Soluciones Agilent para aplicaciones alimentarias: de la preparación de muestra a la separación
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- Rocío Emilia Villalba Vidal
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1 Soluciones Agilent para aplicaciones alimentarias: de la preparación de muestra a la separación Tecnologías que mejoran el rendimiento y la productividad Julián de la Mata 14 de Febrero de
2 Agenda Necesidades actuales de los análisis alimentarios Consideraciones y consejos en los análisis por LC y LCMS. Revisión de las distintas opciones de preparación de muestras. Fundamentos importantes en el desarrollo de métodos Flujo de trabajo en análisis alimentario usando LC/MS Insecticidas botánicos en pescado Fármacos veterinarios en matrices de origen animal. Herramientas para mejorar sus análisis alimentaríos. 2
3 Cómo es hoy el Analisis Alimentario? Aumento en la complejidad en el suministro y origen de los alimentos La globalización en el suministro de alimentos ha hecho necesario un análisis detallado del valor nutricional, la composición y los contaminantes de los alimentos. La preocupación por la Seguridad Alimentaria y sus efectos en la salud humana han incrementado la regulación y las exigencias relacionadas con el análisis de alimentos. Los viejos métodos para el análisis de alimentos eran muy tediosos y no adecuados a las necesidades modernas para obtener un mayor rendimiento en los análisis de alimentos. Las muestras son de todos los tipos! Un apropiado analisis de alimentos no se pueden lograr sin la adecuada metodología de LC y preparación de muestra. 3
4 Técnicas cromatográficas en el análisis alimentario Cromatografía de Gases Usada tipicamente para: No-polares volátiles, aceites, etc Puede requerir derivatización de los compuestos Cromatografía Líquida Usada tipicamente para: Polares, termo lábiles Sin necesidad de derivatización de muchos de los compuestos. Requiere preparación de muestra más sencilla. 4
5 Retos en análisis alimentario Desarrollo de nuevos métodos Encontrar maneras de reducir costes Hacer más con menos incrementar la productividad del laboratorio Mantenerse al día en los últimos cambios en Seguridad Alimentaria 5
6 Desarrollo de Métodos LC en análisis alimentario Que es diferente en el análisis LC para el análisis de alimentos? Complejidad de la matriz de la muestra Múltiples residuos de interés A menudo, las muestras tienen analitos muy polares de interés. Las modernas tecnologías de columnas hacen el análisis alimentarío más rápido y más fácil. 6
7 Nuevas tecnologías de columnas para el desarrollo de métodos. Columnas para análisis de alta resolución y alta velocidad Columnas Sub-2 µm para operación a ultra-altas presiones Columnas Superficialmente porosas Sub-3 µm Considerationes cuando se desarrollan métodos en columnas con nuevas tecnologías Tamaño de partícula < 3 μm Límites de presión de las columnas >400 bar (típicamente bar) Operan con los mismos principios cromatográficos que las columnas de 5 μm, pero con resultados superiores.
8 Nuevas tecnologías de Columnas Superficialmente porosas Poroshell 120 columns: Eficiencia 90% de sub-2 µm Presión 40-50% de sub-2 µm N 2X 3.5 µm (totalmente porosas) d p = 2.7µm Frita con porosidad 2 µm frit para reducir los atascos P limite = 600 bar para HPLC o UHPLC Particulas Núcleo sólido de 1.7 μm Ruta de difusión de 0.5 μm Diametro total de 2.7 μm 0.5um 1.7um 0.5um
9 Beneficios de la tecnología de las columnas Poroshell 120 Permite aumentar la velocidad de separación (reducción del tiempo de análisis) Uso con cualquier instrumento (HPLC o UHPLC) Reducción de los costos de solventes y de desecho Poroshell 120 Escalabilidad Facilidad de transferencia dé métodos Mayor transferencia de masa debido a la menor difusión. Fases similares a las columnas ZORBAX totalmente porosas.
