TOPICOS DE GENETICA TOXICOLOGICA. Single Cell Gel Electrophoresis: Ensayo del Cometa

Transcripción

1 TOPICOS DE GENETICA TOXICOLOGICA Single Cell Gel Electrophoresis: Ensayo del Cometa

2 ENSAYO COMETA Single Cell Gel Electrophoresis

3 FUNDAMENTOS DE LA TECNICA Las células de interés, embebidas en un gel de agarosa y colocadas sobre un portaobjetos, son lisadas por medio de detergentes y altas concentraciones de sal.

4 FUNDAMENTOS DE LA TECNICA El ADN liberado será sometido a la acción de un campo eléctrico a ph alcalino (Singh y col, 1988).

5 FUNDAMENTOS DE LA TECNICA Si existe daño al ADN, se formarán pequeños fragmentos que al ser sometidos a una corriente eléctrica, tendrán la capacidad de migrar hacia el ánodo.

6 FUNDAMENTOS DE LA TECNICA Al mirar al microscopio las células tienen apariencia de cometas con una cabeza en la región nuclear y una cola que contiene los fragmentos o roturas que migran en dirección del ánodo.

7 DETECTA Roturas de ADN simple cadena. Roturas de ADN doble cadena. Sitios Alcali lábiles. ADN-ADN y ADN-prot cross linking. Roturas simples asociadas con mecanismos de reparación

8 VENTAJAS Permite obtener información del daño inducido a células aisladas. No es necesario trabajar con células en proliferación. Fácil aplicación (En virtualmente cualquier tipo celular). Puede aplicarse en estudios tanto in vitro como in vivo. Alta sensibilidad (Detecta muy bajos niveles de daño al ADN). Se requieren bajas cantidades de células (< ). Relativamente poco tiempo para la obtención de resultados.

9 CRECIMIENTO EN SU APLICACION Curso Biomarcadores. ALAMCTA 2005.

10 TÉCNICA Curso Biomarcadores. ALAMCTA 2005.

11 Células en Estudio Células de Sangre Periférica: in vivo e in vitro Células provenientes de cultivos celulares: in vitro

12 Células en Estudio Células obtenidas de Tejidos: in vivo

13 VIABILIDAD CELULAR Siempre es necesario evaluar la citotoxicidad Coloración de Exclusión: Azul de Tripan Células viables: Incoloras Células muertas: Azules

14 VIABILIDAD CELULAR Siempre es necesario evaluar la citotoxicidad Viabilidad mediada por fluorocromos: Carboxi fluoresceína diacetato/ Bromuro de Etidio, Células viables: Verdes Células muertas: Rojas Células comprometidas: Citoplasma verde y núcleo rojo.

15 VIABILIDAD CELULAR Siempre es necesario evaluar la citotoxicidad Viabilidad mediada por fluorocromos: Naranja de Acridina/ Bromuro de Etidio, Células viables: Verdes Células muertas: Naranjas Células comprometidas: Núcleos verdes con vacuolas (VA) Núcleos naranjas fragmentados (NVA).

16 MONTAJE DE LAS CÉLULAS Las células en estudio, luego del proceso de aislamiento, son embebidas en gel y montadas sobre portaobjetos Agarosa Bajo Punto de Fusión 0,5% Agarosa Bajo P.F. 0,5% conteniendo las células en estudio Agarosa Normal Punto de Fusión 0,5% Portaobjeto esmerilado limpio

17 MONTAJE DE LAS CÉLULAS Consideraciones: Controlar la Temperatura del gel de Bajo Punto de Fusión para evitar daño a las células. Los portaobjetos con la primer capa de agarosa puede deshidratarse a 40ºC por 20 min y almacenarse en deshidratador.

18 MONTAJE DE LAS CÉLULAS Realizar los slides siempre por duplicado

19 LISIS CELULAR Los portaobjetos preparados son colocados en la solución de lisis como mínimo por una hora o hasta una semana a 4ºC.

20 LISIS CELULAR Recomendaciones: Preparar la solución de lisis en el día y refrigerar, debe estar a 4ºC cuando se colocan los portaobjetos. Mantener al resguardo de la luz, desde este paso hasta la neutralización.

