Técnica molecular en la evaluación del ganglio centinela en carcinoma de mama: OSNA-CK19

Transcripción

1 Tercer Curso de Actualización en Patología Mamaria Sevilla, Junio 2010 Técnica molecular en la evaluación del ganglio centinela en carcinoma de mama: OSNA-CK19 Dra. Begoña Vieites Pérez-Quintela Unidad de Gestión de Anatomía Patológica. HU Virgen del Rocío-Sevilla

2 CARCINOMA DE MAMA Cáncer más frecuente en mujeres. 2ª causa muerte / 1ª causa muerte años. España: casos/año Factores ambientales hereditarios Factores de riesgo: Sexo Edad Hormonas Dieta grasa Alcohol Obesidad Ambientales: tabaco / radiaciones ionizantes

3 GANGLIO CENTINELA primer ganglio/s al que drena un tumor 1982: Utilización en melanomas. 1993: Krag and cols. Ca mama. Actualmente: técnica de elección. Predice el estado axilar en 96 8% Objetivos: Estadificación de la enfermedad neoplásica Evitar linfadenectomías innecesarias

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5 GANGLIO CENTINELA BSGC Linfadenectomía axilar Recuperación postquirúrgica rápida. Reduce efectos secundarios: linfedema dolor reducción movilidad entumecimiento Mínima desfiguración. Aumenta la detección de ganglios positivos

6 Indicaciones: GANGLIO CENTINELA Carcinoma T1-T2 con axila negativa Tumores multifocales y multicéntricos Carcinoma intraductal: extenso ( 4 cm) y grado ± comedonecrosis Ca mama en varón

7 GANGLIO CENTINELA Contraindicaciones: Sospecha de afectación ganglionar con ECO y PAAF compatible con metástasis. Car.cinoma localmente avanzado con afectación ganglionar Carcinoma inflamatorio No Contraindicación: Biopsia escisional previa Neoadyuvancia: previo o posterior. Embarazo o lactancia (No colorante vital) Antecedente de cirugía plástica (reducción/aumento) Cirugía conservadora con BSGC previa.

8 TÉCNICA MULTIDISCIPLINAR

9 GANGLIO CENTINELA Técnica: MEDICINA NUCLEAR Preparación: Radiotrazador: Nanocoloide-Tc99m Linfogammagrafía: obtención de imágenes. Detección en campo quirúrgico con sonda

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11 GANGLIO CENTINELA Técnica: CIRUGÍA Inyección de colorante precirugía: opcional Colorante: Azul isosulfato Exéresis de el/los ganglios detectado. Envío a Servicio de Patología: Intraoperatoria. Intraoperatoria: - Cierre : + Linfadenectomía axilar Linfadenectomía Sí/No.

12 GANGLIO CENTINELA EN LABORATORIO DE PATOLOGÍA

13 Biopsia de ganglio centinela: El dilema del patólogo Coste Centro X Centro Y Cuántas secciones estudiar? Con qué método intraoperaorio? Sensibilidad Tiempo respuesta Cuánto tiempo puede esperar el cirujano? Cuántos patólogos y técnicos puedo dedicar al estudio intraoperatorio? Qué tasa de segundas intervenciones puedo asumir? Qué protocolo de estudio postoperatorio debemos seguir? Cuál es el coste? Es asumible la carga de trabajo?. Carga de trabajo 13

14 Técnica ideal para la evaluación del ganglio centinela?? Alta Sensibilidad y Especificidad diagnóstica. Falsos Negativos Rapidez: uso intraoperatorio Fácil manejo Estandarización. Reproducibilidad. Eficiencia: coste similar intraoperatoria+diferido

15 TÉCNICAS MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO INTRAOPERATORIO DEL GANGLIO CENTINELA

16 TÉCNICAS MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO INTRAOPERATORIO DEL GANGLIO CENTINELA RT-PCR (transcripción reversa): identifica mrna Marcadores específicos: CEA, CK19, CK20, GA733.2, MUC-1 Inicio: Una sonda PCR no cuantitativa Detección por electroforesis o hibridación Sensibilidad: %FP No diferencia Macro / micrometástasis Gold-standard

