sobrecalentamiento durante su preparación o un ajuste de ph incorrecto. Si el color de un medio es distinto al habitual puede ser indicio de un ajuste de ph incorrecto, particularmente en el caso de medios que contengan indicadores, o bien de un sobrecalentamiento durante la preparación, que pudo ocasionar la caramelización de azúcares o la destrucción o deterioro de colorantes; además, el envasar el medio en recipientes sucios puede ser el origen del cambio de color. Por lo que respecta al punto de solidificación y a la estabilidad del gel, éstos pueden verse afectados por varios factores. Se espera que los medios que contienen agar permanezcan con una consistencia firme entre los 33 y los 39 C. un punto de solidificación muy alto puede indicar que se ha pesado demasiado medio de cultivo, que la calidad del agar es inadecuada o que se agregó mayor cantidad de agar que la requerida por la formula. Por el contrario, una estabilidad del gel muy baja, esto es, cuando el medio no solidifica satisfactoriamente, puede obedecer entre otras causas, a que se empleó menos medio del requerido, a que el medio no se disolvió completamente, a que sufrió un sobrecalentamiento durante su preparación, en particular a phs extremos, o a que el agar es de calidad pobre. 10

15 Esterilidad El control de la esterilidad de un lote de medio de cultivo, puede llevarse a cabo difiriendo su uso por 24 horas desde su preparación, y observando la ausencia de crecimiento. No obstante, ya que esta prueba solo es indicativa de contaminación masiva y principalmente de origen bacteriano, se recomienda también incubar 4% de los tubos o cajas preparadas durante un tiempo prolongado (entre 5 y 7 días) y a temperatura que favorezca el desarrollo de bacterias como de hongos (37 y 25 C, respectivamente). Como esta prueba daría resultados extemporáneos al trabajo adecuado, es de primordial contar con sistema adecuado de validación de los procesos de esterilización, que incluya el uso de indicadores no solo químicos sino también biológicos. Conviene recordar que la cinta testigo no indica el tiempo de exposición de los materiales a cierta temperatura, y su vire ocurre a temperatura inferior a la de esterilización. La presencia de contaminación de un lote de medio preparado, puede indicar no solo esterilización deficiente, si no también contaminación post-esterilización, como durante el envasado, o bien el empleo de aditivos contaminados que se agreguen a las bases [1]. 11

16 Control de la reactividad de algunos medios de cultivo en placa Tabla 1. Control de la reactividad de cada microorganismo al medio de cultivo [1]. Medio de cultivo Agar Baird- Parker Agar bilis y rojo violeta Agar sulfito de bismuto Agar Mac Conkey Tiempo Incubación Temperatur a Microorganismos testigo h 35 C Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis 24 h 35 C Escherichia coli Proteus vulgaris Streptococcus faecalis 48 h 35 C Salmonella typhimurium Escherichia coli h 35 C Escherichia coli Proteus mirabilis Enterococos Resultados esperados Características del cultivo Morfología de las colonias Colonias negras, lustrosas, convexas, de 1 a 5 mm de diámetro, rodeadas por un halo claro o transparente. Colonias negras, lustrosas, de forma irregular. Al cabo de 24 h, presencia de zonas opacas alrededor de las colonias. Colonias rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con halo de precipitación rojizo. Colonias incoloras. Colonias pequeñas, de color rosado. Colonias negras, rodeadas por un halo negro o grisáceo, con brillo metálico. Desarrollo ocasional. Colonias pequeñas, verdosas o incoloras. Colonias grandes, rosadas o rojas con precipitado opaco. Colonias incoloras y transparentes. Inhibición del crecimiento. Colonias escasas, puntiformes y opacas. Agar SS h 35 C Salmonella typhimurium Shigella flexneri Escherichia coli Colonias incoloras, transparentes con centro negro. Colonias transparentes, incoloras. Colonias pequeñas de color rosado o rojo; poco crecimiento o completa inhibición. 12

17 Agar TCBS h 35 C Vibrio parahaemolyticus Colonias pequeñas con el centro verde azulado. Agar verde brillante Vibrio alginolyticus Streptococcus faecalis h 35 C Salmonella typhimurium Escherichia coli Staphylococcus aureus Colonias grandes, amarillas. Inhibición del crecimiento. Colonias transparentes, de color rosa palido. Colonias de color vcerdeamarillento opacas, con halo amarilliento. Inhibición del crecimiento. Agar XLD h 35 C Escherichia coli Salmonella typhimurium Colonias amarillas. Colonias rojas, transparentes con centro negro. IDENTIFICACIÓN DE CEPAS Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación. Pruebas bioquímicas Son pruebas clínicas realizadas al grupo de las enterobacterias. Se puede resumir en los siguientes puntos: - Sustrato (contenido en medio de cultivo) - Enzima o vía metabólica (secretada en el interior del microorganismo) - Producto - Revelados y/o indicador 13

18 Prueba de citrato Principio: determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento con alcalinidad resultante [8]. Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio. Vía: Varias dependientes del ph del medio. Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO 2, lactato/acetoína y CO 2 en condiciones ácidas. Indicador: Azul de bromotimol. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de nitrógeno. La extracción de nitrógeno de las sales de amonio produce amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino [8]. Véase Fig. 1 (Anexo 2). Prueba TSI (Agar con Hierro de Kliger/azúcar triple y hierro.) Principio: determinar la capacidad de un microorganismo para atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de desarrollo basal, con producción de gas o sin ella, junto con la determinación de la posible producción de ácido sulfhídrico (H 2 S) [8]. Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan todo el medio. Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan aeróbicamente la glucosa. Debido a la baja concentración de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio. Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al término de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificación completa del medio. Véase Fig. 2 (Anexo 2). 14

19 Prueba de SIM Principio: En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H 2 S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H 2 S reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico [8]. Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos: indol, metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un compuesto quinónico color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en la superficie del medio El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la zona inoculada [8]. Véase Fig. 3 (Anexo 2). Prueba de Ureasa Principio: determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea en dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa, con la resultante alcalinidad. La hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera dos moléculas de amoniaco que alcaliniza el medio, entonces se vira el indicador de ph, en el caso del rojo de fenol una prueba positiva es color bugambilia [8]. Véase Fig. 4 (Anexo 2). Prueba descarboxilasa (Lya) Principio: determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilar un aminoácido para formar una amina con la resultante alcalinidad. Los aminoácidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas lo que incrementa el ph del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias [8]. Véase Fig. 5 (Anexo 2). 15

