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1 BIO-FLASH Toxo IgG tests BIO-FLASH Toxo IgG es un inmunoensayo quimioluminiscente de dos pasos totalmente automatizado para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG anti-toxoplasma gondii en suero o plasma humano con el instrumento BIO-FLASH. Sumario La toxoplasmosis es una enfermedad infecciosa que afecta tanto a humanos como a animales y que es causada por el protozoo Toxoplasma gondii. 1 La toxoplasmosis adquirida suele ser asintomática y benigna. 2 Sin embargo, en las mujeres embarazadas esta infección es importante ya que el parásito puede entrar en la circulación del feto a través de la placenta y provocar toxoplasmosis congénita. Diversos estudios han demostrado que el riesgo y la gravedad de la toxoplasmosis congénita son mayores cuando se adquiere durante los tres primeros meses de embarazo. 3-6 Las consecuencias de la toxoplasmosis congénita abarcan desde el aborto espontáneo y el nacimiento prematuro hasta síntomas neurológicos y generalizados, que a menudo conllevan complicaciones oculares. Los recién nacidos con toxoplasmosis congénita también pueden permanecer asintomáticos durante varias semanas tras el nacimiento. Múltiples estudios han indicado que la presencia de cierta concentración de IgG maternal anti-toxoplasma antes del embarazo protege al feto contra la infección por el parásito. Las pruebas serológicas también pueden servir para identificar los embarazos de riesgo; las mujeres seronegativas en el momento de diagnóstico del embarazo pueden ser controladas durante su transcurso. El análisis de los isotipos de los anticuerpos específicos anti-toxoplasma gondii puede ayudar a determinar el momento en que se contrajo la infección. 7,8 De esta forma es posible detectar una infección reciente, tomar las medidas profilácticas necesarias y pautar el tratamiento adecuado. La detección de IgM específica posibilita el seguimiento de la mujer en estado, ya que las infecciones por toxoplasma no suelen detectarse clínicamente. El seguimiento serológico debe permitir la detección precoz de una seroconversión y, en función de la gravedad de la infección congénita del feto, la toma inmediata de las medidas necesarias. La toxoplasmosis puede ser mortal en pacientes inmunocomprometidos (SIDA, transplante de órganos). En los pacientes con SIDA, la toxoplasmosis aguda suele sobrevenir como consecuencia de la reactivación de una infección latente previa, si bien también hay diagnósticos de infecciones primarias. 9 Principio Cuando las micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH Toxo IgG se mezclan e incuban con la muestra, si ésta presenta anticuerpos específicos anti-toxoplasma, éstos se combinan con los antígenos de toxoplasma que recubren las micropartículas. Después de una separación magnética y lavado para eliminar la muestra residual, se añade un trazador consistente en un anticuerpo monoclonal anti-igg humana marcado con isoluminol que se une a los anticuerpos IgG anti-toxoplasma capturados por las micropartículas. Tras una segunda incubación, separación magnética y otro lavado, se añaden los reactivos que activan la reacción quimioluminiscente. El luminómetro del BIO-FLASH mide la luz emitida como unidades relativas de luz (URL), que son directamente proporcionales a la concentración de IgG anti-toxoplasma de la muestra. El BIO-FLASH utiliza un método de reducción de datos con ajuste a una curva logística de 4 parámetros (4PLC) para generar una Curva de Calibración Maestra (CCM). Esta curva viene predefinida, depende del lote y se almacena en el instrumento a través del código de barras del cartucho. Con la medición de los calibradores (que se suministran en un kit aparte), la CCM predefinida se transforma en una Curva de Calibración de Trabajo (CCT) nueva y específica para el instrumento. Las concentraciones de los calibradores están incluidas en los códigos de barras de los tubos de calibradores. Esquema de la reacción: LEER CAMBIOS SOMBREADOS Activadores (Triggers) Activadores (Triggers) URL URL Partícula magnética Muestra Trazador Emisión de luz

