CARACTERIZAR LA ACTIVIDAD FOSFATASA ENDÓGENA DE MARISCOS Y SU APLICABILIDAD COMO INDICADOR DE LA PRESENCIA DE VENENO DIARREICO DE LOS MARISCOS

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1 CARACTERIZAR LA ACTIVIDAD FOSFATASA ENDÓGENA DE MARISCOS Y SU APLICABILIDAD COMO INDICADOR DE LA PRESENCIA DE VENENO DIARREICO DE LOS MARISCOS José Córdova Fundación Ciencia para la Vida, Santiago, Chile INTRODUCCION Las Floraciones Algales Nocivas (FAN) comúnmente llamadas mareas rojas, son proliferaciones rápidas de microalgas, generalmente monoespecíficas, las cuales constituyen un problema para la salud humana, la acuicultura, los recursos pesqueros y las actividades de turismo (Clement y Lembeye, 1994). En Chile estos eventos están representados principalmente por 2 especies de dinoflagelados tóxicos: Alexandrium catenella (VPM) y Dinophysis acuta (VDM), los cuales son concentradas por otros moluscos marinos (transvectores) y las traspasan al hombre cuando éste los consume. Alexandrium catenella produce el veneno paralizante de los mariscos (VPM) cuya principal toxina es la saxitoxina que bloquea los canales de sodio dependientes de voltaje de las células nerviosas de mamíferos (Catteral, 1985) produciendo desde un adormecimiento en la boca hasta la muerte. Su presencia se ha detectado en países como Australia, China, España, y Estados Unidos. En Chile los primeros registros datan del año 1972 en la XII región y desde entonces se ha reportado en la XI región y en la zona de Chiloé. Dinophysis acuta produce toxinas que constituye el Veneno Diarreico de los Mariscos (VDM) y provocan diarreas en humanos luego de haber consumido mariscos contaminados. Yasumoto i col. (1979) fue el primero en describir este hecho, identificó Dinophysis fortii que era la fuente primaria de producción de VDM en mariscos de Japón. Después se han reportado otros eventos de VDM en otros países alrededor del mundo (Maestrini y col., 1998). El veneno diarreico de los mariscos está constituido por ácido okadaico (OA) y dinofisistoxina-1 (DTX-1) que son toxinas diarreicas, pero además son promotoras tumorales e inhiben las actividades fosfatasas. Estas toxinas se localizan principalmente en el hepatopáncreas de los mariscos. Cantidades ínfimas de VDM son suficientes para causar problemas, aunque la sensibilidad frente a las toxinas difiere notablemente de un individuo a otro. OBJETIVOS Evaluar presencia de toxinas en muestras de mariscos provenientes de la Xl región mediante métodos alternativos al bioensayo de ratón (CERAN). Analizar la actividad de la fosfatasa de las muestras de mariscos mediante geles FOS/SDS- PAGE para detectar la presencia de VDM. 1