20 Prueba de la Coagulasa Principio: probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa. La enzima producida por S. aureus es excretada al medio extracelular, el mecanismo propuesto es la acción de esta enzima sobre los factores de la coagulación presentes en el plasma y formar un coagulo visible [8]. Prueba Oxidasa Principio: determinar la presencia de enzimas oxidasas. Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. Esta reacción se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones. La prueba positiva se observa por la oxidación del reactivo incoloro en pocos segundos formándose un producto colorido [8]. Prueba de Voges Proskauer Caldo RM/VP Sustrato: Glucosa. Vías: Fermentación ácida o neutra. Producto: Acido orgánicos o acetoína. Reveladores: Solución de Rojo de Metilo, Alfa Naftol y KOH 40%. Fermentación ácido mixta: Los productos finales son ácidos orgánicos que provocan un descenso brusco del ph inicial del medio (viraje del indicador de amarillo ph por encima de 5,1) y rojo (ph por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 moléculas de piruvato formadas, reducen dos a ácido láctico y dos las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del fórmico a CO 2 y H 2 en cantidades iguales [8]. 16

21 Escherichia coli Shigella sonnei Otras Shigella Salmonella TIPICA C. freundii E. aerogenes P. vulgaris P. mirabilis Reacciones bioquímicas en enterobacterias Tabla. 2 Reacciones bioquímicas de los microorganismos [7]. Indol + V - + Rojo de metilo Voges-Proskauer + V Uso de citrato V + + V (V) (Simmons) H2S (TSI) Urea - V(W + V ) Cianuro de potasio Movilidad V Gelatina (22 C) V + + Descarbox. lisina V Arginina dehidrolasa V - V - (V) V(W - - ) Descarbox. ornitina V V Desaminac Fenilalanina Malonato V V Gas de glucosa + B V + Lactosa + d (V) + Sacarosa V d V + + V D-Manitol + + V Dulcitol V V - V - Salicina V V + V V Adonitol + I(meso)-inositol + D-sorbitol V V L-arabinosa + + V V Rafinosa V d V - V + - L-ramnosa V (+) V = 90% muchos son positivos con 48 h. V = son el 10% positivos en 48 h. (+) = del 10% al 89.9% son positivos en 48 h. 17

22 (V) = el 90% son positivas entre 3 y 7 días. W = el 50% son positivas en 48 h y el 90% son positivas de 3 a 7 días. d = débilmente positiva. b = muchas cepas de S. sonnei dan reacciones relativamente positivas de lactosa (88%) y sacarosa (85%). C = algunos serotipos de S. flexnerii producen gas de glucosa. 18

23 8. PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO El tipo de evaluación que debe practicarse a un medio de cultivo, depende íntimamente de su propósito. El objetivo que cada evaluación consiste en verificar los siguientes parámetros: a) El desarrollo de pequeños inóculos en los medios nutritivos. b) La aparición de las reacciones deseadas en los medios para las pruebas bioquímicas. c) El crecimiento de organismos típicos en los medios diferenciales. d) El crecimiento de los organismos deseados y la inhibición de los microorganismos indeseables en los medios selectivos o de enriquecimiento. e) La mayor recuperación de microorganismo en los medios de preenriquecimiento. f) La formación y el aspecto de las colonias en los medios sólidos. Dada la complejidad de algunas de estas pruebas para valorar estos parámetros, no es práctico efectuarlas con la misma periodicidad. Las pruebas deben realizarse toda vez que el aspecto o ph del medio no correspondan a lo esperado. En caso contrario, se sugiere probar: Los medios nutritivos cada vez que se cambie de lote de medio deshidratado, comparándolo con el que está en uso, para asegurar que no es inferior en capacidad de sostener el crecimiento de microorganismos. Los medios selectivos de uso esporádico, cada vez que se prepare un lote, utilizando las cepas correspondientes. En los medios de alta selectividad se deben incluir testigos tanto positivos como negativos, en todas las pruebas. 19

24 Entre los defectos que un medio puede presentar desde el punto de vista de su efectividad biológica, cabe destacar la presencia de alteración y la cantidad de crecimiento, la de crecimiento difuso y la de crecimiento atípico. Un medio puede presentar escaso crecimiento, debido a la existencia de sustancia inhibidoras en el recipiente donde se envasó o preparó, en el agua donde se rehidrató o en la misma muestra que se sembró. Otras causas de este defecto son un ph incorrecto, algunos aditivos inhibidores agregados en cantidades incorrectas, el sobrecalentamiento y presencia de organismos dañados, bien en la muestra o debido a un procedimiento incorrecto, como el empleo de medio caliente durante una cuenta de vaciado en placa. Un crecimiento excesivo en un medio de cultivo puede ser causado por la destrucción de los inhibidores selectivos por sobrecalentamiento o por el uso de aditivos inhibidores en cantidades incorrectas. La participación de crecimiento difuso puede ser motivada por la destrucción de inhibidores del fenómeno por sobrecalentamiento, por el uso de placas con la superficie muy húmeda o por el empleo de un inóculo excesivo. Finalmente, la aparición de crecimiento atípico puede obedecer a una mala formulación del medio, a la adición de sustancias complementarias en cantidades incorrectas o de selección de mutantes [1]. 20

25 8.1 CONSERVACIÓN DE CEPAS A MEDIANO PLAZO EN ACEITE MINERAL El uso de los microorganismos ha sido clave en el enfrentamiento y solución de los graves problemas de la humanidad en los diferentes sectores. Estos necesitan ser viables al menos durante el estudio y los experimentos, para lo cual deberán ser mantenidos y conservados en una colección de cultivos microbianos garantizando su disponibilidad. 1. CULTIVO INICIAL 1.1 A partir del cultivo primario tomar una asada y depositarlo en 10 ml de Caldo Soya Tripticaseina o BHI (Infusión Cerebro Corazón). 1.2 Incubar a 35 ± 2 C por 24 horas. 2. CULTIVO DE RESERVA O MADRE 2.2 Inocular por estría cruzada en placa de Agar nutritivo. 2.3 Incubar a 35 ± 2 C por 24 horas. 2.4 Realizar descripción morfológica de las colonias desarrolladas. 2.5 Tomar una colonia y realizar siembra masiva. 2.6 Incubar a 35 C por 24 horas. 2.7 Tomar inóculo y realizar siembra por estría en 4 tubos previamente etiquetados y que contienen agar nutritivo con bisel corto (cultivo intermedio), incubarlos a 35 C por 24 hrs. 2.8 También realizar a partir de esta placa frotis para Gram y para pruebas bioquímicas convencionales. NOTA: Si las pruebas bioquímicas se realizan con el sistema API (Sistemas de identificación multipruebas) anexar el formato respectivo. 21