2 Componentes Cartucho de reactivos El kit BIO-FLASH Toxo IgG contiene un cartucho de reactivos para 50 determinaciones (REF ). Nota: El diseño del cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Diseño CE ) Composición del cartucho de reactivos: El cartucho se compone de 4 viales que contienen: A. 1 vial cilíndrico de suspensión de micropartículas recubiertas con antígeno de Toxoplasma en tampón fosfato. Contiene < 0,1% de azida sódica. B. 1 vial de tampón de ensayo. Contiene < 0,1% de azida sódica. C. 1 vial opaco de trazador que consiste en anticuerpo monoclonal murino anti-igg humana marcado con isoluminol. Contiene < 0,1% de azida sódica. D. 1 vial vacío. Preparación Véase la figura siguiente. Cartucho: las micropartículas sedimentan durante su transporte y almacenamiento, por lo que se tienen que mezclar para volverlas a resuspender. La primera vez que vaya a utilizar el cartucho, inviértalo suavemente 30 veces sin que se forme espuma (las burbujas pueden hacer que los sensores de líquido del instrumento den lecturas erróneas). Compruebe que las micropartículas se hayan resuspendido totalmente. Si no es así, siga invirtiendo el cartucho hasta que se resuspendan en su totalidad. Si las micropartículas no se resuspenden o detecta que el precinto de los reactivos está roto, NO UTILICE EL CARTUCHO. Una vez resuspendidas las micropartículas, sitúe el cartucho sobre una superficie sólida y retire con cuidado la lengüeta roja de seguridad para el transporte. Manteniendo el cartucho en la superficie sólida, apriete las dos pestañas situadas a los lados del tapón perforador (parte gris) y presione la parte superior del cartucho hasta que quede en posición de bloqueo. Una vez en posición de bloqueo, las pestañas tienen que quedar ocultas. No invierta el cartucho abierto. Deje reposar el cartucho durante 5 minutos antes de cargarlo en el instrumento. Una vez cargado el cartucho, el instrumento mezcla su contenido de forma automática a intervalos periódicos.

3 Precauciones Los reactivos BIO-FLASH son para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profesionales. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Deseche todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Por favor, no reutilice ni reintroduzca reactivos en los cartuchos o viales. Clase de peligro No clasificado. Indicaciones de peligro Ninguna. Consejos de prudencia P280: Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección. P : EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. Recolección y conservación de las muestras Usar suero fresco (también se pueden utilizar tubos con gel separador de suero) o plasma (EDTA, Li-heparina, Li-heparina en tubo con gel separador, Na-heparina y Na-citrato). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Los anticoagulantes líquidos como el Na-citrato ejercen un efecto de dilución y pueden reducir la concentración de muestras de pacientes. Las muestras no deben ser inactivadas por calor. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. En las directrices CLSI H18-A3 y H21-A5 encontrará más información sobre la manipulación, el transporte, el procesamiento y la conservación de las muestras. Suero Las muestras de suero pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Las muestras pueden congelarse/descongelarse un máximo de 3 veces. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Plasma Las muestras de plasma pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Descongelar el plasma a 37 C. Descongelar las muestras sólo una vez. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Volumen de muestra El volumen de muestra necesario para realizar una única prueba con BIO-FLASH Toxo IgG varía en función del tipo de recipiente que se utilice. Un ensayo requiere al menos 15 µl más el volumen muerto, que es de 200 µl si se utiliza la copa de muestra recomendada (REF ). Otros materiales Los siguientes materiales no se suministran con el cartucho de reactivos y deben adquirirse por separado. REF REF BIO-FLASH Toxo IgG Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH Toxo IgG Controls (Controles) Lea detenidamente las instrucciones correspondientes si desea más información. No utilice otros calibradores. La información que necesita el instrumento BIO-FLASH para calibrar el ensayo BIO-FLASH Toxo IgG está incluida en los códigos de barras de los viales. Utilizar controles de otros fabricantes puede dar lugar a resultados imprevistos. Asegúrese de que en el instrumento BIO-FLASH haya una cantidad suficiente de los siguientes consumibles antes de procesar muestras, calibradores o controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) Nota: El diseño de las cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Diseño CE ) REF BIO-FLASH Triggers (Activadores) REF REF BIO-FLASH System Rinse (Solución del sistema) BIO-FLASH Sample Diluent (Diluyente de las muestras)

