Tuberculosis: un caso-una cepa? Análisis de casos con infecciones complejas desde un punto de vista microbiológico

Transcripción

1 Tuberculosis: un caso-una cepa? Análisis de casos con infecciones complejas desde un punto de vista microbiológico Darío García de Viedma Servicio de Microbiología XXXI Congreso SEMI Oviedo, 17 Noviembre 2010

2 Epidemiología molecular tuberculosis RFLP-IS6110 Spoligotyping MIRU-VNTR 3R Cepas/Clones Dendrogramas Identificar Clusters

3 Tuberculosis: un caso-una cepa

4 Complejidad clonal Estudio de poblaciones de casos de TB No cumplen paradigma de UN CASO-UNA CEPA

5 Rastreo de complejidad clonal en TB Recurrencias Infección respiratoria Infección respiratoria + extrarrespiratoria

6 RFLP-IS6110 Restriction-fragment-length-polimorphism Analiza número y posición de IS6110 Electroforesis Hibridación IS6110 Enzima PvuII Diana PvuII

7 Spoligotyping: Spacers-oligo-typing Analiza región DR (Repeticiones directas) Spoligotyping DR DR 1 DR2 DR3 DR4 DR5 DR6 DR espaciador1 espaciador2... Cepa1 DR 1 DR3 DR5 DR6 DR7 Cepa2 Cepa3 DR 1 DR2 DR3 DR4 DR5 DR6 DR2 DR4 DR5 DR7

8 Spoligotyping Sp:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, ,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.. PCR múltiple de los 43 espaciadores Hibridación Cepas Comparación basada en presencia/ausencia de espaciador

9 TB Recurrente

10 TB Recurrente Una infección por MTB protege frente a una nueva infección 6,7% de pacientes con un episodio de tuberculosis en últimos 12 años presentan un nuevo episodio recurrente Reinfecciones Alta incidencia Alto riesgo de exposición Reactivaciones Mal tratamiento Adquisición de resistencias

11 TB Recurrente Análisis en población no seleccionada VIH+ VIH- Moderada incidencia No alto riesgo de exposición Retrospectivo 12 años 43 pacientes Primer episodio Cepa1 Cepa2 Episodio recurrente Caracterización genotípica Iguales o distintas?

12 TB recurrente 14/43 pacientes con cepas sucesivas diferentes 32.6% Reinfección exógena Considerar reinfección en recurrencias en condiciones epidemiológicas más amplias que las habituales Análisis en población no seleccionada

13 Episodio previo TB recurrente Demanda de análisis rápido de recurrencias Reinfección/Reactivación? Episodio actual

14 Episodio previo TB recurrente Demanda de análisis rápido de recurrencias Reinfección/Reactivación? Episodio actual

15 MIRU-VNTR Mycobacterial Interspersed Repetitive Units- Variable Number Tandem Repeats MIRU A 150 pb 50pb PCR electroforesis Cepa A Cepa B Cepa C Cepa D Cepa E Cepa F 150 pb 200 pb 250 pb 300 pb 350 pb 400 pb N o repeticiones MIRUtipo:

16 Episodio previo TB recurrente Demanda de análisis rápido de recurrencias Reinfección/Reactivación? Episodio actual

17 TB recurrente: Análisis rápido PACIENTES A EPISODIOS B C D E F G H I J K L M 3/13 (23%)

18 Infección mixta

19 Infección mixta? Cepa1 Cepa2 Genotipado RFLP No es posible identificar presencia de más de una cepa Spoligotipado

20 Infecciones complejas: Metodología Análisis de múltiples colonias independientes

21 1 2 3 Infecciones complejas 50 pacientes retrospectivos 6% Coinfección con dos cepas simultáneamente

22 Infecciones complejas pacientes retrospectivos Aislado resp + extrarresp 6% Coinfección con dos cepas simultáneamente COMPARTIMENTALIZACION RESP EXTRARRESP RESP EXTRARRESP RESP EXTRARRESP DE LA INFECCION

23 Infección compartimentalizada

24 Infección compartimentalizada cepaa+b cepaa Competición? Factores bacteriológicos?

25 cepaa+b cepaa Infección de macrófagos humanos in vitro simultáneamente con las dos cepas A B A B B A B A B B A A A:B proporción 1:1 Infección de cultivo de macrófagos B A B A A A A A A A B A A A B B B

26 Compartimentalización * * * 1: Respiratoria 2: Respiratoria 3: LCR Cambios sutiles: MICROEVOLUCION modificación comportamiento infectivo de cepa de MTB Posible selección de cepa con mayor capacidad de infección extrarrespiratoria

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28 MIRU-VNTR Mycobacterial Interspersed Repetitive Units- Variable Number Tandem Repeats MIRU A 150 pb 50pb Cepa A Cepa B Cepa C Cepa D Cepa E Cepa F PCR electroforesis 150 pb 200 pb 250 pb 300 pb 350 pb 400 pb N o repeticiones MIRUtipo:

29 Infecciones complejas VNTR-MIRU y policlonalidad Infecciones complejas Población policlonal distinguible sin analizar colonias aisladas

30 Infecciones complejas Casos con infección compartimentalizada 1733 pacientes (Ene 2003-Oct 2009) TB respiratoria Grupo 1 1 aislado 1 aislado respiratorio extrarespiratorio 11 casos analizados Caso 1 17 loci diferentes Aislado resp Sangre Caso 2 3 loci diferentes Aislado resp M24 no disponible Orina M24 no disponible 92 pacientes (5.3%) TB respiratoria + TB extrarespiratoria Grupo 2 1 aislado 2 aislados respiratorio extrarespiratorios 6 casos analizados Caso 3 1 locus diferente Aislado resp Orina Sangre Grupo 3 1 aislado 3 aislados respiratorio extrarespiratorios 2 casos analizados Ningún caso con diferencias

31 Puede el cultivo modificar la complejidad clonal existente en la muestra clínica?

32 Efecto del cultivo sobre Esputos policlonales artificiales MIRUtipado de 30 colonias aisladas Proporción pre-cultivo MIRUtipado de 30 colonias aisladas Proporción post-cultivo

33 Antes del cultivo Después del cultivo C1 C2 C1 C2 Cepa 1(33.4%) Cepa 2(66.6%) Antes del cultivo Cepa 1 (96.3%) Cepa 2 (3.7%) Después del cultivo C3 C4 C4 C3 Cepa 3(80.7%) Cepa 4(19.3%) Cepa 3(14.3%) Cepa 4(85.7%)

34 Rastreo de complejidad clonal en TB

35 Servicio Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas