Aislamiento de Salmonella spp. en alimentos

Transcripción

1 Guatemala, marzo 2007 Aislamiento de Salmonella spp. en alimentos 20 de marzo 2007 María a Teresa Acuña a Calvo INCIENSA - Costa Rica

2 Introducción ETAs debidas a diferentes serovariedades de Salmonella Asociadas al consumo de alimentos contaminados con materia fecal humana o animal: Gastroenteritis Fiebre tifoidea y paratifoidea Complicaciones graves de alta de letalidad (niños, ancianos e inmunocomprometidos) Ampliamente distribuido en la naturaleza: Intestino de aves, reptiles y mamíferos Sobrevivencia en el ambiente Aguas, alimentos, excretas

3 Introducción I M P A C T O Salud humana Salud animal Gastroenteritis Fiebres entéricas Abortos Diarreas Producción n de alimentos de origen animal Bajo rendimiento Rechazo por riesgo para la salud Producción n de alimentos de origen vegetal Rechazo por riesgo para la salud Mayores costos de producción Agua para consumo Turismo Aguas de riego, abonos orgánicos Manejo pos-cosecha

4 La principal preocupación n de los gobiernos en relación n a los alimentos importados de otros países o regiones se relaciona con la inocuidad y con la preservación n de la salud humana, animal y vegetal

5 Recomendaciones Grupo Técnico T de Microbiología a de la Red Interamericana de Laboratorios de Análisis de Alimentos (RILAA) En la Ronda de Negociaciones Comerciales Multilaterales de Uruguay, se aprobaron dos acuerdos con la finalidad de promover el comercio ético y leal de productos entre los países, teniendo la salud como prioridad: Sanitario y Fitosanitario (SPS) Barreras Técnicas T al Comercio (TBT) Asegurar la aplicación de los reglamentos técnicos, patrones y procedimientos analíticos: minimizar y/o eliminar el riesgo sanitario evitar obstáculos innecesarios al comercio Tomado de: Documento Posicionamiento del grupo Técnico de Microbiología de la RILAA frente a la adopción de métodos normalizados y con la necesidad de buscar la acreditación de los laboratorios de análisis de alimentos Agosto 2006

6 Los países comparten la responsabilidad por la inocuidad de los alimentos,, la cual debe mantenerse a lo largo de toda la cadena alimentaria

7 Recomendaciones Grupo Técnico T de Microbiología a de la Red Interamericana de Laboratorios de Análisis de Alimentos (RILAA) Los métodos m analíticos deben ser confiables, reproducibles y factibles, por lo que se ha recomendado la adopción n de métodos normalizados o métodos descritos por organizaciones con credibilidad internacional, como: International Organization for Standardization (ISO) Association of Official Analytical Chemists International (AOAC) U.S Food and Drug Administration (FDA-BAM) Food Safety and Inspection Service-USDA (FSIS) American Public Health Association (APHA) International Commission on Microbiological Specifications for Food F (ICMSF) Tomado de: Documento Posicionamiento del Grupo Técnico de Microbiología de la RILAA frente a la adopción de métodos normalizados y con la necesidad de buscar la acreditación de los laboratorios de análisis de alimentos Agosto 2006

8 Recomendaciones Grupo Técnico T de Microbiología a de la Red Interamericana de Laboratorios de Análisis de Alimentos (RILAA) Los métodos m de laboratorio deben ser utilizados tal como son descritos, sin realizar ningún n cambio. El laboratorio sólo s debe realizar una verificación n del desempeño o del métodom en sus instalaciones. Si alguno de los laboratorios desea utilizar un método m nuevo o modificado, se recomienda que éste sea adoptado después s de hacer una validación n completa para demostrar que el método m nuevo presenta equivalencia al método normalizado. Tomado de: Documento Posicionamiento del Grupo Técnico de Microbiología de la RILAA frente a la adopción de métodos normalizados y con la necesidad de buscar la acreditación de los laboratorios de análisis de alimentos Agosto 2006

