Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria. Hermes Pérez Cardona

Transcripción

1 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Hermes Pérez Cardona Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería de Sistemas e Industrial Bogotá D.C., Colombia 2017

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3 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Hermes Pérez Cardona Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Bioinformática Director (a): PhD., Emiliano Barreto Hernández Línea de Investigación: Tecnologías computacionales en Bioinformática Grupo de Investigación: Bioinformática Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería de Sistemas e Industrial Bogotá D.C., Colombia 2017

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5 Resumen y Abstract V Resumen La OMS publicó este año un estudio multicriterio con un grupo de expertos multidisciplinario para obtener una lista de patógenos de prioridad global resistentes a antibióticos, situando a Acinetobacter baumannii en un nivel crítico. Dentro de las estrategias en las ciencias de la computación se necesitan avances en cuanto al diagnóstico, detección y reporte de la resistencia a antibióticos. En el presente proyecto de grado se diseñó e implemento un sistema de información para la identificación de elementos genómicos asociados a los mecanismos de resistencia, permitiendo la predicción de un perfil de resistencia obtenido por WGS para A. baumannii, estableciendo un modelo de correlación entre los elementos genómicos asociados a la resistencia y el perfil fenotípico de resistencia. El Instituto Nacional de Salud suministró 89 muestras positivamente identificadas de A. baumannii, con sus respectivos antibiogramas, obtenidos por el método Kirby Bauer para las clases de antibióticos principales, adicionalmente se realizó algunos antibiogramas con los sistemas automatizados Vitek2 y Phoenix100. El sistema facilitó la información para depuración de las incongruencias en los perfiles fenotípicos. El sistema hace uso de MySQL como motor de base de datos, scripts en lenguaje Python y visualización de perfiles en tecnología D3.js. Este sistema requiere una anotación del genoma, utilizando una modificación propia del software Prokka. La base de datos actualmente posee 2317 genes, 297 son de A. baumannii o el complejo Acinetobacter, también posee 170 modelos ocultos de Markov con función de resistencia a antibióticos. Se definieron 5 principales reglas de negocio para obtener los perfiles genómicos de resistencia a antibióticos. El sistema luego de algunos ajustes dados por las comparaciones entre perfiles tiene el potencial para predecir con una buena aproximación la resistencia a los antibióticos en A. baumannii, con la facilidad de ser escalable y extrapolable a otras especies. Palabras clave: Acinetobacter baumannii, perfiles de resistencia, modelo bioinformático, mecanismos de resistencia, genes de resistencia.

6 VI Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Abstract WHO published this year a multicriteria study with a group of multidisciplinary experts in order to obtain a list of antibiotic-resistant global priority pathogens, placing Acinetobacter baumannii at a critical level. Within the strategies in the computer sciences advances are needed in the diagnosis, detection and reporting of antibiotic resistance. In the present project, an information system was designed and implemented for the identification of genomic elements associated to the resistance mechanisms, allowing the prediction of a resistance profile obtained by WGS for A. baumannii, establishing a model of correlation between the Genomic elements associated with resistance and the phenotypic profile of resistance. The National Health Institute supplied 89 positively identified isolates of A. baumannii, with their respective antibiograms, obtained by Kirby Bauer method for the main antibiotic classes, some antibiograms were also performed with Vitek2 and Phoenix100 automated systems. The system provided information in order to remove of the incongruities in the phenotypic profiles. The system uses MySQL as a database engine, Python scripts and profile visualization in D3.js technology. This system requires a genome annotation, using a proprietary modification of Prokka software. The database currently has 2317 genes, 297 are of A. baumannii or the Acinetobacter complex, it also has 170 hidden Markov models with antibiotic resistance function. Five main business rules were defined in order to get the genomic profiles of antibiotic resistance. The system after some adjustments given by the comparisons between profiles has the potential to predict with a good approximation antibiotic resistance in A. baumannii, with the ease of being scalable and extrapolable to other species. Keywords: Acinetobacter baumannii, resistance profiles, bioinformatic model, resistance mechanisms, resistance genes

7 Contenido VII Contenido Pág. Resumen... V Lista de figuras... X Lista de tablas... XI Lista de Símbolos y abreviaturas... XIII Introducción Estado del arte Resistencia El problema y un camino Acinetobacter baumanni Importancia Clínica Plasticidad del genoma Tratamiento Mecanismos de resistencia Modificación genética de genes endógenos o Mutación genética Transferencia horizontal de genes Otros mecanismos de HGT Mecanismos de resistencia en A. baumannii Mecanismos de resistencia intrínsecos Mecanismos de resistencia adquiridos Perfiles fenotípicos de resistencia Antibiograma Métodos de difusión Métodos de dilución Otros métodos Los sistemas automatizados Microarreglos y técnicas moleculares Secuenciación del genoma completo Aplicaciones y bases de datos sobre resistencia a antibióticos Bases de datos Activas Bases de datos No Activas Otras herramientas Objetivos General Específicos... 38

8 VIII Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria 3. Metodología Obtención de los datos Clasificación de los antibióticos Extracción de ADN Secuenciación Análisis de calidad, Ajuste de calidad y Ensamblaje Anotación Documentación de la base de datos Perfiles de Resistencia Fenotípica Datos moleculares sumistrados por el INS Reglas pasivas de resistencia y Perfil de resistencia genómica Metadatos de la base de datos CARD y Resfams Persistencia datos bibliográficos Lectura de los genomas ensamblados Clasificación de β-lactamasas orientada a la resistencia Reglas de negocio para la obtención teórica de la resistencia genómica Primera Regla Segunda Regla Tercera regla Cuarta Regla Quinta Regla Determinación a los perfiles de resistencia Fenotípicos Desarrollo de la aplicación Scripts adicionales Resultados y Discusión Resultados Datos en la tecera regla Datos en la tecera regla Perfiles fenotípicos de resistencia Perfiles genotípicos de resistencia Comparación de los perfiles genómicos y fenotípicos Visulización de la comparación de los perfiles genotípicos y fenotípicos Calculo de precisión y análisis del perfil genómico de resistencia Discusión de resultados Monobactams Aminoglycosides Carbapenem Polymyxins Cephalosporin Ic Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Fluoroquinolone Folate pathway inhibitors Glycylcyclines b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Precisión del perfil genotípico Conclusiones y recomendaciones Conclusiones

9 Contenido IX 5.2 Recomendaciones Bibliografía

10 Contenido X Lista de figuras Pág. Figura 3-1: Diagrama E-R sobre resistencia fenotípica Figura 3-2: Diagrama E-R para genes identificados por PCR Figura 3-3: Diagrama E-R para el perfil genómico de resistencia Figura 3-4: Diagrama E-R para Metadatos de la base de datos CARD y ResFams. 69 Figura 3-5: Diagrama E-R para la bibliografía Figura 3-6: Diagrama E-R para aplicación LecturaEnsamblados V Figura 3-7: Tablas que asocian los genes con la resistencia a los antibióticos Figura 3-8: Tablas que asocian los genes que codifican β-lactamasas con la resistencia a antibióticos Figura 3-9: Algunas bombas eflujo tipo RND para A. baumannii Figura 3-10: Diagrama de flujo global del pipeline de la aplicación Figura 3-11: Diagrama de flujo macro Bombas Eflujo tipo RND Figura 4-1: Comparación perfiles de resistencia para RA Figura 4-2: Comparación perfiles de resistencia para RB

11 Contenido XI Lista de tablas Pág. Tabla 3-1: Descripción del catálogo antibiotico Tabla 3-2: Descripción del catálogo clsi-antibiotico Tabla 3-3: Descripción del catálogo sigla_antibiotico Tabla 3-4: Descripción del catálogo equipo Tabla 3-5: Descripción del catálogo interpretacion Tabla 3-6: Descripción del catálogo nivel_antiobiotico Tabla 3-7: Descripción del catálogo relacion_orden Tabla 3-8: Descripción de la tabla resistencia_fenotipica Tabla 3-9: Descripción del catálogo mdrxdrpdr_antibiotico Tabla 3-10: Descripción de la tabla resistencia_fenotipica_consolidado Tabla 3-11: Descripción del catálogo estado_edta_pcr Tabla 3-12: Descripción del catálogo estado_edta_pcr Tabla 3-13: Descripción de la tabla gen_fenotipico Tabla 3-14: Descripción del catálogo mecanismo_resistencia Tabla 3-15: Descripción de la tabla gen_mecanismo_resistencia Tabla 3-16: Descripción del catálogo gen_resistencia Tabla 3-17: Descripción de la tabla resistencia_genomica Tabla 3-18: Descripción de la tabla gen_antibiotico_resistencia Tabla 3-19: Descripción del catálogo correspondencia_antibiotico Tabla 3-20: Decripción de la tabla gen_operon_resistencia Tabla 3-21: Descripción del catálogo operon_resistencia Tabla 3-22: Descripción de la tabla bombas_rnd_antibiotico Tabla 3-23: Descripción de la tabla bombas_rnd Tabla 3-24: Descripción de la tabla mutación_gen_resistencia Tabla 3-25: Descripción de la tabla mutación_resistencia Tabla 3-26: Descripción del catalogo blactam_clase Tabla 3-27: Descripción del catálogo blactam_grupo Tabla 3-28: Descripción de la tabla blactam_grupo_gen Tabla 3-29: Descripción de la tabla blactam_grupo_antibiotico Tabla 3-30: Descripción del catálogo fuente Tabla 3-31: Descripción de la tabla perfil_resistencia_genomica Tabla 3-32: Descripción de la tabla perfil_genomico Tabla 3-33: Descripción tabla metadata CARD, aro_categories Tabla 3-34: Descripción tabla resfams_metadata... 70

12 XII Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Tabla 3-35: Descripción del catálogo bibliografia Tabla 3-36: Descripción de la tabla bibliografia_tablas Tabla 3-37: Agrupación Consolidada para β-lactamasas Tabla 3-38: Asignación de genes a los grupos de β-lactamasas por excepción Tabla 3-39: Jerarquía de los antibióticos base para A.baumannii dada por el INS Tabla 3-40: β-lactamasas que pertenecen a la agrupación en segundo nivel Tabla 4-1: Categorías y agentes antimicrobianos usados para definir MDR, XDR y PDR en Acinetobacter spp. En las 89 muestras del proyecto Tabla 4-2: Agrupación de la cantidad de muestras según antibiograma consolidado 103 Tabla 4-3: Cantidad total de genes encontrados en las 89 muestras según el mecanismo de resistencia Tabla 4-4: Antibióticos y clases por tipos de Bomba eflujo RND Tabla 4-5: Cantidad de genes por antibiótico y clases Tabla 4-6: Relación entre clases y sub clases de los perfiles Fenotípicos y Genómicos 109 Tabla 4-7: Muestras con Incongruencias por clase en el perfil fenotípico Tabla 4-8: Detalle de incongruencias y ajustes Tabla 4-9: Porcentaje de correspondencia entre perfiles por cada muestra

13 Contenido XIII Lista de Símbolos y abreviaturas Abreviaturas Abreviatura Término ADC Acinetobacter-derived cephalosporinase ESAC extended-spectrum AmpC HGT horizontal gene transfer OMPs outer membrane proteins PBPs penicillin binding protein ABC ATP-binding cassette SMR small multidrug resistance MATE multidrug and toxic compound extrusion MFS major facilitator superfamily RND resistance-nodulation-cell division CraA chloramphenicol resistance Acinetobacter AMR antimicrobial resistance ARO Antibiotic Resistance Ontology MLST Multilocus sequence typing HMMs Hidden Markov Models IDSA Infectious Diseases Society of America UCI unidades de cuidado intensivo IS secuencias de inserción CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMI Concentración inhibitoria minima CMB Concentración minima bactericida EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing ATP adenosín trifosfato WGS Whole genome sequencing MLST Multilocus sequence typing SNP Nucleotide Polymorphism MDR Multiple drug resistance XDR Extensively drug-resistant PDR pandrug-resistant INS Instituto Nacional de Salud RND resistance-nodulation-cell division HTML HyperText Markup Language SVG Scalable Vector Graphics CSS Cascading Style Sheets DOM Document Object Model HTML HyperText Markup Language SVG Scalable Vector Graphics CSS Cascading Style Sheets DOM Document Object Model

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15 Introducción Las infecciones son la mayor causa de enfermedades humanas, de perdida de cultivos y de perdidas sobre las poblaciones de animales, por lo tanto, causan un inmenso daño a la economía mundial, además se espera que las enfermedades infecciosas se incrementen conectadas con el calentamiento global. (MCDERMOTT et al., 2012). Se estima que a menos que se tomen medidas, las infecciones por resistencia a los medicamentos podrían causar la muerte de más de 10 millones de personas por año para el 2050 y que, de esta manera, se produciría un aumento tangencial del valor de los tratamientos. (Review on Antimicrobial Resistance, 2014) Acinetobacter baumannii es un cocobacilo gram negativo, patógeno oportunista que es responsable entre un 2 al 10% de todas las infecciones en hospitales. Esta bacteria es clasificada por la sociedad americana de enfermedades infecciosas, como una de los seis microorganismos más importantes alrededor del mundo en cuanto a resistencia a múltiples medicamentos. Las infecciones más comunes ocasionadas por Acinetobacter incluyen neumonías, infecciones en tejidos blandos, tracto urinario, meningitis secundarias y bacteremia; generalmente asociadas a ventiladores, uso de catéteres y heridas (Antunes et al., 2014) Aún existen causas para el optimismo tales como los avances en genética, genómica y ciencias de la computación que cambiarán la forma en que las infecciones y nuevos tipos de resistencia son diagnosticados, detectados y reportados en todo el mundo (Review on Antimicrobial Resistance, 2014), Esta es precisamente el área de aplicación del presente proyecto de grado. El presente proyecto brinda la posibilidad de aprovechar la oportunidad actual en la genómica clínica personalizada, para interactuar con las tecnologías recientemente existentes, en la identificación de objetivos importantes para el diagnóstico.

16 2 Introducción El enfoque de este proyecto según lo extraído en la literatura sobre los elementos genómicos asociados a los mecanismos de resistencia a antibióticos. Permite desarrollar un modelo teórico encontrando la forma de relacionar y unificar toda esta información que se encuentra en muchos casos descrita y evaluada de diferentes formas según cada autor. Se debe crear entonces un modelo de convergencia para la extensa cantidad de datos que actualmente se puede encontrar. El sistema construido se basa en la hipótesis que con toda esta información genómica de resistencia seleccionada, evaluada e implementada según lo extraído de la literatura, es posible construir un modelo bioinformático que permita predecir la resistencia a los antibióticos, adicionalmente comparando los perfiles genómicos de resistencia contra los perfiles fenotípicos de resistencia, debe ser posible afinar, corregir y posteriormente actualizar el modelo para que sus resultados lleguen a tener una buena aproximación al comportamiento real sobre la resistencia antimicrobial. El presente proyecto nos aporta una base teórica actualizada sobre algunos de los elementos genómicos que están involucrados en los mecanismos de resistencia, además de proveer una base de datos, robusta, escalable y extrapolable a otras futuras investigaciones relacionadas con este tema. Potencialmente también sugiere formas de visualización de los datos que va de la mano con los avances de la tecnología. Para desarrollar el presente proyecto se inicia haciendo la evaluación de los elementos genómicos de resistencia desde el nivel de los aminoácidos que conforman un elemento genómico (no desde los nucleótidos), por lo cual se requieren un máximo control en los procesos de ensamblaje y anotación, pero aún más en proceso de anotación de los genomas, este paso es de suma importancia. Para luego pasar a evaluarlo teóricamente bajo un completo análisis de la literatura sobre este tema, y así diseñar por capas un producto que permita satisfacer las aspiraciones y pretensiones de este proyecto. Este proyecto requirió un esfuerzo entre el instituto nacional de salud y los grupos de Bioinformática y epidemiología molecular del instituto de Biotecnología de la universidad Nacional de Colombia - sede Bogotá, para inicialmente aislar muestras hospitalarias en Colombia de Acinetobacter baumannii, extraer su genoma y secuenciarlo. Además, proveyendo los perfiles fenotípicos de resistencia bajo el método de difusión Kirby Bouer y

17 Introducción 3 2 sistemas automatizados, para posteriormente depurar las incongruencias, generando así datos de buena calidad como insumos para este proyecto. Luego de los análisis sobre las comparaciones entre perfiles este proyecto y su posterior actualización, el sistema está en la capacidad de proveer información confiable en un tiempo reducido, sobre la resistencia a antibióticos, especialmente para las clases y subclases de antibióticos que fue posible comparar. Adicionalmente la información que genera servirá para el posterior seguimiento y control sobre este patógeno en Colombia y alrededor del mundo.

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19 1. Estado del arte 1.1 Resistencia Qué es resistencia? dentro del contexto de la salud. El centro de prevención y control de la enfermedades (siglas en inglés, CDC, Centers for Disease Control and Prevention) define resistencia como la habilidad de las bacterias u otros microorganismos a resistir los efectos de un antibiótico, La resistencia a antibióticos ocurre cuando la bacteria cambia de alguna forma que reduce o elimina la efectividad del medicamento, la bacteria sobrevive y continúa multiplicando causando más daño (International Federation of Pharmaceutical Manufacturers & Associations, 2015). La introducción de los fármacos antimicrobianos en la medicina proporcionó la esperanza para un futuro en el cual todas las enfermedades infecciosas pudieran ser controladas. Décadas más tarde se tuvo la certeza que este no iba a ser el caso (Fernández et al., 2011). El fenómeno de la resistencia a los antibióticos precede al uso de estos compuestos en un contexto clínico, este no es sorprendente considerando que los compuestos son omnipresentes en la naturaleza. Por ejemplo, los estudios filogenéticos indican que las β- lactamasas, el principal mecanismo de resistencia a los antibióticos β-lactámicos, se originaron hace más de 2 mil millones de años. Sin embargo, sólo después de la introducción de los antimicrobianos como terapia contra las enfermedades infecciosas, fue que las bacterias comenzaron a experimentar una evolución acelerada que condujo a la aparición y la transferencia de mecanismos de resistencia que afectan a la mayoría, si no es que a todos los antibióticos disponibles en la actualidad (Fernández et al., 2011).

20 6 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria El problema y un camino Se estimó en un primer informe, publicado en diciembre de 2014, que en total unas personas mueren cada año a partir de cepas resistentes a los fármacos por infecciones bacterianas comunes, el VIH, la tuberculosis y la malaria. Este número es probable que este subestimado debido a la mala información y vigilancia. Casi personas mueren cada año de tuberculosis multirresistente y extremadamente resistente. En la India, las infecciones neonatales resistentes a los antibióticos causan cada año la muerte de casi recién nacidos. El número total de muertes según esta escala es más de un millón de personas que han perdido la vida por infecciones resistentes a los medicamentos en los 19 meses desde la publicación del primer informe (Review on Antimicrobial Resistance, 2016). Sobre la base de los escenarios de aumento de la resistencia a los medicamentos para seis patógenos a 2050, se estima que a menos que se tomen medidas, la carga de muertes por AMR (antimicrobial resistance, o resistencia a antibióticos) podría elevarse a 10 millones de vidas cada año en 2050, a un costo acumulado en la economía mundial de 100 billones de USD. Sobre esta base, en 2050, el número de muertos podría ser una persona cada tres segundos (Review on Antimicrobial Resistance, 2016). La organización mundial de la salud definió una lista que se desarrolló en colaboración con la División de Enfermedades Infecciosas de la Universidad de Tübingen, Alemania, utilizando una técnica de análisis de decisiones multicriterio, examinada por un grupo multidisciplinario de expertos internacionales. Los criterios para la selección de patógenos en la lista son: que tan mortales son las infecciones que causan; si su tratamiento requiere largas estancias en el hospital; con qué frecuencia son resistentes a los antibióticos existentes cuando las personas en las comunidades los capturan; la facilidad con que se propagan entre animales, de animales a humanos y de persona a persona; si pueden prevenirse (por ejemplo, mediante una buena higiene y vacunación); cuántas opciones de tratamiento continúan funcionando; y si los nuevos antibióticos para tratarlos ya están en el conducto de investigación y desarrollo (World Health Organization, 2017).

21 Capitulo 1 7 Los expertos acordaron agrupar los patógenos según las especies y el tipo de resistencia y luego estratificar los resultados en tres niveles de prioridad: crítico, alto y medio. Patógenos prioridad 1, nivel crítico: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae; Patógenos prioridad 2, nivel alto: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, Campylobacter, Salmonella spp., Neisseria gonorrhoeae; Patógenos prioridad 2, nivel medio: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Shigella spp (World Health Organization, 2017). Aún existen causas para el optimismo tales como los avances en genética, genómica y ciencias de la computación que cambiarán la forma en que las infecciones y nuevos tipos de resistencia son diagnosticados, detectados y reportados en todo el mundo, para que podamos luchar más rápido cuando las bacterias evolucionan resistiendo a los medicamentos. Estos mismos avances tecnológicos ofrecerán en el futuro herramientas diagnósticas rápidas que mejorarán con el tiempo el uso de antibióticos. Por lo tanto, se tendrá en el mercado nuevos y más rápidos puntos de diagnóstico (Review on Antimicrobial Resistance, 2014). Esta es precisamente el área de aplicación de la presente tesis de maestría. 1.2 Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii es un cocobacilo gram negativo, no fermentador, aerobio estricto, catalasa positivo y oxidasa negativo. Es una bacteria patógena oportunista que es responsable entre un 2 al 10% de todas las infecciones en hospitales causadas por bacterias gram negativas. Acinetobacter baumannii es clasificada por la sociedad americana de enfermedades infecciosas (siglas en inglés, IDSA. Infectious Diseases Society of America) como uno de los seis microorganismos más importantes alrededor del mundo en cuanto a resistencia a múltiples medicamentos (MDR, por sus siglas en inglés Multidrug resistant) (Antunes et al., 2014). La especie Acinetobacter baumannii no fue designada formalmente sino hasta el año 1986 (Bouvet and Grimont, 1986). Por consecuencia la interpretación en la literatura médica científica de las infecciones que fueron causadas por este microorganismo en tiempos anteriores es difícil de identificar. Aparentemente las infecciones causadas por organismos ahora clasificados como A. baumannii se convirtieron en un problema significativo durante

22 8 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria la década de los 70 s (Bergogne-Bérézin and Towner, 1996), ya que desde entonces, A. baumannii gradualmente ha incrementado su importancia como organismo patógeno, principalmente pero no exclusivamente en los ambientes hospitalarios. Se debe considerar que la naturaleza del huésped (pacientes humanos) ha jugado un importante rol en el resultado de las infecciones causadas por A. baumannii y el incremento en la resistencia a los antibióticos, asociado a los avances en la medicina que han involucrado un mayor uso de antibióticos altamente selectivos. (Antunes et al., 2014) Importancia Clínica Acinetobacter baumannii coloniza e infecta pacientes hospitalizados en estado crítico o debilitados por sus comorbilidades, siendo una bacteria común en unidades de cuidado intensivo (UCI) y unidades de quemados. A. baumannii es una de las bacterias más frecuentes en brotes de infección intrahospitalaria por su capacidad de adherencia y persistencia en equipos biomédicos, teclados, cortinas e incluso teléfonos celulares de los trabajadores de salud, siendo resistente a agentes antimicrobianos, incluso a desinfectantes (Morgan et al., 2010). Adicionalmente, su alta capacidad para desarrollar resistencia a los antibióticos, hace de esta genoespecie un agente causal de diversas infecciones intrahospitalarias y elevadas tasas de mortalidad (Torres et al., 2010). Un estudio realizado en la unidad de cuidados intensivos del centro medio de la universidad de Maryland en 2008, reveló que después de 199 interacciones entre personal de la salud y pacientes colonizados o infectados con A. baumannii multirresistente, 38,7% de los guantes o batas del personal de la salud resultaron contaminados y 4,5% de ellos presentaron contaminación en sus manos después de la remoción de los guantes desechables (Morgan et al., 2010). Estos porcentajes son elevados si se comparan con otros microorganismos de importancia clínica como Pseudomonas aeruginosa que solo se presentó en el 8,2% de las batas y guantes del personal de salud. Otro estudio en la Universidad de Buenos Aires, realizado durante un brote, encontró que A. baumannii podía

