PROTOCOLO DE MICROALGAS PARA LA PRODUCIÓN DE ALIMENTO VIVO EN LAS INSTALACIONES DEL CRIP, MANZANILLO COLIMA

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2 CONTENIDO INTRODUCCIÓN... Error! Marcador no definido. OBJETIVOS... 4 PRODUCCION DE MICROALGAS CEPAS DE MICROALGAS MATERIAL Y EQUIPO DE TRABAJO CONDICIONES DE CULTIVO Y TRATAMIENTO DE AGUA CINETICA DE CRECIMIENTO Y CUANTIFICACION DE MICROALGAS CULTIVO SEMICONTINUO DE MICROALGAS CONTAMINACION PROCESOS DE DESINSENFECCION PARA LA SALA DE PRODUCCION D ESINFECCION DE AGUA DE MAR PARA CULTIVOS ALGALES D ESINFECCION DEL SUELO Y EXTERIORES DEL TANQUE DE CULTIVO D ESINFECCION DEL CALZADO D ESINFECCION DE MANOS Y MATERIAL CON ALCOHOL D ESINFECCION DEL MATERIAL CON BAÑO DE CLORO D ESINFECCION DEL MATERIAL CON BAÑO DE ACIDO CLORHIDRICO E STERILIZACION DE MATERIAL Y MEDIO DE CULTIVO EN AUTOCLAVE PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO PARA MICROALGAS ANEXO 1: BITACORA DE REGISTRO DIARIO PARA EL AREA DE MICROALGAS ANEXO 2: BITACORA DE UTILIZACION DE AUTOCLAVE ANEXO 3: BITACORA DE UTILIZACION DEL MICROSCOPIO OPTICO ANEXO 4: BITACORA DE UTILIZACION DE LUPA BINOCULAR ANEXO 5: BITACORA DE UTILIZACION DE BALANZA DE PRECISION ANEXO 6: BITACORA DE SISTEMA DE FILTRACION E IRRADIACION DE AGUA MARINA

3 IMPLEMENTACIÓN DE LA TECNOLOGÍA PARA LA PRODUCCIÓN DE ALIMENTO VIVO (MICROALGAS) EN LAS INSTALACIONES DEL CRIP MANZANILLO INTRODUCCIÓN La acuicultura es el cultivo controlado o semicontrolado de organismos acuáticos para fines comerciales, cuyo motivo principal es satisfacer la demanda de alimentos generada por la población. Datos de la FAO indican que la acuicultura mundial está creciendo alrededor del 7.2% anual, con tendencias hacia la intensificación de los sistemas de cultivo y el control de los aspectos nutricionales. En este sentido, las microalgas tienen un valor muy importante, ya que, aproximadamente el 90% del total de la producción por acuicultura, se emplean como alimento en al menos una etapa de desarrollo de los organismos cultivados (Duerr et al., 1998), ya sea directamente en moluscos, larvas de crustáceos y peces o bien en organismos intermediarios, como rotíferos, copépodos o artemia. Es por eso que en el CRIP Manzanillo, el cultivo de las microalgas tienen un papel trascendental y debe emplearse un sistema de cultivo especializado que sea parte integral y que resulte rentable y suministre la biomasa necesaria durante el tiempo en que transcurra el larvicultivo. Por otro lado cabe mencionar que aun cuando las microalgas tienen características deseables para la acuicultura, no todas son adecuadas como alimento para los organismos cultivados y deben tomarse en cuenta varias consideraciones si se desea llevar a cabo con éxito el cultivo larval de peces o de los organismos que se cultivan como alimento para estos estadios larvales. En primer lugar, las microalgas no deben ser tóxicas, deben tener el tamaño adecuado para ser ingeridas, una pared digerible y además, deben tener una composición bioquímica adecuada. Otros criterios están relacionados con la fisiología de las microalgas e incluyen la resistencia a la fotoinhibición, la respuesta a las fluctuaciones diurnas, la sensibilidad a concentraciones de oxígeno y el estrés osmótico, ya que es común que en los sistemas de cultivo masivo realizados al exterior, se presenten condiciones limitantes que repercuten en el volumen de producción y por lo tanto en la rentabilidad (Abalde et al., 1995). Entre las especies de microalgas que se usan comúnmente en la alimentación de organismos acuáticos y utilizadas para este proyecto se encuentran Tetraselmis suecica, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chrorella sp.y Thalasopsidia pseudonana. El objetivo de este protocolo es dar a conocer la metodología aplicada para la producción de microalgas para alimento de peces y rotíferos. 3