26 2.9 Realizar otras pruebas complementarias como: Confirmación de serotipo, movilidad, oxidasa, coagulasa, termonucleasa y hemólisis de sangre en caso de que aplique. Los resultados se registrarán en el formato control de calidad de cepas microbianas APM- F Sellar con cinta parafilm las placas de AN y almacenar en refrigeración. 3. CULTIVO INTERMEDIO 3.1 Realizar etiquetas con la siguiente información: Nombre de la cepa, clave interna, fecha de pase, CI (cepa o cultivo intermedio) y No. de tubo. 3.2 Verificar la presencia de desarrollo en los 4 tubos de AN. 3.3 Adicionar aceite mineral estéril 1cm arriba del pico del agar inclinado. 3.4 Sellar con cinta parafilm y almacenar a temperatura ambiente (23 a 27 C) o en refrigeración (4 a 8 C). Cada mes realizar evaluación para verificar su pureza, viabilidad y estabilidad aplicando los puntos 1 y 2 de este procedimiento. 4. CULTIVO DE TRABAJO 4.1 Realizar etiquetas con la siguiente información: Nombre de la cepa, clave interna, fecha de pase, CT (cepa o cultivo de trabajo) y No. de tubo. 4.2 Etiquetar 4 tubos de 13 x 100 que contienen agar nutritivo (AN) con bisel largo. 22

27 4.3 El día del control de cepas, sacar un tubo del refrigerador (Cultivo intermedio) atemperar y sembrar en placa de AN para obtener colonias aisladas. 4.4 Picar una colonia desarrollada en la placa de Agar Nutritivo y sembrar por estría en bisel largo los tubos (Cepa de trabajo) Incubar a 35 ± 2 C por 24 horas. 4.5 Observar desarrollo, sellar con cinta parafilm, guardar en gaveta a temperatura ambiente hasta su uso. Inactivar los cultivos y materiales de contacto provenientes de las cepas adicionando cloro al 0.5% y dejar actuar por un lapso de 30 min. En la Fig.1 se detalla la forma en que se realiza el procedimiento mencionado [4]. 23

28 Fig. 1 Proceso para la conservación de cepas. 24

29 8.2 CRITERIOS DE CALIDAD EN LA EVALUACIÓN FÍSICA Y BIOLÓGICA DE MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS Solicitar al Área de Preparación de Medios (APM) los pedidos de medios preparados en frasco, tubo y placa solicitados comúnmente por el Área de Control Ambiental. 1. EVALUACIÓN FÍSICA DE MEDIO EN CALDO Se debe de verificar en forma visual la apariencia y color, en los caldos no debe haber turbiedad o material precipitado, existen excepciones como el caldo tetrationato cuya apariencia física particular y diferente se especifica en la parte de fórmulas de cada medio de cultivo. Se deberán de verificar los volúmenes de los caldos con una probeta. 1.1 Inspeccionar y verificar los medios entregados por el APM observando: Criterios de evaluación física y biológica en caldos y diluyentes: Envases etiquetados con la siguiente información: Nombre o abreviatura del medio de cultivo, volumen, fecha de preparación, No. de lote, personal que los preparó, Envases en buenas condiciones. Ausencia de turbidez y precipitación. Envases con tapa de rosca bien cerrada. Ausencia de materia extraña. Incoloro (donde aplique, diluyentes) Presencia de campanas Durham (donde aplique, caldos) ph finales dentro de los límites establecidos por el fabricante. Volúmenes dentro del rango requerido (donde aplique, diluyentes) Color característico del medio (donde aplique, caldos) 25

30 Prueba de esterilidad del medio entregado (donde aplique, caldos) 2. EVALUACIÓN FÍSICA EN PLACAS Los agares deben de tener una consistencia firme y de color característico. 2.1 Inspeccionar físicamente y verificar con la prueba de esterilidad del medio entregado por el APM observando: Criterios de evaluación física y biológica en placas: Envases etiquetados con la siguiente información: Nombre o abreviatura del medio de cultivo, Fecha de preparación, No. de lote, personal que los preparó. Coloración característica del medio. Solidificación y estabilidad del gel adecuada. Ausencia de rajaduras en su superficie. Ausencia de humedad en la tapa y superficie. Ausencia de coágulo por enfriamiento del medio. ph finales dentro de los límites establecidos por el fabricante. Ausencia de burbujas en el medio. Ausencia de colonias contaminantes. Placas rotuladas en placa. Envasadas en bolsas de plástico e identificadas con etiquetas. Se registran todos los medios de cultivo recibidos en el formato FO y registran si el producto es o no conforme, así mismo se deberán registrar las causas de rechazo. A continuación en la Fig. 2 se resume el procedimiento mencionado [3]. 26

31 INICIO SOLICITUD DE MEDIOS DE CULTIVOS AL APM RECEPCION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO REGISTRAR EN FORMATO FO APLICACIÓN DE LOS CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO NO CUMPLE DEVOLVER PRODUCTO AL APM SI CUMPLE GUARDAR PRODUCTOS EN LUGAR CORRESPONDIENTES. SI FIN Fig. 2 Evaluación física de los medios de cultivo. 27

32 8.3 PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS 1. PREPARACIÓN DE LAS CEPAS EN PLACA 1.1 Sembrar en placas de agar nutritivo por separado la cepa deseada y la interferente. 1.2 Incubar a 35 ± 2 C/ horas. 2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO 2.2 Tomar una colonia aislada de la cepa deseada e interferente e inocular por separado a tubos que contienen 10 ml de BHI (Caldo Infusión Cerebro Corazón), previamente rotulados con el nombre o clave correspondiente. 2.3 Incubar a 35 ± 2 C/ 18 horas. 3. DÍA DEL CONTROL Preparación del material de trabajo 3.1 Preparar en una gradilla dos hileras de 10 tubos del diluyente 9 (9 ml) y rotular cada hilera de la siguiente manera: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, En la misma gradilla acomodar a la par de cada hilera a partir del tubo 10-6, cinco tubos que contienen el caldo a evaluar y marcarlos como 10-6, 10-7, 10-8,10-9, Rotular simultáneamente 10 placas Petri desechables estériles con 10-6 hasta Desarrollo experimental 3.4 Cumplidas las horas de incubación de la cepa deseada e interferente, tomar 1 ml de la suspensión que contiene la cepa deseada y realizar las diluciones decimales correspondientes a partir de las dilución

