Ph.D. Cecilia Díaz Oreiro

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1 Estandarización de técnicas genómicas y proteómicas de detección de posibles mutaciones en moléculas que median la resistencia a drogas quimioterapéuticas en cáncer de hígado Nombre de la investigación: Estandarización de técnicas genómicas y proteómicas de detección de posibles mutaciones en moléculas que median la resistencia a drogas quimioterapéuticas en cáncer de hígado Investigador Principal: Cecilia Díaz Oreiro Unidad de investigación: Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiología y Departamento de Bioquímica, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica. Formación académica: Ph.D. en Ciencias Biomédicas (Cell Biology), University of Texas-Health Science Center at Houston (MD Anderson Cancer Center), 1998 Ph.D. Cecilia Díaz Oreiro M.Sc. en Ciencias Biomédicas (énfasis Fisiología), Universidad de Costa Rica, Posgrado en Ciencias Biomédicas, 1992 Bachillerato en Biología, Universidad de Costa Rica, Escuela de Biología, 1987 Investigadores asociados y estudiantes: MSc. Omar Gätjens Boniche (ITCR) Dra. Ximena Cortés Bratti (UCR) MSc. Gabriela Azofefia Cordero (UCR) Bach. Ernesto Vargas Méndez (Posgrado en Ciencias Biomédicas, UCR) Bach. Natalia Ortiz Chávez (Posgrado en Ciencias Biomédicas, UCR) Esteban Coto Valverde (Bachillerato en Biotecnología, ITCR) El carcinoma hepatocelular (HCC) es el quinto tumor más común en el mundo con una mortalidad que alcanza el 97% de la incidencia anual (Parkin et al 2001). Aunque la incidencia ha sido particularmente alta en países asiáticos un incremento notable en el número de casos

2 está ocurriendo en países occidentales, principalmente en Europa (Collette et al, 2008) y Estados Unidos (El-Serag et al, 2003). El diagnóstico tardío y la resistencia a la quimioterapia (Schwartz et al, 2007) así como la alta hetererogeneidad (Thorgeirsson y Grisham, 2002; Farazi y DePinho, 2006) y la alta recurrencia (Schwartz et al, 2007) hacen de este tumor una enfermedad difícil de tratar. El único tratamiento que a la fecha refleja un aumento en la sobrevida del paciente es la resección cuando el tumor es único e inferior a 5cm de diámetro o el transplante cuando el tumor es multifocal o mayor de 5 cm de diámetro. No obstante pocos pacientes con HCC son elegibles para la resección o el transplante debido a que la mayor parte de ellos presentan cuadro de hepatitis crónica o cirrosis (Schwartz et al, 2007). En Costa Rica el cáncer de hígado se encuentra entre los primeros 10 tumores según incidencia, siendo más frecuente en hombres que en mujeres. Sin embargo la mortalidad debida a estos tumores es bastante alta siendo el quinto tumor que más muertes produce en hombres y entre el quinto y sexto (ha variado en ciertos años) en mujeres (Ortiz et al, 2005). Aunque existen diversos tumores hepáticos, el HCC es el tumor primario de hígado que se presenta con mayor frecuencia (Schwartz et al, 2007). Sin embargo estudios recientes apuntan que dentro de la categoría de Carcinoma hepatocelular se encuentra una gran diversidad de tumores que varían según marcadores moleculares y morfología celular y eventualmente, en el pronóstico de sobrevida para el paciente (Thorgeirsson y Grisham, 2002; Farazi y DePinho, 2006). A pesar de los cambios en las técnicas de diagnóstico y formas de tratamiento llevadas a cabo en los últimos 30 años, el HCC continúa siendo un tumor de alta mortalidad por razones que incluyen que su diagnóstico es generalmente tardío, que en el 80% de los casos se desarrolla en individuos con cirrosis, lo cual tanto dificulta el diagnóstico como reduce las opciones terapéuticas y que las recurrencias son muy frecuentes. Otra de las razones es que estos tumores son resistentes a diversos agentes citotóxicos empleados, tanto solos como en combinación (Leung y Johnson, 2001), y la única terapia potencialmente curativa hasta ahora ha sido la resección quirúrgica, la cual, por otra parte, se asocia con gran morbilidad y mortalidad perioperatorias. Cada vez más, los investigadores están reconociendo diferencias en la biología de los tumores, el metabolismo de las drogas, su toxicidad y la respuesta terapéutica entre las diferentes poblaciones de pacientes que reciben los agentes antitumorales. Estas observaciones proveen oportunidades excitantes para identificar los factores más importantes que permiten predecir la variabilidad individual en fenotipos farmacológicamente relevantes y