23 Capitulo 1 9 ser recuperado de la cama de pacientes infectados hasta nueve días después del alta hospitalaria, lo que demuestra la habilidad de esta bacteria para sobrevivir por largo tiempo en superficies inanimadas (Catalano et al., 1999). En el medio hospitalario A. baumannii origina diversidad de cuadros clínicos, incluyendo infecciones en la piel y tejidos blandos, tracto urinario y meningitis secundaria. Sin embargo, los tipos de infecciones más importantes con la mayor tasa de mortalidad son la neumonía asociada a ventilador e infecciones del torrente sanguíneo. Esta bacteria puede entrar fácilmente al cuerpo a través de heridas abiertas, catéteres intravasculares y ventiladores mecánicos. Las infecciones causadas por A. baumannii son particularmente asociadas con periodos extendidos de hospitalización, principalmente en adultos mayores del género masculino (Antunes et al., 2014). Un fenómeno relativamente reciente ha sido asociado con A. baumannii por infecciones posteriores a lesiones en zonas de conflicto por ejemplo en Iraq y Afganistán, o tras desastres naturales tal como el terremoto de Marmara en Turquía. Hay evidencia de que el uso de morfina, la cual se administra después de las lesiones en el campo de batalla o en lesiones por aplastamiento, podría potencializar las infecciones por A. baumannii, tal vez como resultado de su efecto inmunosupresor (Antunes et al., 2014) Plasticidad del genoma Probablemente una de las características más intrigantes de A. baumannii es su capacidad para adquirir, retener y diseminar múltiples mecanismos de resistencia que, combinados con su capacidad para sobrevivir a la desecación, así como, a la mayoría de los desinfectantes, explica la supervivencia prolongada de las cepas de esta bacteria en el entorno clínico y hace que este microorganismo sea casi imposible de erradicar (Roca et al., 2012). La adquisición y diseminación de los determinantes de la resistencia a los antimicrobianos en A. baumannii se consiguen combinando genes de resistencia con una serie de elementos móviles que median el intercambio de material genético y reorganizan los genomas bacterianos dando lugar a múltiples combinaciones genéticas y proporcionando una fuente inagotable de adaptabilidad genética. Dicha matriz incluye secuencias de

24 10 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria inserción (IS), transposones, integrones, plásmidos y, en última instancia, islas de resistencia (Roca et al., 2012) Tratamiento Con respecto al tratamiento para infecciones causadas por A. baumannii, es importante tener en cuenta el perfil de resistencia involucrado para de este modo considerar las diferentes opciones de tratamiento disponibles. A. baumannii es actualmente resistente a múltiples agentes antibacterianos, incluyendo carbapenémicos y, ocasionalmente, colistina. Por lo tanto, en muchos casos, el tratamiento óptimo para infecciones nosocomiales causadas por este microorganismo a veces no está disponible. Hace una década, se utilizó sulbactam, que tiene actividad intrínseca contra A. baumannii y muestra eficacia para tratar infecciones causadas por aislados clínicos resistentes a carbapenemasas. Sin embargo, hoy en día el porcentaje de resistencia al sulbactam ha alcanzado un nivel tan alto que su uso como agente antimicrobiano contra las infecciones causadas por A. baumannii ha sido invalidado (Roca et al., 2012). Por otra parte, los resultados con la rifampicina han sido consistentes en relación con la eficacia in vivo en modelos experimentales de infección y en algunos estudios clínicos de infecciones humanas, especialmente cuando se combina con colistina. La respuesta clínica y microbiológica sugiere que la combinación de colistina y rifampicina parece ser un tratamiento eficaz y seguro para las infecciones graves debidas a A. baumannii multirresistente (Roca et al., 2012). Existe cierta heterogeneidad con respecto a los datos clínicos para determinar la utilidad de la tigeciclina en el tratamiento de las infecciones nosocomiales causadas por A. baumannii. El posible desarrollo de resistencia durante el tratamiento con tigeciclina sugiere que sólo debe usarse en regímenes combinados con otros antimicrobianos. Dos estudios han reportado la combinación de tigeciclina con otros agentes antimicrobianos. Estos encontraron que la tigeciclina mostró sinergismo con levofloxacina, amicacina, imipenem y colistina, mientras que se observó antagonismo para la combinación tigeciclina / piperacilina-tazobactam. Mientras que, la tetracliclina mostró sinergia con la levofloxacina, amicacina, imipenem y colistina. El sinergismo se detectó sólo entre cepas no susceptibles

25 Capitulo 1 11 a tigeciclina. Los ensayos confirmaron la interacción sinérgica entre tigeciclina y levofloxacina, amicacina, imipenem y colistina en cinco de los siete aislamientos seleccionados. En seis aislamientos de cepas de A. baumannii resistentes a meropenem se observó la sinergia de tigeciclina / colistina y tigeciclina / levofloxacina (Roca et al., 2012). Otras combinaciones también han sido descritas en la literatura científica. De 14 aislamientos de cepas de A. baumannii extremadamente resistentes a fármacos (XDR) en pacientes ingresados en las unidades de cuidados intensivos de un hospital chino. La mayoría de las cepas eran resistentes a todos los antimicrobianos excepto la colistina y la minociclina, los resultados combinatorios por curvas de muerte mostraron un efecto sinérgico entre colistina / meropenem, colistina / rifampicina, meropenem / minociclina y colistina / minociclina. La combinación de meropenem / minociclina podría ser una alternativa posible cuando la colistina no está disponible como en China (Roca et al., 2012). Es preocupante que las infecciones causadas por aislamientos de A. baumannii pan resistentes (pan-resistente se puede definir cuando una bacteria se hace resistente a todos los antibacterianos de utilidad clínica), aumentan constantemente en varias regiones del mundo. Es por ello que es necesario desarrollar nuevas estrategias terapéuticas debido a la existencia de aislamientos reportados resistentes a todos los agentes antibacterianos, incluyendo la colistina (Leite et al., 2016) 1.3 Mecanismos de resistencia En general, la resistencia antimicrobiana se puede lograr mediante dos mecanismos principales: la adquisición de información genética a través de la transferencia horizontal de genes y la modificación genética de genes endógenos Modificación genética de genes endógenos o Mutación genética Bombas de eflujo: Las Bacterias bombean los antibióticos antes de que estos las puedan a atacar. Estas bombas tienen la capacidad de expulsar del medio interno celular, compuestos tóxicos para la bacteria (Coyne et al., 2011).

26 12 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Modificación del sitio blanco: Las bacterias cambian la forma del objetivo o blanco de manera que el antibiótico no puede atacar. La modificación del sitio del blanco es el principal mecanismo de resistencia, por ejemplo, a los β-lactámicos y las fluroquinolonas (Higuchi et al., 2014). Destrucción: Las bacterias desarrollan la capacidad de neutralizar el antibiótico antes de que pueda hacer daño, por ejemplo, cambiando la forma del antibiótico (Wright, 2005). (Wright, 2005) Modificación de porinas: Disminución de la permeabilidad de la membrana externa, o disminución en la cantidad de porinas de transporte (Siroy et al., 2005). Biopelículas: es un ecosistema microbiano organizado, conformado por uno o varios microorganismos asociados a una superficie viva o inerte, con características funcionales y estructuras complejas. Formando una comunidad, que se caracteriza por la excreción de una matriz extracelular adhesiva protectora. Esta forma de desarrollo confiere a los microorganismos una gran resistencia a los agentes antimicrobianos (Del Pozo and Cantón, 2016) Transferencia horizontal de genes La transferencia horizontal de genes (por sus siglas en inglés, HGT, Horizontal Gene Transfer). La Conjugación: requiere contacto físico entre un donante y una célula receptora a través de un pilus de conjugación, por el cual se transfiere material genético. La conjugación es canónicamente restringida a las células bacterianas con donante y receptor, sin embargo, Agrobacterium spp. es una excepción y utiliza su maquinaria de conjugación para la transferencia horizontal de genes en las células vegetales. La transformación: es la captación de ADN exógeno desde el medio ambiente y se ha informado tanto en bacterias como en arqueas. La transducción: es la entrega de material genético a través del uso de un fago debido a la integración de material genético de un huésped exógeno dentro del genoma del fago. Este fenómeno se ha observado tanto en bacterias como en arqueas. Hay dos tipos de transducción: o Generalizada: en el que se incorpora una pieza aleatoria de ADN del huésped durante la lisis celular

27 Capitulo 1 13 o Especializada: en la que un profago de forma imprecisa se divide a sí mismo a partir del genoma huésped e incorpora algún ADN del huésped que lo rodea. (Soucy et al., 2015) Otros mecanismos de HGT Agentes de transferencia de genes (GTA): son sistemas de suministro de genes que se integran en un cromosoma del huésped y están a veces bajo el control regulatorio del huésped. Estos agentes llevan pequeños trozos aleatorios del genoma del huésped en cápsides para su entrega a otras bacterias cercanas. Este mecanismo se encuentra tanto en las bacterias como en arqueas, otros estudios muestran que no todas las bacterias son capaces de recibir donaciones de ADN por esta vía. La fusión celular: la fusión celular se ha observado en medios sólidos donde Haloferax volcanii (y en otras especies) forma agregados y las células se unen físicamente por varios pequeños puentes de membrana de la célula ya fusionada. La bidireccionalidad de este método de intercambio de genes significa que es más similar a la reproducción sexual en eucariotas de lo que es la conjugación en procariotas. La transferencia de genes de acuerdo a la teoría endosimbiótica: Es una forma estable de asociación física conduce a la presencia de genes foráneos en genomas de las eucariotas, como es el caso de la mitocondria y los plastidios, que son organelos en las eucariotas que evolucionaron de endosimbiontes bacterianos. Introgresión: Es el flujo de genes debido a la hibridación entre especies, seguido de retrocruzamientos repetidos a una de las especies parentales, Este mecanismo es una preocupación importante en los cultivos transgénicos que se cultivan en la proximidad de los parientes no domesticados. pero no se limita a las plantas. (Soucy et al., 2015) 1.4 Mecanismos de resistencia en A. baumannii A. baumannii ha desarrollado diversos mecanismos de resistencia, entre los cuales se incluyen: β-lactamasas, sobreexpresión de bombas de eflujo, pérdida de porinas y modificación del sitio blanco de acción de los antibióticos. La adquisición de nuevos determinantes genéticos en A. baumannii se produce por el efecto combinado de elementos genéticos móviles (secuencias de inserción, IS y

28 14 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria transposones), integrones y plásmidos transferibles, mientras que la modificación genética de genes endógenos implica mutaciones espontáneas que modifican los objetivos del fármaco o la inserción / deleción de elementos móviles que alteran la expresión de mecanismos de resistencia endógena o modifican la permeabilidad de la membrana (Roca et al., 2012) Mecanismos de resistencia intrínsecos A. baumannii posee una cefalosporinasa tipo AmpC no inducible denominada ADC (del inglés: Acinetobacter-derived cephalosporinase), siendo éste el mecanismo de resistencia más frecuente de esta bacteria a los β-lactámicos (6). La sobreexpresión de ADC está mediada por la presencia de secuencias de inserción que contienen promotores que favorecen la transcripción del gen, como la ISAba1 e ISAba125 (Lopes and Amyes, 2012). Se estima que aprozamente 50 % de las cepas de A. baumannii tienen hiperproducción de ADC (Peleg et al., 2008). Cuando esta enzima se expresa en bajo nivel confiere resistencia a ampicilina; sin embargo, cuando está sobre expresada produce resistencia a cefalotina, piperacilina, cefotaxima, ceftazidima y aztreonam, sin afectar a los carbapenémicos, ni al cefepime (Lopes and Amyes, 2012). Algunas de estas enzimas (ADC-33 y ADC-56) han sido consideradas como AmpC de espectro extendido o ESAC (del inglés: extendedspectrum AmpC), por lo que pueden hidrolizar también cefepime (G.-B. Tian et al., 2011). Otro mecanismo de resistencia intrínseco en A. baumannii es la presencia de la oxacilinasa OXA-51, cuya expresión basal hidroliza débilmente penicilinas y carbapenémicos; su sobreexpresión también es mediada por la secuencia de inserción ISAba1 en un mecanismo similar a la AmpC cromosómica (Gordon and Wareham, 2010) Mecanismos de resistencia adquiridos Con el paso del tiempo, Acinetobacter baumannii ha adquirido diferentes mecanismos de resistencia a los antibióticos y en la actualidad se reporta resistencia a carbapenémicos, aminoglicósidos, quinolonas, polimixinas, etc., lo que ha complicado el manejo de las infecciones ocasionadas por esta bacteria. En Colombia se han descrito altos porcentajes de resistencia a los carbapenémicos, lo que ha limitado las opciones terapéuticas y hace

29 Capitulo 1 15 necesario el conocimiento de la epidemiología local para establecer medidas de control más certeras (Martínez and Mattar, 2012). β-lactámicos: Es poco frecuente encontrar cepas de A. baumannii sensibles a todos los β-lactámicos y en especial a las penicilinas y cefalosporinas. Los mecanismos de resistencia a este grupo de antibióticos comprenden mecanismos enzimáticos y no enzimáticos. Los mecanismos enzimáticos Estos consisten en la degradación del anillo β-lactámico mediada por diferentes tipos de β-lactamasas, dentro de las cuales se encuentran las β- lactamasas de clase A, B o D, de acuerdo con la clasificación de Ambler (Ambler, 1980). Muchas de estas β-lactamasas pueden estar en elementos genéticos móviles como en integrones, plásmidos y transposones, por lo que el uso repetitivo de un antibiótico puede llevar a la expresión de múltiples mecanismos de resistencia que pueden fácilmente diseminarse hacia otras bacterias (Peleg et al., 2008). Dentro de las β-lactamasas de clase A, se encuentran las de amplio espectro relacionadas con resistencia a penicilinas (TEM-1, TEM-2 y la carbenicilinasa CARB-5), las β- lactamasas de espectro extendido (BLEE) como VEB-1, PER-1, TEM-92 y CTX-M-2 y las de tipo KPC. (Vila and Marco, 2010). Esta última β-lactamasa fue reportada inicialmente en el 2001 en cepas de Klebsiella pneumoniae (Yigit et al., 2001), pero en la actualidad se ha diseminado no solo a otras enterobacterias como Enterobacter spp, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella enterica y Serratia marcescens, sino también a bacilos gram negativos no fermentadores como Pseudomonas aeuruginosa y Acinetobacter baumannii (Arnold et al., 2011). Las β-lactamasas de clase B o metalo-β- lactamasas comprenden un grupo de enzimas que no son inhibidas por el ácido clavulánico ni por el tazobactam, pero son sensibles a la inhibición por agentes quelantes como el EDTA. De los seis grupos descritos hasta la fecha, cinco han sido identificados en A. baumannii incluyendo IMP, VIM, SIM, SPM y NDM (Karthikeyan et al., 2010; Rai et al., 2013; Shahcheraghi et al., 2011). La mayoría de estas enzimas han sido encontradas en integrones con determinantes de resistencia a aminoglicósidos (Peleg et al., 2008).

30 16 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Las β-lactamasas de clase D u oxacilinasas son las que se describen con mayor frecuencia en cepas de A. baumannii, siendo las principales OXA-24, OXA-23, OXA-51 y OXA-58, estas tres últimas asociadas con el elemento de inserción ISAba1 que aumenta su expresión. Estas enzimas pueden estar codificadas en plásmidos, excepto OXA-51, codificada en el cromosoma bacteriano y ha sido usada como marcador de especie (Gordon and Wareham, 2010). Sin embargo, esta oxacilinasa, junto con la OXA-58, han sido reportadas en enterobacterias, lo que evidencia la capacidad de diseminación a bacterias de otro género (Leski et al., 2013). Los mecanismos no enzimáticos: Estos mecanismos de resistencia a β-lactámicos incluyen la alteración de las proteínas de membrana externa denominadas OMPs (del inglés: outer membrane proteins), que conducen a una disminución de la permeabilidad de la membrana, bombas de eflujo que, como su nombre lo indica, expulsan el antibiótico y alteración de las proteínas de unión a penicilina o PBPs (del inglés: penicillin binding protein), cuando son blanco de este tipo de fármacos (Tiwari et al., 2012). Con relación a los cambios en las OMPs se han descrito alteraciones en proteínas como la CarO asociada con resistencia a meropenem e imipenem (Mussi et al., 2007) y la OmpW, la cual es homóloga a las OmpW encontradas en E. coli y P. aeruginosa, que disminuye la entrada de colistina y de los β-lactámicos al interior de la bacteria (Peleg et al., 2008; Tiwari et al., 2012). También se ha descrito una OMP de 43 kda perteneciente a la familia de las OprD (OprD-like), relacionada con cierre de porinas para imipenem. Dentro de las bombas de eflujo, la más estudiada es el sistema AdeABC, que puede expulsar β-lactámicos (incluyendo carbapenémicos), aminoglicósidos, macrólidos, cloranfenicol, tigeciclina, tetraciclinas, fluoroquinolonas y trimetoprim. A. baumannii puede llegar a poseer bombas de eflujo de las cinco superfamilias como: ABC, SMR, MATE, MFS y RND esta última a la cual pertenecen los sistemas adeabc, adeijk, adefgh, adexyz, adede (Coyne et al., 2011) Aminoglicósidos: existen diferentes enzimas modificantes de aminoglicósidos y bombas de eflujo que confieren resistencia a este grupo de antibióticos (Lee et al., 2011). Las enzimas modificantes (acetiltransferasas -AAC-, nucleotiltransferasas -ANT- y

31 Capitulo 1 17 fosfotransferasas -APH-) producen diferentes fenotipos de resistencia selectiva en los aminoglicósidos (Akers et al., 2010). Sin embargo, cuando estas enzimas se combinan con bombas de eflujo como la AdeABC pueden conferir resistencia a todos los aminoglicósidos (Vila and Marco, 2010). La metilación de la subunidad 16S del rrna mediada por el gen arma también ha sido descrita en A. baumannii y al actuar sobre el blanco de acción de los aminoglicósidos también confiere resistencia a todos ellos (Akers et al., 2010). La gentamicina y la kanamicina también son sustratos para la bomba AbeM (Peleg et al., 2008). Quinolonas: la resistencia a quinolonas está mediada por mutaciones en los genes gyra y parc que codifican para las subunidades A del ADN girasa y la topoisomerasa IV, respectivamente (Lee et al., 2011). Las quinolonas son sustratos de las bombas AdeABC y la AbeM (Peleg et al., 2008) Tetraciclinas y glicilciclinas: la resistencia de A. baumannii a este grupo de antibióticos está mediada por bombas de expulsión y proteínas de protección ribosomal. Las bombas de expulsión incluyen TetA y TetB, codificadas por los genes tet(a) y tet(b); la primera confiere resistencia solo a tetraciclina, mientras que la segunda expulsa tetraciclina y minociclina (Coyne et al., 2011). La codificación de las proteínas de protección ribosomal está mediada por el gen tet(m), en un mecanismo idéntico al descrito en Staphylococcus aureus, pero que se encuentra poco en A. baumannii (Peleg et al., 2008). La bomba expulsión AdeABC también puede expulsar tetraciclinas y la tigecilina. Colistina: la resistencia a colistina ha sido asociada con los genes pmra y pmrb que originan cambios en genes relacionados con la modificación del lípido A, con la pérdida o deficiencia de la producción de lipopolisacárido y con la modificación de la porina OmpW (Adams et al., 2009) (Moffatt et al., 2010). Trimetoprim, sulfonamidas y cloranfenicol: la resistencia a sulfonamida está mediada por el gen sul que se encuentran en la región 3 de un integrón (Peleg et al., 2008). El gen dhfr confiere resistencia a trimetoprim, mientras que la bomba de eflujo CraA (del inglés: chloramphenicol resistance Acinetobacter) confiere resistencia a cloranfenicol. La bomba

32 18 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria AdeABC también confiere resistencia a estos dos últimos antibióticos (Akers et al., 2010; Peleg et al., 2008) 1.5 Perfiles fenotípicos de resistencia Antibiograma El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su realización se desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia clínica. El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población bacteriana. Se obtiene como resultado, la farmacología del antimicrobiano, en particular en el lugar de la infección, y los aspectos clínicos del paciente y de su infección, sustentan la elección de los antimicrobianos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas (Cantón et al., 2000). Los métodos más frecuentemente utilizados en Microbiología Clínica para la determinación de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos se basan en un estudio fenotípico. Estos métodos requieren normalmente un tiempo de unas 24 h para la obtención de resultados, es importante entender que para la interpretación del antibiograma es indispensable conocer la especie bacteriana que se está estudiando (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). A continuación, se describen brevemente algunos métodos básicos utilizados y aceptados para el estudio de la sensibilidad Métodos de difusión Método del antibiograma disco-placa El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los métodos que el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) antes llamado National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. El antibiograma discoplaca consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de Petri previamente

33 Capitulo 1 19 inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica (Cantón et al., 2000). Las ventajas de este método de disco-placa son: fácil de realizar, rápido y barato. Es una metodología aplicable a una amplia variedad de bacterias, fundamentalmente bacterias aerobias no exigentes de crecimiento rápido como Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Acinetobacter spp., Staphylococcus spp. y Enterococcus spp. Además, con ligeras modificaciones, puede ser aplicado a Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus spp (Cantón et al., 2000). Método del Epsilon test El principio de este método es una expansión de la técnica de difusión en disco. En el método E-test (AB Biodisk, Suecia) podemos, mediante lectura directa, determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI). Consiste en una tira de plástico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15 diluciones. El protocolo para preparar el inóculo es el mismo que para la difusión en disco. Siguiendo el método de difusión, una vez inoculado la placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira de Etest sobre su superficie, produciéndose de forma inmediata una difusión del antibiótico desde el soporte hasta el agar, creándose de este modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubación de las placas, se puede observar una zona de inhibición elipsoidal y simétrica. Después de la incubación la CMI será el valor obtenido en el punto en el que el extremo de inhibición intersecciona con la tira (Cantón et al., 2000). Desventajas con respecto al método anterior si se coloca la tira al revés no se observa elipse de inhibición ya que el gradiente de concentraciones se sitúa solo sobre una de las caras de la tira. Además, en algunos casos como la prueba de la vancomicina con S.