4 OBJETIVOS El objetivo principal se fundamenta en la implementación de la tecnología para la producción masiva de microalgas (fitoplancton) para el cultivo de larvas de peces, llevada a cabo en las instalaciones del Centro Regional de Investigaciones Pesqueras (CRIP) de Manzanillo; ubicada en Playa Ventanas s/n. Carretera Manzanillo a Campos, Manzanillo. Optimización de los sistemas de cultivo de fitoplancton, para alcanzar niveles masivos de producción continua. Determinación de una concentración adecuada de nutrientes y se estandarizó un tiempo de cosecha óptimo para el cultivo con el objeto de lograr una producción alta y sostenida a largo plazo. Conocer y controlar los parámetros ambientales óptimos para los cultivos, ya que no sólo permiten la supervivencia y desarrollo de los organismos en cultivo, sino además factores como la temperatura y la salinidad regulan la concentración y calidad de nutrientes esenciales como son las vitaminas, los aminoácidos y los ácidos grasos. 1. CEPAS DE MICROALGAS PRODUCCIÓN DE MICROALGAS Las cepas de microalgas de las que disponemos se obtuvieron de colecciones establecidas de los Centros de Investigaciones Acuicolas de Tomatlán y La Paz. Tras previa aclimatación se realizaron diluciones seriadas en tubos de ensayo con el fin de aislar y limpiar la cepa y se procedió a desdoblarlas hasta alcanzar un volumen adecuado para la producción. Las cepas se mantienen en tubos de ensayo de 20 ml y además son sembradas en tubos de agar inclinado para su aislamiento. Estas acciones siempre se realizan de la forma más aséptica posible y con el uso de un mechero. Las microalgas que se usan para la producción en masa de rotíferos de calidad son: lsochrysis galbana, Tetraselmis suecica y Nannochloropsis oculata, debido a sus características nutricionales, compatibilidad con los cultivos de rotíferos, disponibilidad y por su fácil cultivo. Otras especies son mantenidas como cepas para posteriormente crear un banco de microalgas; éstas son: Chaetoceros calcitrans, Chlorella texcoco y Chlamydomonas coccoides. A continuación de describen brevemente cada una de estas especies de microalgas: 4

5 lsochrysis galbana Perteneciente al grupo de las Haptotitas. Isochrysis es una microalga que presenta células subesféricas a fusiformes, biflageladas, con dimensiones de 6 a 8 micras. Su órgano más importante es el haptonema circundado por pequeños relieves. Es un flagelado de color amarillo que habita en climas templados. Su crecimiento óptimo se encuentra a una temperatura que varía de ºC a una salinidad de o/oo y una iluminación de 4000 lux. Debido a su tamaño y a que es un flagelado desnudo es fácilmente digerible por los consumidores. Su alto valor nutritivo le sitúa entre las especies más importantes para alimentación de organismos filtradores marinos. Es destacable su alto contenido de ácido docosahexaenoico (DHA). Tetraselmis suecica Es una microalga verde unicelular y flagelada, de morfología comprimida elipsoidal y perteneciente a las Prasinophyceae. Esta especie presenta cuatro flagelos y mide de 7-9 micras de diámetro y de de largo y un color verde brillante. Es una especie eurihalina y posee una pared celular delgada formada principalmente de carbohidratos que la hace un poco más difícil de digerir que otras microalgas. Crece bien en el rango de temperatura de ºC, a ph de y salinidad de o/oo. Por ello es una especie de considerable potencial de cultivo a gran escala. Nannocchloropsis oculata Estos organismos pertenecientes a la clase Eustigmatophyceae presentan células esféricas de 2 a 4 micras. Presentan un color verde oscuro y el rango de temperaturas óptimas para su crecimiento es de 20 a 24 ºC. Esta especie ha sido ampliamente utilizada en la acuicultura aunque, en algunos casos, las características de su pared celular y su pequeño tamaño no la hacen viable para alimentar a algunos organismos filtradores debido a que son difíciles de digerir y sus nutrientes pueden no ser asimilados. Chaetoceros calcitrans Esta diatomea perteneciente a la clase Bacillariophyceae posee un tamaño de 3 a 7 micras y presenta cuatro largas espinas, que dificultan su digeribilidad. El rango de temperatura óptimo para su crecimiento es de 17 a 26 ºC Presenta un color café oscuro y se caracteriza por su alto contenido de ácido eicosapentaenoico (EPA) por lo que ha sido utilizada ampliamente en la acuicultura. Chlorella Texcoco (Chlorella sp.) Pertenece a un género de algas verdes unicelulares del filo Chlorophyta. Tiene forma esférica, midiendo de 2 a 10 micras de diámetro, y no posee flagelo. Chlorela se caracteriza por contener alta cantidad de los pigmentos verdes fotosintetizadores clorofila-a y -b en su cloroplasto. 5

