Kit de diagnóstico in vitro LightMix Poliomavirus JC y BK

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1 Kit de diagnóstico in vitro LightMix Poliomavirus JC y BK N. cat.: Detección del ADN genómico de los virus JC y BK para ser utilizado con los Instrumentos LightCycler de Roche Diagnostics Reactivos para 96 reacciones Al recibirlos: Almacenar los controles y los reactivos de PCR premezclados protegidos de la luz y a temperatura ambiente (no congelar) Almacenar los reactivos FastStart DNA Master HybProbe congelados (a -20 C) (si están incluidos) Versión del manual: V TIB MOLBIOL

2 Índice 1. Información del producto Contenido: Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Uso previsto Especificaciones Muestras clínicas Instrumentos, software y productividad Configuración de canales para instrumentos LightCycler Almacenamiento y estabilidad 6 2. Dispositivos y reactivos adicionales Requeridos Opcionales Preparación de la muestra 7 3. Antecedentes Antecedentes médicos Metodología y principio del ensayo Reacción de control Características de rendimiento Precauciones y advertencias Preparación de la muestra Preparación del Objetivo de control de extracción (ECT) Uso del ECT como Control de extracción adicional Plasma Orina Sangre completa Factores de conversión Programación Compensación de color Instrumentos para capilares Instrumentos para placas multipocillos Protocolo experimental Preparación de reactivos LightCycler FastStart DNA HybProbe Master Preparación de reactivos específicos de parámetros (PSR) Control sin plantillas (NTC) Diluyentes para tiras y controles estándar (DIL) Preparación de tiras estándar Preparación de controles positivos Preparación de la mezcla de reacción Preparación de mezcla de 32 reacciones Preparación de mezcla de una sola reacción Procedimiento de carga de capilares/pocillos Almacenamiento y estabilidad de los componentes diluidos Carga de muestras y controles Instrumentos para capilares Instrumentos para placas Análisis e interpretación de datos Límites e interferencias Calibración Control de calidad - Criterios de aceptación Control negativo BK+ control o estándares JC+ control o estándares Error en las ejecuciones de controles y estándares Muestras Valores de amplificación del punto de cruce (Cp) fuera del rango Curvas de fusión anormales Cómo guardar las curvas de estándares externos Instrumentos de capilares Instrumentos de placas Lectura de resultados Análisis de amplificación: Instrumentos de capilares Análisis de curva de fusión: Instrumentos de capilares Análisis de amplificación: Instrumentos para placas Análisis de curva de fusión: Instrumentos para placas Tabla de interpretación Picos de fusión inusuales Paneles de evaluación de calidad externa Solución de problemas Referencias 32 Clasificación / Referencias / Exención de responsabilidad / Aviso para el comprador Ficha de datos de seguridad (MSDS) Historial de versiones 33 Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 2 de 36 Versión

3 1. Información del producto 1.1 Contenido: Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Reactivos de PCR premezclados liofilizados Almacenar a temperatura ambiente y en lugar oscuro Color de tapa Etiqueta 3 x Azul PSR Descripción de contenido Reactivos específicos de parámetros (PSR) y Control interno (IC) que incluyen cebadores premezclados y liofilizados, y sondas de hibridación para 32 reacciones cada uno. <0,01 pg de oligonucleótidos no etiquetados (cebadores directos e inversos específicos para BKV, JCV y IC); <0,01 pg de oligonucleótidos etiquetados para LightCycler 640, tapa roja, (sondas de hibridación específicas para BKV y IC); <0,01 pg de oligonucleótidos etiquetados para LightCycler 690, tapa roja, (sonda de hibridación específica para JCV); <0,01 pg de oligonucleótidos etiquetados con fluoresceína (sonda de hibridación específica para BKV, JCV y IC); ADN de control Almacenar a temperatura ambiente Color de tapa Etiqueta 1 x Verde BK + 1 x Amarilla JC + 1 x Blanca ECT 1 x Negra NTC Descripción de contenido Control positivo de BKV <0,01 pg de gen plásmido diana (sintético) [1E5 copias/reacción] Control positivo de JCV <0,01 pg de gen plásmido diana (sintético) [1E3 copias/reacción] Objetivo de control de extracción <0,01 pg de gen plásmido diana (sintético) [4.8E6 copias: cantidad total] Sin control de plantillas Estabilizador (ADN) Fila de dilución estándar (Tira) Almacenar a temperatura ambiente Tira 1 x Transparente 1 x Transparente Descripción de contenido Estándar de plásmido sintético para BKV que representa los objetivos genómicos equivalentes: BKV-1 = 1E1 copias/reacción BKV-2 = 1E2 copias/reacción BKV-3 = 1E3 copias/reacción BKV-4 = 1E4 copias/reacción BKV-5 = 1E5 copias/reacción BKV-6 = 1E6 copias/reacción <0,01 pg de gen plásmido diana (sintético) Estándar de plásmido sintético para JCV que representa los objetivos genómicos equivalentes: JCV-1 = 1E1 copias/reacción JCV-2 = 1E2 copias/reacción JCV-3 = 1E3 copias/reacción JCV-4 = 1E4 copias/reacción JCV-5 = 1E5 copias/reacción JCV-6 = 1E6 copias/reacción <0,01 pg de gen plásmido diana (sintético) 2 x Tapa de la tira Tapa adhesiva de la tira 1 x Certificado de análisis (CoA) Punto de cruce esperado para las tiras de plásmido incluidas en el kit Reacción/ Estado del tubo 32 reacciones liofilizadas Reacción Estado del tubo 32 reacciones liofilizadas 32 reacciones liofilizadas 100 reacciones liofilizadas Total 96 rxs Total 32 rxs 32 rxs 96 rxs Estado liofilizadas liofilizadas Total 8 rxs 8 rxs Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 3 de 36 Versión