34 20 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria pneumoniae, la CMI es más alta utilizando el E-test que la obtenida por los métodos de microdilución, produciendo resultados que se encuentran en el rango superior de aislamientos susceptibles y con resultados de control de calidad por encima de los límites aceptables. Por otro lado, este método es muy útil para determinar la CMI de diversos antibióticos en una amplia gama de bacterias, incluyendo Helicobacter pylori, Corynebacterium spp., estreptococos nutricionalmente deficientes, enterococos con resistencia elevada a aminoglicósidos (Cantón et al., 2000) Métodos de dilución Estos métodos se basan en la determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o agar). Tradicionalmente estos métodos se han venido usando para la determinación de la CMI y la concentración mínima bactericida (CMB) de los antimicrobianos. En la mayoría de los casos se preparan diluciones del antimicrobiano en fase logarítmica utilizando un medio de cultivo adecuado; posteriormente se inocula dicho medio y tras la correspondiente incubación para permitir el crecimiento del microorganismo se realiza la lectura, determinando qué concentración causa la inhibición del crecimiento del microorganismo (Cantón et al., 2000). Las primeras determinaciones se realizaron empleando una cantidad considerable de tubos con caldo de cultivo, a los cuales se le colocaban diluciones crecientes de antibióticos con el mismo fundamento que el descrito para el método de dilución en agar. Este procedimiento se denominó macrodilución en caldo. Esta metodología es muy engorrosa, por la cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su realización. La utilización de micropipetas y de placas de microtitulación facilitó la utilización del método de microdilución en caldo; en la actualidad se han popularizado los métodos automatizados comerciales de microdilución en caldo, fácilmente integrables en sistemas semiautomáticos de lectura e interpretación de resultados, pero con el grave inconveniente del incremento de su costo (Cantón et al., 2000) Otros métodos Citometría de flujo

35 Capitulo 1 21 La citometría de flujo es un proceso que permite que las partículas (generalmente células) pasen en fila dentro de un flujo a través del aparato con una intensidad de partículas/s. Cuando esto sucede, es posible realizar la medición simultánea de múltiples características de una sola célula, de tal forma que es posible caracterizar, separar y cuantificar las diferentes subpoblaciones celulares que se engloban en un conjunto. A principios de la década de los ochenta aparecen los primeros estudios en los que se demuestra la aplicación de la citometría de flujo fluorescente en la determinación de la sensibilidad de bacterias. Posteriormente se han utilizado otros fluorocromos con el fin de obtener información sobre diversos parámetros bacterianos, como el potencial de membrana, el tamaño celular, la cantidad de ADN o la actividad enzimática (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Quimioluminiscencia La quimioluminiscencia es un proceso de relajación radiante que tiene lugar cuando en una reacción química se genera una especie excitada electrónicamente. La bioluminiscencia es una forma de quimioluminiscencia que aparece como consecuencia de una reacción química que tiene lugar en los organismos vivos, como por ejemplo luciérnagas (insectos de la familia Lampyridae). En esta reacción química, la sustancia luminiscente luciferina es oxidada, en presencia de adenosín trifosfato (ATP), por la acción catalítica de la enzima luciferasa. El sistema bioluminiscente de las luciérnagas tiene muchas aplicaciones analíticas, dado que la enzima luciferasa posee una gran especificidad por determinados sustratos y, además, la cantidad de luz producida es directamente proporcional a la cantidad de ATP de la reacción. Los trabajos realizados sobre la determinación de la sensibilidad bacteriana mediante bioluminiscencia se fundamentan en la medida de los niveles de ATP bacteriano de origen intracelular, extracelular o total. Para calcular la CMI mediante bioluminiscencia se compara la señal de ATP obtenida a partir de microorganismos incubados sin la presencia de antibiótico (grupo control) con la señal obtenida a partir de microorganismos incubados en presencia de antibiótico a diferentes tiempos, formulando así diferentes criterios de sensibilidad. Con respecto al grupo control, si se mide el ATP intracelular las cepas sensibles al antibiótico estudiado van a proporcionar una disminución de la señal de bioluminiscencia; si se mide el ATP extracelular las cepas sensibles van a producir un aumento de la señal, y si se mide el ATP total las cepas sensibles van a proporcionar una disminución de la señal de ATP. En cambio, si el microorganismo es resistente al antibiótico las medidas del grupo control

36 22 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria serán prácticamente iguales que las obtenidas a partir de las cepas a estudiar (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Espectrometría de masas La espectrometría de masas (MALDI-TOF) es una herramienta basada en espectrometría de masas que permite obtener en unos minutos la identificación de microorganismos tales como bacterias (incluyendo micobacterias), levaduras y hongos filamentosos. La denominación «MALDI» proviene de Matrix-Assisted Laser Desorp-tion/Ionization, y «TOF» alude al analizador de iones que se acopla al MALDI, que es del tipo de tiempo de vuelo (time of flight). Para realizar el análisis mediante MALDI-TOF es necesario que las proteínas de los microorganismos se ionicen. Para ello, las colonias de microorganismos se depositan sobre la placa portamuestras y a continuación sobre esa muestra se deposita una disolución matriz. A continuación, la placa es introducida en la cámara de alto vacío, donde la superficie cristalina de la muestra es expuesta a disparos de un láser de longitud de onda en la zona ultravioleta del espectro, con lo que la matriz absorbe la energía del láser produciendo se la sublimación del analito y de la matriz. Ya en fase gaseosa, la estabilización de la matriz tiene lugar mediante la liberación de protones que, en parte, son captados por las proteínas de las bacterias, generándose fragmentos de proteínas con carga positiva. Mediante un electrodo se genera un campo eléctrico que acelera los iones formados desde las proximidades de la muestra hacia el analizador de masas. De esta forma, los iones entran en un tubo (de 1 a 4 m de longitud) con la misma energía cinética y siguiendo una trayectoria lineal. Así, el tiempo que tardan los iones en recorrer el tubo es proporcional a la relación masa/carga (m/z) de los mismos. En última instancia está el detector de los iones previamente separados (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). En referencia al antibiograma rápido, el sistema MALDI-TOF permite predecir en unas horas si las bacterias poseen enzimas que degradan los antibióticos. Para ello, los microorganismos previamente aislados en las placas de cultivo deben ser incubados durante un tiempo con el antibiótico. Posteriormente, con el análisis realizado mediante el sistema MALDI-TOF se observa, en caso de que el microorganismo posea la enzima responsable de la degradación del antibiótico, la desaparición del pico correspondiente al antibiótico y la aparición de nuevos picos que corresponden a los metabolitos resultantes

37 Capitulo 1 23 de la rotura del antibiótico. En caso de que la bacteria no hidrolice el antibiótico, se observa únicamente el pico correspondiente al antibiótico (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Métodos colorimétricos Las diferentes metodologías basadas en procedimientos colorimétricos requieren unas 6 horas para poder informar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos y han mostrado muy buenos resultados. La resazurina es un compuesto que, cuando se añade a un cultivo bacteriano en medio líquido resistente al antibiótico con el que es incubado, es reducida por la actividad metabólica de la bacteria. En cambio, si la bacteria es sensible al antibiótico se detiene su metabolismo, con lo que la resazurina permanece en su forma oxidada. Dado que la forma reducida de resazurina es estable y de color azul, y fotométricamente distinguible de la forma oxidada, que es de color rojo, la viabilidad celular puede ser monitorizada mediante espectrofotometría, colorimetría o fluorometría (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Otro método colorimétrico consiste en la medición de la actividad de la enzima bacteriana nitrato reductasa. Cuando se incuba la bacteria en presencia de iones NO3 y antibiótico, si la bacteria es resistente al antibiótico se van a generar iones NO2 que, con los reactivos de Gries, originan un compuesto de color rojo (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Nefelometría La nefelometría es otra técnica analítica basada en la dispersión de luz que permite realizar un antibiograma rápido. El sistema UroQuick o HBandL (Alifax, Padua, Italia), diseñado para realizar un cribado de muestras de orina, detecta la presencia de microorganismos en un tubo que contiene un medio de enriquecimiento dado que el crecimiento de estos causa una desviación de la luz medible mediante los correspondientes detectores. Las señales obtenidas son procesadas por un software que monitoriza las curvas de crecimiento. De este modo, este sistema es capaz de informar la concentración microbiana de la muestra. Este equipo ha sido aplicado con éxito para realizar la detección fenotípica de diversos mecanismos de resistencia de cepas caracterizadas genéticamente o fenotípicamente, requiriendo 24 horas para bacterias grampositivas y 8 horas para bacterias gramnegativas (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Microfluidos

38 24 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Los avances en nanotecnología han posibilitado la miniaturización de los diferentes ensayos usados para la detección de las resistencias a los antibióticos desarrollando plataformas o chips que utilizan volúmenes muy pequeños de muestra y de reactivos, y que además pueden albergar múltiples ensayos como cultivo bacteriano, hibridación y amplificación de ácidos nucleicos y rotura celular, entre otros. De este modo, los métodos de detección varían ampliamente, dependiendo del ensayo realizado. Entre las diferentes posibilidades se tiene por ejemplo que para realizar de un antibiograma directamente a partir de muestras de orina utilizando un sistema de microfluidos que incorpora un sensor electroquímico para la cuantificación del ARN ribosómico16s. Este grupo obtiene, en 3 h y media, un 94% de concordancia con la sensibilidad obtenida mediante microdilución en caldo (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Métodos de lisis bacteriana Otra metodología para la determinación de la sensibilidad consiste en la detección de la lisis bacteriana. Para ello, la bacteria es incubada con la presencia del antibiótico a la concentración deseada; seguidamente la bacteria se inmoviliza en un microgel de agarosa y es expuesta a una solución de lisis que produce la liberación del ADN. Posteriormente, la preparación es incubada con el fluorocromo SYBR Gold y mediante observación al microscopio de fluorescencia es posible estudiar la integridad del ADN. Esta metodología requiere menos de 2 horas y ha sido aplicada tanto a bacterias gramnegativas como grampositivas (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016) Los sistemas automatizados La micro dilución en caldo es la técnica utilizada por los diversos sistemas automatizados comerciales como el MicroScan Walkaway (Siemens, Nueva York, EE. UU.), Phoenix (BD Diagnostics, Sparks, MD, EE. UU.) o VITEK (biomérieux, Marcy l Etoile, Francia). Para la interpretación de los resultados de sensibilidad obtenidos mediante las técnicas anteriormente citadas se siguen las normas del antibiograma publicadas por diversos organismos, como el CLSI y el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). En el trabajo de rutina, todas estas técnicas se aplican a partir de las colonias crecidas en las placas de aislamiento; los métodos Phoenix y VITEK, que son los más

39 Capitulo 1 25 rápidos, requieren un tiempo medio mínimo de 9 h para obtener los resultados (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Entre las ventajas de estos sistemas tenemos: El Impacto clínico dada por la rapidez en el informe de resultado (3-10 horas vs horas con los métodos manuales) adicional a la reducción de costos por concepto de menos días de hospitalización y menos exámenes de laboratorio junto con la posibilidad de dar inicio o cambiar precozmente el antibiótico. La estandarización y control de calidad debido al aumento de la reproducibilidad intra e inter laboratorio. La disminución de la carga de trabajo porque requiere menos personal en métodos que determinen CMI. La disminución de errores post-analíticos al evitar la transcripción errónea de resultados por disponer de programas de comunicación bidireccional. La identificación de patrones fenotípicos de resistencia además de la posibilidad de indicar la sospecha de presencia de β lactamasas de espectro extendido y otras β-lactamasas. La facilidad de obtención de estadísticas junto con la capacidad de almacenar y procesar la información para un análisis de tendencias anuales de susceptibilidad. Por último, también se facilita el control en el uso de antimicrobianos por la posibilidad de generar un informe con los resultados en línea con farmacia (García C., 2002). Entre las desventajas de estos sistemas automatizados tenemos: el alto costo dado porque el equipamiento y los insumos (paneles o tarjetas) son de alto costo. Se requiere de un método de respaldo frente a falla en el equipo por lo tanto es necesario disponer de un equipo de respaldo o de una metodología manual de respaldo. No existen normas CLSI para sistemas automatizados, sin embargo, deben considerarse en los métodos empleados (puntos de corte o CIM). La poca flexibilidad en los antimicrobianos ensayados porque los paneles o tarjetas estás determinadas por el fabricante. Se presentan discrepancias con los métodos convencionales o están aún en evaluación, esto es válido para bacterias fastidiosas como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, para algunos bacilos Gramnegativos no fermentadores, para anaerobios y para algunos antimicrobianos específicos como cefepime en Pseudomonas aeruginosa falsas resistencias o falsas susceptibilidades a imipenem en Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii o Enterococcus de susceptibilidad intermedia a vancomicina. Es conocido también que algunas β-lactamasas inducibles en bacilos Gram negativos requieren una incubación más prolongada para expresar la resistencia (García C., 2002).

40 26 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Otro estudio llevado a cabo con 112 aislamientos de A. baumannii sugiere que el sistema Vitek2 y Phoenix llevó a cabo confiablemente pruebas de susceptibilidad para imipenem contra A. baumannii. El sistema MicroScan WalkAway no logró detectar con precisión la resistencia a imipenem en la colección de aislamientos de A. baumannii resistentes a carbapenemasas (Kulah et al., 2009) Microarreglos y técnicas moleculares Microarreglos La metodología de los microarreglos consiste en el uso de un sustrato sólido que contiene un gran número de moléculas de ácido nucleico de una sola cadena. Fragmentos de ácido nucleico a los que se les denomina normalmente sondas. Los ácidos nucleicos de las muestras a analizar suelen ir marcadas mediante diversos métodos (enzimáticos, fluorocromos, etc.) y se incuban en contacto con las sondas, permitiendo así la hibridación a las sondas complementarias. Finalmente, mediante las herramientas informáticas es posible determinar en las muestras la secuencia de los ácidos nucleicos, detectar pequeñas variaciones en la secuencia de los genes o estudiar la expresión de genes. De este modo, para el estudio de la sensibilidad, los microarreglos permiten la detección de un gran número de genes de resistencia en un solo ensayo, caso contrario de lo que ocurre en la reacción en cadena de la polimerasa PCR. En bacterias gramnegativas es posible detectar, en unas horas, un gran número de genes que codifican para diferentes β- lactamasas (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Las técnicas moleculares Las técnicas moleculares permiten la detección de material genético, tanto ácido desoxirribonucleico (ADN) como ácido ribo-nucleico (ARN). De entre todas las técnicas moleculares utilizadas, PCR es la que ha adquirido un mayor valor diagnóstico, permitiendo la detección de agentes infecciosos, además de caracterizar sus genotipos de virulencia y de resistencia. El primer paso de la PCR consiste en una extracción del material genético, seguido de la desnaturalización térmica del ADN que se va a usar como molde, el anillamiento de cebadores sintéticos y la extensión catalizada por el ADN polimerasa de

41 Capitulo 1 27 los oliogonucleótidos anillados que actúan como cebadores. Este proceso de 3 pasos se repite un número determinado de veces (de 25 a 35), duplicándose cada vez el número de moléculas de producto. Esta amplificación exponencial tiene como resultado un gran número de copias de la secuencia de ADN, lo que le confiere una elevada sensibilidad (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Los importantes avances en el conocimiento de las bases genéticas de la resistencia a antibióticos han permitido que distintas PCR puedan detectar, en unas horas, la presencia de genes de resistencia a una gran variedad de antibióticos para un gran número de especies bacterianas. Además, la PCR a tiempo real ha sido utilizada para monitorizar el crecimiento bacteriano mediante la detección de los genes de resistencia cuando las bacterias han sido incubadas en presencia del antibiótico a ensayar (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016). Las ventajas de estos métodos están representadas por tiempos de respuesta más cortos en comparación con otros métodos nombrados anteriormente. Una mayor sensibilidad, especialmente con pacientes que ya han recibido agentes antimicrobianos antes de las pruebas microbiológicas, situación particularmente común entre los pacientes pediátricos. La posibilidad de realizar pruebas también con muestras polimicrobianas; una mayor fiabilidad en la detección de algunos fenotipos de resistencia. Las desventajas de estas técnicas moleculares están representadas por los altos costos y por el riesgo de subestimar la resistencia. De hecho, estos sistemas solo son capaces de detectar los genes de resistencia dirigidos por las sondas y no detectarán otros determinantes de resistencia. Además, utilizando estos sistemas, existe también la posibilidad de sobrestimar la resistencia porque la presencia de un gen de resistencia no está necesariamente asociada con la expresión de un fenotipo de resistencia (el gen podría estar inactivado o no expresado) (Arena et al., 2015) Secuenciación del genoma completo Otra técnica molecular disponible para realizar un antibiograma rápido es la secuenciación del genoma completo (WGS). Los avances en la secuenciación del ADN han posibilitado secuenciar un genoma bacteriano completo en horas. Una vez obtenida esta gran cantidad de datos, los programas bioinformáticos se encargan de su procesamiento y análisis. De este modo, esta técnica puede utilizarse para el estudio de determinantes genéticos de

42 28 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria resistencias antibióticos (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016), como en el estudio realizado por Zankari et al. 2013, donde utilizan la secuenciación del genoma completo para caracterizar los perfiles de resistencia de 200 aislados bacterianos pertenecientes a 4 especies bacterianas. Cuando se comparan los resultados obtenidos mediante secuenciación con los obtenidos mediante métodos fenotípicos obtienen un 99,74% de concordancia, demostrando así que la sensibilidad obtenida mediante secuenciación puede correlacionar bien con la sensibilidad obtenida mediante métodos fenotípicos. Para la secuenciación del genoma completo se usó la plataforma Illumina paired-end y para identificar los genes de resistencia a los antimicrobianos se usó el servicio web ResFinder (que se contemplara más adelante). Tras las mejoras recientes en las tecnologías de secuenciación, la WGS se posiciona como una herramienta que puede ser esencial en el control de la resistencia a los antibióticos, una amenaza importante en la salud moderna. La WGS ya ha encontrado numerosas aplicaciones en esta área, desde el desarrollo de nuevos antibióticos y pruebas diagnósticas hasta la administración antibiótica de los fármacos actualmente disponibles a través de la vigilancia y la elucidación de los factores que permiten la aparición y persistencia de la resistencia. Numerosos estudios de prueba de principio también han puesto de relieve el valor de la WGS como una herramienta para el control diario de la infección y, para algunos patógenos, como una herramienta de diagnóstico primaria para detectar la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, las plataformas de análisis de datos apropiadas deberán ser desarrolladas y/o mejoradas antes de que la WGS de rutina pueda ser introducida a gran escala (Köser et al., 2014, p.). 1.6 Aplicaciones y bases de datos sobre resistencia a antibióticos Es importante resaltar que la presente Tesis de Maestría no pretender hacer una evaluación comparativa (benchmarking) sobre las diferentes aplicaciones o bases de datos que se nombran para identificar la resistencia a antibióticos.

43 Capitulo 1 29 Existen algunas bases de datos sobre genes asociados a la resistencia a antibióticos que solo sé que quedan hasta allí es decir solo poseen el repositorio, hay otras que además proveen una aplicación para obtener alguna aproximación a un perfil genómico de resistencia a antibióticos basado en diferentes métodos que se presentan a continuación Bases de datos Activas CARD (The comprehensive antibiotic resistance database) La base de datos CARD es un recurso curado manualmente que contiene datos de referencia de alta calidad sobre la base molecular de la resistencia antimicrobiana (siglas en inglés AMR), con énfasis en los genes, proteínas y mutaciones involucradas en AMR. CARD está estructurado ontológicamente, centrado en el modelo, abarca una amplitud de las diferentes clases de fármacos y los mecanismos de resistencia, incluyendo la resistencia intrínseca, dada por las por mutaciones y resistencia adquirida. Se basa en la Ontología de Resistencia a los Antibióticos (siglas en ingles ARO, Antibiotic Resistance Ontology), una construcción personalizada y un vocabulario contralado jerárquicamente que permite compartir datos. Su diseño permite el desarrollo de herramientas de análisis del genoma novedoso, como el identificador de genes de resistencia (RGI, Resistance Gene Identifier) para la predicción de resistomas a partir de la secuencia del genoma sin procesar. Las mejoras recientes incluyen una extensa curación de las secuencias de referencia y secuencias mutadas, el desarrollo de un modelo ontológico único, acompañado de un modelo de detección de AMR que mejora el análisis de secuencias, nuevas herramientas de visualización y la expansión del RGI para la detección de amenazas emergentes de AMR. CARD curada se actualiza mensualmente sobre la base de una interacción de la recuperación manual de la literatura, la minería de texto computacional y análisis de genoma (Jia et al., 2017). Es más que una simple base de datos, porque posee una aplicación que le permite la aproximación a un perfil genómico de resistencia, y la forma de visualizar vía web. Este sistema se encuentra alojado por: A Canada UK joint health research programme on antibiotic resistance. En la siguiente url: ResFINDER

44 30 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria La base de datos ResFINDER posee un repositorio de genes adquiridos que son capaces de conferir resistencia a los antibióticos (secuencias completas o parciales, así como genomas completos y secuencias de plásmidos) No se hace distinción entre genes adquiridos y genes mutados ResFinder posee una aplicación basado en la web, que utiliza BLAST para la identificación de los genes de resistencia a los antimicrobianos adquiridos en los datos del genoma completo. Como entrada, el método puede usar genomas pre-ensamblados, completos o parciales, y lecturas de secuencias cortas de cuatro plataformas de secuenciación diferentes tales como: 454, Illumina, Ion Torrent y SOLiD. La versión inicial del método fue evaluado en 1862 archivos en el GenBank, que contenían 1411 diferentes genes de resistencia, así como en 23 secuencias de aislamientos de novo (Zankari et al., 2012). También posee una herramienta Web para identificar los replicones de plásmidos llamada Plasmid Finder y la identificación de especies basadas en alelos MLST (por sus siglas en inglés, Multilocus sequence typing). Adicionalmente vía Web se puede visualizar un perfil de resistencia genómico, además la base de datos esta curada y se actualiza periódicamente. Este sistema se encuentra alojado en: Center for Genomic Epidemiology, Denmark. University, Denmark. En la siguiente url: Lahey Clinic website La base de datos Lahey, es un repositorio de referencias a fuentes para información de secuencias de β-lactamasas, con grupos de enzimas tales como: TEM, SHV, OXA-, CTX- M-, CMY, AmpC, CARB-, IMP-, VIM-, KPC, GES-, PER- y VEB-, entre otros, además Quinolonas (genes qnr).

45 Capitulo 1 31 Surgió como un intento por estandarizar la nomenclatura para el número creciente de ß- lactamasas TEM. El objetivo de esta base de datos estaba orientado en hacer más fácil a los investigadores la identificación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo a las secuencias reportadas (Bush and Jacoby, 1997). Principalmente este repositorio se fundamenta en la nomenclatura y en un esquema de numeración propuesto con el fin de evitar duplicaciones. Es de aclarar, que no usa herramienta BLAST. Es curada por Karen Bush y George Jacoby y Actualizada por la comunidad científica. Esta base de datos se encuentra alojada en: Lahey Clinic, USA. En la siguiente url: LacED (The lactamase engineering database) Esta base de datos actualmente posee únicamente genes que codifican para las β- lactamasas de tipo TEM y SHV. Proporcionando información sobre las secuencias de mutaciones y estructuras de estas. Se centra en la nomenclatura y en la identificación de variantes conocidas y desconocidas y de esta forma asignar nuevas ß-lactamasas, identificar inconsistencias en bases de datos públicas y facilitar la ingeniería de proteínas. La última vez que se actualizó el grupo SHV fue el 6 de abril de 2010, esta sección no recibe mantenimiento. Mientras que el grupo TEM hace parte de la base de datos del sistema BioCatNet y se encuentra actualizado Esta base de datos se encuentra alojada en: Institute of Technical Biochemistry, University of Stuttgart, Germany. En la siguiente url: OXY, OKP, LEN beta-lactamase protein variation Home Page

46 32 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Inicialmente es una base de datos que aloja los alelos de los tipos de β-lactamasas: OXY, OKP y LEN (sin genes de resistencia a antibióticos adquiridos). Se centra en la armonización de la nomenclatura de genes. No hay una herramienta BLAST en esta base de datos La nomenclatura de beta-lactamasas OKP, LEN y OXY está curada y se mantiene dentro de esta base de datos. La curación de datos se realiza de forma voluntaria y se basa en un esfuerzo comunitario. Estos datos hacen parte de un compendio de datos mucho más grande del Instituto Pasteur, como los datos genotípicos de los aislados de K. pneumoniae basados en MLST, core genome MLST (cgmlst), ribosomal MLST (rmlst), tipificación capsular (secuenciación wzc y wzi), genes de resistencia a los antimicrobianos y genes de virulencia. La base de datos se encuentra alojada en: Institut Pasteur, France. En la siguiente url: =downloadalleles. Bajo la sección Beta-lactamase genes. MARILYN C. ROBERTS, Ph. D personal website Es una base de datos que se centra en la armonización de la nomenclatura de los genes resistentes a Macrolides y tetracyclines principalmente. No usa la herramienta BLAST. Se encuentra alojado en: University of Washington, USA. En la siguiente url: Attaca-RAC (Repository of antibiotic resistance cassettes) Es un repositorio de Cassettes de genes de resistencia a antibióticos en integrones de resistencia a múltiples fármacos.