2 Evaluar la presencia de VPM en los mariscos colectados mediante el ensayo de inhibición de la aglutinación. MATERIALES Y METODOS Electroforesis en geles de Acrilamida Los geles se obtuvieron siguiendo el protocolo descrito por Laemmli, Una vez preparado el gel, el tejido de hepatopáncreas se resuspendió en una solución fría salina de fosfato (PBS: KCl 3 mm; KH 2 PO 4 monobásico 15 mm; Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O 8mM; ph 7,2) y se mantuvieron en hielo durante todo el proceso. Posteriormente, las muestras de moluscos se centrifugaron a rpm por 2 minutos (Microcentrífuga Modelo 5415, Eppendorf, Alemania) y se determinó la concentración de proteínas solubles totales mediante el método de Bradford, Determinación de la Concentración de las Proteínas Solubles Totales Para determinar la concentración de las proteínas solubles totales se utilizó un Kit comercial BIO-RAD y una placa con pocillos Inmulón 3. El pocillo que correspondió al blanco se colocó 5 µl de solución PBS y en los pocillos restantes se colocó 5 µl de la muestra respectiva (suspención de la muestra de tejido). A cada uno de los pocillos se le agregó 25 µl de reactivo A y 200 µl de reactivo B, luego la placa se incubó en una estufa (modelo ULE , Memmert, Alemania) a 37 ºC por 15 minutos y a continuación se leyó la placa en un lector de ELISA (modelo El x 800 Universal Microplate Reader, BIO-TEK instrumento, INC) a 630 nm. Una vez obtenido los datos de la lectura se realizó una regresión lineal para saber qué volúmen de muestra contenía la concentración de proteína deseada. Una vez conocida la cantidad se colocó en cada tubo el Buffer de Muestra en condiciones no denaturantes ( M Tris-HCl ph 6.8; 10% glicerol, 2,3% dodecil sulfato de sodio (SDS), azul de bromofenol al % (p/v) y que corresponde a la mitad del total de la muestra, esta mezcla se homogeneizó por un minuto. Las muestras obtenidas se analizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% de 10 bolsillos y 1,0 mm de espesor. Los geles se ubicaron en una cámara electroforética (Mini Protean 3 Cell, BIO-RAD, USA) con amortiguador de corrida (Tris M HCl ph 8,8; M glicina; M SDS) y se agitó suavemente para eliminar las burbujas que pudieran interferir en la corrida. Finalmente se colocó en el primer carril 10 µl de estándar de proteínas (Marcador preteñido de proteína, rango entre 20 y 120 KDa, Winkler Ltda.) y 75 µg de proteína total en los bolsillos correspondientes. La cámara se conectó a una fuente poder (Fuente Poder Modelo 4001, Life Technology) y la electroforesis se realizó a 60 voltios los primeros 30 minutos hasta que el azul de bromofenol atravesó el gel concentrador y a 80 voltios hasta que el colorante terminó de migrar a través del gel separador. 2

3 Tinción de Geles de Poliacrilamida Tinción para detectar actividad fosfatasa de moluscos (VDM) Obtenido el gel de la electroforesis, éste se incubó con agua suave dos veces por 10 minutos cada uno y manteniéndolos en agitación, luego el gel se traspasó a una placa petri con 15 ml de solución de fosfatasa alcalina (Tampón Fal; Tris 100 mm HCl ph 9.5; 5mM MgCl 2 ; 100mM NaCl) y se deja agitando hasta el otro día con la finalidad de que quede totalmente limpio de detergentes. El tampón FAL se cambió por 15 ml de tampón fresco y a continuación se agregó 40 µl de BCIP (5-Bromo 4- Cloro 3-indolil fosfato, sal disódica, Sigma; disuelto en dimetilformamida al 100%) y 80 µl de NBT (dimetilformaldehído al 100% más azul nitro tetrazolium 3,9 x 10-4 M, Sigma). Esta mezcla se homogeneizó por unos minutos y se incubó a oscuridad hasta que las bandas se visualizaron y que correspondieron a la actividad fosfatásica endógena del marisco. Posteriormente el revelado se detuvo con agua destilada, se procedió a digitalizar y secar al vacío. Preparación de las muestras para test de aglutinación (VDM y VPM). El tejido proveniente del hepatopáncreas de cada marisco se homogeneizó individualmente con 0,5 ml de Metanol al 90% para el caso de VDM. Posteriormente las muestras se centrifugaron por 10 minuto a r.p.m. y el sobrenadante fue separado en un tubo nuevo para su posterior análisis. Para el caso de VPM, el tejido de hepatopáncreas de cada marisco se homogeneizó individualmente con 0,5 ml de ácido acético al 0,1 M (modificado: HCl 0,1 M). Las muestras se calentaron en baño maría por 5 minutos, luego éstas se centrifugaron por 10 minutos a r.p.m y por ende se recogió el sobrenadante. Detección de toxinas empleando el test de aglutinación: Para el análisis de las muestras se utilizó un ensayo de detección de las toxinas paralizantes y diarreicas, el cual fue desarrollado en el laboratorio de la Fundación Ciencia para la Vida, dicho ensayo está basado en la aglutinación de látex por anticuerpos policlonales (anti-stx y anti- ácido okadaico respectivamente) que en su superficie tienen acopladas las toxinas. 1.- Si la muestra a analizar no contiene toxina, entonces los sitios de unión de los anticuerpos permanecerán libres, por lo que al agregar el látex acoplado a la toxina, los anticuerpos son capaces de reconocer a ésta última, uniéndose y formando la malla de aglutinación. 2.- Si el extracto contiene toxina, entonces los sitios de unión de los anticuerpos se unirán a la toxina libre. Posteriormente al incubar los anticuerpos con el látex que contiene en la superficie la toxina, éstos no podrán unirse y no se formará la malla de aglutinación. RESULTADOS Los resultados obtenidos muestran diferencias significativas al comparar los resultados del bioensayo de ratón con respecto al método usado para detectar presencia de toxinas marinas VPM a través del método FOS/SDS-PAGE. 3