6 Chlamydomonas coccoides Algas verdes unicelulares flageladas pertenecientes a la clase clorophyceae. Mide cerca de 10 micras de diámetro y presenta dos flagelos apicales. Poseen una pared celular gruesas que las hacen difícilmente digeribles. Isochysis galvana Teraselmis suecica Chaetoceros calcitrans Nannochloropsis oculata Clhorella sp. Chlamydomonas sp. Fig. 1. Especies de microalgas para producción 6

7 2. MATERIAL Y EQUIPO DE TRABAJO El equipo de trabajo a utilizar se basa principalmente en cumplir con los mínimos requisitos de limpieza y maniobrabilidad adecuados para lograr que el cultivo de microalgas se lleve a cabo. Podemos distinguir dos zonas en el laboratorio de producción, la zona de gabinete y la zona húmeda. La zona de gabinete es la que proporciona todo el material necesario para el cultivo. Consta de varias mesas de laboratorio donde se cuenta con la cristalería, como matraces, probetas, pipetas, tubos de ensayo, vasos de precipitados, frascos para diversas sustancias, un mechero, un microscopio óptico, una lupa y una balanza de precisión y por otro lado tenemos un refrigerador para mantenimiento de reactivos y un autoclave para esterilización. También se dispone de guantes de látex, batas de laboratorio, un kit de primeros auxilios y un lavador de ojos, así como bitácoras para registrar las actividades diarias y el uso de los aparatos. Además se cuenta con un almacén con reactivos, cubetas, bolsas de polietileno y productos de limpieza. La zona húmeda comprende aquella donde se llevan a cabo los cultivos. Está provista de una toma de agua de mar filtrada y otra de agua dulce, canal de desagüe, luz, aireación y temperatura controlada mediante un aparato de aire acondicionado. Debido a la importancia de esta área es recomendable tomar en cuenta normas y medidas de limpieza y desinfección así como llevar diariamente un control de la misma. Igualmente, debido a que el uso de la cristalería en el cultivo exige medidas de limpieza estrictas es necesario que antes de utilizarla se lave con un día de anticipación. En caso de cristalería tenemos bidones para baño con ácido clorhídrico al 2% y en el caso de plásticos, mangueras y demás materiales como cubetas o tinas, contamos con bidones de baño en cloro o preparamos cloro y limpiamos con éste y con una escobilla para remover los residuos, después aclaramos con abundante agua. Para la esterilización de agua de mar para cepario, medios de cultivo, vitaminas y otro material de cristal como pipetas, se recomienda el uso del autoclave (recordar poner tapón de algodón y/o cerrar con papel de plata el recipiente. 3. CONDICIONES DE CULTIVO Y TRATAMIENTO DEL AGUA Para conseguir un cultivo de microalgas en crecimiento activo es necesario un inóculo viable de tamaño mínimo, suministro de nutrientes y microelementos además de unas adecuadas condiciones químicas y físicas (Cañizares 1994). Cada especie y subespecie de microalga presenta sus características propias respecto a condiciones óptimas de crecimiento, así como productividades máximas alcanzadas en diferentes configuraciones de sistema de cultivo. Los factores influyentes son sin embargo comunes y se comentan a continuación. 7