4 Instrumento / realización del ensayo En el Manual del Usuario del BIO-FLASH encontrará las instrucciones completas para realizar el ensayo. Calibración El código de barras del cartucho contiene una Curva de Calibración Maestra (CCM) que es válida para el lote de reactivos. Sin embargo, para todos los reactivos se necesita una Curva de Calibración de Trabajo (CCT), que es específica para cada lote y válida hasta la fecha de caducidad de éste. Se debe obtener una nueva CCT cuando los resultados de los controles salgan fuera del rango de aceptación o cuando se hayan realizado ajustes en el instrumento. Lea detenidamente el Manual del Usuario del BIO-FLASH para configurar una CCT. Control de calidad Para realizar un programa completo de control de calidad se recomiendan tres niveles de control. Los controles BIO-FLASH Toxo IgG negativo, positivo y positivo alto se han diseñado para dicho programa. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propia media y desviación estándar y un programa de control de calidad para monitorizar sus resultados. Los controles se deben analizar al menos cada 24 horas por día de utilización. Si los controles están fuera de rango, puede resultar necesario recalibrar el instrumento. En el Manual del Usuario del instrumento encontrará más información. Para la identificación y resolución de situaciones anormales de control de calidad, consulte Westgard et al. 10 Conservación y estabilidad Los reactivos que no se hayan abierto se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del cartucho si se conservan entre 2-8 C en posición vertical. Una vez abierto, la estabilidad del cartucho cargado en el instrumento BIO-FLASH o guardado a 2-8 C es de 11 semanas. Trazabilidad de calibradores y controles Los valores se expresan en UI/mL y se asignaron mediante múltiples ensayos con el instrumento BIO-FLASH utilizando lotes específicos de reactivos, frente a estándares internos referenciados al estándar internacional de la OMS para suero Ig Anti-Toxoplasma (código NIBSC: TOXM). Interpretación de resultados La cantidad de analito en cada muestra se determina a partir de la luz emitida (URL), mediante interpolación en la Curva de Calibración de Trabajo almacenada. La determinación cuantitativa de las IgG anti-toxoplasma con el ensayo BIO-FLASH Toxo IgG ayuda a determinar el estado inmunitario del paciente: Las muestras con una concentración < 8,0 UI/mL se consideran no reactivas (negativas). Las muestras con una concentración 8,0 y < 10,0 UI/mL se consideran indeterminadas (zona gris). Las muestras que se interpreten como indeterminadas deben reanalizarse. Si al reanalizarse se obtiene un resultado indeterminado, se debe reportar como tal y debe realizarse otro ensayo con un método alternativo o debe obtenerse y analizarse una segunda muestra. Las muestras con una concentración 10,0 UI/mL se consideran reactivas (positivas). En aquellos pacientes en que se sospecha de seroconversión, debe recogerse una segunda muestra de suero entre 2 y 4 semanas después de la primera y evaluar ambas de forma conjunta para anticuerpos IgG anti-toxoplasma. Un aumento significativo en la concentración de anticuerpos IgG anti-toxoplasma entre la primera y la segunda muestra de suero puede considerarse como indicativo de seroconversión a causa de infección reciente. Si se sospecha de una infección reciente, es altamente recomendable analizar la muestra para anticuerpos IgM anti-toxoplasma. Los anticuerpos IgM se detectan en sujetos que han adquirido la infección recientemente, pero los anticuerpos pueden persistir hasta 18 meses tras la infección. 11 Un resultado negativo de IgG anti-toxoplasma no descarta una infección reciente. Dado que los anticuerpos IgG anti-toxoplasma pueden manifestarse ligeramente más tarde que los anticuerpos IgM, se recomienda analizar igualmente los anticuerpos IgM anti-toxoplasma durante el seguimiento serológico de las mujeres embarazadas. El ensayo BIO-FLASH Toxo IgM REF resulta adecuado para esta finalidad. Limitaciones El resultado de una única muestra no es suficiente para diagnosticar una infección primaria por toxoplasma. Por tanto, además de los resultados de BIO-FLASH Toxo IgG deben tenerse en cuenta otros datos como, por ejemplo, la sintomatología, la historia clínica, los resultados de otras pruebas, y demás información relevante.