47 Capitulo 1 33 Posee un archivo de cassettes de genes que incluye nombres de genes alternativos de múltiples sistemas de nomenclatura, además permite la anotación y el nombre constantes de los cassettes en las secuencias presentadas Este sistema es una aplicación en línea que permite a los usuarios: Navegar y explorar el depósito de cassettes de genes. Anotar las secuencias de cassettes utilizando una base propia de conocimientos y el motor de anotación Attacca. Finalmente, puede aportar nuevos cassettes que aún no están en la base de datos y obtener nombres únicos para ellos (Tsafnat et al., 2011). Esta base de datos se encuentra alojada en: Centre for Health Informatics at UNSW, Australia, in collaboration with the Centre for Infectious Diseases and Microbiology, Westmead, UK. En la siguiente url: INTEGRALL (Repository of antibiotic resistance cassettes) Es un repositorio de acceso libre, que posee un sistema de búsqueda basado en texto, desarrollado con el objetivo de recolectar y organizar información sobre integrones en una sola base de datos. Proporciona un repositorio genético público para la secuencia de datos y nomenclatura, ofreciendo acceso a las secuencias de ADN de los integrones, sus arreglos moleculares, así como sus contextos genéticos (Moura et al., 2009). A la fecha posee 1509 Genes integrasa, 8561 Cassettes de genes, en 167 Géneros y 375 Especies. Esta base de datos se encuentra alojada en: Universidade de Aveiro, Portugal. En la siguiente url: Bases de datos No Activas ARG-ANOTT (Antibiotic resistance gene-annotation) Esta base de datos posee un repositorio de genes adquiridos que son capaces de conferir resistencia a los antibióticos (completa o parcialmente secuenciados) Se hace una distinción entre los genes adquiridos y los genes mutados

48 34 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Es una herramienta bioinformática capaz de detectar genes existentes y posibles nuevos genes de resistencia a los antibióticos. Se basa en un programa que usa BLAST local con un software llamado Bio-Edit que permite el análisis de secuencias por línea de comando entre otras características (Gupta et al., 2014). Este programa funciona en Windows 95/98/NT/2000/XP/7. La versión actual es la 7.2.5, actualizada por última vez el 12/11/2013, ya no se le hace mantenimiento. Este sistema se encuentra alojado en: The Méditerranée Infection Foundation, France. En la siguiente URL: RED DB (Resistance determinants database) Esta base de datos posee un repositorio de genes adquiridos que son capaces de conferir resistencia a los antibióticos (completa o parcialmente secuenciados) No se hace distinción entre genes adquiridos y genes mutados Es una herramienta bioinformática que es capaz de detectar genes de resistencia a antibióticos existentes y putativos. Los datos que tiene no son curados. El sitio esta deshabilitado. La base de datos se encuentra alojada en: Università di Siena, Italy. En la siguiente url: Resfam

49 Capitulo 1 35 Es una base de datos curada de las familias de proteínas y perfiles asociados a modelos ocultos de Markov (Por sus siglas en inglés HMMs, Hidden Markov Model), confirmados para función de resistencia a antibióticos y organizados por ontología (Gibson et al., 2015). La última versión fue la 1.2 y la última vez que fue actualizada fue el 27 de enero del año Esta base de datos no ha vuelto a tener mantenimiento. La base de datos se encuentra alojada en: Center for Genome Sciences and Systems Biology, Washington University in St. Louis School of Medicine, USA (Dantas laboratory). En la siguiente url: ARDB (base de datos de genes de resistencia a antibióticos) Es un repositorio de genes adquiridos que son capaces de conferir resistencia a los antibióticos (completa o parcialmente secuenciadas). No se hace distinción entre genes adquiridos y genes mutados Es una herramienta bioinformática que es capaz de detectar genes de resistencia a antibióticos existentes y putativos (Liu and Pop, 2009). La última actualización que tuvo fue el 3 de julio de 2009, no recibe mantenimiento, pero esta base de datos fue la base para CARD (The comprehensive antibiotic resistance database) La base de datos se encuentra alojada en: Center for Bioinformatics and Computational Biology, University of Maryland, USA. En la siguiente url: MBLED (Metallo-betalactamase engineering database) Es una base de datos de Metallo-β-lactamasas que proporciona información sobre mutaciones, secuencias y estructuras de las β-lactamasas clase B, subclases B1, B2 y B3. Esta base de datos no hace uso de la herramienta BLAST.

50 36 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria La última versión publicada fue la 1.0, y la última vez que se actualizó fue el 30 de abril de No recibe mantenimiento. La base de datos se encuentra alojada en: Institute of Technical Biochemistry, University of Stuttgart, Germany. En la siguiente url: Otras herramientas Las siguientes herramientas computacionales proveen visualmente perfiles de resistencia genómicos. ARIBA: Antimicrobial Resistance Identification by Assembly Es una herramienta de Sanger Institute que identifica los genes de resistencia antibiótica ejecutando alineamientos locales. También se puede utilizar para identificación por MLST. La entrada es un archivo FASTA de secuencias de referencia (puede ser una mezcla de genes y secuencias no codificantes) y lecturas de secuencias emparejadas. ARIBA informa cuáles de las secuencias de referencia fueron encontradas, además de proveer información detallada sobre la calidad de los ensamblajes y cualquier variante entre las lecturas de secuenciación y las secuencias de referencia. ARIBA a la fecha requiere las siguientes dependencias, preinstaladas: Python3 versión 3.3.2, Bowtie2 versión 2.1.0, CD-HIT versión 4.6 y MUMmer versión Además, las siguientes dependencias de varios paquetes de Python. Dendropy 4.2.0, matplotlib, pyfastaq , pysam y pymummer Se encuentra en la siguiente url: Mykrobe Predictor Está diseñado para ser utilizado por microbiólogos y médicos, proporcionando la información necesaria para elegir el mejor tratamiento. Analiza todo el genoma de una

51 Capitulo 1 37 muestra bacteriana, en un par de minutos, y predice a qué fármacos es más resistente de acuerdo al tipo de infección. Funciona con una base de conocimiento curada de alelos resistentes y susceptibles, ensamblados en un gráfico de Bruijn de acuerdo a diferentes antecedentes genéticos, junto con muchos ejemplos de genes de resistencia. Esto forma un gráfico de referencia. Luego compara directamente el gráfico de Bruijn de la muestra con el gráfico de referencia. Esto da como resultado las pruebas estadísticas para la presencia de alelos de resistencia que no son imparciales por elección de referencia o suposiciones de clonalidad (Bradley et al., 2015). Corre en los sistemas operativos: Windows, Mac OS X, Linux. Requiere más o menos 300Mb of RAM. El Tiempo de ejecución es entre 40 segundos y 3 minutos. Soporta secuenciación por Illumina y Nanopore (en desarrollo) De momento solo funciona para 2 bacterias, Staphylococcus aureus y Mycobacterium tuberculosis, Sin embargo, este software aún no está certificado para uso clínico. Se encuentra en la siguiente url:

52 38 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria 2. Objetivos 2.1 General Diseñar e implementar un sistema de información para la identificación de los elementos genómicos asociados a los mecanismos de resistencia que permitan predecir el perfil de resistencia de una bacteria. 2.2 Específicos Identificar los elementos genómicos asociados a los mecanismos de resistencia en las secuencias de los genomas de A. baumannii obtenidas por WGS Establecer un modelo de correlación entre los elementos genómicos asociados a los mecanismos de resistencia y el perfil fenotípico de resistencia. Diseñar e implementar una herramienta informática que permita almacenar y automatizar la Identificación de los elementos genómicos asociados a los mecanismos de resistencia. Probar la lógica y funcionalidad de la herramienta con la colaboración de expertos y usando datos reales.

53 3. Metodología La presente tesis de maestría parte de la idea de solucionar el problema de identificar los elementos genómicos de resistencia asociados a los mecanismos de resistencia para obtener un perfil de resistencia a los antibióticos en Acinetobacter baumannii, haciendo la evaluación de los elementos genómicos de resistencia desde el nivel de los aminoácidos que están codificados en el elemento genómico (no comparando los elementos genómicos desde nucleótidos como lo hace el programa ResFinder, este programa está mencionado en el subcapítulo 1.6.1), por lo cual se requiere un proceso de anotación depurado y específico que permita cumplir esta necesidad. De este modo el proceso de ensamblaje, pero aún más el de anotación de los genomas es de suma importancia. Para luego pasar a evaluarlo teóricamente bajo la dirección de la literatura en resistencia para A. baumannii. Cada una de las tablas presentadas en este capítulo incluida las presentadas en los Anexos (excepto las tablas del subcapítulo 3.2, y el Anexo Error! Reference source not found.), son extraídas de a través de consultas a la base de datos de este proyecto de grado. 3.1 Obtención de los datos 105 muestras fueron suministradas al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, por parte del Instituto Nacional de Salud (INS), junto con los datos sociodemográficos y clínicos asociados a las muestras, los perfiles fenotípicos de resistencia y la identificación de algunos genes de resistencia sintetizados a través PCR. 89 muestras fueron identificadas positivamente A. baumannii, de los cuales fueron obtenidos los perfiles de resistencia a antibióticos utilizados en el presente trabajo.

54 40 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Clasificación de los antibióticos Se debe plantear una clasificación base para los antibióticos, que sea completa y que permita realizar las comparaciones adecuadas para los perfiles fenotípicos y genómicos de resistencia. Haciendo una búsqueda generalizada por internet, y preguntado a expertos en el tema, se encuentra la dificultad de crear un consenso en las clasificaciones. La base de datos de CARD (Jia et al., 2017). Posee su propia ontología de resistencia antibióticos, que aún sigue en desarrollo y se puede extraer de sus metadatos, aunque la jerarquía es confusa. Finalmente la repuesta a esta situación la poseen los documentos del CLSI, Normas de Desempeño para la Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (Patel et al., 2015), dentro de los cuales el glosario 1 presenta la designación de clase, subclase y nombre genérico para antibióticos β-lactámicos y no β-lactámicos. Estos datos son utilizados. Como base para llenar el catálogo de antibióticos en la base de datos del presente estudio, Tabla 3-1. adaptándolo al caso particular de este trabajo; por ejemplo: las Cephems orales están agrupadas en una sección independiente a las Cephems parenterales en el documento del CLSI, aunque para efectos de la abstracción de este trabajo es necesario colocar las Cephems orales junto a las Cephems parenterales en una sola categoría, la cual a su vez contiene categorías como la de las cefalosporinas de primera, segunda, tercera o cuarta generación, esto con el propósito de agrupar con mejor precisión los diferentes grupos de Clasificación de β-lactamasas, capitulo 3.3, Ya que sin importar que sean o parenterales pertenecen a las agrupaciones de primera, segunda o tercera generación que aplica para ambos grupos. Por otro lado cuando se cruza la información de los metadatos de CARD, contra los antibióticos (y los mecanismos de resistencia), se encuentran varios agentes antimicrobianos adicionales a los que contiene la clasificación del CLSI, para los cuales se asignó una clase o una subclase dentro de los antibióticos, como ocurre con los agentes aminocumarin y nybomycin, que hacen parte de las clases de las Quinolinas, o con los que no se pueden asignar a una clase o subclase, se clasifican como sin asignación.

55 Error! Reference source not found.apítulo 3 41 Toda la información sobre la clasificación de los antibióticos se presenta en el Anexo C Extracción de ADN La siguiente información es relevante dentro este trabajo porque hace parte del principio de la información de todo el proyecto global, pero es importante recalcar que todo el contenido de este sub capítulo, fue realizado por el grupo de Epidemiologia Molecular del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Sede Bogotá. La información resumida y compilada para las 89 muestras está en el Anexo A en la Tabla 1-1. Extracción con el kit comercial UltraClean Microbial DNA Isolation Para la extracción del DNA mediante el kit comercial UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (Catálogo , MOBIO, Laboratories Inc) se partió de un inóculo (5 colonias) bacteriano a partir de aislamientos de Acinetobacter baumannii. El inóculo se incubó durante 4 horas a 37 C, en caldo Luria Bertani (LB) en agitación rotacional a 200 rpm hasta alcanzar una densidad óptica entre 0,6 0.7 (λ 600 nm). Posteriormente, el inóculo se centrifugó por 7 minutos a 5000 rpm, a temperatura ambiente, después de los cual se descartó el sobrenadante y el pellet se lavó con 2 ml de buffer TE. Una vez se eliminó el sobrenadante, el pellet bacteriano se resuspendió en 300 L de la solución MicroBead y luego se transfirió al tubo MicroBead. Inmediatamente se adicionó 50 L de la solución MD1 al tubo con lisado bacteriano. El MicroBead con el lisado celular se colocó horizontalmente sobre un vórtex y se colocó a máxima velocidad por 10 minutos. Después de ello, se centrifugó a rpm por 1 minuto a temperatura ambiente y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. Luego, se adicionó 100 L de la solución MD2 al sobrenadante e inmediatamente se mezcló con vórtex por 5 segundos y se incubó a 4 C por 5 minutos. Después de la incubación a 4 C se centrifugó el tubo por 1 minuto a rpm, temperatura ambiente y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo. Posteriormente, se agregó 900 L de la solución MD3 al sobrenadante y se mezcló con vórtex por 5 segundos. De la mezcla obtenida se cargó cerca de 700 L a un tubo con una columna de sílica gel y se centrifugó por 1 minuto a rpm a temperatura

56 42 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria ambiente, se descartó la solución obtenida en el tubo y se cargó de nuevo el resto de la solución centrifugándose nuevamente con las mismas condiciones. Posterior se adicionó 300 L de la solución MD4 y se centrifugó por 1 minuto a rpm temperatura ambiente. Posteriormente, se descartó la solución obtenida y se centrifugó de nuevo el tubo por un minuto a rpm a temperatura ambiente. Finalmente, se adiciono 50 L de agua HPLC estéril en el centro de la columna para eluir el DNA y se centrifugó a rpm por 1 minuto temperatura ambiente. El DNA purificado fue cuantificado a 260 nm con el espectrofotómetro Nanodrop ND- 2000C (Termo scientific) y mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % utilizando marcador cuantitativo HyperLadderTM 1 kb Plus (Bioline), realizando comparaciones con diferentes concentraciones del DNA Fago Lambda 0,446 µg/µl (Invitrogen) Secuenciación Esta se realizó usando Hiseq2000 system (Illumina), obteniendo lecturas pareadas con un promedio de tamaño de 101 pares de bases. La cantidad de lecturas por muestra está en el Anexo A en la Tabla Análisis de calidad, Ajuste de calidad y Ensamblaje El análisis inicial de calidad de las lecturas se realiza usando FastQC (Andrews, 2014). El ajuste de la calidad cuando es necesario se utiliza Sickle (Joshi and Fass, 2011). Este programa se usa por la facilidad de utilizarlo automáticamente dentro de un pipeline. Las primeras 79 muestras se ensamblaron con SPAdes versión 3.8 (de las anteriores 79 muestras 66 fueron identificadas positivamente como A. baumannii) y varios meses después, 25 muestras adicionales fueron ensambladas con SPAdes versión 3.10 (de las cuales 23 fueron identificadas positivamente como A. baumannii) (Bankevich et al., 2012). Los resultados indicaron que la diferencia de versiones de Spades no afectó la anotación de los elementos genómicos de resistencia.

57 Error! Reference source not found.apítulo 3 43 Cabe resaltar que también se realizaron pruebas de ensamblaje con Soap Denovo V.2.4 (Luo et al., 2012), y se realizaron algunas pruebas con Edena V.3 (Hernandez et al., 2014). Pero finalmente luego de los análisis para escoger los mejores ensambles se utilizaron los resultados obtenidos con el programa SPAdes. La información resumida de las muestras está en el Anexo A, tabla 1-1 y Anotación Este paso es de suma importancia dentro del proceso, aquí es donde se debe hacer la identificación de los diferentes genes involucrados en los distintos mecanismos de resistencia para luego poder evaluar el perfil genómico de resistencia. En el Anexo B, tabla 1-3, se encuentra un resumen de datos de anotación para las 89 muestras. Por sugerencia de expertos se usa el programa bioinformático para anotación de procariotas, llamado Prokka desarrollado inicialmente por Victorian Bioinformatics Consortium, mantenido actualmente por el Torsten Seemann. (Seemann, 2014). Las primeras 66 muestras se anotan con la versión 1.1, y las ultimas 23 con la versión De nuevo el cambio de versión se da por la diferencia en los meses en que se llevaron a cabo estos procesos. Esta diferencia de versiones no tiene ningún efecto en cuanto a la anotación de elementos genómicos de resistencia. Prokka tiene la posibilidad de agregar más bases de datos para mejorar la anotación, básicamente en 2 formas: uno o varios archivos en formato HMM, y un solo archivo en formato multifasta. Para anotar los genomas ensamblados de las muestras de este proyecto, a este programa se le adicionaron las siguientes bases de datos: Un archivo multifasta con 2285 proteínas de resistencia que posee la base de datos de CARD (formateado para proyecto) (Jia et al., 2017), complementado con 32 proteínas adicionales de resistencia encontradas en la revisión bibliográfica especialmente dirigida a los elementos de resistencia reportados para Acinetobacter baumannii, no incluidas en CARD. Se adicionó además la base de datos Resfams-full.hmm con 170 HMM especializados para encontrar genes de resistencia

58 44 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria (Gibson et al., 2015). Aunque Prokka viene con una versión reducida de Pfam, esta se reemplazó por la versión actualizada que existe en línea para los HMM de Pfam. (Bateman, 2004). Adicionalmente, se incluyeron en el procesamiento de Prokka 3 bases de datos, la primera es una base de datos con 57 HMM para detectar genes (factores) de virulencia VFDB (Chen et al., 2016); la segunda corresponde a 60 HMM para encontrar transposasas llamada Gipsy (Soares et al., 2016); la tercera se trata de 30 HMM adicionales de transposasas reportados por Choumouss Kamoun (Kamoun et al., 2013). Esta última base de datos fue extraída y unificada para que Prokka las pudiera usar en un solo archivo. En el Anexo Error! Reference source not found. se presentan tablas con algunos genes de resistencia de la siguiente forma: tabla 1-9 tiene 219 genes de resistencia identificados para A. baumannii. La tabla 1-10 tiene 18 genes de resistencia, aunque no han sido etiquetados explícitamente para A. baumannii son de importancia de acuerdo con la literatura, algunos hacen parte del complejo Acinetobacter calcoaceticus-baumanii, otros fueron identificados por primera vez en otras especies diferentes a A. Baumannii. La tabla 1-11 muestra los 170 HMM de Resfams cruzados con los Mecanismos de resistencia. Finalmente se tiene otros 2060 genes de resistencia que hacen parte de CARD estos se encuentran en la tabla 1-12 del mismo Anexo D. Nota: El siguiente comando permite encontrar cualquier gen dentro del complejo Acinetobacter al filtrar por taxonomía, en la página del NCBI, es muy útil cuando se tiene un nombre de algún gen de resistencia, para lo cual en el espacio entre paréntesis gen (NombreGen) de la línea, debe ir al nombre del gen: ((NombreGen) AND "g-proteobacteria"[porgn: txid1236]) AND "Moraxellaceae"[porgn: txid468] Como parte de las reglas para obtener el perfil teórico de resistencia genómica (ver 3.4), fue necesario hacer una modificación al script principal de Prokka para que cuando se ejecutará el programa Blast dentro del proceso de anotación, se pudiera obtener el porcentaje de identidad, e-value y Q-cover en el tag "Product". Para esto se utilizó la librería

59 Error! Reference source not found.apítulo 3 45 SearchIO de bioperl y se adicionaron las siguientes líneas de código luego de la línea 1050 del script de Prokka versión 1.12 (que se encuentra en la carpeta bin): my $hsps = $hit->next_hsp or next; $cleanprod = $cleanprod. " identity:". $hsps->percent_identity. " evalue:". $hsps->evalue. " qcover:". $hit->frac_aligned_query; 3.2 Documentación de la base de datos El software que se utiliza para este trabajo, se eligió bajo algunos criterios tales como, facilidad en el uso para todo el equipo, software libre, benchmarking comercial. La primera parte del diseño de la base de datos se basa en la información que fue enviada por el Instituto Nacional de salud (INS) sobre el estudio para Acinetobacter baumannii realizado en los años 2012 a 2015 y otros documentos que permiten completar la información sobre la resistencia Fenotípica. La segunda parte del diseño se basa en la obtención de los perfiles de resistencia genómica como un modelo teórico construido según la literatura sobre mecanismos y genes de resistencia para A. baumannii principalmente. Además, se presta atención a la correlación que estos perfiles genómicos deben tener con los perfiles resistencia Fenotípica. La base de datos está construida sobre MySQL Community Server con la instalación standard, en un servidor Dell, con sistema operativo OpenSuse Leap El acceso a los datos se realiza mediante una interfaz cliente-servidor llamada MySQL Workbech Community Edition Perfiles de Resistencia Fenotípica La razón de esta sección es permitir la definición de los perfiles fenotípicos de resistencia a antibióticos, proveyendo la información consolidada, además crea la base para un sistema de fácil escalabilidad.

60 46 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria A continuación, se presentan las tablas implementadas para almacenar e integrar los datos relacionados con la norma CLSI y sus modificaciones a través de los años y los datos de resistencia fenotípica obtenidos utilizando los métodos Kirby Bauer, Vitek2 y Phoenix 100, junto con los de pruebas moleculares suministrados por el INS. Es de destacar que la tabla clsi_antibiotico Tabla 3-2, es importante para establecer cuáles fueron los antibióticos válidos para realizar el antibiograma para A. baumannii, los cuales fueron definidos anualmente por el CLSI, entre 2012 y el 2015 (período que corresponde a la fecha de recepción de las muestras por parte del Instituto Nacional de Salud). Inicialmente la tabla relacion_orden Tabla 3-7, junto con la columna valor de la tabla resistencia_fenotipica Tabla 3-8, por antibiótico CLSI según el año, tenía la intención de permitir la comparación fácil contra la Concentración mínima inhibitoria (MIC) definida para ese antibiótico en ese año en particular ( es importante recordar que cada año la MIC, para cada micro organismo puede variar un poco). Las tablas son las siguientes:

61 Error! Reference source not found.apítulo 3 47 Figura 3-1: Diagrama E-R sobre resistencia fenotípica Tabla 3-1: Descripción del catálogo antibiotico Nombre de la tabla: antibiotico Catalogo que guarda la información de todos los antibióticos Descripción de la tabla: definidos por el CLSI 2015 y todos los niveles del árbol que agrupan a los antibióticos.