10 Comparando Eficiencia y Presión con Diferentes Tipos de Columnas Tamaño de partícula/tipo 5µm Totalmente Porosa 3.5µm Totalmente Porosa 2.7µm Poroshell µm Totalmente Porosa Presión Eficiencia LC Compatibilidad 40 bar 5, bar 7, bar 12, bar 12,500 Todos los instrumentos hasta 400 bar Todos los instrumentos hasta 400 bar Todos LCs/UHPLCs (hasta 600 bar) Todos LCs/UHPLCs (hasta to 1200 bar) Columnas: 4.6 x 50mm, Fase Movil: 60% ACN:40% Agua Flujo: 2 ml/min
11 Mejoras en la transferencia de masas del analíto gracias a una menor Difusión Totalmente Porosa Superficialmente Porosa Particulas totalmente porosas Difusión a través de toda la partícula Poroshell 120 Difusión solo en la capa porosa Ecuación van Deemter h A B / C Resultados: Menor término C Mayor eficiencia Y Mayores flujos con Mínimo impacto en la eficiencia
12 Otras consideraciones al seleccionar una columna Robusted y reproducibilidad lote-a-lote de las columnas Poroshell mau B10015 min mau mau B10018 B11041 min min mau B11256 min 2012 mau B12041 min Aditivos en Bebidas
13 Pasos generales en un método LC robusto para Análisis de Alimentos Elija el tipo de cromatografía a menudo fase reversa (C18, polar embebida, etc ) o fases HILIC. Elija las condiciones apropiadas de inicio y fin de gradiente. Ajuste el ph para obtener la mejor retención del analito. Cambie de fase ligada para obtener la separación de picos más adecuada y la mejor resolución. 13
14 El cambio en la retención con el ph para los compuestos ionizables es clave en el desarrollo de métodos. En fase reversa, los analitos no cargados tienen mejor retención (i.e. los ácidos a bajo ph y las bases a alto ph) Los Silanoles de la sílica ionizan a ph medio, incrementando la retención de los analitos básicos (i.e posibles interacciones de intercambio iónico) Elija un ph de la fase móvil para optimizar la retención y la selectividad durante el desarrollo de métodos La columna Poroshell 120 EC-C18 puede usarse en un amplio rango de ph. Existen otras opciones para phs altos
15 Retention Time El cambio en la retención con el ph para Compuestos Ionizables depende del compuesto Más retención para analitos no cargados (i.e. acidos a bajo ph y bases a alto ph) Acetylsalicylic acid (pka 3.5) Pyridine (pka 5.2) Codeine (pka 8) Procainamide (pka 9.2) Amphetamine (pka 9.9) Caffeine (pka 14) ph 2.5 ph 6.5 ph 8 ph 11.5 Fase Móvil : 45% MeOH, 55% 20 mm Tampón Fostafo
16 Por qué cambiar la fase estacionaria? Diferentes interacciones para compuestos polares y no polares. Explotar otras interacciones con la fase ligada (e.g., pi-pi) Todo esto cambia al cambiar la fase ligada! Cambiando la fase ligada se puede mejorar la selectividad/resolución y reducir el tiempo de análisis Cuando usas columnas Poroshell 120 la comparación de fases ligadas puede hacerse rápidamente! Más fácil con múltiples opciones de columnas, además usando tecnologias de alta velocidad.
17 Fases estacionarias de las columnas Poroshell 120 Poroshell 120 EC-C18 and C8 Robustas C18 y C8 desactivadas para las mejores formas de pico a ph 2-9 Poroshell 120 Stablebond C18 and C8 Química robusta para ph<2 Poroshell 120 Phenyl-Hexyl Misma selectividad que las ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl Excelente elección para interacciones pi-pi. Selectividad alternativa a EC-C18 o SB- C18 Selectividad similar a columnas fenil, difenil, u otras columnas fenil-hexil Poroshell 120 SB-Aq Fase de ligado propietario que es una excelente elección para analitos polares. Poroshell 120 Bonus-RP Su grupo polar embebido proporciona una selectividad única para compuestos polares Poroshell 120 EC-CN Química CN desactivada con caracter flexible para fase reversa y normal Poroshell 120 HILIC Sílica HILIC para uso en Cromatografía de Interacción Hidrofílica de moléculas polares.