21 UNWINDING ELECTROFORESIS Unwinding o desenrrollamiento de las hebras de ADN en ph alcalino (ph>13), se realiza en el mismo tanque de electroforesis. La corrida electroforética: a 300 mamp- 0,7 a 1,2 v/cm. El tiempo de Unwinding y de Electroforesis son críticos y dependen de cada especie celular.

22 UNWINDING ELECTROFORESIS El volumen de la solución de electroforesis permite ajustar la resistencia del circuito, a mayor volumen mayor será el consumo en mamp. y viceversa. La solución de electroforesis debe estar a 4ºC, preparar en el día con agua bidestilada fría.

23 UNWINDING ELECTROFORESIS Colocar la cuba sobre hielo. Controlar la horizontalidad de la cuba. Trabajar en oscuridad, para evitar el daño a los nucleoides.

24 NEUTRALIZACIÓN El alcali en los geles debe ser neutralizado con buffer trizma ph:7.5. Se realizan 3 lavados de 5 minutos cada uno.

25 CONSERVACIÓN Los slides se sumergen en alcohol etílico por cinco minutos, luego terminar de secar al aire Para deshidratar el agar y evitar que los fragmentos de ADN se difundan en el gel.

26 CONSERVACIÓN Los slides deshidratados pueden ser conservados por varios meses. Se pueden rehidratar en cámara húmeda para mejorar su visualización

27 TINCIÓN Las técnicas de tinción tienen alta afinidad al ADN..

28 . TINCIÓN Bromuro de Etidio y DAPI son las más comunes utilizando microscopía. Otras: Propidium Iodide, YOYO, SybrGold, SybrGreen. Puede utilizarse microscopía convencional con Nitrato de Plata. Utilizaremos 50 µl de Bromuro de Etidio (2µg/ml) con lámpara de fluorescencia DAPI Sybr Green Sybr Gold Bromuro de Etidio Propidium Iodide YOYO Nitrato de Plata

29 MICROSCOPIA Conteo visual Captación de Imágenes y utilización de Software

30 Siendo n la cantidad de células dañadas que se registraron para cada una de las cuatro categorías. ANALISIS DE RESULTADOS CONTEO VISUAL Se deben contar 50 cometas/vidrio. 2 vidrios/muestra. Total: 100 células por muestra. Estableciendo Categorias de Daño: 1:< 20 micras 2: micras 3: micras 4: > 80 micras ID= n 1 +2 n n 3 +4 n 4

31 ANALISIS POR SOFTWARE

32 SOFTWARE CASP Se puede obtener gratuitamente de Internet Permite obtener Longitud del Cometa, Longitud de la Cola y de la Cabeza, ADN en la cabeza, ADN en la cola y Tail Moment.

33 CONTROLES Incorporar controles positivos y negativos en cada corrida. El control positivo utilizado más frecuentemente es Peróxido de Hidrógeno 50 µmolar. Es altamente oxidante e induce en el ADN roturas doble, simple cadena y sitios álcali lábiles. El control negativo, células no expuestas al mutágeno en evaluación, debemos encontrar migración en alguna célula. Indide Daño Puesta a punto E. Cometa 22/4/ H2O2 (µm)

34 ANALISIS VISUAL VERSUS SOFTWARE Mutagenesis 2008

35 DETECCION DE TIPOS DE DAÑO ESPECÍFICOS VERSION NEUTRA ph 7-8 Ruptura de Doble Cadena Cross-Links VERSION ALCALINA ph>13 Ruptura de Doble Cadena Cross-Links Ruptura de Cadena Simple Sitios de Reparación por escision Sitios Alcali Lábiles

36 DIFERENCIAR ADN-ADN Y ADN-PROTEÍNAS CROSS LINK Se utiliza proteinasa K luego de la lisis. Los sitios con uniones ADN proteínas generaran nuevos fragmentos. La diferencia de migración entre ambas corridas puede correlacionarse con la presencia de ADN-proteínas cross link.