8 Tanto la composición de las microalgas como su productividad están determinadas principalmente por la alcalinidad del medio, salinidad, temperatura, disponibilidad y concentración de nutrientes, intensidad y tipo de luz, densidad celular del cultivo y la contaminación o depredación por otros organismos. En nuestro caso, los cultivos son llevados a cabo en el laboratorio de cultivo de plancton del Centro Regional de Investigación Pesquera (CRIP) de Manzanillo, bajo condiciones controladas de: temperatura (20±2 C), luz artificial (iluminación continua las 24 horas) y limpieza. Como medio de cultivo se utiliza el fertilizante foliar Bayfolan forte y se añaden EDTA, vitaminas y para el caso de las diatomeas (Chaetoceros gracilis) añadimos silicatos. El tratamiento del agua de mar utilizada es de vital importancia para un óptimo desarrollo de los cultivos. Toda aquella agua utilizada para el cultivo de microalgas debe ser tratada para remover materia particulada, protozoarios, otras especies de microalgas, bacterias y ciertos metales disueltos. Por ello el agua marina que se recolecta es pasada por filtros de arena, de cartucho, ultravioleta, y para trabajar con cepas (volúmenes de ml) se autoclava 24 horas antes de realizar el cultivo. El agua utilizada en este nivel antes de ser autoclavada se baja en salinidad, esto es de 35 ups a 30 ups, añadiendo un 15% de agua destilada (el volumen a preparar se muestra en la tabla 1). Adicionalmente disponemos de filtros de mangas de 100 a 1 micra para asegurarnos de la total eliminación de cualquier microorganismo presente en el agua, así como cloro para una desinfección química en caso de grandes volúmenes de agua. VOLÚMEN A PREPARAR AGUA MARINA AGUA DESTILADA 20 ml 17 ml 3 ml 50 ml 42.5 ml 7.5 ml 250 ml ml 37.5 ml Tabla 1. Relación del volumen de agua marina y agua destilada 4. CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROALGAS En el cultivo de microalgas se hace necesario el conocimiento de la cinética de crecimiento de cada especie en cada determinado volumen. Independientemente de la especie y el volumen al que es cultivada se reconoce un patrón estándar de crecimiento indicado por las siguientes fases (Fogg y Thake 1987) figura 2: Lag o fase de adaptación: En donde no ocurre incremento en el número de células, pudiendo incluso llegar a disminuir en número con respecto al inoculo inicial. 8

9 Exponencia: Una vez adaptadas al medio de cultivo las microalgas comienzan a multiplicarse. Puesto que la división da lugar a nuevas células que son capaces de dividirse el aumento en número de microalgas se acelera continuamente en forma exponencial. De declinación: Conforme el cultivo va creciendo se da una disminución de nutrientes, cambios de ph y alteración de otros factores como consecuencia del incremento de la población de ahí que las microalgas disminuyan su tasa de división celular. Estacionaria: Cuando ya no se aprecia una división celular neta. El número de células alcanzado se mantiene constante por cierto periodo de tiempo debido al balance entre la natalidad y la mortalidad que presenta la población en cultivo. Es la fase en la que se debe de cosechar el cultivo. De muerte: Las células pueden durar en la fase anterior semanas e incluso meses aunque lo más normal es que comiencen a morir. Figura 2. Curva representativa de crecimiento de un cultivo de microalgas (modificado de Fogg y Thake, 1987) 1 Fase de adaptación, 2 Fase de crecimiento exponencial, 3 Fase de declinación de crecimiento, 4 Fase estacionaria y 5 Fase de muerte La medición de la biomasa es importante en el cultivo de microalgas para tener un recuento directo de la población celular y se puede hacer a través de diferentes métodos como son el conteo celular a través de una cámara de conteo, siendo éste uno de los 9

10 Métodos más comunes. Otra forma de contaje es por medición de la densidad óptica o absorbancia con ayuda de un espectrofotómetro que tiene la ventaja de poder leer varias muestras en un corto espacio de tiempo y es de alta precisión. Otro método es el de fluorometría, que mide la concentración de clorofilas a través de un fluorímetro pero la desventaja de este método radica en que la concentración de clorofila a no permanece constante durante toda la curva de crecimiento del alga por lo que los valores no son constantes. Por último, se puede hacer cuantificación de la biomasa a través del peso seco, método ampliamente utilizado. Por otro lado se deben de hacen muestreos de cada cultivo cada día para ver al microscopio las características de las células, tales como forma, tamaño, color y movilidad, para elegir la muestra que mejores condiciones presente; y cada dos días se procede a la cuantificación para ajustar los volúmenes de suministro debido al crecimiento del alga. En nuestro caso los conteos se llevan a cabo con un hemocitómetro tipo Neubauer y un microscopio óptico. La cámara de Neubauer (figura 3) puede tener una o dos cuadriculas, si empleamos las dos debemos hacer una media de los conteos. Figura 3. Cámara de Neubauer de cuadrícula simple Los pasos a seguir para la cuantificación de la muestra de cultivo puro algal son los siguientes: Agitar la muestra y tomar 1 ml. Adiccionarle una gota de lugol. Colocar el cubre objetos sobre la cuadricula de la cámara de Neubauer (fig, 3.A). Agitar de nuevo la muestra y tomar una gota para llenar la cámara de Neubauer, colocando la punta de la pipeta en la cada ranura ubicada entre el cubre objetos y la superficie de la cuadricula en ángulo de 45 y dejar reposar la muestra 3 minutos (fig 3.B). 10