18 Consideraciónes en el desarrollo de métodos en LCMS Selección de fase móvil A menudo se prefieren los gradientes debido a las diferencias en las características de retención. Elección del tampón Por ejemplo un tampón volátil para LCMS (Fórmico,acético, etc) Dimensiones de columna para una mayor sensibilidad y velocidad Elija columna estrechas para una mayor sensibilidad y más cortas para análisis rápidos. 18
19 En el análisis de alimentos, cuales son los mayores inconvenientes? Seleccionar el método de preparación de muestra correcto para mi muestra de alimento. La preparación de muestra consume mucho tiempo. La selección de la columna/ el refinamiento del método. Las obstrucciones de columna Las inconsistencias en la solución de problemas. Necesito hacer preparación de muestra si tengo un QQQ? 19
20 Es necesaria la preparación de muestra si tengo un QQQ? Un QQQ es tan específico que tu puedes seleccionar los iones de interés. Pero no retirar los compuestos endógenos/interferencias de matriz no es lo mismo que no verlos. Ha de hacerse preparación de muestra o aceptar las consecuencias. La solución variará dependiendo de cada situación específica. Filtrado de la muestra Eliminación de fosfolípidos Protección de la columna 20
21 Preparación de muestras en análisis de alimentos SPE Límites de detección Automatización QuEChERS Fácil de usar Ideal para muestras alimenticias Extracción Líquido- líquido.(sle, en soporte sólido ChemElut) Separación de fases Filtration Retirada de partículas Retirada de lípidos A menudo lleva mucho tiempo 21
22 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces La Nicotina es un insecticida botánico usado ampliamente en US y Canada. Prohibido como insecticida en la Unión Europea y que será prohibido en US a comienzos de Es un líquido oleoso a temperatura ambiente y miscible en agua. 22
23 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces Cómo termina la nicotina en el pescado en otros organismos acuáticos? Insecticidas usados en granjas Lluvia Rios Mares Pescadores fumadores Colillas de cigarrillos Peces fumadores 23
24 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces Cómo preparar una muestra real de pescado? Q u E C h E R S Si la matriz de la muestra es sólida, especialmente alimentos, considere primero QuEChERS. QuEChERS es el métodos de preparación de muestras más común en muchos laboratorios de análisis de alimentos. Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe. 24
25 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces Beneficios del QuEChERS en el análisis de nicotina en pescados QuEChERS es la combinación de dos pasos. 1º extracción, 2º SPE dispersiva. Se requiere muy poco o ningún desarrollo de método. 1º extracción: Simplemente elija un método AOAC, EN, u original. 2º SPE dispersiva: Elija uno de nuestros kits dispersivos. Adaptelo a sus necesidades. Se puede obtener material dispersivo a granel y personalizar el método para adecuarlo a sus necesidades. 25
26 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces 1º: Extracción º: SPE Dispersive
27 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces qué columna elegir para el análisis de nicotina? HILIC!!! por qué? Tiempo de retención Beneficios de HILIC sobre Fase Reversa HILIC La Nicotina y sus metabolitos se retendrán y separarán Fase Reversa La nicotina y la mayoría de sus metabolitos eluirán demasiado pronto. Solvente de muestra Fase Móvil Inicial No evaporación y reconstitución. 90% ACN. Cambio de solvente de muestra o Dilución son NECESARIOS. Fase movil con muy poco orgánico o 100% acuosa. Sensibilidad MS Alta ( por qué?) Baja ( por qué?) Presión Baja Rango de flujo más amplio. Alta Rango de flujo limitado. 27
28 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces Condiciones LC-MS/MS Columna: Poroshell 120 HILIC 2.7 µm, 2.1 X 100 mm LC: Agilent Infinity 1290 UHPLC MS: Agilent 6460 con JetStream y ESI+ Fase Móvil A: 10 mm formiato amónico (ph=3.0) Fase móvil B: ACN Flujo: 0.7 ml/min Gradiente: Tiempo (min) %B
29 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces Nicotina y sus metabolitos Nicotina Cotinina Anabasina log P pka Transición MRM Energía colisión