4 Mezcla de polimerasa: LightCycler FastStart DNA Master HybProbe Almacenar a -20 C al recibirlos La FastStart DNA Master HybProbe se incluye en los kits que TIB MOLBIOL suministra directamente a los clientes de Europa Central únicamente (1). La FastStart DNA Master HybProbe no está incluido en ningún kit suministrado a través de Roche Diagnostics o de su distribuidor local. Color de tapa Etiqueta Descripción del contenido 3 x Roja 1a LightCycler FastStart Enzyme 3 x Blanca 1b LightCycler FastStart Reaction Mix Hyb-Probe Almacenamiento del tubo de reacción 32 reacciones congelado 32 reacciones congelado 3 x (2) Incolora Agua H 2 O grado PCR congelado 3 x (2) Azul MgCl 2 MgCl 2, 25 mm 32 reacciones congelado 1) TIB MOLBIOL envía la enzima FastStart a temperatura ambiente. 2) La enzima FastStart que suministra Roche Diagnostics contiene solo 2 tubos de H 2 O y 1 tubo de MgCl 2 ; sin embargo, la cantidad proporcionada es suficiente para el uso que se describe en este kit. Tabla Uso previsto Este dispositivo es una prueba de amplificación in vitro de ácido nucléico para la detección y cuantificación de ADN genómico de Poliomavirus JC y BK a partir de los extractos de ácido nucléico obtenidos de plasma, suero, sangre y orina de seres humanos; el kit no detecta los Poliomavirus KI ni WU. La cantidad de virus que se detecte en estos fluidos corporales es una indicación de la reactivación del virus en pacientes inmunoincompetentes, en especial pacientes con trasplante renal. El objetivo de esta prueba es que sea utilizada para controlar las cantidades de poliomavirus en sangre u orina (carga viral) en pacientes con trasplante renal que se encuentren en riesgo de desarrollar nefropatía por poliomavirus (PVAN). El resultado de la prueba informará al médico de un daño inminente del riñón. El objetivo de esta prueba no es identificar subtipos virales. Los resultados se muestran como copias de virus/ml de muestra. Los poliomavirus se han propagado ampliamente en la población y se han vuelto comúnmente asintomáticos en personas sanas. La detección del virus en la orina de sujetos sanos no indica que se requiera tratamiento. Solo el personal cualificado debe usar el presente dispositivo de diagnóstico. Nota: El desempeño del ensayo solo se puede garantizar si se utiliza con instrumentos LightCycler (para obtener más detalles, consulte la sección 1.3.2). Total 96 rxs 96 rxs 96 rxs 96 rxs Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 4 de 36 Versión