11 Observar al Microscopio óptico a una magnificación de 10X o 20X y si son de pequeño tamaño (como la Nannochlorospsis sp.) se observan a 40X. Si la concentración es baja se contarán los cuadrantes 1, 2, 3 y 4 como se muestra en la figura 4 y se hará un promedio. Si la concentración celular es más alta se contará el área central y si es posible se contarán los 25 cuadros centrales. Pero dado un caso si la cantidad de células encontradas en los 25 cuadros es demasiada, se contaran 5 de los 25 cuadros aleatoriamente o se optara por contar los cuadros del extremo y el cuadro central como se muestra en la figura 5 y se multiplica por 5 para tener el total de células en el cuadrante entero. Hacerlo por triplicado (3 submuestras) y promediar. Anotar en bitácora (ANEXO 1) Fig 4. Cuadrantes 1, 2, 3 y 4 de la cámara Neubauer 11

12 Fig 5. Parte central de la cámara de Neubauer. En algunos casos la densidad de células es tan alta (mayor a 10 6 células por mililitro) se requieren de métodos de dilución para realizar el recuento por este método, en este caso, luego de sumar el resultado obtenido, se debe multiplicar por el factor de dilución. Lo habitual es diluirla 1:10 en cuyo caso el factor de dilución será 10. Cada cuadrícula tiene 1 mm de lado, por lo que tiene 1 mm2 de superficie. Esto hace que, con el cubre colocado, cada cuadrado grande represente un volumen de 0,1 mm3 lo que equivale a 0,1 ul, por lo que para saber cuántas células tenemos en un mililitro lo tenemos que multiplicar por Con esto solo nos falta hacer el cálculo de biomasa, que sería: C = N x 10 4 x FD Donde: C ( cel/ml) N (promedio de células contadas en un cuadrante) FD (factor de dilución) NOTA: los valores de densidad celular para cultivo intensivo dependen de la especie, pero en general deben de estar por encima de 1 x10 6 o 2 x10 6 de células por mililitro, pudiendo llegar hasta los 40 x10 6 c/ml en el caso de microalgas de tamaño reducido. 12

