El laboratori de micobactèries: present i futur

Transcripción

1 II Jornada de treball: La tuberculosi a la xarxa sanitària de la Regió Sanitària Barcelona El laboratori de micobactèries: present i futur José Domínguez Servei de Microbiologia Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Fundació Institut d Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol Universitat Autònoma de Barcelona

2 Objetivos propuestos para controlar la tuberculosis Disponer de métodos diagnósticos rápidos, sensibles y específicos que nos permita diagnosticar precozmente y tratar de forma apropiada a los individuos enfermos. Pautas antibióticas más cortas y con menos efectos secundarios. Métodos diagnósticos para la detección de individuos infectados y poder interrumpir la cadena de infección.

3 Diagrama del diagnóstico microbiológico de la tuberculosis Diagnóstico de la tuberculosis Infección tuberculosa Enfermedad tuberculosa Tuberculina Técnicas IFN-γ Técnicas moleculares -Detección -Identificación -Detección resistencias Examen microscópico Cultivo medio sólido y líquido Identificación micobacteriana Antibiograma Técnicas Alternativas -Discriminación -Rápidas y reproducibles -Automatizadas Estudio molecular de las cepas RFLP MIRU Spoligotyping

4 Diagnóstico clásico de la infección tuberculosa: la tuberculina Baja Especificidad El PPD es una mezcla compleja de antígenos. Más de 200 de estos constituyentes proteicos del PPD son compartidos por micobacterias ambientales y por el bacilo vacunal (BCG). Baja Sensibilidad Falta de respuesta en pacientes con alteraciones de la inmunidad celular. Problemas logísticos Errores en la administración y subjetividad en la interpretación de los resultados. Visita de lectura. Pérdida horas laborales. Pacientes que no vuelven a la lectura. Conmoción social.

5 Inmunodiagnóstico in vitro de la infección tuberculosa: técnicas del IFN-γ Métodos in vitro estandarizados T-SPOT.TB QuantiFERON-TB Gold (In Tube)

6 Inmunodiagnóstico in vitro de la infección tuberculosa: técnicas del IFN-γ Se evidencia in vitro la presencia en sangre de células T sensibilizadas mediante el estímulo con antígenos específicos. Antígenos RD1: ESAT-6 y CFP-10. Revelar la sensibilización mediante detección de IFN-γ. La respuesta predominante del hospedador frente a Mycobacterium tuberculosis consiste en la liberación de IFN-γ por parte de las células T.

7 T-SPOT.TB Separación y contaje celular Determinación IFN-γ mediante ELISPOT

8 T-SPOT.TB CONTROL NEGATIVO CONTROL POSITIVO RESULTADO NEGATIVO RESULTADO POSITIVO

9 QuantiFERON-TB Gold (In Tube) Estimulación sangre total y liberación IFN-γ Determinación IFN-γ mediante EIA

10 Técnicas del IFN-γ Los tests basados en la detección de IFN-γ son más sensibles que la tuberculina en población inmunodeprimida. Inclusión de controles para detectar anergia. Tiene mejor especificidad que la tuberculina en población vacunada y susceptibles de infección por micobacterias atípicas. No efecto booster. Evita visita de lectura. Confidencialidad. Lectura más objetiva.

11 PROPUESTA NORMATIVA SEPAR NEGATIVA TUBERCULINA POSITIVA RIESGO RIESGO RIESGO RIESGO INFECCIÓN INFECCIÓN INFECCIÓN INFECCIÓN BAJO ALTO BAJO ALTO INMUNODEPRIMIDOS BCG NEGATIVO IFN-γ POSITIVO NO INFECTADO INFECTADO No TIT TIT

12 MICROSCOPÍA

13 CULTIVO

14 IDENTIFICACIÓN GENÉTICA MICOBACTERIAS

15 IDENTIFICACIÓN GENÉTICA MICOBACTERIAS GenoType Mycobacterium CM/AS

16 IDENTIFICACIÓN GENÉTICA MICOBACTERIAS MTBC M. microti M.africanum I M. bovis BCG M. bovis M.africanum II ssp. bovis ssp. M.caprae GenoType MTBC

17 PRA La PCR-RFLP del gen hsp65 (PRA), es una técnica genotípica para la identificación rápida de especies de micobacterias. Se basa en la amplificación, mediante PCR del gen hsp65, seguido de una restricción con dos enzimas de restricción (BstEII y HaeIII).