62 48 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Columna Id_antibiotico Nombre Id_padre Activo origen id_nivel_antibiotico Tipo Rangos Validos Permite Nulos Descripción int(11) AI PK Entre 1 y No Identificador auto numérico varchar(100) Ascii hasta 100 No int(11) bit(1) varchar(50) int(11) Entre 1 y Si True o False Ascii hasta 50 No No Entre 1 y No Nombre del antibiótico genérico (como describe el CLSI 2015) o nombre del grupo, clase o subclase. Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, Sirve para crear las agrupaciones y dependencias en un árbol lógico. Señala si este registro se encuentra activo o no Inicialmente la ontología de antibióticos se tomó del CLSI año 2015 y luego se sumaron algunos más de la base de resistencia a antibióticos CardDB Llave foránea al identificador de la tabla catalogo nivel_antibiotico Tabla 3-2: Columna id_clsi_antibiotico ano Descripción del catálogo clsi-antibiotico Nombre de la tabla: clsi_antibiotico Descripción de la tabla: Tipo int(11) AI PK int(11) Es un catálogo que cruza la información de los antibióticos válidos para un organismo dado según el documento del CLSI 2015 Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Entre 2012 a 2016 No id_organismo int(11) Entre 1 y No id_antibiotico int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador del catálogo tabla organismo Llave foránea al identificador del catálogo tabla antibiotico, siempre señala el nivel del antibiótico, nunca el grupo Tabla 3-3: Descripción del catálogo sigla_antibiotico Nombre de la tabla: sigla_antibiotico

63 Error! Reference source not found.apítulo 3 49 Descripción de la tabla: Es un catálogo de la sigla o siglas usadas para cada uno de los antibióticos (algunas siglas son iguales para diferentes antibióticos) este catálogo también es tomado del documento CLSI Columna Tipo Rangos Validos Permite Nulos Descripción id_sigla_antibiotico int(11) AI PK Entre 1 y No Identificador auto numérico sigla varchar(15) Ascii hasta 15 No id_antibiotico int(11) Entre 1 y No los caracteres que componen la Sigla, teniendo en cuenta si son mayúscula o minúsculas Llave foránea al identificador de la tabla catálogo antibiótico, siempre al nivel del nombre genérico Tabla 3-4: Descripción del catálogo equipo Nombre de la tabla: equipo Descripción de la tabla: Catalogo que guarda los equipos o técnicas válidas para realizar los antibiogramas Columna Tipo Rangos Validos Permite Nulos Descripción Id_Equipo int(11) PK Entre 1 y No Identificador auto numérico Nombre varchar(45) Ascii hasta 45 No Nombre de la técnica o tecnología usada para hacer el antibiograma: Kirby Bauer, Vitek2, Phoenix 100 Tabla 3-5: Descripción del catálogo interpretacion Nombre de la tabla: interpretacion Catalogo para calificar la resistencia a los antibióticos, en una escala Descripción de la tabla: discreta. Columna Id_Interpretacion Descripcion Tipo int(11) PK Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico varchar(45) Ascii hasta 45 No Se tienen 4 opciones, 3 de estas hacen la calificación discreta de la resistencia así: Resistente, Intermedio, Susceptible, No se realizó Tabla 3-6: Descripción del catálogo nivel_antiobiotico Nombre de la tabla: nivel_antobiotico

64 50 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Columna Id_nivel_antobiotico nivel Descripción de la tabla: Catalogo que describe el nivel dentro del árbol de agrupación de los antibióticos. Tipo int(11) PK Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico varchar(45) Ascii hasta 45 No Actualmente hay 5 niveles, definidos así: Grupo, Clase, Subclase1, Subclase2, Nombre Genérico Tabla 3-7: Descripción del catálogo relacion_orden Nombre de la tabla: relacion_orden Catálogo que define las relaciones de orden que permiten comparar con números la resistencia antibióticos según los Descripción de la tabla: antibiogramas. Puede servir de ser necesario, para obtener un reporte particular sobre la relación orden en la resistencia fenotípica, especialmente para la técnica Kirby bauer. Columna Id_Relacion_orden Simbolo Descripcion Tipo int(11) PK varchar(10) varchar(20) Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Ascii hasta 10 No Ascii hasta 20 No Tenemos los siguientes 5 símbolos separados por coma: =, <, <=, >, >= Es solo la descripción en palabras de los símbolos definidos Tabla 3-8: Columna Id_Resistencia_Fenotipica Id_muestra Descripción de la tabla resistencia_fenotipica Nombre de la tabla: resistencia_fenotipica Descripción de la tabla: Tipo int(11) AI PK int(11) Esta tabla permite relacionar las tablas catálogos de este submodulo, para guardar los resultados de todos los antibiogramas realizados a cada una de las muestras. Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Entre 1 y No Id_antibiotico int(11) Entre 1 y No Id_interpretacion int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla muestra Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico, siempre al nivel del nombre genérico Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación

65 Error! Reference source not found.apítulo 3 51 Id_equipo Id_relacion_orden int(11) int(11) Entre 1 y No Entre 1 y No valor varchar(10) Ascii hasta 10 No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo equipo Llave foránea al identificador de la tabla catalogo relacion_orden El valor que le corresponde a la muestra dada para este antibiótico particular, según el equipo usado. Tabla 3-9: Descripción del catálogo mdrxdrpdr_antibiotico Nombre de la tabla: mdrxdrpdr_antibiotico Columna id_mdrxdrpdr_antibiotico id_antibiotico id_organismo categoria id_padre Descripción de la tabla: Tipo Es un catálogo con 2 niveles, que define según el organismo las categorías y agentes antimicrobianos usados que definen MDR (Multiple drug resistance), XDR(Extensively drug-resistant) y PDR (pandrug-resistant). Rangos Validos Permite Nulos Descripción int(11) AI PK Entre 1 y No Identificador auto numérico int(11) int(11) Entre 1 y si Entre 1 y No varchar(100) Ascii hasta 100 No int(11) Entre 1 y si Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico, siempre al nivel del nombre genérico cuando se trata de un agente, cuando es una categoría esta en NULL Llave foránea al identificador de la tabla catalogo organismo Se guarda el nombre de la categoría que difiere de las categorías que usa el CLSI, cuando es un agente se guarda el nombre de este Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, sirve para saber cuál categoría le corresponden que agentes. Tabla 3-10: Columna Descripción de la tabla resistencia_fenotipica_consolidado Nombre de la tabla: resistencia_fenotipica_consolidado Esta tabla es una sub agrupación de la tabla "resistencia_fenotipica" donde se hace un consolidado según equipo de la siguiente forma: se toma los datos de Kirby Bauer Descripción de la tabla: como prioritarios, luego los que no estén allí y existan en Vytek y finalmente lo que no estén en los anteriores y existan en Phoenix. Tipo Rangos Validos Permite Nulos Descripción

66 52 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Id_Resistencia_Fenotipica Id_muestra int(11) AI PK int(11) Entre 1 y No Identificador auto numérico Entre 1 y No Id_antibiotico int(11) Entre 1 y No Id_interpretacion Id_equipo Id_relacion_orden valor int(11) int(11) int(11) varchar(10) Entre 1 y No Entre 1 y No Entre 1 y No Ascii hasta 10 No Llave foránea al identificador de la tabla muestra Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico, siempre al nivel del nombre genérico Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación Llave foránea al identificador de la tabla catalogo equipo Llave foránea al identificador de la tabla catalogo relacion_orden El valor que le corresponde a la muestra dada para este antibiótico particular, según el equipo usado Datos moleculares sumistrados por el INS Las tablas y los datos de las siguientes tablas se utilizaron para almacenar los datos de pruebas moleculares reportadas por el Instituto Nacional de Salud. Figura 3-2: Diagrama E-R para genes identificados por PCR

67 Error! Reference source not found.apítulo 3 53 Tabla 3-11: Descripción del catálogo estado_edta_pcr Nombre de la tabla: estado_edta_pcr Descripción de la tabla: Catalogo que define los estados de existencia de un Gen según pruebas microbiológicas Columna id_estado_edta_pcr Estado Tipo int(11) PK Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico varchar(45) Ascii hasta 45 No Negativo: NO se encontró el gen, Positivo: Si se encontró el Gen, No Realizado: No se hizo esa prueba Microbiológica Tabla 3-12: Descripción del catálogo estado_edta_pcr Nombre de la tabla: pcr_edta Es el catálogo de todas las pruebas moleculares microbiológica que Descripción de la tabla: fueron realizadas, con el propósito de detectar genes conocidos resistentes a antibióticos a través de PCR Columna Tipo Rangos Validos Permite Nulos Descripción Id_pcr_edta int(11) PK Entre 1 y No Identificador auto numérico nombre varchar(45) Nombre la prueba microbiológica, actualmente tenemos 12: EDTA/SMA, PCR blandm, PCR blakpc, PCR blavim, PCR blages, PCR blaimp, PCR blaoxa-48, PCR blaoxa-23, PCR blaoxa-24, Ascii hasta 45 No PCR blaoxa-51, PCR blaoxa-58, PCR blaoxa- 143 Tabla 3-13: Descripción de la tabla gen_fenotipico Nombre de la tabla: gen_fenotipico Columna Id_gen_fenotipico Id_estado_edta_pcr Descripción de la tabla: Esta tabla permite relacionar las tablas catálogos de este sub modulo, para guardar los resultados de las pruebas de detección de genes de resistencia a antibióticos conocidos. Tipo int(11) AI PK int(11) Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo estado_edta_pcr

68 54 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Id_pcr_edta int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo pcr_edta Id_muestra int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla muestra Reglas pasivas de resistencia y Perfil de resistencia genómica. Es importante tener en cuenta que todos los datos sobre genes de resistencia que se van a anotar, deben estar incluidos en el catálogo de gen_resistencia Tabla 3-16, sin excepciones. Los genes de resistencia fueron ordenados de acuerdo con los mecanismos definidos para este trabajo, que son los siguientes: Degradación o Modificación del Antibiótico, Alteración de Porina, Bombas de Eflujo (entre estas se tiene las siguiente: MATE, ABC, MFC, RND, SMR), Cambio de Sitio Blanco, Proteína de Protección, Modulación de genes, Elementos Móviles, los cuales fueron presentados los apartes 1.3 y 1.4 del presente documento. A continuación, se presentan las tablas implementadas para almacenar e integrar los datos de los genes y reglas pasivas relacionadas con los elementos genómicos asociados a los perfiles de resistencia genómica.

69 Error! Reference source not found.apítulo 3 55 Figura 3-3: Diagrama E-R para el perfil genómico de resistencia

70 Tabla 3-14: Columna id_mecanismo_resistencia Descripción del catálogo mecanismo_resistencia Nombre de la tabla: mecanismo_resistencia Catalogo que guarda estructuralmente los mecanismos y sub Descripción de la tabla: mecanismos de resistencia a antibióticos señalados en la literatura. Tipo int(11) PK Rangos Validos nombre varchar(45) Ascii hasta 45 No Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Nombre que identifica al mecanismo, o el nombre que agrupa más mecanismos id_padre int(11) Entre 1 y No Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, Sirve para crear las agrupaciones y dependencias en los respectivos niveles de los mecanismos de resistencia Tabla 3-15: Descripción de la tabla gen_mecanismo_resistencia Nombre de la tabla: gen_mecanismo_resistencia Columna Descripción de la tabla: Tipo Permite relacionar las tablas de los mecanismos de resistencia con la tabla catálogo de los genes de resistencia, y además califica a los genes agrupado por sus mecanismos (inicialmente) Rangos Validos Id_gen_resistencia int(11) PK Entre 1 y No Id_mecanismo_resistencia int(11) PK Entre 1 y No Permite Nulos Descripción Llave foránea a la llave primaria de la tabla gen_resistencia Llave foránea a la llave primaria de la tabla mecanismo_resistencia porcentaje_identidad double de 0 a 100, con decimales No Configura el porcentaje de identidad mínimo que deben tener los genes de resistencia para ser evaluados dentro del perfil genómico de resistencia, agrupado por mecanismos inicialmente. Para los HMM se define en 0

71 Error! Reference source not found.apítulo 3 57 qcover float Entre 0 y 1 No Configura el porcentaje de cobertura mínimo que deben tener los genes de resistencia para ser evaluados dentro del perfil genómico de resistencia, agrupados por mecanismos inicialmente. Para los HMM se define en 0 Tabla 3-16: Descripción del catálogo gen_resistencia Nombre de la tabla: gen_resistencia Descripción de la tabla: Columna Tipo id_gen_resistencia int(11) AI PK nombre varchar(50) id_organismo int(11) Catalogo que guarda todos los elementos genómicos de resistencia a antibióticos identificados para este proyecto, señalados en la literatura. Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Ascii hasta 50 No Entre 1 y No Nombre del elemento genómico de resistencia. Llave foránea al identificador de la tabla catalogo organismo secuencia mediumtext texto hasta No Secuencia o cadena de caracteres, sin diferenciar mayúsculas de minúsculas, que corresponden al elemento genómico de resistencia (ej. cadena de aminoácidos) detalle varchar(200) Ascii hasta 200 Si Una breve descripción sobre el elemento genómico en cuestión proteinaonucleotido enum('proteina ','nucleotido') Incluido en el tipo No Solo permite escoger para esta enumeración si se trata de una secuencia de nucleótidos o de una secuencia de proteínas iden1 varchar(45) Ascii hasta 45 No iden2 varchar(100) Ascii hasta 100 No desc1 varchar(500) Ascii hasta 500 Si Primer identificador del encabezado del archivo de origen de estos genes de resistencia. Segundo identificador del encabezado del archivo de origen de estos genes de resistencia. Alguna descripción extra, o especial sobre el gen o este elemento de resistencia.

72 58 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria id_fuente int(11) Entre 1 y No Identificador al catálogo de la tabla "fuente", donde describe el origen de este gen de resistencia, en este momento se tiene 3: CardDB, Resfam, y Propio perfilxregla blactamengrupo bit(1) bit(1) verdadero o falso verdadero o falso No No Es un filtro para indicar si este gen está contemplado dentro de una de las reglas de resistencia (verdadero), o se evalúa directamente desde esta tabla (falso). Indica si el gen en cuestión se debe evaluar como una beta-lactamasa que tiene asociación de resistencia a antibióticos con otras tablas especiales para este. Tabla 3-17: Descripción de la tabla resistencia_genomica1 Nombre de la tabla: resistencia_genomica1 Columna id_resistencia_genomica Descripción de la tabla: Tipo int(11) AI PK Es la tabla base que guarda la anotación, pero únicamente las características de resistencia por cada muestra teniendo en cuenta que sus características anotadas son las del catálogo "gen_resistencia" Rangos Validos id_muestra int(11) Entre 1 y No contig int(11) Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Ascii hasta 45 No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo muestra El numero perteneciente a la ubicación dentro del archivo ensamblado que corresponde al contig locus_tag int(11) Entre 1 y No pos_inicio int(11) Entre 1 y No pos_fin int(11) Entre 1 y No Es la parte entera del identificador locus tag que se usa en la anotación de características genómicas la posición inicial (en bases) de la característica dentro del contig la posición final (en bases) de la característica dentro del contig

73 Error! Reference source not found.apítulo 3 59 hebra tinyint(4) 1 o -1 No Dirección con la cual está orientada esta característica porcentaje_identidad double de 0 a 100, con decimales No Es el porcentaje de identidad en el hit dado por uso de blast para la identificación de la característica, Si fue un HMM el resultado es 0 e_value varchar(20) Ascii números > 0 No Es el valor esperado del hit dado por uso de blast para la identificación de la característica, Si fue un HMM el resultado es 0 qcover float Entre 0 y 1 No Es el porcentaje de cobertura en el hit por uso de blast para la identificación de la característica, Si fue un HMM el resultado es 0 id_gen_resistencia int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_mecanismo_antibiotico id_caracteristica id_fuente int(11) int(11) Entre 1 y No Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_mecanismo_antibiotico Llave foránea al identificador de la tabla catalogo fuente. Que indica el origen de este gen de resistencia, en este momento se tiene 3: CardDB, Resfam y Propio Tabla 3-18: Descripción de la tabla gen_antibiotico_resistencia Nombre de la tabla: gen_antibiotico_resistencia Descripción de la tabla: Es la tabla que cruza la información entre la tabla de antibióticos y la tabla del catálogo de genes de resistencia "gen_resistencia", además permite calificar este cruce de datos con el nivel de resistencia y agruparlo por la correspondencia según el perfil de resistencia fenotípica.

74 60 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Columna Tipo Rangos Validos id_gen_resistencia int(11) Entre 1 y No id_antibiotico int(11) Entre 1 y No Id_interpretacion id_correspondencia_antibiotico int(11) int(11) Entre 1 y No Entre 1 y No Permite Nulos Descripción Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_resistencia Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación, que permite calificar cada gen según el antibiótico dado asignándole el nivel de resistencia correspondiente. Responde a la segunda regla. Llave foránea al identificador de la tabla catalogo correspondecia_antibiotico que permite agrupar los genes que se van a evaluar según la resistencia antibióticos dada por el perfil de resistencia fenotípico. Tabla 3-19: Descripción del catálogo correspondencia_antibiotico Nombre de la tabla: correspondencia_antibiotico Descripción de la tabla: Columna Tipo id_correspondencia_antibiotico int(11) PK descripcion varchar(45) Es el catalogo que permite hacer una agrupación o filtro del cruce entre las tablas: antibiótico y gen_resistencia. Para cumplir con la regla uno Rangos Validos Entre 1 y No Entre 1 y No Permite Nulos Descripción Identificador auto numérico La descripción de la agrupación. Actualmente se tiene: Sin correspondencia, 8 antibióticos principales, sub clases y clases de los 8 base, Sin precisión.

75 Error! Reference source not found.apítulo 3 61 Tabla 3-20: Decripción de la tabla gen_operon_resistencia Nombre de la tabla: gen_operon_resistencia Columna Descripción de la tabla: Tipo La tabla que permite la relación de muchos a muchos entre el catálogo de genes de resistencia y la tabla de operónes de resistencia que hace referencia a las Bombas tipo RND. (Tercera Regla 3.4.3) Rangos Validos Permite Nulos Descripción id_gen_resistencia int(11) PK Entre 1 y No id_operon_resistencia int(11) PK Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_resistencia Llave foránea al identificador de la tabla catalogo operon_resistencia Tabla 3-21: Descripción del catálogo operon_resistencia Nombre de la tabla: operon_resistencia Descripción de la tabla: Columna Tipo id_operon_resistencia int(11) PK Es el catalogo que posee la arquitectura de la conformación los operónes de resistencia y los reguladores de estos operónes, que hacen parte de las bombas eflujo tipo RND. (Tercera Regla 3.4.3) Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico nombre varchar(45) Ascii hasta 45 No Nombre de identificación del operón, del regulador o del gen tipo enum('operon', 'promotor', 'regulador') Incluido en el tipo No Para identificar qué clase de objeto genético se esta referencia en registro, realmente se están usando solo 2 o es un operón o es un regulador, para el operón ya definido direccion int(11) Entre 1 y No indica la dirección en la cual se debe dirigir la hebra de este gen

76 62 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria id_hermanoatras int(11) Entre 1 y Si Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, sirve para crear la posición del gen dentro del operón o del gen dentro regulador o del regulador con respecto al operador. Indicando cual es el gen que debe ir atrás. id_hermanoadelante int(11) Entre 1 y Si Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, sirve para crear la posición del gen dentro del operón o del gen dentro regulador o del regulador con respecto al operador. Indicando cual es el gen que debe ir adelante. nombregen varchar(200) Ascii hasta 200 No El mismo nombre del gen que corresponde a la tabla gen_resistencia, para mejorar la visualización de los datos Tabla 3-22: Descripción de la tabla bombas_rnd_antibiotico Nombre de la tabla: bombas_rnd_antibiotico Descripción de la tabla: Columna Tipo nombre varchar(45) La tabla que permite relacionar únicamente los operónes por nombre contra la tabla de antibióticos, porque esto es una excepción que precisamente se identifica en el filtro ""perfilxregla" de la tabla "gen_antibiotico. (Tercera Regla) Rangos Validos Ascii hasta 45 No Permite Nulos Descripción Nombre del operón de resistencia id_antibiotico int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico Tabla 3-23: Descripción de la tabla bombas_rnd Nombre de la tabla: bombas_rnd

77 Error! Reference source not found.apítulo 3 63 Columna id_bombas_rnd Descripción de la tabla: Tipo int(11) AI PK Es la tabla donde se aloja la operación final de identificación de los operónes y reguladores de resistencia por muestra, luego de ser previamente identificado todo según el catálogo de resistencia y el script en python para bombas eflujo tipo RND. (Tercera Regla 3.4.3) Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico nombreoperon varchar(45) Ascii hasta 45 No id_muestra int(11) Entre 1 y No Nombre con el que se identifica el operón según la tabla operon_resistencia Llave foránea al identificador de la tabla catalogo muestra nombreregulador varchar(45) Ascii hasta 45 Si Nombre con el que se identifica el regulador según la tabla operon_resistencia tieneregulador bit(1) Verdadero o falso No Indica si este operón posee un regulador o no encontrado según las operaciones contig_operon int(11) Entre 1 y No El número del contig donde fue encontrado el operón pos_inicio_operon int(11) Entre 1 y No pos_fin_operon int(11) Entre 1 y No pos_inicio_regulador int(11) Entre 1 y Si pos_fin_regulador int(11) Entre 1 y Si La posición inicial donde comienza el primer gen del operón de resistencia La posición final donde comienza el primer gen del operón de resistencia La posición inicial donde comienza el primer gen del regulador de resistencia La posición final donde comienza el primer gen del regulador de resistencia Tabla 3-24: Descripción de la tabla mutación_gen_resistencia Nombre de la tabla: mutacion_gen_resistencia

78 64 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Columna Descripción de la tabla: Tipo La tabla que permite la relación de muchos a muchos entre el catálogo de genes de resistencia y la tabla de que hace referencia a genes que con mutaciones puntuales son resistentes a antibióticos. (Quinta Regla 3.4.5) Rangos Validos id_gen_resistencia int(11) PK Entre 1 y No id_mutacion_resistencia int(11) PK Entre 1 y No Permite Nulos Descripción Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_resistencia Llave foránea al identificador de la tabla catalogo mutacion_resistencia Tabla 3-25: Descripción de la tabla mutación_resistencia Nombre de la tabla: mutacion_resistencia Descripción de la tabla: Columna Tipo id_mutacion_resistencia int(11) PK nombre varchar(45) mutacionregex varchar(45) La tabla que permite la relación de muchos a muchos entre el catálogo de genes de resistencia y la tabla de que hace referencia a genes que con mutaciones puntuales son resistentes a antibióticos. (Quinta Regla 3.4.5) Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Ascii hasta 45 No Ascii hasta 45 No Nombre que se le va a dar a esta mutación. Actualmente hay 2 únicamente: gyra (S83L), parc S80L or W,E84K and G78C) Es la expresión regular que permite encontrar la mutación de resistencia dentro de la secuencia de aminoácidos del gen correspondiente Tabla 3-26: Descripción del catalogo blactam_clase Nombre de la tabla: blactam_clase

79 Error! Reference source not found.apítulo 3 65 Descripción de la tabla: Columna Tipo id_blactam_clase int(11) PK nombre varchar(45) Catálogo que contiene la clasificación más amplia que tienen las β-lactamasas, es decir por clase molecular y/o subclase, actualmente posee 6 clases. Finalmente, solo sirve como referencia a este tipo de agrupación obtenido de la literatura para el modelo de base de datos actual. Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Ascii hasta 45 No Es el nombre de la clase molecular y subclase. Con las siguientes 6 posibilidades: A, B1, B2, B3, C, D Tabla 3-27: Descripción del catálogo blactam_grupo Nombre de la tabla: blactam_grupo Columna id_blactam_grupo nombre Descripción de la tabla: Tipo int(11) PK Catálogo que contiene la clasificación del grupo funcional para las β -lactamasas, según la clasificación Bush-Jacoby. Esta tabla permite señalar los grupos de resistencia a antibióticos, así que incluso existen más registros que grupos funcionales según la clasificación Bush-Jacoby por que se debe subdividir según la resistencia a antibióticos. Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico varchar(45) Ascii hasta 45 No id_blactam_clase int(11) PK Entre 1 y No Es el nombre del grupo funcional actualmente posee 20 registros Llave foráea al identificador de la tabla catalogo blactam_clase Tabla 3-28: Descripción de la tabla blactam_grupo_gen Nombre de la tabla: blactam_grupo_gen Descripción de la tabla: Esta tabla permite la relación de muchos a muchos entre la tabla gen_resistencia y blactam_group, por lo cual crea la asociación de cuales genes pertenecen a que grupo funcional de β-lactamasa.

80 66 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Columna id_blactam_grupo Tipo int(11) PK Rangos Validos id_gen_resistencia int(11) PK Entre 1 y No Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_resistencia Tabla 3-29: Descripción de la tabla blactam_grupo_antibiotico Nombre de la tabla: blactam_grupo_antibiotico Columna Descripción de la tabla: Tipo Es la tabla que cruza la información entre la tabla de antibióticos y la tabla del catálogo de grupos de beta-lactamasas "blactam_group", además permite calificar este cruce de datos con el nivel de resistencia y agruparlo por la correspondencia según el perfil de resistencia fenotípica. Funciona de forma similar que la tabla "gen_antibiotico_resistencia". Rangos Validos id_blactam_grupo int(11) Entre 1 y No id_antibiotico int(11) Entre 1 y No Permite Nulos Descripción Llave foránea al identificador de la tabla catalogo blactam_grupo Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico Id_interpretacion int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación, que permite calificar el grupo funcional para el antibiótico dado, asignándole el nivel de resistencia correspondiente. Respondiendo así a la segunda regla.