13 5. CULTIVO SEMICONTINUO DE MICROALGAS El tipo de cultivo utilizado en este nivel es el denominado semicontinuo que se caracteriza por la remoción regular de un volumen estándar de cultivo a ciertos intervalos de tiempo y el reemplazo de éste con medio nuevo para obtener el volumen original lo que se conoce como razón de dilución. Se prepara una línea de cultivos de inóculos a partir de las cepas de las especies requeridas. Las cepas las tenemos aisladas en tubos de ensayo y también cultivadas en matraces de 250 ml de medio de cultivo con 20 ml de microalgas. Se cultivan de 18 a 22 C y a una distancia de cm de las lámparas fluorescentes de 60 W, con dos lámparas por estante. Las cepas son desdobladas a diferentes intervalos de tiempo para refrescar el cultivo y sacar otra línea a partir de ellas. Las cepas en tubos de ensayo se cultivan cada mes o mes y medio y las de 250 ml se cultivaron durante períodos variables de tiempo antes de su uso. En el caso de las especies de diatomeas, que tienen intervalos generacionales cortos, este período dura entre 3 y 5 días y para la mayoría de las algas flageladas dura entre 7 y 14 días. En nuestro caso esperamos 5 días para diatomeas y 14 para flageladas. Cuando ya está listo para usar se replicó el inóculo utilizando técnicas estériles (Fig 6). Se transfieren 50 ml a un cultivo fresco de 250 ml - para mantener la línea de cultivo de inóculos. El resto se emplea como inóculo para llevarlo a 500 ml, y cada día se van haciendo desdobles a volúmenes mayores reemplazando con medio nuevo el volumen anterior. De 500 ml pasamos 100 ml a un nuevo inóculo de 500 ml y el resto lo trasferimos a un volumen de 1.5 L y de éste pasamos 300 ml a un nuevo inóculo de 1.5 L y el resto lo transferimos a un volumen de 4 L y de éste pasamos 1 L a un nuevo inóculo de 4 L y el resto lo transferimos a un volumen de 20 L. A modo de aclaración, los cultivos de entre 4 y 20 L de volumen se denominan cultivos a escala intermedia y se les adiciona aire por mínimo 20 minutos al día, divididos en dos tiempos de 10 minutos en la mañana y otros 10 en la tarde para oxigenar y homogeneizar la muestra, así como la temperatura. Para pasar a volúmenes mayores conviene incrementar el nivel de iluminación y de aireación. De 20 L se pasan 4 L a un nuevo inóculo de 20 L y el resto se trasfiere a bolsas de 140 L de volumen. De estas bolsas se abastece para el cultivo de rotíferos y el resto se pasa a un estanque para mesocosmos (cultivo conjunto de microalgas, rotíferos y bacterias). A partir de las bolsas de 20 L hasta las bolsas de 140 L consideraremos a estos cultivos como masivos. En cuanto a la salinidad, es aconsejable diluir el medio para cultivar especies de diatomeas hasta PSU (unidades prácticas de salinidad, equivalente a partes por mil) para así obtener los mejores índices de crecimiento. La mayoría de las especies de flagelados se cultivan mejor a aproximadamente 30 PSU. 13

14 Fig 6. Cultivo semicontinuo de microalgas a) cepa de 250 ml b) inóculo de 500 ml c) inónulo de 1.5L d) inóculo de 4L e) bolsas de 140 L Procedimiento para transferir cultivos de algas: (a) Limpie todas las superficies de la zona a trabajar con etanol 75%. (b) Coloque todos los matraces que se vayan a necesitar en la mesa; p. ej. todos los matraces desde los que se vaya a transferir (matraces de transferencia) y los matraces que contengan medio esterilizado a los que se vaya a transferir (matraces nuevos). (c) Prenda el mechero. (d) Quite el tapón del matraz de transferencia. Queme el cuello del matraz mientras lo gira lentamente a través de la llama. (e) Haga la misma operación con el matraz de transferencia. En un solo movimiento vierta un inóculo en el matraz nuevo. Nunca toque la porción del tapón insertada en el matraz. Una vez añadido el inóculo, sustituya el tapón en el matraz de transferencia. Queme lentamente el cuello del matraz nuevo antes de sustituir el tapón. (f) Sustituya el papel de plata que rodea el cuello del matraz nuevo. Con ayuda de un rotulador indeleble, etiquete el nuevo matraz indicando la especie de alga inoculada y la fecha de transferencia. (g) Repita el procedimiento con todos los matraces. Una vez finalizado, apague el mechero. (h) Retire todos los matraces nuevos y colóquelos en la incubadora de algas. (A partir de Bourne, Hodgson y Whyte, 1989) 14

15 6. CONTAMINACIÓN La contaminación de los cultivos de microalgas puede ser biológica, química o física que puede afectar de manera particular o ser una combinación de ellas. Indicadores de contaminación química: Existen diversos patrones indicativos de este tipo de contaminación: Si el cultivo se ha caído (disminución del número de células) recién sembrada la microalga, conservando su color natural, el problema podría deberse a la composición del agua, poca circulación o cambio repentino de temperatura En este caso las células están vivas y deben reponerse incrementando la agitación. Cuando el cultivo se toma blanco dentro de las 24 h de sembrado probablemente se debe al cloro residual y otros químicos disueltos en el agua. Si el cultivo conserva un color claro después de 3 ó 4 días observando poco crecimiento se puede deber a que la fuente de luz es poca o existe un desbalance en los nutrientes. Cultivos viejos de 15 o más días de cultivo que inician una deficiencia en nutrientes generalmente se toman turbios y algunos otros levemente claros. Los esfuerzos por recobrar estos cultivos ya carentes de nutrientes son inútiles. Indicadores de contaminación biológica: Los tipos más comunes de contaminación biológica son excesivos niveles de bacterias otras microalgas protozoarios o macroalgas Si un cultivo después de 3 o 7 días cambia de color y eventualmente se aclara la causa más común se debe considerar provocada por protozoarios. El excesivo crecimiento de bacterias se manifiesta como agua turbia, bajo crecimiento y colapso del cultivo. Probablemente esto se debe a una mala manipulación de los cultivos, fallo en el tratamiento del agua o por cambios en los parámetros físicos como son temperatura, ph o salinidad (contaminación física). Por ello es necesario un buen manejo de los cultivos y de los parámetros ambientales, así como el mantenimiento de los sistemas de filtración e irradiación a través de los rayos ultravioleta para asegurar agua marina de buena calidad. Todo ello se registra en bitácoras de control de parámetros físicos y de uso de aparatos (ANEXOS 2 AL 6). 15