33 depositar 1 ml a placas estériles vacías y 1 ml a los tubos que contienen el caldo a evaluar [5]. 3.5 Repetir este procedimiento para la cepa interferente. 3.6 Realizar el vaciado en placa con agar cuenta estándar. 3.7 Dejar solidificar e incubar las placas a 35 C durante 24 horas. En forma simultánea incubar los caldos a evaluar de acuerdo a las condiciones requeridas. 4. DESARROLLO EN CALDO 4.1 Una vez transcurrido el tiempo de incubación de los caldos evidenciar con registro y visualmente las características típicas del crecimiento. 5. SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO 5.1 Una vez transcurrido el tiempo de incubación de los caldos sembrar la dilución 10-6 hasta la dilución en placas de Salmonella shigella (SS), agar verde brillante (VB), Agar sulfito bismuto (SB). 6. CONTEO DE PLACAS 6.1 A las 24 horas contar las colonias desarrolladas en las placas de cuenta estándar para conocer en que dilución se tienen una concentración de 100 a 150 UFC / ml [6]. 7. CRITERIOS DE EVALUACIÓN Un medio de cultivo es considerado como aquel que tiene un funcionamiento adecuado de selectividad y productividad cuando: - Se observa suficiente inhibición del crecimiento del microorganismo que debe ser inhibido (interferente) y suficiente crecimiento del microorganismo deseado (control). 29

34 Expresar lectura e interpretación de los resultados en el formato FO (Formato Promoción de crecimiento en caldo). En la Fig. 3 se detalla la forma en que se realiza la promoción de crecimiento en caldos [3]. 30

35 Fig. 3 Promoción de crecimiento de microorganismos en caldos. 31

36 8.4 PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS SELECTIVOS 1. PREPARACIÓN DE LA CEPA 1.1 Sembrar en placas de agar nutritivo por separado las 3 cepas (la cepa deseada y dos cepas interferentes): Tabla 1. Cepas deseadas e interferentes para la promoción de crecimiento en caldos selectivo. PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS SELECTIVOS Cepas Salmonella typhimurium Escherichia coli Citrobacter freundii Deseada Interferente Interferente 1.2 Incubar a 35 C/ horas. 2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO 2.1 Tomar una colonia aislada de cada una de las cepas e inocular por separado en tubos que contienen 10 ml de BHI (Caldo Infusión Cerebro Corazón), previamente rotulados con el nombre o clave correspondiente. 2.2 Incubar a 35 ± 2 C durante18 horas 3. DÍA DEL CONTROL Preparación del material 3.1 Preparar en una gradilla una hilera de 10 tubos del diluyente 9 (9 ml) y rotular de la siguiente manera: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, En la misma gradilla acomodar a la par de la hilera a partir del tubo 10-6, cinco tubos que contienen el caldo selectivo a evaluar el caldo 32

37 Tetrationato (CTT) y el caldo Rappaport Vassiliadis (CRp) y marcarlos como 10-6, 10-7, 10-8,10-9, Desarrollo experimental 3.3 Sacar de la incubadora los tres tubos de BHI que contienen el cultivo o suspensión de cada una de las cepas. 3.4 Transferir las 3 suspensiones de los tubos de BHI y colocarlos en un matraz Erlenmeyer y agitar. 3.5 Tomar 1 ml de la suspensión y realizar las diluciones decimales correspondientes, a partir de la dilución 10-6 depositar 1 ml a los tubos que contienen el caldo selectivo a evaluar [5]. 3.6 Incubar los caldos selectivos a evaluar a 35 C durante 24 horas. 4. SEMBRADO POR ESTRÍA EN MEDIOS SELECTIVOS Preparación del material 4.1 Rotular las placas con los medios selectivos Verde Brillante (VB), agar Xilosa, Lisina, Desoxicolato (XLD), agar Sulfito Bismuto (SB), agar Salmonella shigella (SS) que corresponden a cada caldo selectivo utilizado de acuerdo a la dilución (10-6,10-7, 10-8, 10-9 y ). Desarrollo experimental 4.2 Una vez transcurrido el tiempo de incubación de los caldos que contienen la mezcla de las 3 cepas tomar una asada e inocular en los medios selectivos sembrando por estría cruzada en superficie. 4.3 Incubar a 35 ± 2 C, 24 a 48 horas. 5. CRITERIOS DE EVALUACIÓN Se evalúan los medios según su productividad y selectividad. En relación a si productividad: El caldo selectivo debe permitir el desarrollo de un cultivo puro de 33

38 la cepa deseada con un inóculo bajo y un desarrollo pobre o nulo del cultivo de la cepa interferente en mayor concentración. En la Fig. 4 se detalla la forma en que se realiza la promoción de crecimiento en caldos selectivos [3]. 34

39 Fig. 4 Promoción de crecimiento de microorganismos en caldos selectivos. 35

40 8.5 PRUEBA ECOMÉTRICA EN AGARES SELECTIVOS, DIFERENCIALES E INDICADORES. 1. DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD 1.1 Usar tres cepas de microorganismos deseados y tres interferentes para cada tipo de agar. Tabla 2. Cepas deseadas e interferentes para la prueba ecométrica PRUEBA ECOMÉTRICA EN AGARES SELECTIVOS DIFERENCIALES E INDICADORES Cepas Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus ATCC6538 Staphylococcus epidermidis Escherichia coli Enterobacter aerogenes Proteus mirabilis. Deseada Deseada Deseada Interferente Interferente Interferente 1.2 Sembrar en placas de agar nutritivo por separado cada una de las cepas e incubar a 35 C durante 24 horas. 2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO 2.1 Inocular por separado una colonia aislada de cada una de las 6 cepas de reserva a 6 tubos que contienen 10 ml de caldo infusión cerebro corazón (BHI) previamente rotulados con el nombre o clave de las 3 cepas deseadas y de las 3 cepas interferentes. 2.2 Mezclar perfectamente los tubos e incubar 18 horas a 35 C±1 C. 36

41 3. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS 3.1 Seleccionar 6 cajas de petri que contienen el medio selectivo a evaluar y 6 cajas de petri que contiene el medio de referencia. 3.2 Dividir cada una de las 12 cajas petri por la parte posterior de la base marcándolas en 4 cuadrantes. 4. SIEMBRA 4.1 Tomar con un asa calibrada un 1microlitro de cada uno de los 6 tubos de la suspensión bacteriana e inocular las 6 cajas de Petri que contienen el medio a evaluar y otras 6 que contienen el medio de referencia (se eligen 12 cajas de Petri: 3 que contengan el medio a evaluar y 3 con el medio de referencia para inocular las cepas deseadas. Se eligen 3 placas con el medio a evaluar de las cepas interferentes y 3 con el medio de referencia para inocular las cepas interferentes). 4.2 Trazar 5 estrías paralelas entre ellas sobre la superficie del medio en el primer cuadrante. 4.3 Repetir las 5 estrías en cada uno de los demás cuadrantes de la placa sin cargar el asa con cultivo y sin flamearla. 4.4 Trazar una última estriada central en el punto donde se unen los cuadrantes. En la Fig. 5 se detalla la forma en que se realiza la siembra. Fig. 5 Siembra por estría para la técnica ecométrica en agares selectivos e indicadores 37