30 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces Matrina (ISTD) Cotinina Nicotina Anabasina 30
31 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces Resultados Curvas de Calibración y límites de detección Nicotina R 2 = Anabasina R 2 = Cotinina R 2 = Rango de Calibración ng/g de pescado. Gran linearidad. LOD: 1 ng/g LOQ: 5 ng/g 31
32 Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces Resultados Precision y exactitud (n=8) Nicotina Anabasina Cotinina Bajo (10 ng/g) Medio (100 ng/g) Alto (500 ng/g) Bajo (10 ng/g) Medio (100 ng/g) Alto (500 ng/g) Bajo (10 ng/g) Medio (100 ng/g) Alto (500 ng/g) Media Recupera ciónes % 97.7 % 90.0 % 91.8 % 86.4 % 77.8 % % % 93.4 % %RSD 6.4 % 1.6 % 2.1 % 6.2 % 1.6 % 2.5 % 5.4 % 2.2 % 2.1 % 32
33 Nuevo Kit de QuEChERS modificado: Fármacos Veternarios en carnes Fundamentos de la aplicación Historia del desarrollo Descripción del producto Nota de aplicación
34 Fundamentos de la aplicación: Fármacos Veternarios en carnes -- Las interferencias adicionales de proteinas y lípidos encontradas en las carnes, comparadas con las frutas y vegetales, requieren el uso de PSA y C18EC en la fase de SPE dispersiva -- Estos farmacos veterinarios en particular no requieren sales tamponadas, como las requeridas en la extracción de pesticidas lábiles al ph de los métodos AOAC o EN. -- Se extrajeron cuatro(4) clases de farmacos veterinarios de interés: 1) Sulfanilamidas 2) Lactonas macrocíclicas 3) Quinolonas 4) Clopidoles
35 Historia del desarrollo: Fármacos Veternarios en carnes -- Inicialmente se usaron kits QuEChERS de Agilent con sales no tamponadas y d-spe para residuos de fármacos,pero luego fueron modificadas para conseguir los requerimientos de recuperaciones de los analitos de interés Descripción; PN Kit de sales de Extracción Original d-spe: Otros métodos en alimentos Ingredientes 4 g MgSO4; 1 g NaCl 150 mg C18; 900 mg MgSO4 -- Matrices de muestra: carne, miel, huevos y leche
36 Historia del desarrollo: Fármacos Veternarios en carnes -- Los experimentos mostraron que el MgSO4 impactaba negativamente en las recuperaciones de muchos compuestos, particularmetne las sulfanilamidas y las lactonas macrocíclicas. Reemplazando con Na2SO4 aumentaba las recuperaciones Actual Modificado
37 Descripción del nuevo kit de QuEChERS Fármacos Veterinarios en Carnes Descripción Contenidos Cantidad/paquete tamaño Kit de Extracción 4 g Na2SO4; 1 g NaCl 50 sobres y 50 tubos (50 ml) Part Number d-spe 50 mg PSA; 150 mg C18EC; 900 mg Na2SO4 50 tubos de 15-mL
38 Nota de aplicación EN : Reactivos: Solución de ácido fórmico al 1% en ACN hecho con 1 ml de ácido fórmico en 100 ml ACN; comparado con solucion de ácido acético al 1 % en ACN hecho con 1 ml de ácido acético en 100 ml ACN. Estándares: Solutiones hechas a concentraciones de 10 ug/ml (sulfanilamidas y lactonas macrocíclicas), 5 ug/ml (clopidoles) y 1 ug/ml (quinolonas) Equipo: Agilent 1260 HPLC con Detector Diode Array Agilent 6460 Triple Cuadrupolo LC/MS con fuente de ionización AJST Electrospray Columna Agilent Zorbax Solvent Saver HD Eclipse Plus C18
39 Cromatograma de los 36 Fármacos veterinarios
40 GPC en el análisis alimentario La técnica de cromatografía por Permeación en gel tiene varías aplicaciones en el campo de la alimentación: Como técnica de clean-up en la preparación de de la muestra Instrumento PL-GPC 50 con detector de Viscosimetría y light Scattering Como procedimiento de análisis de contaminantes provenientes del empaquetado de los alimentos. Cómo técnica de caracterización de ingredientes de los alimentos. 40
41 GPC para caracterización de ingredientes de los alimentos. Aditivos. GPC acuosa de pectina Figura 1. Cromatogramas contriple-detector de pectina (autoscalados) analizada con el Agilent PL-GPC 50 y dos columnas Agilent PL aquagel-oh MIXED-H en serie Figura 2. Curva de distribución de peso molecular calculado para la Pectina 41
42 GPC para caracterización de ingredientes de los alimentos GPC orgánico de almidón Figura 3. cromatogramas con detección por Viscometría e índice de refracción de almidón analizado con tres columnas Agilent PLgel Olexis en serie. Figura 4. Distribuciones de pesos moleculares superpuestas para dos muestras de almidón. Las diferencias en distribuciones de peso molecular informan de sus propiedades físicas diferentes. 42