16 7.- PROCEDIMIENTOS DE DESINFECCIÓN PARA LA SALA DE PRODUCCIÓN DESINFECCION DE AGUA DE MAR PARA CULTIVOS ALGALES: Usamos hipoclorito sódico a una concentración de 15 ppm. Para ello añadimos 0.1 ml de cloro al 15 % por litro de agua. Dejamos reposar horas Neutralizamos con tiosulfato de sodio (Na2S2O3) a una concentración de 20 ppm. Para ello añadimos 200 mg de tiosulfato por litro de agua y usamos 0.1 ml de esta disolución por cada 0.1 ml de cloro. Posteriormente introducimos aireación al recipiente de cultivo y se deja así por una hora. Una vez esterilizado, se agregan los nutrientes y vitaminas previamente esterilizados. Volumen de agua de cultivo (L) Volumen de cloro (ml) Volumen de tiosulfato (ml) DESINFECCION DEL SUELO Y EXTERIORES DEL TANQUE DE CULTIVO: Usamos hipoclorito sódico a una concentración de 200 ppm. Para ello añadimos 1.3 ml de cloro al 15% por litro de agua. Para preparar la solución usamos cubetas de 20 L. Añadimos 15 litros de agua de la llave a la cubeta y después 19.5 ml de cloro. Limpiar la zona y dejar secar. DESINFECCION DEL CALZADO: Usamos hipoclorito sódico a una concentración de 200 ppm. Para ello añadimos 1.3 ml de cloro al 15% por litro de agua. Llenar las cubetas con aproximadamente 10 litros de agua de la llave y añadir 13 ml de cloro. DESINFECCION DE MANOS Y MATERIAL CON ALCOHOL: Usamos una solución de alcohol al 70%. Para ello añadimos 140 ml de alcohol al 100% y llenamos el frasco pulverizador con 60 ml de agua de la llave. 16

17 o Se puede utilizar para esterilizar las manos antes de operar y para limpiar material de cristal (pipeta, cajas de Petri, tubos de ensayo, etc.) y la mesa de trabajo. DESINFECCION DEL MATERIAL CON BAÑO DE CLORO: Usamos hipoclorito sódico a una concentración de 200 ppm. Para ello añadimos 1.3 ml de cloro al 15% por litro de agua (para preparar 5 L añadiremos 6.5 ml de cloro) Dejamos el material en el baño al menos por una hora. Lavar con abundante agua y jabón y dejar secar. DESINFECCION DEL MATERIAL CON BAÑO DE ÁCIDO CLORHÍDRICO: Usamos ácido clorhídrico (HCl) al 2 %. Para ello tomamos 1 litro de HCl al 37% y le añadimos 17.5 litros de agua. Dejamos el material durante varias horas, pueden ser 24h. Lavar abundantemente con agua y jabón y enjuagar con agua destilada, secar y guardar. o Todas las superficies de vidrio deben lavarse de vez en cuando con solución de Hidróxido de sodio (sosa cáustica) aproximadamente al 0.5% y dejar en reposo como máximo 1 hora. ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL Y MEDIO DE CULTIVO EN AUTOCLAVE: Se recomienda para la esterilización de agua, medios de cultivo, vitaminas y material de cristal como pipetas (recordar cerrar o envolver con papel de plata el recipiente) PROCEDIMIENTO: o Instalar filtro y placa de fondo o Cerrar válvula de drenaje o Instalar la botella con 1.5 litros de agua destilada o Verter agua en la cámara (de 2.8 L a 3 L) o Colocar los materiales en las cestas o Cerrar la puerta central o Cerrar la tapa (1/2 de giro a la derecha) o Fijar el receptor de vapor o ENTER (15 min 120 ) o Si pulsas otra vez ENTER interrumpes el programa o En su caso abrir la válvula de drenaje CUANDO SE ENFRIE EL AGUA o Abrir la tapa cuando la temperatura baje de 100 y el manómetro este a 0 Relación del volumen de agua marina y agua destilada para esterilizar en la autoclave: Volúmen a preparar Agua marina Agua destilada 20 ml 17 ml 3 ml 17