42 4.5 Incubar las placas en posición invertida de acuerdo a las condiciones en que se va a utilizar el medio de cultivo. 5. CRITERIOS DE EVALUACIÓN 5.1 Determinar el valor de cada estría. Efectuar la lectura de las cajas petri teniendo en cuenta que cada estría tiene un valor de 0.2, este valor corresponde a crecimiento completo o parcial (considerándose válida cualquier estría que tenga crecimiento en más del 25% de la línea). 5.2 Determinar el valor en cada cuadrante de una placa. El valor de 0.2 se multiplica por el número de estrías que se realizó en cada cuadrante que son 5, por lo tanto cada cuadrante tiene un valor total de Determinar el valor de la estría central. La estría central tiene un valor de 1 este valor corresponde a crecimiento completo o parcial que se presente en ella. 5.4 Determinar el valor de la placa La placa está dividida en 4 cuadrantes si cada cuadrante tiene valor de 1 entonces 4 x 1= 4 a este valor le sumamos el valor de la estría central que es de 1 y tenemos que la placa tiene un valor máximo de 5. Expresar en forma simultánea el desarrollo en el formato APM-F-017 valores de selectividad y reproductividad. Los resultados obtenidos se expresan con un número de 6 cifras, en que las primeras 3 representan la presencia de crecimiento en las estrías de las cepas que deben crecer en el medio, y las otras 3 representan la presencia en las estrías de las cepas que no deben crecer. Así, un medio muy selectivo estaría representado por el número (5, 5,5, 0, 0,0), en el que las cepas que se esperaban que crecieran, se desarrollaron en las 5 estrías de las 3 cajas, y las que no deberían no lo hicieron en las 5 estrías de las 3 cajas. 38

43 Son aceptables para un medio selectivo las formulas (5,5,5,0,0,0), (5,5,4 0,0,1) y (5,4,4 1,1,0). Para los medios indicadores se deben probar con cepas que produzcan las reacciones características y otras que no las den [3]. En la Fig. 6 se detalla la forma en que se realiza la prueba ecométrica. 39

44 Fig. 6 Prueba para evaluar el Método ecométrico. 40

45 8.6 PRUEBA DE TOXICIDAD DEL DILUYENTE 1. PREPARACIÓN DE LA CEPA 1.1 Sembrar en una placa de agar nutritivo la cepa de Escherichia coli ATCC e incubar a 35 C durante 24 horas. 2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO. 2.2 Tomar una colonia aislada de la cepa e inocular en un tubo con 2 ml de caldo nutritivo. 2.3 Incubar durante 18 horas a 35 C. 3. DÍA DE CONTROL Preparación del material 3.1 Preparar 3 frascos con diluyente 99 ml y rotularlos con 10-2, 10-4 y Rotular 5 cajas petri con la dilución 10-6 para el tiempo 0 (T 0 ), simultáneamente otras 5 cajas petri con la dilución 10-6 para el tiempo 45 (T 45 ). Desarrollo experimental 3.3 Transferir 0.1 ml del cultivo que se encuentra en el caldo nutritivo a un matraz Erlenmeyer con 100 ml de caldo nutritivo. Incubar 4 horas a 35 C. 3.4 Transferir 1 ml del cultivo anterior al frasco de la dilución 10-2 que contiene el diluyente 99 (peptona gelatina). 3.5 A partir de la dilución anterior (1:100), realizar diluciones decimales en el diluyente a probar hasta la dilución 1:1,000,000.(10-6 ) para tener un inóculo de 100 a 250 UFC/ml. 3.6 Inmediatamente transferir 2 ml de la última dilución (10-6 ) a 5 cajas de petri estériles rotuladas con (T 0 ) y agregar por vaciado en placa 15 ml de 41

46 Agar Rojo Violeta Bilis fundido a 45 C, dejar solidificar y agregar una segunda capa (5 ml) de agar rojo violeta. 3.7 Dejar transcurrir 45 minutos, se agita el frasco y de la misma dilución se transfiere 2 ml a 5 cajas de Petri rotuladas con T Agregar por vaciado en placa 15 ml de agar rojo violeta bilis fundido a 45 C dejar solidificar y agregar una segunda capa (5 ml) de Agar Rojo Violeta Bilis [5]. 3.9 Incubar ambas series de cajas de petri invertidas a 35 C durante 24 horas. 4. CONTEO DE PLACAS 4.1 Contar las colonias desarrolladas en las dos series de cajas (T 0 y T 45 ) y hacer un promedio de cada serie[6]. 4.2 Calcular el porciento de cambio en la población entre el T 0 y T 45 mediante la siguiente formula: FÓRMULA 5. ANÁLISIS DE RESULTADOS Se considera aceptable si el porcentaje se encuentra entre 20% ± 5% En la Fig. 7 se detalla la forma en que se realiza la prueba de toxicidad de diluyente [3]. 42

47 Fig. 7 Prueba para determinar la toxicidad del diluyente 43

48 8.7 PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN BACTERIANA EN AGARES PARA CUENTA EN PLACA 1. PREPARACIÓN DE LA CEPA 1.1 Sembrar en placas de agar nutritivo por separado las cepas: Escherichia coli Staphylococcus aureus Bacillus subtillis 1.2 Incubar a 35 C/ horas. 2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO 2.1 Tomar una colonia aislada de cada cepa y sembrar por separado en 3 tubos de BHI e incubar a 35 C 18hrs. 3. DÍA DE CONTROL Preparación del material 3.1 Preparar en una gradilla una hilera de 10 tubos del diluyente 9 (9 ml) y rotular cada hilera de la siguiente manera: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, Rotular simultáneamente 10 placas petri estériles con 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, Desarrollo experimental 3.3 Depositar el contenido total de cada una de las suspensiones bacterianas del BHI en un matraz estéril de 100 ml y agitar suavemente. 3.4 A partir de la mezcla anterior, transferir 1 ml y hacer las diluciones decimales 10-1, 10-2 hasta llegar a [5]. 3.5 Simultáneamente transferir 1 ml a partir de la dilución 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, por duplicado a cajas Petri estériles para realizar el vaciado 44

49 en placa, las primeras 5 placas con el medio a evaluar Agar Rojo Bilis Violeta y las restantes con el medio de referencia Agar Cuenta Estándar (15 ml de cada medio fundidos a 45 C) observar Fig Dejar solidificar e incubar a 3 5± 1 C por 24 horas. 4. CONTEO DE COLONIAS 4.1 Seleccionar las placas con una cuenta 100 UFC/ml. Anotar los resultados [6]. 5. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS El Porcentaje de recuperación bacteriana o proporción de productividad del agar de interés, se calcula con la siguiente ecuación: PR= (Ns/No)(100) Dónde: PR: Proporción de Productividad Ns: Es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo a probar (obtenido de uno o más placas) No: Es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia definido obtenido de uno o más placas que debe ser 100 UFC [6]. En general para que el medio de cultivo no selectivo (utilizado en recuento en placa) sea conforme en cuanto a productividad su PR debe ser mayor o igual a un valor límite de 0,7 [2]. 45