17 Gene Search TM Breast Lymph Node Assay (Veridex ) RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Detecta 2 genes de alta expresión en tejido mamario: Mamoglobina Citoqueratina 19 Control interno: Porfobilinógeno deaminasa (PBGD). Gold-standar : HE+IHQ Intraoperatorio + diferido. HE+IHQ PCR HE+IHQ PCR

18 OSNA (One Step Nucleid Acid Amplification) (Sysmex Corp. ) OSNA Amplificación de ARNm mediante tecnología RT-LAMP

19 OSNA (One Step Nucleid Acid Amplification) RT-LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) Desarrollada por Eiken Chemical Co./ Licenciada por Sysmex Corp. Transcripción inversa de mrna y amplificación de cdna con detección en tiempo real Detecta mrna CK19: gen de alta expresión en ca.mama Amplificación isotérmica (65 C) Tiempo de amplificación: sólo 16 minutos Seis primers diferentes (alta especificidad) 19

20 RT-LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification Amplificación Básica Molècula ARNm 5 F3 F2 F1 B1c B2c B3c 3 Primers Para la amplificación 5 FIP 5 F1c F2 3 BIP 3 B2 B1c F3 Primer B3 Primer F3 Para aumentar la velocidad de reacción B3 Loop F Loop F Loop B Loop B DNA pol Transcriptasa Reversa + ADN polimerasa TReversa

21 RT-LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification TReversa Paso 1. Unión BIP a ARNm y RT crea el ADNc. ARNm 5 F3 F2 F1 B1c B2c B3c 3 3 B2 BIP 5 Paso 2. Unión de B3, síntesis de nuevo ADNc y la RT libera ADNc creado a partir de BIP. ARNm 5 ADNc 3 F3 F2 F1 F3c F2c F1c B1 B1c B2c B3c B3 3 B3 Primer ARNm ADNc 5 F3 F2 F1 B1 c B2c B3c 3 F3 F2c F1c B1 B2 B3 c 5 3 ADNc 3 F3 c F2c F2 F2 F1c B1 B1c B2 FIP 5 DNA pol

22 Paso 3 Liberada la cadena de ADNc a partir de BIP se le une FIP y la ADNpol inicia una nueva copia. ADNc 3 FIP F3 c 5 F2 F2c F1c DNA pol B1 B1c B2 ADNc 5 Paso 4 Primer F3 se une a una región exterior a FIP y su extremo 3 se convierte en un inicio para la síntesis mientras se libera la cadena de ADN creada previamente con FIP. F3 Primer F3 F2F2 3 F1 B1c B2c F3c F2c F1c B1 5 B1c B2 B F3c F2c F1c B1 B2 B1c B1 F3 F2 F1 B1c B2c 3 5 F1 B1c F2 F1c 5 3 B1 B2c RT-LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification

23 RT-LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification

24 RT-LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification

25 OSNA (One Step Nucleid Acid Amplification) Detección Detection of pyrophosphate Determination of Rise Time Determination of amount of RNA Magnesium pyrophosphate 25

26 OSNA Amplificación de ARNm mediante tecnología RT-LAMP

27 OSNA Esquema del flujo de trabajo Homogeneización Centrifugado Amplificación y detección 5 min 1 min 16 min; 65 C 27

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30 OSNA (One Step Nucleid Acid Amplification) RD-100i/ Instrumento 30

31 Monitorización en tiempo real 31

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33 Lectura de Resultados

34 Ventajas de OSNA frente a otras técnicas Alta especificidad y sensibilidad Combinación de 6 oligo-primers No amplificaciones indeseadas: reacción isotérmica Disminuye el error de muestreo Amplificación a alta velocidad (16 min) No requiere extracción de DNA Totalmente automatizada Fácil manejo. Automatización. Estandarización Disminuye carga de trabajo en laboratorio 34

35 Limitaciones de OSNA frente a otras técnicas Ausencia de gold-estándar histológico. No archivo histológico (sí tejido homogenizado / impronta citológica) No diferencia otras lesiones: linfomas, otras metástasis Coste / beneficio 35

36 PROCESAMIENTO GANGLIO CENTINELA

37 Nº casos GC H.Virgen Rocío

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