9 Norma: ISO 16140:2003 Microbiology of food and animal feeding struffs (Protocol for validation of alternative methods) 1era etapa: Estudio comparativo en que las caracter Estudio comparativo en que las características de desempeño del método m alternativo son confrontadas con las del método m normalizado 2da etapa: Ensayo Ensayo colaborativo en que participan 8 a 10 laboratorios acreditados y coordinados por el laboratorio coordinador Límite de detección n y / o cuantificación Precisión n relativa Sensibilidad Especificidad Inclusividad Exclusividad Repetibilidad Reproducibilidad

10 Salmonella spp. Microorganismos pertenecientes al género g Salmonella se aislaron inicialmente en muestras de origen clínico Poco tiempo después s se empezó a sospechar de la contaminación n de algunos alimentos con bacterias de éste género Parecía a lógico l aplicar los procedimientos existentes, con algunas modificaciones, para el análisis de alimentos. Sin embargo se hizo evidente que esta práctica no era adecuada debido a muchas razones.

11 La recuperación n de Salmonella a partir de un alimento está relacionado a diferentes factores : Se encuentra en cantidades menores en muestras de alimentos que en muestras clínicas Su recuperación n se dificulta porque han sido sometidas a condiciones adversas resultando así dañadas adas y debilitadas La naturaleza de algunos alimentos altera las características y el modo de acción n de los medios de cultivo, dificultando la recuperación n del patógeno

12 La recuperación de Salmonella a partir de un alimento está relacionado a diferentes factores: La manipulación n de la muestra después s de la recolección: Ej.: En carnes crudas la flora competitiva puede ser un factor importante Se pueden encontrar variaciones de muestra a muestra y entre un tipo de carne y otro

13 La recuperación de Salmonella a partir de un alimento está relacionado a diferentes factores : Para propósitos epidemiológicos el analista debe ser más m exhaustivo: Adicionando medios de enriquecimiento, otros medios de cultivo, utilizando dos temperaturas de incubación, n, intensificando el número n de colonias a picar, y/o utilizando métodos m de screening rápidos Laboratorio Clinica Ambiente Epidemiología

14 Esquema básicob Presencia de Salmonella spp. en alimentos Dia 1 Pre-enriquecimiento enriquecimiento en medio líquido l no selectivo: permite a las salmonelas que están en bajos niveles y/o lesionadas resucitar y proliferar Homogenización n del alimento (1: 9) Licuar, remojo, triturado, batido Incubar: tiempo y temperatura definidos Dia 2 Enriquecimiento en medio líquido l selectivo: permite a las salmonelas proliferar y a la vez suprime el crecimiento de microflora competitiva Incubar: tiempo y temperatura definidos

15 Día a 3 Plateo selectivo Suprime el crecimiento de microflora competitiva y permite el crecimiento de colonias de Salmonella bien aisladas Incubar: tiempo y temperatura definidos XLT4 XLD HE BGS BGA BS

16 Día a 4 Selección n de colonias típicas t y atípicas y siembra en TSI y LIA Incubar: tiempo y temperatura definidos Día a 5 Confirmación n bioquímica BQ convencional API, Vitek H2S (+) H2S S (-)(

17 Día a 6 Confirmación n serológica Antisueros polivalentes O Antisueros polivalentes H Reporte de resultados: Presencia de Salmonella spp. en 25 gramos o ml del producto Antígenos flagelares H Antígenos somáticos O

18 Cuál l esquema de aislamiento debo utilizar?

19 La selección n del método m de aislamiento de Salmonella depende básicamente b de : El socio comercial (país s importador) El alimento a analizar (matriz) Flora acompañante ante Si se trata de un análisis de rutina o si es para fines epidemiológicos (investigación n de brote)

20 Esquemas de aislamiento para Salmonella spp. en alimentos Etapa USDA 10/01/04 AOAC 2000 BAM 2003 ISO 6579:2002 Carnes, Huevos, lácteosl Huevo, lácteos l Alimentos para Aplicable productos de carne y huevos alimentos crudos, Alimentos altamente contaminados, frutas y vegetales pescado, mariscos carnes y sustitutos consumo humano y alimentación n animal, muestras ambientales No aplicable: alimentos para animales especias, dulces Aplicable: S. Typhi S. Typhi y S. Paratyphi Caldo lactosa Caldo Lactosa Pre-Enriq Enriq. Agua peptona Bufferizada (APB) Agua + V B1% C.T.S CTS + sulfito de potasio Agua + VB 1% CTS + sulfato ferroso Caldo Nutritivo Agua peptona Bufferizada (APB) Caldo LST CTS + sulfito de Cocoa: : APB +/-NDFM potasio NFDM Tiempo / Temperatura h 35 C C +/- 2 C Ajusta PH 24 h +/- 2 h 35 C Ajusta PH 24 h 35 C 18 +/- 2 h 37 C C +/- 1 C