50 9. RESULTADOS - Conservación de cepas. Se realizó la purificación de cepas microbianas a mediano plazo en aceite mineral, obteniendo satisfactoriamente el crecimiento de los microorganismos, por el método anteriormente descrito, se realizó la identificación por medio de pruebas bioquímicas, tinción de Gram, agares selectivos. Se hizo uso del equipo Sistema MicroScan WalkAaway plus de la marca Siemens Healthcare Diagnostics, para corroborar los resultados de las pruebas bioquímicas para identificación cepas. Se realizó la elaboración y modificación del formato correspondiente (véase conservación de cepas anexo 1). Microorganismos identificados Cepa Clave Salmonella typhimurium ATCC Stapylococcus aureus ATCC Vibrio cholerae 01 OPS-OMS Salmonella grupo G 3277 Shigella sonnei 3283 Salmonella grupo B 3355 Salmonella sp urbana 3321 Salmonella newport 4344 Shigella boydi Criterios de calidad en la evaluación física y biológica de medios de cultivo preparados. Se establecieron los criterios de evaluación para caldos, diluyentes y placas. Se realizaron las modificaciones correspondientes dando como resultado el FO (formato criterios de calidad en la evaluación física de medios de cultivo). (Ver anexo 1 Criterios de calidad en la evaluación física de medios de cultivo). 46

51 - Prueba de promoción de crecimientos en caldos. Aplicando el procedimiento anteriormente mencionados se evaluación los siguientes medios. MEDIO A CEPA DESEADA CEPA INTERFERENTE RESULTADO EVALUAR (marca) Caldo lauril (s) Escherichia coli Staphylococcus aureus Aceptado Difco Caldo lauril (s) Escherichia coli Staphylococcus aureus Aceptado Bioxon Caldo Lauril [1.5] bioxon Escherichia coli Staphylococcus aureus Aceptado Caldo Ec. Con Escherichia coli Enterobacter aerogenes Rechazado Mug Difco Caldo lauril Mug Escherichia coli Staphylococcus aureus Aceptado Caldo lactosado bilis verde Escherichia coli Staphylococcus aureus Aceptado brillante Bioxon Los medios fueron aceptados ya que se demostró la inhibición de la cepa interferente, resultando como rango de sensibilidad la dilución 10-7, el medio caldo Ec. con Mug fue rechazado ya que no presento crecimiento en el rango de sensibilidad. Los resultados fueron registrados en el formato FO (promoción de crecimiento en caldos), a este formato se realizaron modificaciones. (Véase Anexo 1 Promoción de crecimiento en caldos). - Promoción de crecimiento en caldos selectivos Realizando el procedimiento anteriormente descrito, se evaluó con las siguientes cepas: PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS SELECTIVOS Cepas Salmonella typhimurium Escherichia coli Citrobacter freundii Deseada Interferente Interferente 47

52 Evaluando el caldo selectivo Tetrationato (CTT) y el caldo Rappaport Vassiliadis (CRp). Caldos Evaluados CTT con Verde Brillante y CTT base CTT con verde brillante y CTT base Medio selectivo de recuperación VB, XLD, SB VB, SS, SV Se demostró que el caldo CTT c/vb tuvo una recuperación en la dilución 10-6 y 10-7 en los medios VB, XLD y SB, el verde brillante es inhibidor de la cepa Citrobacter y E. coli. Los medios selectivos son aceptables para su reproducibilidad. (Ver anexo 2 FIG 6 y FIG 7). En el CTT base se obtuvo una mayor recuperación en los medios selectivos VB, XLD, SB, SS. (Ver anexo 1. Prueba de promoción de crecimiento en caldos selectivos). - Prueba Ecométrica en agares selectivos, diferenciales e indicadores. Se usaron las tres cepas deseadas y las tres interferentes dando resultados aceptables demostrando que los medios selectivos agar salado manitol (ASM) y el Agar eosina azul de metileno (EMB) (ver anexo 2 FIG. 8), son aceptados para trabajar con ellos. (Ver anexo 1 Prueba ecométrica). - Prueba de Toxicidad del diluyente. Se realizó el procedimiento anteriormente descrito, evaluando lo siguiente: DILUYENTE CEPA RESULTADO Solución amortiguadora Escherichia coli ATCC Aceptado de fosfatos Peptona de gelatina Escherichia coli ATCC Aceptado Se considera aceptable si el porcentaje se encuentra entre 20% ± 5% y se demostró que los diluyentes analizados son viables para trabajar con ellos. (Ver anexo 1. Toxicidad de diluyente). 48

53 - Porcentaje de recuperación bacteriana en agares para cuenta en placa. Utilizando las cepas: Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Se evaluaron los medios Agar Billis Rojo Violeta (ABRV) y el medio agar cuenta estándar (ACE), utilizando como cepa control: Escherichia coli, cepas interferentes: Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Ver anexo 2 FIG. 9. Se seleccionaron las placas con una cuenta 100 UFC/ml. (Ver anexo 1. Porcentaje de recuperación bacteriana en agares para cuenta en placa). 49

54 10. CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES El trabajo realizado en esta investigación, cumplió los objetivos que se plantearon al 100 %. La evaluación de medios de cultivo resultó ser el procedimiento más importante del departamento de control ambiental, ya que el desarrollo de los procedimientos en el área de Microbiología de alimentos depende de la buena calidad de un medio. Sin un medio de cultivo viable se tendría falsos positivos en cada una de las pruebas realizadas en estos. Control de calidad es un área importante en todos los laboratorios, manteniendo controladas las diferentes variables que pueden afectar a un medio se logra un resultado confiable tanto para el mismo laboratorio como para el cliente. Las condiciones de trabajo en el laboratorio, el equipamiento e instalaciones no fueron las más adecuadas, sin embargo, se logró realizar cada uno de los procedimientos descritos anteriormente. Con la experiencia adquirida se recomienda lo siguiente: a) Se implemente un plan de trabajo complementario en las áreas de preparación de medios de cultivo, control de calidad de medios y Microbiología de Alimento, desarrollando cronogramas de actividades de cada área mencionando los medios de cultivo a utilizar, la cantidad de medio y el tiempo en que se desarrollará dicha actividad, con el fin de mejorar la comunicación, coordinar y facilitar cada una de las actividades correspondientes de cada departamento. b) Información adecuada y oportuna a través de talleres para que manejen adecuadamente sus equipos e instalaciones. c) Qué se tomen acciones inmediatas para el equipamiento del área de control de calidad de medios. d) Es indispensable que se logre una mejor comunicación entre todas sus áreas y trabajadores. 50