5 1.3 Especificaciones Muestras clínicas La ejecución de la prueba requiere 5 µl de ADN purificado en solución acuosa. La prueba se realiza sobre el ADN extraído de la orina o de la sangre con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), del plasma o del suero. Recolecte como mínimo una muestra de 1 ml para la extracción. La sangre completa debe transportarse en un recipiente refrigerado. Las muestras de plasma y orina deben enviarse congeladas. Utilice una muestra de 200 µl, agregue 10 µl del Objetivo de control de extracción (ECT) para llevar a cabo el procedimiento de Control de extracción adicional (sec) que se encuentra descrito a lo largo de todo este manual, y extraiga 50 µl. También recuerde completar el Control sin molde (NTC, agua) mediante la incorporación del ECT (consulte la sección 7.1.3). Nota: La carga viral en la orina puede ser muy alta; en caso de que la orina se diluya antes de la extracción, recuerde incluir el factor de dilución en el cálculo de carga viral. La cantidad de virus por volumen de muestra es clínicamente relevante, mientras la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) informa de las copias que existen por reacción. El factor de conversión entre ambos números depende de los volúmenes de la muestra y de la extracción. La extracción generalmente comienza con menos de un mililitro y la prueba de PCR no utiliza todo el material extraído. La carga viral (VL) puede calcularse con la siguiente fórmula general: VL [copias/ml] = MV x EVF x SF x EY x 1/CN donde : VL = Carga viral MV = Valor Medido [número de copia por reacción] EVF = Factor del Volumen de Extracción [Volumen de extracción final / Volumen de muestra de la PCR] SF = Factor de la Muestra [1.000 µl / volumen extraído de la muestra clínica] EY = Rendimiento de la Extracción [según la especificación del fabricante] (se asume que es 1) CN = Número de Copia de la región objetivo por organismo (para el Poliomavirus es 1) Por ejemplo, 200 µl de muestra clínica extraída en 50 µl del volumen final da como resultado un factor de conversión de 50, y la VL [copias/ml] se calcula de la siguiente manera: MV x 50 µl del volumen final µl = MV x 50 x 5 µl del volumen de muestra de la PCR 200 µl del volumen extraído [copias/ml] El efecto de los diferentes volúmenes se demuestra mejor en la siguiente tabla: Volumen extraído Volumen final Volumen de muestra de la PCR Factor de conversión LOD/ml de LOD 10/rxn ( * ) Método de extracción 200 µl 100 µl 5 µl x Ácido nucléico (AN) total en 200 µl 50 µl 5 µl x MagnaPure Roche µl 35 µl 5 µl x µl 60 µl 5 µl x QIAamp EZ1 Virus µl 100 µl 5 µl x * Límite de detección (LOD) por muestra en ml que resulte de los Factores de conversión calculados y que asuman un LOD técnico de 10 copias genómicas por reacción de la PCR. Al utilizar un volumen de muestra mayor o un volumen de extracción reducido, aumenta naturalmente el nivel de sensibilidad que se pretende alcanzar (LOD), pero recuerde que este no es un factor demasiado importante para la detección de Poliomavirus, ya que la carga de virus relevante y fundamental se encuentra, en cambio, en los niveles altos. Recomendamos insertar el factor de conversión que resulte del método de extracción dentro de las curvas estándar del instrumento a fin de informar copias de virus/muestra en ml, pero esto requiere de la ejecución de Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 5 de 36 Versión