81 Error! Reference source not found.apítulo 3 67 id_correspondencia_antibiotico int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo correspondecia_antibiotico que permite agrupar los grupos funcionales de betalactamasas que se van a evaluar según la resistencia antibióticos dada por el perfil de resistencia fenotípico. Tabla 3-30: Descripción del catálogo fuente Nombre de la tabla: fuente Descripción de la tabla: Columna Tipo id_fuente int(11) PK Pequeño catálogo que contiene el origen o fuente de los genes de resistencia con los cuales se trabajan en este proyecto. Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico detalle varchar(45) Ascii hasta 45 No Indica el nombre o detalle de los datos. En este momento se tiene 3: CardDB, Resfam y Propio Tabla 3-31: Descripción de la tabla perfil_resistencia_genomica1 Nombre de la tabla: perfil_resistencia_genomica1 Descripción de la tabla: Es la tabla permite agrupar por elementos de resistencia según todas las reglas de resistencia a antibióticos descritas, para poder evaluar un perfil genómico de resistencia, es un paso intermedio y necesario según el modelo para definir el perfil genómico. Columna id_perfil_resistencia_genomica1 id_muestra Tipo int(11) AI PK Rangos Validos Entre 1 y No int(11) Entre 1 y No Permite Nulos Descripción Identificador auto numérico Llave foránea al identificador de la tabla catalogo muestra

82 68 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria id_resistencia_genomica1 id_antibiotico int(11) Entre 1 y No int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo resistencia_genomica1 Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico Id_interpretacion int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación, que permite calificar el grupo funcional o gen para el antibiótico dado, asignándole el nivel de resistencia correspondiente. Respondiendo así a la segunda regla. id_correspondencia_antibiotico int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo correspondecia_antibiotico que permite agrupar los grupos funcionales de beta-lactamasas o genes que se van a evaluar según la resistencia antibióticos dada por el perfil de resistencia fenotípico. Tabla 3-32: Descripción de la tabla perfil_genomico Nombre de la tabla: perfil_genomico Consolida un consenso para definir un perfil genómico Descripción de la tabla: de resistencia orientado a la resistencia por antibiótico y calificándolo con un valor para una muestra dada. Columna Tipo Rangos Validos Permite Nulos Descripción id_perfil_genomico id_muestra int(11) AI PK Entre 1 y No int(11) Entre 1 y No Identificador auto numérico Llave foránea al identificador de la tabla catalogo muestra

83 Error! Reference source not found.apítulo 3 69 id_antibiotico int(11) Entre 1 y No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico valor int(11) Entre 1 y No Es un valor entero que califica la resistencia a determinado antibiótico, donde los valores <= 0 corresponde a susceptible, 1 es intermedio y >= 2 es resistente Metadatos de la base de datos CARD y Resfams Son datos adicionales a los genes de resistencia, que permiten cruzar (se crearon una serie de scripts MySQL para cada caso y versión, scripts que se encuentran dentro del repositorio de archivos del trabajo en la carpeta COMPLEMENTARIOS ) los datos de los catálogos de mecanismos de resistencia Tabla 3-14, y antibióticos Tabla 3-1, con los genes de resistencia que estas bases proveen. Estos metadatos tuvieron que ser adaptados a los mecanismos definidos para este proceso, y fue posible adaptarlos debido a que los mecanismos usados logran englobar todo lo que los metadatos proveen. A continuación, se presentan las tablas implementadas: Figura 3-4: Diagrama E-R para Metadatos de la base de datos CARD y ResFams.

84 70 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Tabla 3-33: Descripción tabla metadata CARD, aro_categories Nombre de la tabla: aro_categories Columna Descripción de la tabla: Tipo Es la tabla principal de la metadata de la base de datos de CARD, tomada de un archivo con extensión csv. Aquí se encuentra la relación de las secuencias que se encuentran en un multifasta contra los mecanismos de resistencia y los antibióticos. Los datos originales tuvieron que ser curadas y ajustadas al modelo E-R. Rangos Validos Permite Nulos Descripción Protein_Accession varchar(20) Ascii hasta 20 No Corresponde al identificador de la proteína en las bases de datos del NCBI, que además hace parte de la columna iden1 de la tabla "gen_resistencia". DNA_Accession varchar(20) Ascii hasta 20 No Identificador para este registro ARO_Category_Name varchar(200) Ascii hasta 200 No Corresponde a un texto que contiene o el mecanismo de resistencia al cual pertenece este registro o el antibiótico al cual es resistente. ARO_Accession varchar(20) Ascii hasta 20 No Corresponde a un identificador en la base de datos de CARD, que además hace parte de la columna iden2 de la tabla "gen_resistencia". Tabla 3-34: Descripción tabla resfams_metadata Nombre de la tabla: resfams_metadata Descripción de la tabla: Es la tabla principal de la metadata de la base de datos de Resfams en HMM, tomada de un archivo con extensión csv. Aquí se encuentra la relación entre los 170 HMM que corresponden a resistencia a antibióticos. contra los mecanismos de resistencia y los antibióticos. Los datos originales tuvieron que ser curadas y ajustadas al modelo E-R de este proyecto.

85 Error! Reference source not found.apítulo 3 71 Columna Tipo Rangos Validos Permite Nulos Descripción Resfam_ID Resfam_Family_Name varchar(20) varchar(100) Ascii hasta 20 No Ascii hasta 100 No Description varchar(200) Ascii hasta 200 No Corresponde al identificador propio de ResFams, que además hace parte de la columna iden1 de la tabla "gen_resistencia". El nombre que identifica a este HMM Una descripción brevemente detallada del HMM en cuestión ARO_Identifiers varchar(100) Ascii hasta 100 No Corresponde a un identificador en la base de datos de ResFams que además hace parte de la columna iden2 de la tabla "gen_resistencia". HMM_Source varchar(20) Ascii hasta 20 No Es la fuente de donde Resfam, ha tomado la información siendo estas las siguientes posibles: Resfam, Pfam, TIGRFam. Antibiotic_Classification Mechanism_Classification varchar(50) varchar(50) Ascii hasta 50 Si Ascii hasta 50 Si Corresponde al antibiótico o grupo de antibióticos para el cual este HMM es resistente. Corresponde al Mecanismo de resistencia. B_Lactamase_Ambler_Class varchar(50) Ascii hasta 50 Si Califica a las betalactamasas por sus clases: A, B, C o sin clasificar. Tetracycline_Resistance varchar(50) Ascii hasta 50 Si Tres tipos de clasificacion solo para los HMM resistentes a Tetraciclinas: Bomba Eflujo MFS, Protección ribosomal, inactivación.

86 72 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Persistencia datos bibliográficos Las siguientes tablas fueron implementadas para guardar sistemáticamente los datos bibliográficos de muchos registros en diferentes tablas sobre el modelo completo de a presente tesis, y además tener un modelo simplificado y unificado, es decir la misma bibliografía puede aplicar a diferentes registros en diferentes tablas. Las tablas a las cuales se les está referenciando la bibliografía son: Figura 3-5: Diagrama E-R para la bibliografía Tabla 3-35: Descripción del catálogo bibliografia Nombre de la tabla: bibliografia Columna id_bibliografia PMID PMCID Descripción de la tabla: Catálogo que guarda todas las referencias bibliográficas que se desean persistir y que tiene relación con registros de otras tablas particulares en esta base de datos. Tipo int(11) AI PK varchar(45) varchar(45) Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Ascii hasta 45 Ascii hasta 45 Si Si Identificador PubMed del artículo que se relaciona con este gen de resistencia. Identificador PMC del artículo que se relaciona con este gen de resistencia.

87 Error! Reference source not found.apítulo 3 73 DOI nombre autores varchar(50) varchar(45) varchar(250) Ascii hasta 50 Ascii hasta 45 verdadero o falso Si No No Identificador digital de objeto del artículo que se relaciona con este gen de resistencia. Nombre de la referencia bibliográfica Autores de la referencia bibliográfica en cuestión anno int(11) entre 1900 y año actual No EL año de publicación de la referencia bibliográfica en cuestión Tabla 3-36: Columna id_bibliografia_tablas id_bibliografia Descripción de la tabla bibliografia_tablas Nombre de la tabla: bibliografia_tablas Descripción de la tabla: Tipo int(11) AI PK int(11) Esta tabla permite la interacción entre el catalogo "Bibliografía", y cualquier tabla a la cual sus registros tiene alguna referencia bibliográfica que se quiera persistir en este modelo. Rangos Validos Permite Nulos Descripción Entre 1 y No Identificador auto numérico Ascii hasta 45 No nombre_tabla varchar(64) Ascii hasta 45 No id_tabla int(11) Ascii hasta 50 No Llave foránea al identificador de la tabla catalogo bibliografía El nombre de la tabla a la cual va a hacer una referencia bibliográfica Es el ID o PK del registro de la tabla señalada en la columna anterior Lectura de los genomas ensamblados Figura 3-6, las tablas incluidas en la base de datos implementadas para almacenar los datos de anotación de los genomas ensamblados producidos por el programa Prokka en forma de un archivo en formato gff. Este esquema es una adaptación de las tablas que hacen parte de un modelo aún más avanzado y completo desarrollado por (Ballen Mejía, 2016), como parte de su tesis de maestría desarrollada dentro del grupo de Bioinformática del Instituto de Biotecnología.

88 74 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Para hacer la carga automática de las anotaciones de cada genoma ensamblado Ballen en la base de datos (Ballen Mejía, 2016), desarrolló el programa LecturaEnsamblados V en Python que lee cada archivo gff capaz de leer los archivos gff y alimentar con los datos de anotación las diferentes tablas implementadas en la base de datos (Figura 3-6). Para el presente trabajo, el programa LecturaEnsamblados V tuvo que ser modificado para que pudiera cargar los archivos gff producidos e incluir el tag Product de los archivos de anotación, que contiene los valores correspondientes a e-value, porcentaje de identidad y cobertura, producidos por el programa Blast durante la ejecución de Prokka cuando encuentra el hit que corresponda con el CDS anotado dentro del genoma. Finalmente, también se modificó para que además de funcionar por lotes también funcione cargando una por una las muestras. Esta aplicación está hecha con la misma versión de Python y las mismas librerías del presente trabajo, igualmente la misma versión del motor de base de datos. La utilidad de esta aplicación se encuentra en que ella carga toda la información de la anotación a un modelo de base de datos, el cual permite su fácil extracción y análisis para el presente trabajo.

89 Error! Reference source not found.apítulo 3 75 Figura 3-6: Diagrama E-R para aplicación LecturaEnsamblados V Clasificación de β-lactamasas orientada a la resistencia Este grupo de enzimas por su cantidad y por la posibilidad de clasificación en la resistencia a los antibióticos son tomadas y valoradas de una forma que se va a explicar en este sub capitulo. Es necesario encontrar y aplicar una clasificación consenso bajo la indicación de varios artículos científicos que son relevantes para tal tarea (la bibliografía que referencia estos artículos esta especificada en las la Tabla 3-37 y la Tabla 3-38). Hay que tener en cuenta

90 76 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria que el propósito principal en esta clasificación es encontrar una forma adecuada de crear un perfil genómico de resistencia para este grupo de enzimas, orientado a la resistencia. Como muchas de estas proteínas fueron tomadas de la base de datos de CardB (McArthur et al., 2013) al igual que los metadatos que ellos tienen para descargar, la asignación a la resistencia de los antibióticos simplemente apuntaba a la clase principal de antibióticos, es decir β-lactams, pero para poder hacer la comparación necesaria con el perfil fenotípico de resistencia es necesario una discriminación más detallada, que nos lleve hasta el punto de discriminar por sub-clase de antibióticos. Primero la base de datos creada para manejar este sistema de información para la resistencia a antibióticos en nuestras cepas de Acinetobacter baumannii, tiene definido un modelo para asociar los genes con la resistencia a los antibióticos, como se aprecia en la Figura 3-7. Figura 3-7: Tablas que asocian los genes con la resistencia a los antibióticos El modelo de la Figura 3-7, muestra una relación de muchos a muchos entre los antibióticos y los genes de resistencia (por genes de resistencia se quiere indicar las

91 Error! Reference source not found.apítulo 3 77 siguientes posibilidades: genes, proteínas y HMM asociadas a la resistencia a los antibióticos). La tabla que permite esta interacción de muchos a muchos, califica a esta relación con una interpretación basada en los mismos 3 niveles de susceptibilidad con los cuales se califica la resistencia fenotípica cuando se realiza el antibiograma: Susceptible, intermedio y resistente. Adicional también se permite agrupar a esta relación según la tabla clsi-antibiotico actualmente corresponde únicamente para Acinetobacter spp. En su concentración mínima inhibitoria dada según el año que le pertenece, según el año de la muestra (Patel et al., 2015) páginas 56 y 57. Por otro lado, la información sobre β-lactamasas obtenida de la literatura consultada fue almacenada en las tablas de la base de datos que se muestran en el modelo presentado en la Figura 3-8. Figura 3-8: Tablas que asocian los genes que codifican β-lactamasas con la resistencia a antibióticos.

92 78 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria La tabla blactam_clase (Tabla 3-26), guarda los registros de las clases moleculares de β- lactamasas, agrupadas según la similitud de sus secuencias. Hay 4 clases reportadas: A, B, C y D. (Bush and Jacoby, 2010) dentro de las cuales la clase B a su vez está dividida en B1, B2, y B3. La tabla blacta_grupo (Tabla 3-27) contiene los grupos funcionales definidos inicialmente por Karen Bush y George A. Jacoby como subcategorías de las clases moleculares (Bush and Jacoby, 2010). Esta tabla también contiene las sub clases de antibióticos de los que hay reportes de haber sido hidrolizados por determinado grupo funcional y el nivel de resistencia que se genera, esta última información tomada de (Bush, 2013), donde por cada grupo funcional se detalla la resistencia para las enzimas más representativas y para algunos de las sub clases de antibióticos. Adicionalmente, dadas las diferencias reportadas entre las enzimas KPC, SME y GER pertenecientes al grupo funcional de carbapenemasas 2f (Queenan and Bush, 2007), dentro de los registros de la tabla la tabla blacta_grupo (Tabla 3-27) se establecieron 3 grupos para las carbapenemasas 2f: 2f, 2f_GES y 2f_SME, para facilitar la inclusión de las diferencias en el perfil de resistencia que presentan los diferentes miembros del grupo Finalmente, el consolidado de todas las agrupaciones es el que se describe en la Tabla Tabla 3-37: Agrupación Consolidada para β-lactamasas Clase Grupo Subclase Interpretación Molecular Funcional Antibiótico A 2a Penicillins Resistente (Bush and Jacoby, 2010) 2b 2be Cephalosporin Ic Penicillins Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente (Bush and Jacoby, 2010) Bibliografía (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)

93 Error! Reference source not found.apítulo 3 79 B1 2ber 2br Monobactams Penicillins Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Penicillins b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Penicillins Resistente Resistente Resistente Intermedio Intermedio Intermedio Resistente Intermedio Resistente (Bush, 2013), (Poole, 2004) (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013), (Poole, 2004) 2c Penicillins Resistente (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) 2ce Penicillins Resistente (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) 2e 2f 2f_GES 2f_SME 3a Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Penicillins Carbapenem Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Monobactams Penicillins Carbapenem Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Monobactams Penicillins Carbapenem Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Monobactams Penicillins b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Carbapenem Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Intermedio Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Intermedio Intermedio Intermedio Resistente Resistente (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Queenan and Bush, 2007), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Queenan and Bush, 2007), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Queenan and Bush, 2007), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) Intermedio (Queenan and Bush, 2007), (Bush and Jacoby, 2010), Resistente (Bush, 2013)

94 80 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria B2 B3 C D 3b 3a 1 1e Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Penicillins b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Carbapenem b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Carbapenem Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Penicillins b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Cephalosporin Ic b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Intermedio Resistente Intermedio Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Intermedio Resistente Intermedio Resistente Resistente Resistente Resistente 2d Penicillins Resistente 2de 2def 2df Cephalosporin Ic Cephalosporin IIIc Penicillins Carbapenem Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Monobactams Penicillins Carbapenem Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Penicillins Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Evans and Amyes, 2014), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Evans and Amyes, 2014), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) (Gomez et al., 2013), (Evans and Amyes, 2014) (Bush, 2013), (Evans and Amyes, 2014), (Bush and Jacoby, 2010)

95 Error! Reference source not found.apítulo 3 81 El grado de resistencia conferida por una β-lactamasa, como ya se ha indicado, fue obtenido de lo descrito en la literatura, teniendo cuidado de solo utilizar aquellos datos que estuvieran soportados en pruebas experimentales. Los datos que actualmente tiene la base de datos sobre las enzimas y familias de enzimas de los grupos funcionales, fueron completados en algunos casos particulares con otras fuentes especializadas (Tabla 3-38). Tabla 3-38: Asignación de genes a los grupos de β-lactamasas por excepción. Clase Grupo Nombre Bibliografía Cometarios Molecular Funcional Gen A 2a PC1 (Bush and Jacoby, 2010) 2b 2be El nombre de este gen no se encuentra en Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona SHV-32 Se logra asignar a un grupo por Lahey SHV-1 (Bush and Jacoby, 2010) TEM-1 (Bush and Jacoby, 2010) TEM-2 (Bush and Jacoby, 2010) GES-1 (Poole, 2004) PER-7 (Bonnin et al., 2011, p. 7) VEB-1a (Poirel et al., 2001) El nombre de este gen no se encuentra en Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona El nombre de este gen no se encuentra en Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona El nombre de este gen no se encuentra en Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona El nombre de este gen no se encuentra en Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona El nombre de este gen no se encuentra en Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona El nombre de este gen no se encuentra en Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona VEB-1b (Poirel et al., 2001) El nombre de este gen no se encuentra en Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona CTX-M Se logra asignar a un grupo por Lahey BEL 1 al 3

96 82 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria 2ce CARB-16 (Petrova et al., 2014) ADC-2 NCBI protein: WP_ C 1 PDC-3 NCBI protein: ACQ OXA-24 (Guo-Bao Tian et al., 2011) 2df OXA-120 OXA-215 OXA OXA-100 Según el artículo, posiblemente esta proteína tiene un tipo de resistencia muy limitado. Las enzimas CARB pueden estar tanto en el grupo 2c y 2ce. Por la descripción de resistencia limitada se decide dejar este gen en el grupo 2c. Identificada inicialmente para Psychrobacter maritimus, obtiene un 100% de identidad en la muestra RB 1321, id 74. No se encuentra por este nombre en Lahey, fue necesario revisar la fuente principal que indica en un tag de la anotación sobre la pertenencia a la clase C No se encuentra por este nombre en Lahey, fue necesario revisar la fuente principal que indica en un tag de la anotación sobre la pertenencia a la clase C Este gen corresponde al mismo OXA-40, que es mencionado en el artículo referenciado para A. baumannii Se logra asignar a un grupo por Lahey La información de la clase molecular D es limitada en la literatura disponible, por lo que se utilizó la página de la clínica Lahey ( para completar estos datos. De esta misma forma también se completó el grupo AmpC, que hace parte de la clase molecular C grupo funcional 1, y el grupo NDM que se encuentra en la clase molecular B1 en el grupo funcional 3. Todos los genes agrupados por sus clases y grupos de β-lactamasas se encuentra en el Anexo D, tabla Reglas de negocio para la obtención teórica de la resistencia genómica La primera parte de la implementación de las reglas consiste en la definición estática de estas, en los diferentes catálogos. Más adelante se define la forma dinámica de las reglas, para que con estas se obtenga la información de los catálogos asociados a cada una de las muestras y así generar el perfil teórico de resistencia genómico.

97 Error! Reference source not found.apítulo Primera Regla La primera regla tiene como finalidad el poder filtrar en los reportes del perfil genómico según el alcance de los antibióticos que se encuentran en el perfil fenotípico. Estos ajustes se implementan en la tabla llamada gen_antibiotico_resistencia (Tabla 3-18), esta tabla es la que permite la relación muchos a muchos entre la tabla antibiótico y la tabla gen_resistencia, encargada de almacenar el catálogo de todos los genes relacionados con la resistencia a antibióticos, tomados de las bases de datos de proteínas de CardDB (Jia et al., 2017), de los HMM de Resfam (Gibson et al., 2015) y otras proteínas, obtenidas a partir de la literatura sobre resistencia de A. baumannii, que no estaban incluidas en las bases de datos anteriormente nombradas. Se creó la tabla catalogo llamada correspondencia_antibiotico (Tabla 3-19) para relacionar con la tabla gen_antibiotico_resistencia (Tabla 3-18), para marcar cuales son los antibióticos que van a ser relacionados en el perfil de resistencia genómica. Este catálogo permite saber cuál es el perfil de resistencia genómico basado únicamente en los 8 antibióticos base del perfil de resistencia fenotípica según el CLSI, y su versión ampliada con las sub clases o clases de antibióticos a los cuales pertenecen esos 8 antibióticos base. Esto permite hacer la comparación entre los perfiles de resistencia genómico y fenotípico. EL Instituto Nacional de Salud (INS) basado en el estándar del CLSI, estableció los siguientes 8 antibióticos, como la base de su perfil de resistencia fenotípica para A. baumannii: Ampicillin-sulbactam, Ceftazidime, Amikacin, Cefepime, Cephalexin, Imipenem, Meropenem, Piperacillin-tazobactam Teniendo en cuenta lo sugerido en la literatura para los genes de resistencia a antibióticos que se encuentran en la base de datos, se realizó una consulta que cruzó las tablas mencionadas anteriormente, para obtener los registros que presentan elementos

98 84 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria genómicos asociados con resistencia únicamente a: Imipenem, Meropenem, Ceftazidime, obteniendo los siguientes resultados: Imipenem Meropenem Ceftazidime (porinas: CarO, omp33 y omp36 ) (porinas: CarO ) (Bomba eflujo "adede") El resultado de la consulta muestra 4 genes, de los cuales los genes CarO, omp33 y omp66 se relacionan con resistencia al grupo global de antibióticos β-lactámicos, y no a alguna de las sub clases de antibióticos, mientras que la bomba eflujo adede, está relacionada con la resistencia a diferentes sub clases de antibióticos. Es evidente que la información de un posible perfil genómico de resistencia que se podría obtener utilizando estos datos estaría incompleto. Para entender un poco como se relaciona los antibióticos base, con las sub clases y clases de este, tenemos la siguiente tabla: Tabla 3-39: Jerarquía de los antibióticos base para A.baumannii dada por el INS Antibióticos Sub-Clase Clase Ampicillin-sulbactam β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations Piperacillin-tazobactam β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations Ceftazidime Cephalosporin IIIc Cephems (parenteral) Amikacin Aminoglycosides Cefepime Cephalosporin IVc Cephems (parenteral) Cephalexin Cephalosporin Ic Cephems (oral) Imipenem Carbapenem Penems Meropenem Carbapenem Penems Por supuesto la regla debe incluir las sub clases: Cephalosporin IIIc, Cephalosporin IVc, Cephalosporin, Carbapenem. Además, las clases: β-lactam/ β -lactamase inhibitor combinations, Aminoglycosides, Cephems (parenteral), Cephems (oral), Penems.