18 50 ml 42.5 ml 7.5 ml 250 ml ml 37.5 ml PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO PARA MICROALGAS Disolución stock 1: STOCK 1 Cantidad de agua de mar tratada Cantidad de Bayfolan (en ml) 50 ml 0.1 Bayfolan forte Nutriente vegetal foliar (2ml/L) 250 ml L 2 5 L L 40 Tratar el agua de mar filtrada a 1 micra y esterilizada en la autoclave (24-36 horas antes). Incorporar el nutriente foliar en las cantidades indicadas para cultivo. Usar dentro de las horas siguientes. Disolución stock 2: STOCK 2 Cantidad de agua destilada Cantidad de EDTA Na2EDTA.2H2O (4.5 ) 1 L 4.5 g Disolver la cantidad indicada en agua destilada caliente y esterilizar en la autoclave. Mantener en el refrigerador hasta su uso. Tomamos 1 ml por litro de agua de mar esterilizada en la autoclave (24-36 horas antes) para cultivo. Disolución stock 3: STOCK 1 Cantidad de agua de Cantidad de 18

19 mar tratada vitaminas (en ml) Vitamina B1 (tiamina) 200 Vitamina B ml 10 Vitamina H (biotina) 10 Diluir las cantidades indicadas en agua destilada esterilizada en la autoclave. Mantener en refrigerador hasta su uso. Tomamos 0.1 ml/l de agua de mar esterilizada en la autoclave para cultivo. Para DIATOMEAS: STOCK 4 Cantidad de agua destilada Cantidad de silicatos Silicatos (3%) Na2SiO3.9H2O 1 L 30 g Diluir las cantidades indicadas en agua destilada caliente y esterilizar en la autoclave. Mantener en el refrigerador. Utilizamos 1 ml/l de agua de mar esterilizada en la autoclave hs. antes para cultivo. 19

20 ANEXO 1. BITACORA DE REGISTRO DIARIO PARA EL AREA DE MICROALGAS Fecha: TQ Día de AREA DE MICROALGAS BITACORA. PRODUCCION DIARIA DE MICROALGAS Empleado: PARAMETROS FISICO- QUIMICOS CONTEO INOCULO COSECHA / INOCULO COND. O2 cultivo (mg/l) ( ) TºC Sal ph Vol. Cultivo (L) Cel/ml (cel/ml) TQ TQ DEL CULTIVO Cosecha Siembra (L) Microorg. Ci/Protozo/O) OBSERVACIONES PARAMETROS DE CALIDAD DEL AGUA: TºC = O2 (mg/l) = Salinidad = ph = MOVIMIENTOS DIARIOS CONDICIONES MICROALGA (Cosechada) CONTROL DE PRODUCCION Producción solicitada: anterior) Producción entregada: curso) (Día (Día Cosecha total (L): Especie: (cel/ml) Microorganismos Condiciones del cultivo A producción (L): T º C= O2 (mg/l)= Ci = Ciliados, Protozoo=Protozoarios, A inoculo (L): ph= Otros (O) o / oo = 0= Limpio 1= Contaminación media 2= Contaminación fuerte Resto (L):

21 ANEXO 2: BITÁCORA AUTOCLAVE FECHA USUARIO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES 21

22 ANEXO 3: BITÁCORA MICROSCOPIO ÓPTICO FECHA USUARIO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES 22

23 ANEXO 4: BITÁCORA LUPA BINOCULAR FECHA USUARIO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES 23

24 ANEXO 5: BITÁCORA BALANZA DE PRECISIÓN FECHA USUARIO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES 24

25 ANEXO 6: BITÁCORA SISTEMA DE FILTRACIÓN E IRRADIACIÓN DE AGUA MARINA FECHA USUARIO INICIO TÉRMINO COMENTARIOS 25