5 Resultados esperados Aproximadamente un tercio de la población mundial posee anticuerpos anti-toxoplasma, si bien hay diferencias notables en su prevalencia entre países e incluso en cada uno de ellos. En Inglaterra y Gales la prevalencia aumenta con la edad un 0,5% - 1,0% al año hasta alcanzar alrededor del 30% en sujetos de 40 años. Sin embargo, en Francia el 80% - 90% de la población da positivo para anticuerpos a esa edad. 12 En un estudio multicéntrico llevado a cabo en más de muestras de suero de mujeres embarazadas en Barcelona (España), el 28,6% presentaba anticuerpos anti-toxoplasma. Se detectaron anticuerpos específicos IgM en el 2,2% de las mujeres con anti-toxoplasma. 13 En un estudio realizado en Noruega entre 1992 y 1994 en que participaron embarazadas, el 10,9% eran positivas de anticuerpos anti-toxoplasma antes del inicio del embarazo. El 0,17% de las mujeres previamente no infectadas demostraron evidencia de infección primaria durante el embarazo. 14 Características funcionales NOTA: los datos siguientes son representativos; los resultados en experimentos aislados pueden variar respecto a estos datos. Comparación de métodos BIO-FLASH Toxo IgG se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales. Evaluación interna Se analizó con BIO-FLASH Toxo IgG un panel de muestras de distinta procedencia que incluía sueros positivos y negativos de anticuerpos IgG anti-toxoplasma y los resultados se compararon con los obtenidos con un método de EIA Toxo IgG comercial. En los cálculos no se tuvieron en cuenta los resultados indeterminados. Método de referencia BIO-FLASH Toxo IgG IND NEG POS Total IND NEG POS Total Se obtuvieron los siguientes resultados iniciales de sensibilidad y especificidad relativas y concordancia global: Sensibilidad relativa Especificidad relativa Concordancia global ,8% 94,9% a 99,3% 100,0% 98,1% a 100,0% 98,8% 97,2% a 98,6% El mismo panel fue probado con otros métodos comerciales de Toxo IgG y se resolvieron las muestras discrepantes. El resumen de los resultados de consenso, excluidas las 6 muestras indeterminadas con BIO-FLASH Toxo IgG y las 4 muestras para las que no se llegó a un consenso, se muestra en la siguiente tabla: Consenso BIO-FLASH Toxo IgG NEG POS Total NEG POS Total Frente al consenso se obtuvieron los siguientes resultados de sensibilidad, especificidad y concordancia global: Sensibilidad vs. consenso Especificidad vs. consenso Concordancia vs. consenso ,0% 98,3% a 100,0% 100,0% 98,1% a 100,0% 100,0% 99,1% a 100,0% Evaluación externa Se realizó una evaluación externa en el Servei de Microbiologia del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (España). Las muestras fueron caracterizadas mediante otro método comercial, MEIA Toxo IgG, y analizadas con BIO-FLASH Toxo IgG. En los cálculos no se tuvieron en cuenta los resultados indeterminados.