99 Error! Reference source not found.apítulo 3 85 Por lo tanto, al hacer nuevamente la consulta en la base de datos con las anteriores clases y subclases de los antibióticos, para los aminoglycosides se obtienen 197 genes, entre los que se encuentran AAC, APH, ANT entre muchos otros; para Carbapenem se obtienen por un lado 4 genes: OprD, AdeD, AdeE, SCO-1 y por el lado de los genes que codifican para β-lactamasas se tienen 167 genes. Para Cephalosporin Ic, Cephalosporin IIIc, Cephalosporin IVc, se tiene por un lado un gen llamado SCO-1 que confiere bajo nivel de resistencia a estas sub clases de antibiótico y por el lado de los genes asociados a resistencia a β-lactamasas que se muestran en la Tabla Tabla 3-40: β-lactamasas que pertenecen a la agrupación en segundo nivel. Cantidad Nombre grupo Interpretación Genes b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 1 Intermedio 96 Cephalosporin Ic 1 Resistente 96 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 1e Intermedio 1 Cephalosporin Ic 1e Resistente 1 Cephalosporin IIc 1e Resistente 1 Cephalosporin IIIc 1e Resistente 1 Cephalosporin IVc 1e Resistente 1 Cephalosporin Ic 2b Resistente 7 Cephalosporin Ic 2be Resistente 102 Cephalosporin IIc 2be Resistente 102 Cephalosporin IIIc 2be Resistente 102 Cephalosporin IVc 2be Resistente 102 Cephalosporin Ic 2ber Resistente 5 Cephalosporin IIc 2ber Intermedio 5 Cephalosporin IIIc 2ber Intermedio 5 Cephalosporin IVc 2ber Intermedio 5 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 2br Intermedio 8 Cephalosporin Ic 2de Resistente 21 Cephalosporin IIIc 2de Resistente 21 Carbapenem 2def Resistente 2 Cephalosporin IIc 2def Resistente 2 Cephalosporin IIIc 2def Resistente 2 Cephalosporin IVc 2def Resistente 2 Carbapenem 2df Resistente 45 Cephalosporin IIc 2df Resistente 45 Cephalosporin IIIc 2df Resistente 45

100 86 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Cephalosporin IVc 2df Resistente 45 Cephalosporin Ic 2e Resistente 2 Cephalosporin IIc 2e Resistente 2 Cephalosporin IIIc 2e Resistente 2 Cephalosporin IVc 2e Resistente 2 Carbapenem 2f Resistente 14 Cephalosporin Ic 2f Resistente 14 Cephalosporin IIc 2f Resistente 14 Cephalosporin IIIc 2f Resistente 14 Cephalosporin IVc 2f Resistente 14 Carbapenem 2f_GES Intermedio 14 Cephalosporin Ic 2f_GES Resistente 14 Cephalosporin IIc 2f_GES Resistente 14 Cephalosporin IIIc 2f_GES Resistente 14 Cephalosporin IVc 2f_GES Resistente 14 Carbapenem 2f_SME Resistente 3 Cephalosporin Ic 2f_SME Resistente 3 Cephalosporin IIc 2f_SME Intermedio 3 Cephalosporin IIIc 2f_SME Intermedio 3 Cephalosporin IVc 2f_SME Intermedio 3 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 3a Intermedio 83 Carbapenem 3a Resistente 83 Cephalosporin Ic 3a Resistente 83 Cephalosporin IIc 3a Resistente 83 Cephalosporin IIIc 3a Resistente 83 Cephalosporin IVc 3a Resistente 83 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 3b Intermedio 8 Carbapenem 3b Resistente 8 Ciertamente si se toman únicamente como base de comparación, los ocho antibióticos base incluidas las sub clases de antibióticos correspondientes, aun así, se pierde información que puede ser valiosa en el perfil genómico teórico de resistencia Segunda Regla Esta regla establece el nivel de resistencia, en Resistente, intermedio o susceptible a los elementos genómicos de resistencia.

101 Error! Reference source not found.apítulo 3 87 Para entender esta regla se presenta el siguiente ejemplo: el gen SCO-1 confiere alta resistencia a penicilinas y baja resistencia a cefalosporinas y carbapenemasas (Poirel et al., 2007), es decir que frente a la primera clase de antibióticos la bacteria se hace resistente y frente al resto su nivel es intermedio. Además, la resistencia en otros casos se debe a la poca expresión y/o la desaparición de algunos genes como los que permiten la expresión de las porinas: caro, omp33, opm66, oprd, opmw. Entonces para este caso, si los genes simplemente se encuentran en la anotación, la regla señala que son susceptibles a carbapenemasas entre otros (García, 2013). Así mismo los genes gyra y parc, confieren resistencia intermedia a quinolonas (si presentan la mutación que les confiere tal resistencia) (Ardebili et al., 2015). Si ambos se encuentran mutados entonces esta combinación causaría que la resistencia sea alta. La solución para este caso esta descrito en la quinta regla, por lo que el comportamiento de estos genes estaría cubierto con la presente y la quinta regla. En la implementación de esta regla interviene la tabla gen_antibiotico_resistencia Tabla 3-18 a través de su relación con la tabla interpretación Tabla 3-5, de tal forma que para cada dupla gen-antibiótico se pueda acceder al nivel de resistencia asociado, bien sea: Resistente, intermedio, susceptible, ya que la tabla gen_antibiotico_resistencia posee una columna que se relaciona con la tabla interpretación que se usa para calificar el nivel de resistencia en la relación gen-antibiótico durante la elaboración del perfil genómico de resistencia. La decisión de usar los 3 niveles de resistencia para calificar el nivel de resistencia en la relación gen-antibiotico (que finalmente califica el perfil genómico de resistencia), es porque esto permite hacerlos comparables con lo reportado por la literatura Tercera regla Esta regla evalúa los Operones de resistencia y sus reguladores de expresión.

102 88 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Esta regla aplica para las bombas eflujo del tipo RND (resistance-nodulation-cell division) y otros genes que permiten o regulan su sobre expresión. Para la implementación de esta regla se creó una tabla que permite guardar la configuración de estos operones llamada: operon_resistencia (Tabla 3-21), donde se incluye la dirección de la transcripción y los genes con su ubicación en el operón. Igualmente, se almacena en esta tabla la ubicación de los reguladores de expresión, de tal forma que en con junto de los datos almacenados en esta tabla corresponde a la representación topológica de los operones y sus elementos de regulación, como se esquematiza en la Figura 3-9, para los operones de algunas bombas de eflujo tipo RND encontradas en el genoma de diferentes cepas de A. baumannii. Figura 3-9: Algunas bombas eflujo tipo RND para A. baumannii Imagen tomada de: (Coyne et al., 2011) Cabe destacar que la implementación de esta regla permite ubicar el gen regulador, aunque no esté cerca del gen que regula, como es el caso del gen aden asociado con la regulación de la bomba adeijk (Rumbo et al., 2013) que no necesita estar cerca de la bomba adeijk para regular la expresión de la misma (Rosenfeld et al., 2012), y es diferente a los otros genes reguladores como por ejemplo el gen adel o la dupla de genes aders.

103 Error! Reference source not found.apítulo 3 89 Se tiene en cuenta la bomba adexyz que posee 97% de identidad con la bomba adeijk. Por último, se tiene la bomba adede. (Coyne et al., 2011). Finalmente, esta información fue recopilada y organizada a través de scripts en MySQL por medio de un procedimiento almacenado llamado getbombasrndxmuestra, que a su vez es utilizado por el script en Python llamado bombasxmuestra.py, encargado de almacenar en la tabla bombas_rnd, todos los hallazgos de bombas y reguladores encontrados en las anotaciones registradas en la base de datos para los genomas de las diferentes muestras. (Tabla 3-23) Cuarta Regla Define un porcentaje de identidad y un porcentaje de cobertura mínimo por grupos de genes según los mecanismos de resistencia. La gran mayoría de genes de resistencia a antibióticos se encuentran bajo el mecanismo definido como Degradación o Modificación del Antibiótico y dentro de este, la mayoría pertenece al grupo de β-lactamasas. Esto último se debe a que la penicilina fue el primer antibiótico descubierto y utilizado para el tratamiento de infecciones (Tan and Tatsumura, 2015), y por tanto, es frente al cual las bacterias han desarrollado más estrategias moleculares para hacerse resistentes, estrategias que involucran mutación de su secuencia genómica, de tal forma se generan variantes con secuencias muy parecidas, que les permiten eludir la acción de la penicilina y sus derivados o de las otras clases de antibióticos disponibles en este momento para el tratamiento de infecciones. Dada las pequeñas variaciones de secuencia que se presentan en los elementos genómicos asociados a resistencia en bacterias, fue necesario definir inicialmente el porcentaje de identidad y el de cobertura, necesarias para identificar en la anotación de los genomas estos elementos genómicos de resistencia. Por ejemplo, para el caso de las de β-lactamasas, la identidad y la cobertura deben estar mucho más cercanas al 100%,

104 90 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria dado que la diferencia entre secuencias en muchos de sus grupos es apenas de unos pocos aminoácidos, haciendo que porcentajes por debajo de 90% puedan generar errores de identificación. Al resto de mecanismos se le dio un poco más de holgura, estableciendo los porcentajes sobre 60% para la identidad y 75% para la cobertura. Por otra parte, cuando los resultados de anotación de un elemento genómico no incluyen un hit obtenido por el uso del programa de BlastP y por ende no incluyen los porcentajes de identidad y cobertura, pero si resultados de la utilización de los HMM de ResFam, por ejemplo, para facilitar el manejo interno de la aplicación a estos se les deja por defecto el 0% tanto para la identidad y como para la cobertura. Es posible que bajo la lupa de análisis futuros se puedan dar mejor precisión a estos porcentajes inicialmente planteados (separados y/o discriminados por grupos más pequeños e incluso por gen o elemento genómico). Para lograr la implementación de la parte estática de esta regla en la tabla llamada gen_mecanimos_resistencia (Tabla 3-15), se almacena tanto el porcentaje de identidad como la cobertura Quinta Regla Evalúa las mutaciones puntuales de proteínas que causan resistencia a antibióticos Se crea un catálogo para esta regla, que define la forma pasiva para los genes gyra y parc. Ambos según indica la literatura, al poseer mutaciones puntuales crea resistencia a los siguientes antibióticos: Fluoroquinolonas, Quinolonas y Ciprofloxacin (Ardebili et al., 2015). Para estos genes, siempre se describe la posición puntual de la mutación, pero también es importante establecer el vecindario del o los aminoácidos mutados para poder asegurar con una búsqueda de sub-cadena que se encuentre sin equivocación dicha mutación puntual.

105 Error! Reference source not found.apítulo 3 91 Para el caso de gyra se tiene la mutación: Serina 83 a Leucina (S83L), además obtenemos el motivo HPHGDLAVYETI que incluye los aminoácidos vecinos a la mutación, en donde la Leucina está en el centro indicando la mutación que hace a la bacteria resistente a los antibióticos mencionados anteriormente (Martínez and Máttar, 2010). Esta cadena o motivo siempre va a ser único dentro de la búsqueda para el gen gyra mutado. Para el caso de parc se debe encontrar la mutación: Ser80Leu, para definir entonces la sub-cadena que permite la resistencia en este gen, la siguiente sub-cadena está asociada a una alta resistencia: HPHGDLACYEA, nuevamente la Leucina está en el centro. (Vakili et al., 2014). También se encuentran en la literatura otras posibilidades que añaden un poco más de complejidad, y que las siguientes mutaciones en parc también causan resistencia: (S80L or W, E84K and G78C). (Park et al., 2011) En la posición 80 ahora se tienen 2 posibilidades L ó W y para las posiciones 84 y 78 se debe permitir que la búsqueda se haga por ambos aminoácidos descritos allí, aunque la base sigue siendo la mutación en la posición 80. Para el caso de parc se debe encontrar la mutación: S80L, para lo cual el motivo asociada a una alta resistencia es HPHGDLACYEA, encontrándose nuevamente la leucina en el centro. (Vakili et al., 2014). También se encuentran en la literatura otras posibilidades que añaden un poco más de complejidad, como las siguientes mutaciones en parc que también causan resistencia: (S80L o W, E84K y G78C). (Park et al., 2011). En la posición 80 ahora se tienen 2 posibilidades L ó W y para las posiciones 84 y 78 se debe permitir que la búsqueda se haga por ambos aminoácidos descritos allí, aunque la base sigue siendo la mutación en la posición 80. Entonces para este caso se usa una expresión regular y se evalúa sobre las secuencias traducidas del gen parc, la expresión regular HPH(G C)D(L W)ACY(E K)A basada en el motivo antes descrito. Esta regla es implementada con la tabla llamada mutacion_resistencia (Tabla 3-25), donde se guardan los motivos o las expresiones regulares, y con la tabla llamada mutacion_gen_resistencia (Tabla 3-24), en la cual se hace el cruce entre la tabla mutacion_resistencia y la tabla gen_resistencia donde se encuentra el catálogo de los genes de resistencia: (Tabla 3-16).

106 92 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria 3.5 Determinación a los perfiles de resistencia Fenotípicos El INS facilitó inicialmente los perfiles fenotípicos de resistencia (antibiograma) de las 89 muestras seleccionadas, obtenidos utilizando el método de disco plata Kirby Bauer (gold estándar) (Cantón et al., 2000), el método automatizado Vitek 2 (d Azevedo et al., 2009), y el método automatizado Phoenix 100 (O Hara, 2006). Los datos fueron almacenados en la base de datos en la tabla resistencia_fenotipica (Tabla 3-8), y con ellos se procedió a hacer una comparación muestra por muestra, del antibiograma reportado por cada una de las tecnologías, encontrando diferentes incongruencias en la resistencia del microorganismo frente a algunos antibióticos y las sub clases a las que pertenecen. Por lo cual, para hacer más robustos los resultados de los antibiogramas se repitieron las pruebas en las muestras que presentaron incongruencias. De acuerdo con el protocolo del INS, el antibiograma obtenido por la metodología Kirby Bouer utiliza 8 antibióticos, como se mencionó en la regla 1 del capítulo 3.4.1, todos pertenecientes al grupo de los antibióticos las β-lactámicos. Dado que la prueba considerada Gold estándar está limitada a un solo grupo de antibióticos, y que los sistemas automatizados como Vitek y Phoenix incluyen muchos más en sus pruebas, se tomó la decisión junto con el equipo del grupo de Epidemiologia Molecular del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional sede Bogotá, de definir las jerarquías y crear un antibiograma consolidado utilizando los resultados de las tres pruebas. La totalidad de estos datos se encuentra en el Anexo B. Dentro de la búsqueda por un algún método que permitiera la comparación de los dos tipos de perfiles de resistencia, fenotípico Versus genómico, se definió para el perfil fenotípico de resistencia 4 categorías de multiresistencia: MDR resistente a múltiples antimicrobianos cuando por lo menos es resistente a por lo menos 1 miembro de 3 categorías diferentes de antimicrobianos; XDR Extremadamente resistente a los antimicrobianos cuando por lo menos es resistente a por lo menos 1 miembro de 8 categorías diferentes de las 10 de antimicrobianos; PDR pandrug resistente cuando es completamente resistente a todos los antimicrobianos (Magiorakos et al., 2012); y sin asignar.

107 Error! Reference source not found.apítulo Desarrollo de la aplicación La construcción de la aplicación se hizo por capas, según se avanzaba en las necesidades del proyecto. Este desarrollo se realizó utilizando el lenguaje Python. Específicamente se trabajó con la versión 3.4, usando para facilidad del desarrollador el IDE 1 (entorno de desarrollo integrado) de Microsoft Visual Studio Las librerías que se requieren para el correcto funcionamiento de todos los scripts de la aplicación son los siguientes: bcbiogff (0.64), para leer y escribir los archivos GFF (Generic Feature Format) de la anotación de los genomas; biopyhton (1.67), que posee muchas funcionalidades bioinformáticas como por ejemplo la fácil manipulación de archivos en formato FASTA, entre muchas otras; mysql-conector-python (2.13), driver para Python que facilita la interacción con la base de datos en MySQL; y Numpy (1.11.2) paquete para la computación científica con Python, que permite manipular objetos de matriz N-dimensional. La aplicación en Python llamada LecturaResistencia es compatible tanto en Windows como en Linux, siempre y cuando tenga los prerrequisitos instalados incluida la base de datos en MySQL. La Figura 3-10, muestra un diagrama de flujo de los pasos que debe seguir LecturaResistencia para cumplir con el objetivo de obtener un perfil genómico de resistencia partiendo de la anotación de los genomas de A. baumannii descrita en el sub capitulo (3.1.5). La línea de comando utilizada para su ejecución sobre la carpeta con la muestra previamente anotada con Prokka para una de las muestras es el siguiente: python3.4 /vault2/hermes/codigofuente/lecturaresistencia_v_1.0/perfilresistencia.p y -r /vault2/seqilluminabaumannii/anotaciong3/gmrra Es posible que la anterior línea de comando pueda estar en un archivo de Shell junto con más líneas de comando para las diferentes muestras, y así hacer un procesamiento en lote de ser necesario. 1 IDE: Entorno de Desarrollo Integrado, es un entorno de programación que ha sido empaquetado como un programa de aplicación, es decir, consiste en un editor de código, un compilador, un depurador y un constructor de interfaz gráfica (GUI)

108 94 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Figura 3-10: Diagrama de flujo global del pipeline de la aplicación Como se puede ver en la Figura 3-10, el ingreso de los datos solicita la ruta de la anotación con el formato adecuado, como se puede ver en el ejemplo de línea de comando antes presentada, el nombre de la carpeta utilizada es GMRRA , cuyo nombre tiene el formato adecuado que requiere, de la siguiente forma: nombre de la carpeta que contenga el nombre de la muestra, seguido por un punto, y luego por el ID de la muestra en la base de datos. Este script llamado perfilresistencia.py, es el que internamente hace el llamado a cada uno de los procesos de este pipeline, como se ve en el diagrama de flujo.

109 Error! Reference source not found.apítulo 3 95 El segundo proceso llamado Cargar Genes, hace uso de una versión especial del programa LecturaEnsamblados que permite subir a la base de datos, todo lo que la anotación funcional llama genes, en las tablas que se muestran en el diagrama E-R, en la Figura 3-6. Esta versión del programa fue modificada para guardar un tag de la anotación llamado Inference, el cual permite identificar si la anotación del gen fue hecha con base en el multifasta generado a partir de la base de datos CARD o en otras bases de datos de HMM como ResFams. Además, permite hacer el cruce de todos estos datos de la anotación con el ID de la muestra que ya existe en la base de datos. El proceso llamado Extraer Características, se ejecuta a través de un procedimiento almacenado llamado extraercaracteristicasxmuestra, que únicamente solicita como parámetro de entrada el id_muestra. Este extrae de manera adecuada todos los datos previamente identificados para la resistencia genómica del proceso anterior; y los guarda en la tabla resistencia_genomica1 (Tabla 3-17), es decir los genes que identifica según el archivo multifasta generado a partir de la base de datos CARD incluidos los genes adicionales para A. baumannii, y los HMM de ResFams. El siguiente proceso llamado Extraer Bombas RND, requirió de un script llamado bombasxmuestra.py y un procedimiento almacenado llamado getbombasrndxmuestra, ya que por el tipo de configuración que estas tienen es necesario hacer una evaluación más completa que requiere de esta interacción. La Figura 3-11 muestra el diagrama de flujo que explica en forma global el funcionamiento de este script. Este proceso presenta una particularidad, mientras se almacenen en el catálogo de las bombas eflujo tipo RND operon_resistencia Tabla 3-21, nuevos operones y reguladores, no importando la configuración que estos tengan, el script lograra identificar sí este está correctamente formado o no, para su evaluación dentro de la resistencia. genómica. Por último, el proceso llamado Crear un perfil genómico, utiliza un procedimiento almacenado llamado CrearPerfilGenomicoXMuestra, que recibe únicamente como parámetro el id_muestra, para generar el perfil.

110 96 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Este procedimiento finalmente aplica todas las reglas definidas en el sub capítulo 3.4, y genera los valores necesarios para el perfil de resistencia genómica que se presenta en el capítulo Error! Reference source not found.. A continuación, se presenta una explicación a manera de pseudo código de los pasos que realiza este procedimiento almacenado. 1. Borrar perfil consolidado genómico por muestra (si existe) 2. Borrar perfil de resistencia genómica temporal por muestra (si existe) 3. Insertar en el perfil de resistencia genómica temporal todos los genes que no pertenecen a alguna regla ni las beta-lactamasas. 4. Insertar en el perfil de resistencia genómica temporal únicamente las betalactamasas (estas poseen un camino de resistencia a antibióticos diferente). 5. Insertar en el perfil de resistencia genómica temporal las mutaciones puntuales 6. Insertar en la tabla temporal de bombas RND la información de resistencia a antibióticos del grupo padre si es una agente. 7. Insertar en la tabla temporal de bombas RND la información de resistencia a antibióticos cuando su información ya esta en un grupo y no un agente. 8. Insertar en la tabla de perfil temporal una agrupación únicamente de las bombas RND, calificándolas con un valor. 9. Insertar en la tabla temporal PRG la información de resistencia a antibióticos agrupada por los padres de los agentes, quitando elementos móviles y sin incluir genes referenciados al grupo "Sin asignar". 10. Insertar en la tabla temporal PRG la información de resistencia a antibióticos cuando su información ya hace parte de un grupo y no un agente, dejando afuera los elementos móviles y aquí se incluye los agentes del grupo "Sin Asignar". 11. Inserta en la tabla de perfil temporal PRG una agrupación con los datos de los 2 pasos anteriores, calificándolas con un valor. 12. Inserta en la tabla del perfil consolidado la agrupación de la tabla perfil temporal PRG. 13. Presenta el perfil genómico de resistencia de la muestra.

111 Error! Reference source not found.apítulo 3 97 Figura 3-11: Diagrama de flujo macro Bombas Eflujo tipo RND Scripts adicionales Para poder subir los datos de los genes que provee CARD, fue necesario crear 2 pequeños scripts para tener la información en el formato adecuado. El primer Script llamado

112 98 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria ajustefasta.py, hace un ajuste al encabezado de cada Fasta, para que el proceso de anotación pueda hacer correctamente el trabajo y guarde la información en el archivo GFF de forma correcta. El segundo Script llamado cargarcarddb.py, sirve para subir de forma adecuada la información que se encuentra en el archivo multifasta, a la tabla gen resistencia Tabla 3-16.

113 4. Resultados y Discusión La primera parte de esta capitulo introduce algunos resultados iniciales que se observan al avanzar a través de las reglas en la metodología. Luego se presentan los datos sobre los mecanismos, genes y la relación con los antibióticos. Para posteriormente presentar los resultados finales del presente trabajo. 4.1 Resultados Datos en la tercera regla Algunas estadísticas generales al respecto de estas bombas para las 89 muestras: De las 89 muestras 88 poseen alguna bomba e-flujo tipo RND bien formada, solo la muestra RA 768 no posee ninguna. 44 muestras poseen la bomba adeabc. De las 44 muestras que poseen la bomba adeabc solo la muestra RB 1458 no posee el regulador aders. De las 89 muestras de cepas de A. baumannii ninguna posee la bomba adede. 88 muestras poseen la bomba adeijk y el regulador aden, muestras que la muestra con RA 768 no posee ninguno de los genes. 87 muestras poseen la bomba adefgh, la muestra RB 1287 poseen 2 bombas de este tipo. De las 87 muestras que poseen la bomba adefgh, 23 muestras poseen el regulador adel. Ninguna muestra posee la bomba adexyz.