55 e) Es relevante la importancia de continuar con este proyecto ya que como área nueva dentro de este laboratorio, sin un buen control de calidad no se aseguran resultados confiables. La cooperación incondicional y apoyo de los Químicos Analistas, fue parte de este logro. El trabajo concluido en tiempo y forma, fue de acuerdo a lo planeado inicialmente y de acuerdo al cronograma de actividades. Dentro de los logros realizados en el proyecto, se obtuvo experiencia en el manejo e implementación de control de calidad en medios de cultivo. Además de tomar las decisiones en el momento adecuado bajo presión. Por otro lado, quedó claro que el trabajo en equipo, propicia que los resultados sean exitosos y confiables. 51

56 11. ANEXO 1 CONSERVACIÓN DE CEPAS 52

57 53

58 CRITERIOS DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVOS: CALDOS 54

59 55

60 CRITERIOS DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVOS: DILUYENTES NOMBRE DEL DILUYENTE Dil 9 Dil 99 Dil 9 Dil 99 Dil 99 FECHA DE EVALUACIÓN 19/06/12 19/06/12 21/06/12 22/06/12 29/06/12 CANTIDAD EVALUADA 5/100 3/6 5/100 2/6 2/4 FECHA DE PREPARACIÓN 14/06/12 14/06/12 21/06/12 21/06/15 29/06/12 LOTE DE PREPARACION MARCA COMERCIAL BIOXON BIOXON BIOXON BIOXON BIOXON No DE LOTE CUMPLE CON LOS CRITERIOS? SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO Volumen dentro del rango requerido Ausencia de turbidez y precipitación Incoloro. Envase con tapa bien cerrada. Ausencia de materia extraña. Envases en buenas condiciones Presencia de etiquetas ph dentro del limite establecido PUNTOS INCUMPLIDOS % DE CUMPLIMIENTO 100% 100% 100% 100% 100% RESULTADO 1.-9ml 1.-90ml 1.-9ml 1.-90ml ml VERIFICACIÓN DE VOLUMEN ml ml ml ml ml ml ml ml ml 3.-91ml ml ml 5.-90ml 5.-9ml ml ml 56

61 CRITERIOS DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVOS: PLACAS FECHA DE EVALUACIÓN 29/05/12 29/05/12 29/05/12 29/05/12 08/06/12 12/06/12 12/06/12 ABREVIACIÓN MEDIO EN PLACA ASM EMB AN AN(3%N AVB ASM EMB CANTIDAD EVALUADA acl) FECHA DE PREPARACIÓN 28/05/12 28/05/12 27/05/12 17/05/12 31/05/12 07/06/12 07/06/12 LOTE PREPARACIÓN MARCA COMERCIAL BIOXON BIOXON BIOXON BIOXON MCD-LAB BIOXON BIOXON No LOTE CUMPLE CON LOS CRITERIOS? SI NO SI NO SI NO SI NO 26 SI NO SI NO SI NO Presenta coloración característico Solidificación y estabilidad de gel adecuado Ausencia de rajaduras en superficie Ausencia humedad tapa y superficie No Hemolisis y coágulos de sangre NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Ausencia de coágulo formado por enfriamiento del medio Libre de materia extraña. ph dentro del límite establecido Ausencia de burbujas en el medio Ausencia de colonias contaminantes Placas rotuladas en tapa Envasadas en bolsas de plástico e identificadas con etiqueta. PUNTOS INCUMPLIDOS PORCENTAJE DE CUMPLIMIENTO 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 57

62 PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS 58

63 59

64 60

65 61

66 62

67 63

68 PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO EN CALDOS SELECTIVOS CEPA CONTROL CLAVE CEPAS INTERFERENTES CLAVE Salmonella typhimurium ATTCC14028 Citrobacter freundii Escherichia coli ATCC8090 ATCC25922 FECHA DE EVALUACIÓN 06/06/12 MEDIOS A EVALUAR CTT c/vb CTT (base) Marca Comercial Bioxon LOTE Marca Comercial Bioxon LOTE FECHA preparación 01/06/12 LOTE preparación FECHA preparación 01/06/12 LOTE preparación 22-5 ph referido N/R ph final 8.13 ph referido N/R ph final 8.11 No. DIL ACE (UFC) RECUPERACIÓN Medios selectivos ACE (UFC) RECUPERACIÓN Medios selectivos VB XLD SB VB XLD SB Placa control ACE 0 UFC 64

69 CEPA CONTROL CLAVE CEPAS INTERFERENTES CLAVE Salmonella typhimurium ATTCC14028 Citrobacter freundii Escherichia coli ATCC8090 ATCC25922 FECHA DE EVALUACIÓN 27/06/12 MEDIOS A EVALUAR CTT c/vb CTT s/vb (base) Marca Comercial BIOXON LOTE Marca Comercial BIOXON LOTE FECHA preparación 22/06/12 LOTE preparación FECHA preparación 22/06/12 LOTE preparación ph referido N/R ph final 7.60 ph referido N/R ph final 7.57 No. DIL ACE (UFC) RECUPERACIÓN Medios selectivos ACE (UFC) RECUPERACIÓN Medios selectivos VB SS SB VB SS SB Placa control ACE 0 UFC 65

70 PRUEBA ECOMETRICA 66

71 67

72 TOXICIDAD DEL DILUYENTE CEPA CONTROL No. DE COLECCIÓN CLAVE Escherichia coli ATCC25922 CCM-Esc-01 NOMBRE DEL DILUYENTE FECHA DE EVALUACIÓN Solución amortiguadora de fosfatos 22/02/2012 Marca comercial Preparado por ingredientes Lote N/A Fecha preparación 20/02/2012 ph referido 7.0 ± 0.2 ph final 7 Lote preparación 8-1 Minutos PLACA 1 UFC PLACA 2 UFC PLACA 3 UFC PLACA 4 UFC PLACA 5 UFC SUMATORIA PROMEDIO TIEMPO TIEMPO Placa ABRV CONTROL = 0 UFC Lote preparación8-2 RESULTADO 15.30% 68

73 CEPA CONTROL No. DE COLECCIÓN CLAVE Escherichia coli ATCC25922 CCM-Esc-01 NOMBRE DEL DILUYENTE FECHA DE EVALUACIÓN Solución amortiguadora de fosfatos 07/03/2012 Marca comercial Preparado por ingredientes Lote N/A Fecha preparación 29/02/2012 ph referido 7.0 ± 0.2 ph final 7 Lote preparación 9-2 Minutos PLACA 1 UFC PLACA 2 UFC PLACA 3 UFC PLACA 4 UFC PLACA 5 UFC SUMATORIA PROMEDIO TIEMPO TIEMPO Placa ABRV CONTROL = 0 UFC Lote preparación8-2 RESULTADO 16.22% 69