6 Método de referencia BIO-FLASH Toxo IgG IND NEG POS Total IND NEG POS Total Se obtuvieron los siguientes resultados iniciales de sensibilidad y especificidad relativas y concordancia global: Sensibilidad relativa Especificidad relativa Concordancia global ,7% 98,2% a 100,0% 100,0% 99,0% a 100,0% 99,8% 99,1% a 100,0% La muestra discrepante fue analizada con un método ELFA Toxo IgG comercial y se resolvió como negativa a favor de BIO-FLASH Toxo IgG. Tras el ensayo adicional se obtuvieron los siguientes resultados finales de sensibilidad, especificidad y concordancia global: Sensibilidad final Especificidad final Concordancia global final ,0% 98,8% a 100,0% 100,0% 99,0% a 100,0% 100,0% 99,4% a 100,0% Panel SeraCare-BBI Se analizó el panel comercial de BBI panel de título mixto anti-toxo PTT201, que se compone de 25 muestras caracterizadas. Los resultados del ensayo BIO-FLASH Toxo IgG concordaron en todos los casos con el consenso de resultados de la mayoría de fabricantes. Panel CDC El panel de sueros humanos Toxoplasma 1998 de la CDC compuesto por 70 muestras de suero positivas y 30 muestras de suero negativas fue analizado con el ensayo BIO-FLASH Toxo IgG con un resultado de sensibilidad y especificidad del 100,0%. Precisión Se evaluó, conforme a las directrices CLSI EP05-A, la precisión intra-ensayo y total (ensayo a ensayo y día a día) en múltiples ensayos. Los resultados se resumen en la tabla siguiente: Media (UI/mL) CV% (Intra-ensayo) CV% (Total) Control negativo 2,8 4,7 6,3 Control positivo 50,4 4,1 5,7 Control positivo alto 279,4 6,4 10,5 Alrededor del valor de corte 9,1 3,6 5,3 Reproducibilidad Se evaluó la reproducibilidad entre réplicas, entre lotes y entre instrumentos. Los resultados se muestran en la tabla siguiente: Pendiente Intersección R Réplica 2 vs. Réplica ,00 0,98 a 1,03-0,01-0,47 a 0,48 0,99 0,99 a 1,00 Lote 2 vs. Lote ,97 0,93 a 1,02 0,76 0,10 a 1,89 0,98 0,97 a 0,99 Instrumento 2 vs. Instrumento ,05 1,03 a 1,07 0,09-0,27 a 0,64 1,00 1,00 a 1,00 Interferencias Estudios conforme a las directrices CLSI EP7-A han demostrado que las siguientes sustancias potencialmente interferentes no alteran los resultados de BIO-FLASH Toxo IgG:

7 Sustancia potencialmente interferente Concentración % Interferencia Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indirecta 18 mg/dl 10 Bilirrubina directa 18 mg/dl 10 Triglicéridos 1300 mg/dl 10 Factor reumatoide 800 UI/mL 10 Reactividad cruzada Cuando se analizaron 120 muestras con potencial de producir reacción cruzada con el ensayo BIO-FLASH Toxo IgG y se compararon los resultados con ensayos comerciales de Toxo IgG, se evidenció la siguiente concordancia: Reacción cruzada potencial Concordancia IgG frente a rubéola 9/9 Anti-CMV IgG (anticuerpos frente a citomegalovirus) 16/16 Anti-HIV (anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana) 6/6 HAMA (anticuerpo humano antimurino) 5/5 SLE (Lupus eritematoso sistémico) 3/3 ANA (anticuerpos antinucleares) 10/10 Anti-EBV (anticuerpos frente al virus Epstein-Barr) 6/6 Anti-PV B19 (anticuerpos frente a Parvovirus B19) 6/6 Anti-HSV 1 (anticuerpos frente al virus Herpes simplex tipo 1) 5/5 Anti-VZV (anticuerpos frente al virus de la Varicela Zoster) 5/5 Paraproteínas IgG e IgM 6/6 IgG e IgM elevadas 5/5 Anticuerpos heterófilos 5/5 RF (Factor Reumatoide) 10/10 Mujeres embarazadas (multíparas incluidas) 22/22 Límite de detección Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de detección (LD) se sitúa en 0,9 UI/mL. Límite de cuantificación Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de cuantificación (LC) se sitúa en 0,9 UI/mL. Linealidad El ensayo BIO-FLASH Toxo IgG es lineal entre 0,9 y 500 UI/mL conforme a las directrices CLSI EP6-A. Sin embargo, la linealidad puede ampliarse hasta 7500 UI/mL mediante dilución si se habilita la opción de re-run automático. Consulte el Manual del Usuario del BIO-FLASH para habilitar la opción de re-run automático.