4 Analizando la inhibición de la actividad enzimática de la fosfatasa, a través de SDS- PAGE para determinar la presencia de VDM, algunos de los ejemplares de las estaciones 51, 44, 52, 66 (segunda parte) se detectó la presencia de VDM lo cual no coincide del todo con el ensayo biológico(figura 1A, 1B, 1C, 1D): También se detectó ausencia de VDM en algunos ejemplares de las estaciones Puerto Ballena, Estero Dublé Norte, Tic Toc, 62, 51 y 76 (Figura 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F), que a diferencia del ensayo biológico éste veneno pudo ser detectado: El ensayo de aglutinación para la detección de las toxinas paralizantes mostraron resultados significativos en estaciones 51, 54 (primera parte) y bahía Tic Toc (segunda parte) mostrándo presencia de VPM a diferencia del ensayo biológico de ratón cuyo VPM no fue detectado (Tabla I): Por otro lado, en las estaciones 74, 44, 66, 62, 51,76, Estero Dublé Norte y Puerto Ballena se encontró en algunos ejemplares ausencia de VPM a diferencia del ensayo biológico de ratón que la totalidad de las muestras analizadas presentó VPM (tabla II): Se detectó presencia de VDM en electroforésis SDS-PAGE en las estaciones 51, 44, 52, 66. Cabe mencionar que alguna de estas estaciones no pudieron ser comparadas con el ensayo biológico de ratón, puesto que no fueron muestreadas (Tabla III): Se encontraron algunos ejemplares con ausencia de VDM lo cual no coincide del todo con el ensayo biológico de ratón (Tabla IV): El Veneno Amnésico en Mariscos (VAM) fue detectado solamente por HPLC, no encontrándose éste en ninguna estación monitoreada. DISCUSION La actividad de la proteína fosfatasa de diferentes especies de mariscos: almeja (Venus antiqua), chorito (Mytilus chilensis), culengue (Gari solida) y cholgas (Aulacomya atter) se vieron significativamente inhibidas en varias estaciones muestreadas especialmente en el mes de Noviembre, esto se debe a que el método empleado tiene un alto grado de sensibilidad. Por otro lado, esta inhibición se puede deber a que la mayoría de éstos organismos mantuvieron retenida la toxina desde el primer muestreo que fue el mes de Julio, no obstante esta inhibición se puede ser detectada con pequeñas cantidades de proteína (25 µg) contenidas en un extracto acuoso de tejido digestivo. Por otro lado, también hubieron unidades de mariscos en la cuál tuvieron una baja toxicidad o ausencia completa de veneno esto se ve atribuído a la posibilidad que las toxinas no fueron retenidas en el tejido del marisco, o bien las células fueron evacuadas rápidamente por las heces y por último puede que exista un bajo número de moléculas de proteína fosfatasa que actúen como aceptores de VDM. Se encontraron diferencias significativas respecto al test de aglutinación y el ensayo biológico de ratón, lo cual indica que este Test detecta en forma simultánea VPM y VDM, y por ende, bajas cantidades de saxitoxina y ácido okadaico. Además cabe destacar que en el ensayo biológico de ratón requiere de a lo menos 100 a 150 gr de carne lo que a diferencia de este ensayo 4

5 que requiere solamente una muestra individual, no obstante, es más preciso y requiere sólo un pequeño volúmen de tejido (> 0,008 gr) para detectar presencia de estos venenos. Por otro lado, el bioensayo se requiere de un stock de ratones para los análisis además de tiempo para ser detectado a diferencia del test que solo requiere de unos segundos y a temperatura ambiente para determinar si el organismo está contaminado o no. 5

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