37 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DEL ENSAYO Las endonucleasas incrementan la sensibilidad y especificidad porque reconocen daños en bases particulares y crean roturas adicionales. FPG: formamidopypiridine DNA-Glycosylase. Específica para purinas oxidadas (incluyendo 8-oxo-Gua, FaPyAde) Endo III: Endonuclease III. Reconoce pirimidinas oxidadas (incluyendo tiamina glicol y uracil glicol).

38 ENZIMAS DE REPARACIÓN ESPECÍFICAS Incubar a 37 ºC min (Humedad) Luego de la lisis Lavado con Buffer (oscuridad) Agregar Enzima diluida Agregar buffer de la Enzima Realizar Unwinding Electroforesis Cálculos: Diferencia Con y Sin enzima

39 IDENTIFICAR DÍMEROS DE PIRIDINA Las células se incuban con Endonucleasa III despues de la lisis. La enzima reconoce los dimeros, los corta y se generan nuevos fragmentos que aumentan la migración. La diferencia entre la migración sin enzima y con enzima, se correlaciona con la cantidad neta de daño al ADN debida a los sitios sensibles a la enzima.

40 IDENTIFICAR PURINAS OXIDADAS Se incuban las células con FPG (Formamido-pirimidina-glicosilasa) después de la lisis Indentifica 8-oxometil guanosina, detecta daño oxidativo al ADN los corta y aumenta la migración. Por diferencia entre la migración sin enzima y con enzima, se da la cantidad neta de daño al ADN debida a los sitios sensibles a la enzima.

41 EVALUAR MECANISMOS DE REPARACIÓN IN VITRO Se exponen las células en estudio a un conocido mutágeno (radiación o Peróxido de Hidrogeno) una concentración determinada no citotóxica. Se incuban las células en un medio óptimo, RPMI 1640 con Suero fetal bovino al 10% durante 30 minutos o tiempos crecientes (Cinética de Reparación). Se realiza el ensayo y se compara con los valores obtenidos antes del tratamiento. Permite evaluar la capacidad de reparación del daño generado in vitro en una determinada especie celular.

42 Sensibilidad: pueden observarse desde unas cientos de roturas hasta varias miles. Pero solo pueden ser identificadas cuando el ensayo está bien calibrado.

43 Recomendaciones Prácticas Electroforesis:es importante tener en cuenta que deberíamos estar más preocupados por el voltaje perdido de carga a través del gel que con el voltaje o corriente total. La forma en que se contabilizan los cometas no es crítico: visual o basado en análisis de imágenes por software dan resultados comparables.

44 Recomendaciones Prácticas Es un ensayo muy versátil y adaptable, capaz de dar información sobre los diferentes tipos de daños al ADN presentes en una célula, y también sobre la capacidad celular para reparar los daños. Su aplicación en las pruebas de genotoxicidad de productos químicos y control biológico humano parece aumentar con el inminente desarrollo de métodos de alto rendimiento y de análisis totalmente automatizados.

45 Los estudios de biomonitoreo (observacional y no experimental), son vulnerables a factores de confusión y biases.

46 Factores decisivos en cualquier análisis estadístico: La elección de una medida representativa de la distribución del cometa en la muestra celular Las estimaciones de la variabilidad inter-experimental y la identificación de la magnitud de los efectos que podrían ser considerados biológicamente importantes. Potencia y tamaño de la muestra, los cálculos se pueden utilizar en conjunción con esta información para determinar el tamaño óptimo experimental. Se recomienda el uso de Estadística Multivariada. Combinar los resultados de los análisis estadísticos con otro tipo de información para facilitar la interpretación. Estudios de validación para el ensayo incluyen la determinación de niveles aceptables de intra e inter laboratorios y la repetibilidad y reproducibilidad, criterios para dicotomización de resultados positivos o negativos.

47 Cátedra de Toxicología, Farmacología y Bioquímica Legal. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe, Argentina. CIGETOX - Citogenética Humana y Genética Toxicológica - Departamento Bioquímica Clínica - INFIBIOC, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

48 Muchas Gracias