114 100 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria De las 44 muestras que poseen el operón adeabc, 28 de estas comienzan en la misma posición, (aunque en diferentes contigs para cada muestra), en la posición 17766, es decir allí comienza el gen adea, y de igual manera termina siempre en la misma posición 14583, además indica que la dirección de estos operones siempre es negativa, y todos tienen el regulador aders igualmente en la misma posición. Con respecto a lo descrito en la bibliografía, se evidenciaron en algunas muestras variaciones en la ubicación de los genes que forman el operón de las bombas RND y de sus reguladores, lo que lleva a preguntarse si es posible que las Bombas RND puedan funcionar con esas configuraciones que son un poco diferentes a las reportadas. Esto es observable en 19 muestras (ID s: 1,2, 3, 4, 16, 18, 19, 20, 21, 24,26, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36 y 37), donde el gen regulador adel que a su vez regula la expresión del operón adefgh, no se encuentra exactamente detrás del gen adef, como se supone debería estar, sino que está repetido y a 2 genes de distancia en la dirección correcta, es decir que hay otro gen adel a 3 genes de distancia del gen adef como se ilustra a continuación: adel <- adel <- [proteína] -> adef -> adeg -> adeh Donde para todos los casos [proteína] es una proteína hipotética (verificadas contra la base nr del NCBI), en donde 17 de los casos la proteína es la siguiente: MVRMGETGFMEWTEHKSLSITNKYIKFDNTIRIFITIDVFALENALIGVGVWIYFMP Y para los 2 casos restantes la siguiente: MEWTEHKSLSITNKYIKFDNTIRIFITIDVFALENALIGVGVWIYFMP Es posible que el regulador si sobre exprese al operón por la configuración 3D de la molécula de ADN, ya que espacialmente el regulador adel estaría precediendo al operón (Reguero Reza, 2016). Adicionalmente estas muestras siempre poseen un gen extra adec al final del operón adeabc, (solo para mostrar los hallazgos).

115 Capítulo 4: Resultados y Discusión 101 Por otro lado, en la muestra con ID 6 el regulador aders está en la posición y dirección correcta con respecto al operón adeabc, pero esta repetido 2 veces de la siguiente forma: ader->ader->ades->ades. Aunque esta configuración no es válida según lo consultado en la literatura, de nuevo podría ser interesante conocer su comportamiento in vivo. Adicionalmente, en 16 muestras (ID s: 8,9,10,11,12,13,15, 17, 22,23,25, 30, 31, 32, 38, 40), la bomba adeabc se encuentra incompleta, siempre falta el gen adec, pero poseen completo el regulador aders. Por supuesto es una bomba RND que posiblemente no sea funcional, lo cual sería recomendable probar en el laboratorio Datos en la quinta regla Todas las 89 muestras poseen el gen gyra, de las que la muestra RB 183,2 posee dos. De las 89 muestras 82 poseen el gen gyra con la mutación que confiere resistencia. Ninguna de las muestras posee el gen parc Perfiles fenotípicos de resistencia Tabla 4-1: Categorías y agentes antimicrobianos usados para definir MDR, XDR y PDR en Acinetobacter spp. En las 89 muestras del proyecto Categoría Antimicrobiana Agente Antimicrobiano # R # I # S Total Muestras Gentamicin Aminoglycosides Tobramycin Amikacin Netilmicin Imipenem Antipseudomonal carbapenems Meropenem Doripenem Antipseudomonal fluoroquinolones Ciprofloxacin Levofloxacin Antipseudomonal penicillins+ inhibitors Piperacillin-tazobactam Ticarcillin-clavulanic acid Extended-spectrum cephalosporins Cefotaxime

116 102 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Folate pathway inhibitors Ceftriaxone Ceftazidime Cefepime Trimethoprim-sulfamethoxazole Monobactams Aztreonam Penicillins+ inhibitors Ampicillin-sulbactam Polymyxins Tetracyclines Colistin Polymyxin B Tetracycline Doxycycline Minocycline Criterio para Definir MDR, XDR y PDR en Acinetobacter spp. MDR: no-susceptible a 1 agente en 3 categorías antimicrobianas XDR: no-susceptible a 1 agente en 8 de 10 categorías antimicrobianas PDR: no-susceptible a todos los agentes antimicrobianos listados #R= Cantidad de muestras Resistentes; #I= Cantidad de muestras Intermedias; #S= Cantidad de muestras susceptibles. Como se puede apreciar en la tabla 4-1, solo 3 miembros de 3 categorías diferentes de antibióticos (las casillas que están resaltadas con color), fueron evaluados en las 89 muestras, siendo esto especialmente crítico para la categoría de las Tetraciclinas porque ninguna muestra fue probada frente a este tipo de antibióticos. En el Anexo B, Tabla 1-4, se encuentra para cada una de las muestras su clasificación de resistencia, además de mostrar cuales son las categorías de antibióticos frente a los cuales cada muestra fue resistente. En general la resistencia de las 89 muestras fue clasificada como sigue: 14 XDR, 73 MDR y solo 2 muestra sin clasificación (1 con todas las categorías sensibles y la otra con 1 categoría sensible). Nuevamente con el agravante de que en el antibiograma de algunas muestras no están representados todos los grupos de antibióticos, y, por lo tanto, algunas de las muestras clasificadas como XDR podría ser PDR. Por otro lado, es pertinente mostrar el antibiograma en general para las 89 muestras, de tal forma que se pueda saber a cuantas muestras se les probo su resistencia frente a un antibiótico en particular, visualizando además a que sub clase o clase pertenece ese antibiótico (Tabla 4-2).

117 Capítulo 4: Resultados y Discusión 103 Tabla 4-2: Agrupación de la cantidad de muestras según antibiograma consolidado ID Clase o Subclase 89 Aminoglycosides ID Antibiótico # Muestras 120 Amikacin Gentamicin Aminopenicillin 29 Ampicillin 32 4 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 21 Carbapenem 41 Amoxicillin-clavulanate Ampicillin-sulbactam Piperacillin-tazobactam Doripenem Ertapenem Imipenem Meropenem Cephalosporin Ic 50 Cephalothin Cephalosporin IIIc 57 Cefotaxime Ceftazidime Ceftriaxone Cefuroxime (Oral) Cephalosporin IVc 61 Cefepime Cephamycin 66 Cefoxitin Fluoroquinolone 158 Ciprofloxacin Levofloxacin Norfloxacin Folate pathway inhibitors 131 Trimethoprim-sulfamethoxazole Glycylcyclines 182 Tigecycline 54 7 Monobactams 81 Aztreonam Nitrofurans 149 Nitrofurantoin Polymyxins 188 Colistin 67 Como se puede apreciar en la tabla anterior, de 25 antibióticos utilizados en común por los 3 métodos para obtener el antibiograma (Kirby Bauer, Vitek2 y Phoenix 100), solo 3 antibiótico (Imipenen, Ceftazidime y Ciprofloxacina), fueron probados en las 89 muestras, por lo que no fue posible una estandarización completa del perfil fenotípico Perfiles genotípicos de resistencia

118 104 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Tabla 4-3: Cantidad total de genes encontrados en las 89 muestras según el mecanismo de resistencia Mecanismo resistencia Cantidad Genes Alteración de Porina 17 Modulación de genes 86 Elementos Móviles 87 Proteina de Protección 155 Cambio de Sitio Blanco 204 Bombas de Eflujo 288 Degradación o Modificación del Antibiótico 1685 En general en los genomas de 89 muestras de A. Baumannii estudiadas se encontraron elementos genómicos asociados a todos los mecanismos de resistencias antes descritos (Tabla 4-3). También se identificaron 87 diferentes elementos genómicos cuyo mecanismo de resistencia está catalogado como Elementos Móviles, que, aunque están descritos en el Anexo E, tabla 1-15, no se tomaron en encuentra dentro de los perfiles genómicos de resistencia abordados en el presente trabajo, ya que estos requieren de un análisis y desarrollo que se consideró desde un comienzo por fuera del alcance de este proyecto y que será abordado por el grupo de investigación en el futuro. Los genes que corresponden al mecanismo de resistencia: Degradación o modificación del Antibiótico como era de esperarse fueron los que se identificaron en mayor número (1685, Tabla 4-3). Con cada uno de ello, como se explicó en el subcapítulo 3.3, se procedió a establecer de acuerdo con la información disponible, el grupo, sub grupo, antibiótico y el nivel de resistencia que podrían conferir cuando están presentes en el genoma de una bacteria como A. Baumannii. Por supuesto esto fue únicamente posible para aquellos de los que se encontró evidencia comprobada según la literatura (esto fue constantemente actualizado), para el momento cuando se realizó la revisión de este apartado. Las Bombas e-flujo tipo RND fueron identificadas en todos los genomas de A. Baumannii estudiados, encontrando variaciones en términos de su ubicación y la de sus reguladores de expresión de llegar a poseerlos, características que como se explicó antes, influyen en la resistencia conferida a la bacteria por este tipo de elementos genómicos (Anexo E, tabla 1-14). La influencia de estas bombas de eflujo sobre la resistencia, se basó en reportes

119 Capítulo 4: Resultados y Discusión 105 de la literatura que señalan cuales son los antibióticos frente a los que confieren resistencia, y estos a que clase o sub clase pertenecen (Tabla 4-4) Tabla 4-4: Antibióticos y clases por tipos de Bomba eflujo RND BombaRND Antibiótico subclase o Clase adeabc adede adefgh adeijk adexyz Gentamicin Kanamycin Cefotaxime Tigecycline Erythromycin Chloramphenicol Tetracycline Rifampin Ceftazidime Erythromycin Chloramphenicol Tetracycline Tetracycline Rifampin Trimethoprim Chloramphenicol aminocoumarin Tetracycline Rifampin Ciprofloxacin Chloramphenicol Tetracycline Aminoglycosides Cephalosporin IIIc Glycylcyclines Macrolides Phenicols Tetracyclines Aminoglycosides Ansamycins Carbapenem Cephalosporin IIIc Fluoroquinolone Macrolides Phenicols Tetracyclines Fluoroquinolone Tetracyclines Ansamycins b-lactams Fluoroquinolone Folate pathway inhibitors Lincosamides Macrolides Phenicols Quinolones Tetracyclines Ansamycins b-lactams Fluoroquinolone Phenicols Tetracyclines

120 106 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Así como ya se presentó el perfil fenotípico de resistencia discriminado por los antibióticos y sus clases o subclases de todas las muestras (Tabla 4-2), se elaboró el perfil genotípico de resistencia que relaciona el número de genes encontrados en las muestras con el grupo o subgrupo del antibiótico frente al cual confieren resistencia (Tabla 4-5). Por supuesto, esta relación se basa en lo encontrado en la literatura y permite la predicción teórica del perfil de resistencia luego de la aplicación de las reglas, objetivo de la presente tesis, de tal forma que lo hace comparable con el perfil fenotípico. Tabla 4-5: Cantidad de genes por antibiótico y clases subclase o Clase Antibiótico Cantidad Genes Aminoglycosides 195 Ansamycins Rifampin 36 b-lactams 1018 Carbapenem Imipenem 3 Meropenem 1 Cephalosporin Ic 1 Cephalosporin IIIc 2 Cephalosporin IVc 1 Fluoroquinolone Folate pathway inhibitors Ciprofloxacin 2 Sulfonamides 7 Trimethoprim 48 Fosfomycins Fosfomycin 18 Fusidanes Fusidic acid 3 Glycopeptide 94 Lincosamides 53 Lipopeptides 10 Macrolides 110 Erythromycin 9 Nitrofurans Nitrofurantoin 1 Oxazolidinones linezolid 4 Penicillins 2 Phenicols 7 Phenicols Chloramphenicol 97 Polymyxins 22 Colistin 3 Polymyxin B 2 Pseudomonic acid Mupirocin 1

121 Capítulo 4: Resultados y Discusión 107 Quinolones 3 aminocoumarin 25 elfamycin 8 ethambutol 8 isoniazid 4 Sin Asignar peptide antibiotic 14 pleuromutilin 10 pyrazinamide 1 triclosan 7 tunicamycin 1 Streptogramins 57 Tetracyclines Minocycline 1 Tetracycline Comparación de los perfiles genómicos y fenotípicos Finalmente, para entender por qué se necesitaba mostrar las tablas anteriores, siempre incluyendo las clases y subclases de los antibióticos, es importante darse cuenta que cualquier tipo de comparación tiene que darse entre iguales elementos o categorías, para que la comparación tenga sentido. Comparar los agentes microbianos entre ambos perfiles no es exactamente una opción viable, por que como se puede observar en la Tabla 4-5, se tienen muchos elementos genómicos que no se les reporta la resistencia que confieren hacia un agente específico si no hacia una clase o subclase. En muchos otros casos incluso solo se enuncia la gran posibilidad de conferir resistencia hacia un grupo, ya que por solo por nombrar un ejemplo: el gen rama, confiere resistencia al grupo de antibióticos β-lactámicos (Jia et al., 2017). Por este motivo es necesario hacer la comparación a un nivel donde se pueda comparar, y este nivel es precisamente un nivel superior, es decir en las clases y sub clases de los antibióticos. Considerando lo anterior, por el lado del perfil fenotípico de resistencia, de las muestras se obtuvo información de resistencia frente a 14 clases o sub clases de antibióticos (Aminoglycosides, Aminopenicillin, b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations, Carbapenem, Cephalosporin Ic, Cephalosporin IIIc, Cephalosporin IVc, Cephamycin, Fluoroquinolone, Folate pathway inhibitors, Glycylcyclines, Monobactams, Nitrofurans, Polymyxins), aunque debido a que el perfil se obtuvo basándose en las indicaciones hechas por la CLSI, los conjuntos de antibióticos probados variaron de

122 108 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria pendiendo del año y de las necesidades del INS, por lo que no todas las 14 clases o sub clases de antibióticos fueron probadas en todas las 89 muestras. Se encontró que solamente 4 categorías de antibióticos (Fluoroquinolone, Carbapenem, b-lactam/blactamase inhibitor combinations, Cephalosporin IIIc), fueron utilizadas en todas las muestras, y con ellas se realizó un estudio completo. Por otro lado, los perfiles genómicos de resistencia de las 89 muestras muestran 23 clases, subclases o grupos de antibióticos (Aminoglycosides, Ansamycins, b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations, b-lactams, Carbapenem, Cephalosporin Ic, Cephalosporin IIc, Cephalosporin IIIc, Cephalosporin IVc, elfamycin, Fluoroquinolone, Folate pathway inhibitors, Glycylcyclines, Lincosamides, Macrolides, Monobactams, Penicillins, Phenicols, Polymyxins, Quinolones, Streptogramins, Tetracyclines, triclosan). El comportamiento en el perfil genómico por supuesto es diferente al del perfil fenotípico, si en alguna muestra no se presenta el dato sobre una sub clase, clase o grupo de antibiótico, es porque simplemente no se encontraron elementos genómicos que puedan influir en la resistencia a tal categoría, como sucede por ejemplo para el caso de los elementos que confieren resistencia a "Monobactams", que solo fueron hallados en 5 muestras.

123 Tabla 4-6: Relación entre clases y sub clases de los perfiles Fenotípicos y Genómicos Genómico Aminoglycosides Ansamycins b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations b-lactams Carbapenem Cephalosporin Ic Cephalosporin IIc Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc elfamycin Fluoroquinolone Folate pathway inhibitors Glycylcyclines Lincosamides Macrolides Monobactams Penicillins Phenicols Polymyxins Quinolones Streptogramins Tetracyclines triclosan Fenotípico Aminoglycosides Aminopenicillin b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Carbapenem Cephalosporin Ic Cephalosporin IIIc Cephalosporin IVc Cephamycin Fluoroquinolone Folate pathway inhibitors Glycylcyclines Monobactams Nitrofurans Polymyxins Al comparar todas las clases o subclase, tanto del perfil fenotípico como del genómico compilados para las 89 muestras de este estudio (Tabla 4-6), se encontró que dadas las limitaciones de las pruebas fenotípicas utilizadas, solamente hay 11 categorías en común entre los dos perfiles (señaladas en amarillo, Tabla 4-6)), 2 que se corresponden por que la sub clase Aminopenicillin está incluida en la clase Penicillins (en naranja, Tabla 4-6)). Las restantes categorías del perfil genómico no fueron correlacionadas en los ensayos con el perfil fenotípico (en blanco, Tabla 4-6)). Por ultimo las celdas de la Tabla 4-6 que están con fondo gris, corresponde a agentes antimicrobianos que hacen parte del grupo de sustancias que no tienen una asignación a ninguna categoría de antibióticos.

124 110 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Para efecto del análisis y la comparación entre perfiles es necesario ajustar lo que se podría llamar como pseudo incongruencias, lo que sucede en muy pocas muestras y en las muestras, en pocas sub clases y clases (Tabla 4-7). Este tipo de incongruencias o pseudo incongruencias aparece cuando en una muestra, dentro de la misma sub-clase o clase, un antibiótico es resistente y otro es susceptible Tabla 4-7: Muestras con Incongruencias por clase en el perfil fenotípico Id Muestra Sub-Clase / Clase 4 RB 13 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 8 RB 67 Cephalosporin IIIc 11 RB 138 Aminoglycosides 12 RB 147 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 15 RB 184 Carbapenem 18 RB 198 Cephalosporin IIIc 23 RB 589 Cephalosporin IIIc 40 RB 1399 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 40 RB 1399 Cephalosporin IIIc 41 RA 121 Cephalosporin IIIc 42 RB b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations 48 GMR-RA 1051 Aminoglycosides 80 GMR - RA 267 Aminoglycosides 118 RB330 b-lactam/b-lactamase inhibitor combinations Para solventar esta situación se procedió de la siguiente manera: primero la prelación se da por el tipo de tecnología, siendo la prioridad el resultado por Kirby Bauer; segundo si la tecnología es la misma entonces el perfil de resistencia estará orientado a la sospecha por la resistencia, es decir, tendría prelación siempre el perfil resistente sobre los demás. En la Tabla 4-8 se muestra el detalle de las incongruencias que fueron encontradas y la solución que se le dio a cada muestra en la clase o sub clase que posee dicha incongruencia. Tabla 4-8: Detalle de incongruencias y ajustes. ID Muestra Clase/Subclase Antibiótico Interpretación Equipo

125 Capítulo 4: Resultados y Discusión RB 13 β-lactam/β-lactamase Ampicillin-sulbactam Sensible Kirby Bauer 4 RB 13 inhibitor combinations Piperacillin-tazobactam Resistente Kirby Bauer 8 RB 67 Ceftazidime Sensible Kirby Bauer Cephalosporin IIIc 8 RB 67 Ceftriaxone Intermedio Vitek 2 11 RB 138 Amikacin Resistente Kirby Bauer Aminoglycosides 11 RB 138 Gentamicin Sensible Kirby Bauer 12 RB 147 β-lactam/β-lactamase Ampicillin-sulbactam Sensible Kirby Bauer 12 RB 147 inhibitor combinations Piperacillin-tazobactam Resistente Kirby Bauer 15 RB 184 Meropenem Sensible Kirby Bauer Carbapenem 15 RB 184 Imipenem Resistente Kirby Bauer 18 RB 198 Ceftriaxone Resistente Vitek 2 Cephalosporin IIIc 18 RB 198 Ceftazidime Sensible Kirby Bauer 23 RB 589 Ceftriaxone Resistente Vitek 2 Cephalosporin IIIc 23 RB 589 Ceftazidime Sensible Kirby Bauer 40 RB 1399 Ceftazidime Sensible Kirby Bauer Cephalosporin IIIc 40 RB 1399 Ceftriaxone Intermedio Vitek 2 40 RB 1399 β-lactam/β-lactamase Ampicillin-sulbactam Sensible Kirby Bauer 40 RB 1399 inhibitor combinations Piperacillin-tazobactam Intermedio Kirby Bauer 41 RA 121 Ceftazidime Sensible Kirby Bauer 41 RA 121 Cephalosporin IIIc Ceftriaxone Intermedio Phoenix RA 121 Cefuroxime (Oral) Resistente Phoenix RB β-lactam/β-lactamase Piperacillin-tazobactam Resistente Kirby Bauer 42 RB inhibitor combinations Ampicillin-sulbactam Sensible Kirby Bauer 48 GMR-RA 1051 Gentamicin Sensible Kirby Bauer Aminoglycosides 48 GMR-RA 1051 Amikacin Resistente Kirby Bauer 80 GMR RA 267 Gentamicin Resistente Kirby Bauer Aminoglycosides 80 GMR RA 267 Amikacin Sensible Kirby Bauer 118 RB330 β-lactam/β-lactamase Ampicillin-sulbactam Sensible Vitek RB330 inhibitor combinations Piperacillin-tazobactam Resistente Vitek 2 La casilla roja muestra entonces el perfil que no se va a tener cuenta dentro de esa clase o sub clase para la muestra en particular. Esto aplica finalmente para las comparaciones de perfiles, pero los datos en la base de datos del proyecto siguen estando completos, es decir, con las incongruencias arriba nombradas. Toda la información de las 89 muestras sobre de los perfiles de resistencia genómica se encuentran en el Anexo E, Tabla 1-15, donde se puede apreciar por cada una los genes de resistencia relacionados con los antibióticos y los mecanismos de resistencia, teniendo en cuenta la posición de estos elementos dentro del genoma, previa aplicación de las reglas de negocio propuestas.

126 112 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Visualización de la comparación de los perfiles genotípicos y fenotípicos A continuación, se presenta la comparación de perfiles de resistencia a antibióticos basado en un experimento visual del profesor John Alexis Guerra Gómez ( donde presenta una herramienta que compara importaciones y exportaciones de productos en los países de América, llamada TradeFlow. Esta herramienta a su vez está basada en la tecnología D3.js ( librería de JavaScript que permite manipular documentos basados en datos. Usa HTML, SVG, y CSS, Y Combinando componentes de visualización y un enfoque basado en datos para la manipulación DOM. Por supuesto algunas partes del código y la presentación fueron modificadas, aun así, la Versión actual es Beta, pero permite una visualización sobre la comparación de perfiles de resistencia a antibióticos. Esta se encuentra actualmente en la siguiente URL: Todos los datos que componen la información necesaria para crear la visualización se encuentran en el archivo llamado todaslasmuestras.csv, para el cual la información necesaria para cada muestra es consultada en la base de datos y formateada por el procedimiento almacenado implementado para este fin llamado chartresistencia. La aplicación implementada para la comparación de los perfiles de resistencia fenotípicos y genotípicos ( (Figura 4-1 y Figura 4-2), tiene en la parte superior izquierda una lista desplegable muestra donde se debe seleccionar la muestra que se desea visualizar, y segundo se debe escoger el año de la muestra para poder ver el grafico con la comparación. Primero en la lista desplegable muestra se debe seleccionar la muestra que se desea visualizar, y segundo se debe escoger el año de la muestra para poder ver el grafico con la comparación.

127 Capítulo 4: Resultados y Discusión 113 Ambos perfiles graficados una vez se ha seleccionado la muestra y el año, tienen las clases o subclases de antibióticos con ciertos valores, pero en cada uno el significado es diferente. En el perfil Fenotípico se tiene únicamente los valores 1 y 3: 1 significa que es susceptible a esa clase o subclase de antibiótico 3 que es resistente (a todos los agentes que estaban marcados como intermedios les fue asignado el valor 3, es decir resistente, para agrupar y simplificar el gráfico). El perfil genómico tiene valores desde el 1 hasta N, dependiendo de la aplicación de la segunda regla de negocio (sección 3.4.2). Estos puntajes fueron asignados de la siguiente forma: si el elemento genómico era resistente (+2), intermedio (+1) o susceptible (-1), dependiendo claro de las demás reglas. Entonces se podría afirmar que si el valor es mayor e igual a 2 en la Clase o subclase de antibiótico que lo posee este es posiblemente resistente, entre más alto sea el valor significa que tiene más elementos genómicos que suman a esa resistencia. Este grafico organiza de mayor a menor, y cambia el grosor de la barra si el valor es mayor. Si el valor es de uno indica que el nivel de resistencia es intermedio. Por otro lado, también existen valores de cero o negativos (los negativos suceden por la suma de elementos susceptibles que están calificados con -1), como sucede con algunas muestras en las Carbapenemasas, pero la gráfica solo muestra valores mayores a cero. Los colores en las barras a cada lado de la gráfica ayudan relacionar los que corresponden a la misma Clase o Subclase entre ambos perfiles, pero están ordenados según la interpretación: del lado izquierdo es una suma (perfil genómico) y del lado derecho solo si son o no resistentes. A continuación, se presenta 2 de las 89 figuras con la comparación grafica de los perfiles. Las 89 figuras se encuentran en el Anexo F.

128 114 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma de una Bacteria Figura 4-1: Comparación perfiles de resistencia para RA121 Figura 4-2: Comparación perfiles de resistencia para RB67