18 0 1ml Cepa micobacteriana en 5ml de agua destilada ANTIBIOGRAMA (RADIOMÉTRICOS Y NO RADIOMÉTRICOS) Cuando crecimiento entre 300 i 500 GI 12B Crecimiento entre 500 i 900 GI 0 1ml 9 9ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml Control Strepto INH RIF ETB CPZA PZA 0 1ml Strepto 0 1ml INH 0 1ml RIF 0 1ml ETB 0 1ml RF 0 1ml PZA

19 Técnicas de Biología Molecular en el diagnóstico de la tuberculosis Más de 3500 publicaciones relacionadas con métodos moleculares comerciales en el diagnóstico de la tuberculosis. De los cuales en 500 se aportan datos en función de la baciloscopia y si las tuberculosis fueron clínicas o tenian confirmación microbiológica. Aprobadas para tuberculosis pulmonar: en ZN+: COBAS, AMTD2 en ZN-: AMTD2.

20 Técnicas biología molecular detección M. tuberculosis SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD Muestras respiratorias Muestras extra-respiratorias ZN positiva ZN negativa ZN positiva ZN negativa Sensibilidad (%) Especificidad (%)

21 Nuevas plataformas de amplificación aplicadas al diagnóstico molecular Detección, identificación y en algunos casos detección de resistencia en muestra directa. PCR e hibridación reversa. PCR real-time. Pirosecuenciación.

22 INNO-LiPA Mycobacteria v2 Estudiamos dos grupos de muestras: 46 muestras clínicas respiratorias ZN + 23 muestras clínicas respiratorias ZN - De las 46 muestras clínicas incluidas en el estudio en 43 casos se obtuvieron resultados concordantes. Sensibilidad 93.5%. Con respecto a las 23 muestras ZN negativas en ningún caso obtuvimos bandas de amplificación.

23 GenoType Mycobacteria Direct Weizenegger M et al. Sensibilidad total MTBC 82.5% (94.6% en ZN+ y 65.4% en ZN-) Franco-Álvarez et al. JCM Sensibilidad MTBC 92% (6/6 micobacterias atípicas)

24 PCR real-time RealArt M.tuberculosis RG PCR (Artus). Detección de todas las especies del complejo M.tuberculosis. 90% resultados positivos en ZN positivas. 70% resultados positivos en ZN negativas. La sensibilidad de las técnicas se ve mejorada por la utilización de métodos de extracción automatizados. Algún resultado de difícil interpretación.

25 Interpretación resultados en función sospecha clínica de riesgo de TB PACIENTES CON ALTA SOSPECHA DE TB (ZN +) Resultado POSITIVO: PRUEBA CONFIRMATORIA (VPP ) Resultado NEGATIVO: NO EXCLUYE DIAGNÓSTICO TB (VPN ) PACIENTES CON BAJA SOSPECHA DE TB (ZN -) Resultado POSITIVO: ESCASO VALOR DIAGNÓSTICO (VPP ) Resultado NEGATIVO: EXCLUYE DIAGNÓSTICO DE TB (VPN )

26 Papel del grado de sospecha clínica en la evaluación de las técnicas moleculares La evaluación previa del grado de riesgo clínico de TB es de gran importancia en los valores predictivos de las técnicas. Catanzaro A. et al JAMA 2000

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28 PCR real-time Plataformas de amplificación basadas en PCR real-time para la detección de las principales mutaciones para isoniazida y rifampicina. Espasa M et al JAC Sensibilidad: 99% en ZN+ y 35% en ZN- Sensibilidad global detectando mutaciones: 74.3%

29 INNO-LiPA Rif.TB Traore H et al JCM % sensibilidad (92% en ZN+ y 94.5% en ZN-) 99.6% concordancia en detección resistencia. Tortoli E y Marcelli F. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis % sensibilidad (91.9% en ZN+ y 46.74% en ZN-) 99.1% concordancia en detección resistencia.