3 consecuentemente poder personalizar la administración de la terapia anti-tumoral (Maitland et al, 2006). La variabilidad observada en el desarrollo clínico de un tumor junto con el rango diverso de condiciones terapéuticas disponibles (algunas de ellas muy poco eficientes) han demostrado que se requiere de un pronóstico preciso del paciente individual. Se ha demostrado que un gran número de parámetros clínicos, de laboratorio y patológicos que han sido asociados con el riesgo de enfermedad, pueden ser incorporados en índices pronósticos fácilmente calculables (Salas et al., 2006). Con los nuevos avances en la biología de las enfermedades y la identificación de biomarcadores que surgen del análisis, tanto del genoma como del transcriptoma, se debería de poder realizar una individualización más precisa del pronóstico del paciente. Uno podría pensar en por lo menos dos estrategias disponibles para individualizar la terapia: el monitoreo de la cantidad de droga en el plasma para detectar el metabolismo individual del paciente con respecto a su respuesta al tratamiento y la caracterización de las alteraciones específicas del tumor para poder diseñar una terapia acorde y que no esté dirigida o basada en moléculas que se encuentran alteradas o ausentes. Se sabe que muchos factores no-genéticos, tales como la edad, sexo, dieta y función de los órganos, afectan la respuesta terapéutica a las drogas. Sin embargo, avances recientes in farmacogenómica han revelado que los polimorfismos genéticos también influencian significativamente tanto la eficacia como la toxicidad de las drogas. Mutaciones en los genes que codifican para enzimas que metabolizan las drogas, transportadores y moléculas blanco, pueden alterar su expresión, actividad, o afinidad a las drogas, influenciando la farmacocinética y farmacodinámica de estas. El estudio de estas alteraciones podría ser muy útil en la individualización y optimización de las terapias contra el cáncer (Yamayoshi et al, 2005). Los perfiles basados en microarreglos ( chips de ADN ) se han vuelto muy populares en muchos países, pero sin embargo son sumamente caros para ser aplicados al diagnóstico individualizado en Costa Rica. Sin embargo, otras tecnologías para hacer estos perfiles, tanto genómicas como proteómicas, podrían ser también muy útiles y no tan caras. Se requiere cuanto antes la individualización de la terapia para tratar a cada paciente con la droga y dosis óptima apropiada. Los polimorfismos genéticos son los determinantes

4 hereditarios de estas variaciones individuales de los efectos y llevar a cabo un acercamiento genético representaría una nueva herramienta de diseño para terapias individuales (Toffoli y Cecchin, 2004). El cáncer es causado por una acumulación escalonada de mutaciones que afectan tanto el control del crecimiento como la diferenciación y la supervivencia, cada una de ellas haciendo distintas contribuciones a la progresión del fenotipo maligno. Con respecto al proceso de formación del tumor, la evolución neoplásica del HCC procede a través de un proceso histológico de múltiples pasos, que en el caso de este tumor no está tan bien definido. Los nódulos hiperplásicos de hepatocitos en regeneración tienen características citológicas normales y representan el primer paso hacia la transformación. Estas lesiones pueden progresar a nódulos displásicos pre-malignos, los cuales tienen características anormales. Luego, estos nódulos pueden desarrollarse en HCC, el cual tiene la capacidad de invadir el estroma fibroso de sus alrededores y los vasos sanguíneos y puede desarrollar potencial metastático (Farazo y DePinho, 2006). Los estudios genómicos podrían tener gran relevancia en el entendimiento de las características de este tipo de tumor y podrían brindar la posibilidad de utilizar marcadores moleculares en la clasificación de los pacientes y, potencialmente, los posibles tratamientos que mejor se aplican para cada individuo. Algunos resultados del proyecto El proyecto original consistía en la estandarización de dos diferentes protocolos para la detección (semi-cuantitativa) de variaciones en la expresión de marcadores que podrían ser utilizados como indicadores de progresión tumoral, uno a nivel de ARNm y otro a nivel de proteína. En este caso se seleccionó un tipo de tumor, que corresponde al cáncer hepático, un tumor sumamente agresivo y difícil de tratar terapéuticamente, el cual hemos estado estudiando en nuestro laboratorio, principalmente en lo que respecta a posibles terapias alternativas. El panel de marcadores seleccionados, consistió en 5 proteínas que según la literatura científica presentan variaciones en su expresión en tumores de hígado y por consiguiente podrían suministrar información diagnóstica y terapéutica y una proteína control de la cual no se espera variación.

5 Estos experimentos se realizaron en paralelo para las dos líneas tumorales humanas, como se había establecido originalmente en el proyecto y para muestras extraídas del modelo tumoral de rata inducido químicamente. Esto último se realizó como un avance del proyecto debido a que paralelamente estamos trabajando en la estandarización de modelos animales de cáncer y el primer modelo que hemos estandarizado es el de inducción química conjuntamente con hepatectomía parcial, de cáncer hepático en ratas. De estos animales pudimos obtener muestras de tejido, las cuales fueron utilizadas para extraer ARNm y estandarizar la determinación de los marcadores por RT-PCR para luego realizar análisis de PCR en tiempo real. Las figuras muestran algunos resultados del RT-PCR de la expresión de los diferentes marcadores en las líneas celulares de cáncer hepático.

6 La figura muestra algunos resultados de la estandarización de la técnica de inmunotransferencia de algunos marcadores tumorales en las células de cáncer hepático utilizando anticuerpos comerciales. Investigadores del proyecto (UCR y TEC) trabajando con el nuevo equipo para PCR en tiempo real adquirido por el Laboratorio de Biología Molecular del TEC, Sede San Carlos. A: MSc. Gabriela Azofeifa de la UCR, B: equipo PCR tiempo real adquirido a la Compañía Analytical Instruments, C: M.Sc. Omar Gatjens del TEC, D: estudiante de Biotecnología Esteban Coto y el técnico de Analytical Instruments Francisco Calvo dando la capacitación sobre la utilización del equipo.

7 Conclusiones generales del proyecto 1. La técnica de RT-PCR es una técnica muy eficiente en la determinación de marcadores tumorales, tanto en líneas celulares como en biopsias de tumores. 2. La técnica de RT-PCR no es cuantitativa por lo que permite ver variaciones gruesas en los niveles de expresión de los marcadores, sin embargo la técnica de PCR en tiempo real es perfecta para la cuantificación de diferencias en la expresión de los tumores, sin embargo debe estandarizarse mejor ya que es una técnica sumamente complicada y sensible. 3. La técnica de inmunotransferencia no es una técnica confiable para la determinación de variaciones en los niveles de expresión de proteínas tumorales, debido a que es muy difícil adquirir anticuerpos comerciales que sean suficientemente sensibles. Además es una técnica semi-cuantitiativa. 4. Los marcadores seleccionados para este trabajo podrían ser la base de un panel más extenso de marcadores tumorales utilizables para la determinación de la expresión proteica (o de ARN), tanto para diagnóstico como para pronóstico de pacientes después de un tratamiento. 5. Los marcadores seleccionados se utilizaron para tumores hepáticos pero también podrían utilizarse para otros tumores. En estos momentos estamos comenzando un proyecto similar pero para cáncer gástrico, el cual tiene especial relevancia en nuestro país. Sería de suma importancia para el diagnóstico molecular individualizado en los hospitales, la determinación de la expresión de marcadores moleculares como estos, los cuales tendrían gran impacto en la selección de una terapia específica, por ejemplo. Este tipo de determinaciones podrían hacerse directamente en los hospitales o en colaboración con los laboratorios de investigación de las universidades.

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