74 CEPA CONTROL No. DE COLECCIÓN CLAVE Escherichia coli ATCC25922 CCM-Esc-01 NOMBRE DEL DILUYENTE FECHA DE EVALUACIÓN Peptona de gelatina 07/03/2012 Marca comercial BIOXON Lote Fecha preparación 05/03/2012 ph referido 6.5 ± 0.7 ph final 7.11 Lote preparación 10-1 Minutos PLACA 1 UFC PLACA 2 UFC PLACA 3 UFC PLACA 4 UFC PLACA 5 UFC SUMATORIA PROMEDIO TIEMPO TIEMPO Placa ABRV CONTROL = 0 UFC Lote preparación9-4 RESULTADO 15.34% 70

75 CEPA CONTROL No. DE COLECCIÓN CLAVE Escherichia coli ATCC25922 CCM-Esc-01 NOMBRE DEL DILUYENTE FECHA DE EVALUACIÓN Peptona de gelatina 06/06/2012 Marca comercial BIOXON Lote Fecha preparación 01/06/2012 ph referido 6.5 ± 7.5 ph final 7.02 Lote preparación 22-5 Minutos PLACA 1 UFC PLACA 2 UFC PLACA 3 UFC PLACA 4 UFC PLACA 5 UFC SUMATORIA PROMEDIO TIEMPO TIEMPO Placa ABRV CONTROL = 0 UFC Lote preparación RESULTADO 16.87% 71

76 CEPA CONTROL No. DE COLECCIÓN CLAVE Escherichia coli ATCC25922 CCM-Esc-01 NOMBRE DEL DILUYENTE FECHA DE EVALUACIÓN Peptona de gelatina 13/06/2012 Marca comercial BIOXON Lote Fecha preparación 28/05/2012 ph referido 6.5 ± 7.5 ph final 6.93 Lote preparación 22-1 Minutos PLACA 1 UFC PLACA 2 UFC PLACA 3 UFC PLACA 4 UFC PLACA 5 UFC SUMATORIA PROMEDIO TIEMPO TIEMPO Placa ABRV CONTROL = 0 UFC Lote preparación RESULTADO 16.08% 72

77 CEPA CONTROL No. DE COLECCIÓN CLAVE Escherichia coli ATCC25922 CCM-Esc-01 NOMBRE DEL DILUYENTE FECHA DE EVALUACIÓN Peptona de gelatina 20/06/2012 Marca comercial BIOXON Lote Fecha preparación 14/06/2012 ph referido 6.5 ± 7.5 ph final 6.94 Lote preparación 24-3 Minutos PLACA 1 UFC PLACA 2 UFC PLACA 3 UFC PLACA 4 UFC PLACA 5 UFC SUMATORIA PROMEDIO TIEMPO TIEMPO Placa ABRV CONTROL = 0 UFC Lote preparación RESULTADO 15.29% 73

78 PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN BACTERIANA EN AGARES PARA CUENTA EN PLACA CEPA CONTROL No DE COLECCIÓN CEPAS INTERFERENTES No DE COLECCIÓN Escherichia coli ATCC25922 Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis ATCC25923 ATCC12228 FECHA DE EVALUACIÓN 20/06/2012 MEDIO A EVALUAR Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV) FECHA Preparación LOTE Preparación MARCA LOTE 23-5 ph Referido No de dilución MEDIO EVALUADO (UFC) MEDIO DE REFERENCIA (UFC) Agar Cuenta Estándar Dilución 10-6 >250 >250 Dilución Dilución Dilución Medio Control Placa Control 0 UFC Placa Control 0UFC 74

79 CEPA CONTROL No DE COLECCIÓN CEPAS INTERFERENTES No DE COLECCIÓN Escherichia coli ATCC25922 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus ATCC25923 ATCC16538 FECHA DE EVALUACIÓN 31/05/2012 MEDIO A EVALUAR Agar Cuenta Estandar (ACE) FECHA Preparación 24/05/2012 LOTE Preparación 21-4 MARCA BIOXON LOTE ph Referido 7.0 ± 0.2 No de dilución MEDIO EVALUADO (UFC) Agar Cuenta Estándar (ACE) MEDIO DE REFERENCIA (UFC) Agar Soya tripticasa Dilución Dilución Dilución Dilución 10-9 <1 <1 Medio Control Placa Control 0 UFC Placa Control 0UFC 75

80 CEPA CONTROL No DE COLECCIÓN CEPAS INTERFERENTES No DE COLECCIÓN Escherichia coli ATCC25922 Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis ATCC25923 ATCC12228 FECHA DE EVALUACIÓN 06/06/2012 MEDIO A EVALUAR Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV) FECHA Preparación LOTE Preparación MARCA LOTE ph Referido No de dilución MEDIO EVALUADO (UFC) MEDIO DE REFERENCIA (UFC) Agar Cuenta Estándar Dilución 10-6 >250 >250 Dilución Dilución Dilución 10-9 <1 0 Medio Control Placa Control 0 UFC Placa Control 0UFC 76

81 CEPA CONTROL No DE COLECCIÓN CEPAS INTERFERENTES No DE COLECCIÓN Escherichia coli ATCC25922 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus ATCC25923 ATCC16538 FECHA DE EVALUACIÓN 07/05/2012 MEDIO A EVALUAR Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV) FECHA Preparación 01/03/2012 LOTE Preparación 09-4 MARCA BIOXON LOTE ph Referido 7.4 ± 0.2 No de dilución MEDIO EVALUADO (UFC) Agar Cuenta Estándar (ACE) MEDIO DE REFERENCIA (UFC) Agar Soya tripticasa Dilución Dilución Dilución Dilución Medio Control Placa Control 0 UFC Placa Control 0UFC 77

82 12. ANEXO 2 FIG. 1 REACCIÓN POSITIVA DE CITRATO FIG. 2 REACCIÓN TSI POSITIVA CON GENERACION ACIDO SULHÍDRICO FIG 3 REACCIÓN NEGATIVA DE MOVILIDAD FIG 3. REACCIÓN POSITIVA INDOL 78

83 FIG 4. REACCIÓN POSITIVA UREASA FIG. 5. REACCIÓN POSITIVA DE LYA FIG 6. PLACA DE SULFITO DE BISMUTO CTT 79

84 FIG. 7 PLACA SS. CRECIMIENTO DE SALMONELLA FIG 8. IZQ. PLACA DE ASM. DER. PLACA DE EMB. AMBAS PRESENTANDO ALTA SELECTIVIDAD Y PRODUCTIVILIDAD, 80

85 FIG. 9. PLACAS DE ABRV 81