21 Esquemas de aislamiento para Salmonella spp. en alimentos Etapa USDA 10/01/04 AOAC 2000 BAM 2003 ISO 6579:2002 Enriquecimiento Medio Rappaport Vassiliadis modifi Caldo Selenito Cistina Alimentos de alta y baja carga microbiana: Medio Rappaport Vassiliadis con soya Tiempo Temperatura CaldoTetrationato (Hajna) h 42 C Caldo Tetrationato 24 h +/- 2 hrs 35 C Medio Rappaport Vassiliadis Alta y baja carga 24 h +/- 2 h 42 C +/- 0.2 C Caldo Tetrationato TT baja carga 24 h +/- 2 h 35 C +/- 0.2 C 24 h +/- 3h 41.5 C +/- 1 C Caldo Tetrationato Muller Kauffaman con novobiocina (mkttn) 24 h +/- 3 h 37 C +/- 1 C alta carga 24 h +/- 2 hrs 43 C +/- 0.2 C

22 Esquemas de aislamiento para Salmonella spp. en alimentos Etapa USDA 10/01/04 AOAC 2000 BAM 2003 ISO 6579:2002 Plateo selectivo XLT 4 y BGS XLD, HE, BS XLD y HE XLD (2 placas) h 35 C C +/- 2 C 24 h +/- 2 h 35 C 24 h +/- 2 h 35 C C +/- 1 C 24 h +/- 3 h 37 C C +/- 1 C Otro medio BGA y/o BGA Selección n de colonias 3 colonias sospechosas por placa 2 o más m s colonias sospechosas de cada placa 1 colonia sospechosa de cada placa o dos colonias atípicas 1 colonia sospechosa por placa Inocule en ATS o AN 24 h a 35 C Inocule en AN 24 h +/- 3 h 37 C C +/- 1 C Identificación BQ presuntiva TSI y LIA 24 h+/- 2 h 35 C C +/- 2 C TSI y LIA 24 h +/- 2 h 35 C TSI, LIA, BHI 24 h +/- 2 h 35 C BQ use medios apropiados (TSI, urea, lisina decarboxilasa, ONPG, VP, indol)

23 La sostenibilidad de los recursos de laboratorio depende del uso inteligente que se de a los mismos

24 Investigación n de patógenos en alimentos durante la investigación n de brotes ETA Experiencia en INCIENSA Solicitar al nivel local: Muestras de casos asociados al brote, a fin de identificar el patógeno involucrado (incluyendo manipuladores de alimentos) Recolección n de muestras de alimentos sospechosos como probable fuente de infección Realizar la investigación n epidemiológica oportunamente (formularios de brotes) Se procesan en el laboratorio únicamente aquellos alimentos que muestran evidencia epidemiológica que los implique como probable vehículo de infección. n. Se busca específicamente el patógeno identificado en los casos clínicos.

25 Algunos ejemplos de vehículos de infección identificados en brotes por Salmonella Costa Rica, Provincia, año N casos Patógeno identificado en casos clínicos Patógenos en vehículos de infección Manipuladores Asintom. Sintom. Alimento Alajuela,, S. Enteritidis ø1* 1 1 Papas a la francesa Heredia,, S. Typhimurium ø atípico pico* Alajuela, S. Enteritidis Arroz cantonés Heredia,, S. Enteritidis 4 -- Mayonesa casera San José,, S. Typhimurium DT104* (multirresistente**) 0 0 Chicharrones de cerdo (sospechoso: no enviaron muestras) Fuente: Centro Nacional de Referencia en Bacteriología, INCIENSA * Fagotipo confirmado en el LCDC-Canadá. ** Cepa resistente a AN, AMP, CHL, TCY, S3, S.

26 Muchas gracias!!!