30 GenoType MTBDR plus

31 Pirosecuenciación Nuevo método de secuenciación que se basa en la detección del pirofosfato (PPi) que se libera durante la síntesis de DNA cada vez que se incorpora un nucleótido. Este pirofosfato entra en una cascada enzimática que como resultado genera luz. La luz generada es proporcional al número de nucleótidos incorporados.

32 PPi ATP

33 104 Detección resistencia a rifampicina GM Well A2 Entry: rpob His526 Sample: 33 Position 1: C/C (Passed), Position 2: A/A (Passed) C/ C A/ A E S C G T G A C G T A G T C 5 10 GM Well A3 Entry: rpob His526 Sample: 35 Position 1: T/T (Passed), Position 2: A/A (Passed) T/ T A/ A E S C G T G A C G T A G T C 5 10

34 Detección resistencia a isoniazida

35 Métodos de tipaje molecular RFLP (IS6110) Spoligotyping MIRU-VNTR

36 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Secuencia de inserción, presente exclusivamente en el complejo M.tuberculosis: IS6110 La variabilidad tanto en el nº de copias como en la localización en el cromosoma genera un elevado polimorfismo entre cepas de diferentes orígenes. Ventajas: Elevado poder discriminativo. Desventajas: Lento, laborioso y complejo.

37 Pvu II Electroforesis Extracción y restricción Revelado radiográfico Hibridación Transferencia

38 Spacer oligonucleotype typing (Spoligotyping) Las secuencias DR (direct repeat), son secuencias repetidas de 36 pb que se encuentran en único locus del cromosoma del complejo M. tuberculosis, separadas por secuencias de 34 a 41 pb. La ausencia o presencia de los diferentes DR permite un patrón específico para cada cepa. Ventajas: Poco DNA, fácil interpretación. Desventajas: Menor poder discriminativo que RFLP.

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40 MIRU-VNTR Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit Variable Number Tandem Repeat Detección del número de veces que se repiten de forma contigua determinadas secuencias en el genoma. MIRU-VNTR es más discriminativo que el spoligotyping y similar a la RFLP- IS6110. Ventajas: rápido, simple y automatizable. Desventajas: Aún en estudio.

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42 IS6110: Fast ligation-mediated PCR (Flip); Ligation-mediated PCR (LM-PCR) VNTR typing: QUB-VNTR; 12 MIRU VNTR. DR locus: Spoligotyping de segunda generación FAFLP typing: diferentes enzimas de restriccion. PCR de locus muy conservados: Rv3479, Rv0648, rpfa y lppa

43 (QUB: Queens University of Belfast)

44 Fluorescent Amplified Fragment Lenght Polymorphism Method (FAFLP) Nuevos enzimas de restricción: BamHI y MspI. En la PCR los primers están marcados con fluorescencia. Los productos de PCR se separan por electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida y detectado por un secuenciador automático.

45 Repetitive sequence based PCR (rep-pcr) 1. rep-pcr primers bind to many specific repetitive sequences interspersed throughout the genome 2. Multiple fragments of various lengths are amplified rep-pcr primers genome 3. Fragments can be separated by mass and charge via electrophoresis (+) (-) 4. A unique rep-pcr DNA fingerprint profile is created with multiple bands of varying intensity Size of amplified fragments (time) Cangelosi G et al. Concordancia del 97% con RFLP

46 Conclusiones El futuro del diagnóstico de la tuberculosis pasa por la aplicación de nuevas técnicas moleculares. Idealmente: técnicas útiles en la detección de M.tuberculosis, de las principales micobacterias no tuberculosas y que nos den una información sobre el patrón de resistencias. La incorporación a la práctica clínica de las nuevas técnicas in vitro basadas en la detección de IFN-gamma contribuirá a un mejor control de la tuberculosis.

47 Conclusiones Las técnicas de epidemiología molecular clásicas son extraordinariamente robustas y continuarán siendo consideradas de referencia en el futuro. Sin embargo, se introducirán nuevas técnicas que sean muy reproducibles, con un alto grado de discriminación, preferiblemente automatizadas, y basadas en técnicas PCR, que nos permitan establecer de forma rápida la clonalidad de las cepas.