43 Dónde podemos hacer mejoras? Consejos para el mantenimiento del instrumento Añada una guarda columna o filtro en linea para proteger el sistema. Filtre la muestra. Garantiza la retirada de partículas y proteinas/lípidos (con Captiva ND lipids ) Evite alta concentración de sal en HILIC, especialmente cuando el gradiente reverso va alta concentración de fase móvil acuosa como el 50%. Comience con 10 mm de formiato amónico (ph=3.0) e isocrático a 90:10 ACN:10 mm formiato amónico (ph=3.0). (Para la protección de la columna, bomba, y fuente de ionización.) 43
44 Use Guarda Columnas y filtros en línea Los filtros en línea y las guarda columnas extienden la vida de las columnas de HPLC impidiendo que las partículas y las impurezas provoquen un atasco potencialmente irreversible de la columna analítica. Alargan la vida media de las columnas Ahorran costos al tener que comprar menos columnas Mínimo o ningún impacto en la cromatografía! Poroshell 120 Fast Guard para UHPLC Guarda Columna Unión/Ferrula Capilar Integrado Page 44
45 Ancho de Pico (min) Ancho de Pico (min) Beneficios de instalar una Fast Guard para UHPLC Método: Test de tiempo de vida acelerado- Muestra Similac (sustituto de la leche diluido 300:1) que contiene 2 sulfamidas; El cambio en el ancho de pico indica fallo de columna $$$ Se requiere nueva columna Guard reemplazada Guarda columna alarga la vida de la columna Presión (bar) Presión (bar) Sin Guarda Fallo de Columna; se requiere nueva columna Con Guarda Fallo de Guarda; guarda reeplazada; Misma columna en todo el análisis Sulfachloropyridazine PW Sulfamethoxazole PW End Pressure Mediante la instalación de una guarda columna con muestras más sucias, se puede alargar la vida de la columna y utilizar guarda columnas más baratas en vez de reemplazar la columna ayuda a ahorrar costes Page 45
46 Utilize Captiva ND o ND lipids Ideal para una gran variedad de muestras que necesitan filtración de partículas, precipitación de proteinas y retirada de lípidos - Disponible en tubos simples de 3mL y en placas de 96 pocillos - Indicado para analisis de compuestos en matrices alimentarias como la leche.
47 Norm % Norm % Mejore la calidad de sus datos: Mejor sensibilidad retirando Lípidos con Captiva ND Lipids Infusión Post-Columna (PCI) de Albuterol antes del Tratamiento con Captiva ND Lipids en Plasma Humano Infusión Post columna de Albuterol Fosfolípidos Picos de lípidos sistema contaminado causa supresión iónica La retirada de lípidos reduce dramáticamente la supresión iónica y se obtienen mejores resultados Minutos 35 Experimento con mustras después de la eliminación de Proteinas y Lipidos Con Captiva ND Lipids de una matriz de plasma humano Datos de alta calidad con más sensibilidad y mejor precisión 0 Infusión Post columna de Albuterol Fosfolípidos No hay fosfolípidos 0 Minutos 35 47
48 Conclusión Obtener una solución libre de problemas Encuentre la mejor herramienta, para la justa preparación de muestra Entre las posibilidades se encuentran la SPE tradicional, la extracción liquido/líquido, la SLE, o nuevos métodos que ahorran tiempo y gastos como los QuEChERS QuEChERS es ideal para detecciones MRL (maximum residue level) para muchas muestras alimenticias y la SPE tradicional es buena para detecciones a niveles más bajos cuando se necesiten. La utilización de filtros de jeringa o sistemas de filtración Captiva o viales con filtro incorporado y las guarda columnas son procedimientos muy simples, pero extremadamente útiles para proteger su instrumento. 48
49 Una nueva herramienta para el desarrollo de métodos El NAVEGADOR de Columnas y Preparación de Muestras Facilita la elección de columnas y preparación de muestras 49
50 Una nueva herramienta en la selección de Filtros de Jeringa Una guía en la elección de Filtros de jeringa Agilent Captiva
51 Guía de Columnas y Desarrollo de Métodos Solicite la Guía de Columnas y Desarrollo de Métodos: Una guía de 162 páginas con recomendaciones de columnas y pasos en el desarrollo de métodos. Número de Publicación EN 51
52 Soporte Técnico Agilent Teléfono de Atención al Cliente:
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