6 un protocolo de extracción estandarizado y de recordar realizar el cambio de los valores, en caso que se produzcan cambios en el método de extracción Instrumentos, software y productividad Un kit contiene reactivos para 96 reacciones realizadas en un volumen de 20 µl. Cada análisis requiere la incorporación de dos estándares y un control negativo. En la tabla siguiente se resumen algunas características del kit: Instrumento LightCycler Versión de software (o superior) Tiempo de análisis (aprox.) Máx. de muestras por análisis (2) Productividad máxima del kit (3) Productividad mínima del kit (4) LC (1) 70 min ctrl LC (1) 70 min ctrl LC min ctrl LC480 II (6) (96 pocillos) min ctrl LC480 II (6) (384 pocillos) min 381 (5) + 3 ctrl z 480 (canal abierto) min ctrl Si la prueba se realiza con los instrumentos LightCycler 1.2 o 1.5 con la versión de software 3.5, se obtienen resultados comparables. En este manual no se describen las instrucciones de programación, el análisis de los datos ni la interpretación de los resultados. Actualice a la versión 4.10 o superior siempre que sea posible. 2 Cada análisis debe incluir dos estándares y un Control sin molde (NTC) para un total de 3 reacciones de control. 3 El primer análisis del kit requiere la incorporación de 15 controles (en lugar de 3) para enseñar al módulo de cuantificación. El número máximo de muestras que se pueden procesar se reduce en consecuencia. 4 Se calcula teniendo en cuenta una sola muestra clínica analizada en cada análisis. 5 Requiere el uso de cuatro kits. 6 Este kit no puede utilizarse con la "primera versión" de LightCycler 480. Tabla Configuración de los canales (filtros) de instrumentos LightCycler Instrumento Marcaje/Nombre del canal 530 LC640 LC690 LightCycler 1.2 / 1.5 (1) F1 F2 F3 LightCycler LightCycler 480 II Analizador cobas z (1) Instrumentos con la versión de software 3.5 Tabla Almacenamiento y estabilidad Tenga en cuenta las diferentes condiciones de almacenamiento para los reactivos y la mezcla de polimerasa. Condiciones de almacenamiento Reactivos y controles: Almacene los reactivos liofilizados (PSR, Fila de dilución estándar y ADN de control) protegidos de la luz y a temperatura ambiente (de 18 C a 25 C). No congele estos reactivos liofilizados. La fecha de vencimiento está impresa en la etiqueta del kit. Mezcla de polimerasa: Almacene la LightCycler FastStart DNA Master HybProbe a una temperatura entre -15 C y -25 C. Vea la fecha de vencimiento en la etiqueta del tubo de polimerasa. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 6 de 36 Versión

7 Envío: Los productos se envían a temperatura ambiente. La estabilidad de transporte de los reactivos y los componentes de la enzima se han comprobado en esas condiciones de envío. 2. Dispositivos y reactivos adicionales 2.1 Requeridos TIB Molbiol LightMix Kit Color Compensation HybProbes N. cat.: Instrumento LightCycler 2.0 Roche Diagnostics Instrumento LightCycler 2.0 N. cat.: Software de LightCycler versión 4.05 o Discontinuado Software de LightCycler versión 4.10 o superior N. cat.: Capilares de LightCycler (20 µl) N. cat.: o Instrumentos LightCycler 480 Roche Diagnostics Instrumento LightCycler 480 II N. cat.: Sistema cobas 4800 (/Analizador cobas z 480) N. cat.: Software de LightCycler versión 1.5 o superior N. cat.: Placa LightCycler 480 Multiwell 96 blanca o N. cat.: Placa LightCycler 480 Multiwell 384 blanca N. cat.: o Instrumentos LightCycler 1.x Roche Diagnostics Instrumentos LightCycler 1.2 y 1.5 Discontinuado Versión de software 3.5.x de LightCycler (consulte el capítulo 1.3.2) Discontinuado Software de LightCycler versión 4.10 N. cat.: Capilares de LightCycler (20 µl) N. cat.: Materiales generales Tampón de fosfato (Phosphate Buffer Saline, PBS) cualquier proveedor 2.2 Opcionales Instrumentos: Roche Diagnostics Centrífuga LC Carousel 2.0 (230 V) N. cat.: Herramienta para tapar capilares N. cat.: Preparación de la muestra Preparación manual de la muestra: Roche Diagnostics Kit de preparación de plantillas de alta pureza para PCR N. cat.: o Kit para Ácido nucléico viral de alta pureza N. cat.: Agua grado PCR libre de nucleasa cualquier proveedor Etanol p.a. cualquier proveedor Isopropanol p.a. cualquier proveedor Preparación automática de la muestra: Roche Diagnostics Instrumento MagNA Pure Discontinuado Kit I de aislamiento de ADN MagNA Pure LC N. cat.: Instrumento MagNA Pure 2.0 N. cat.: Kit I de aislamiento de ADN MagNA Pure LC N. cat.: Instrumento MagNA Pure Compact N. cat.: Kit I de aislamiento de ácido nucleico MagNA Pure Compact N. cat.: Instrumento MagNA Pure 96 N. cat.: Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 7 de 36 Versión

8 Kit para volúmenes pequeños MagNA Pure 96 ADN y Viral NA N. cat.: Antecedentes 3.1 Antecedentes médicos Los Poliomavirus JC y BK son virus de ADN de doble cadena comunes en la población humana. Las infecciones de personas sanas generalmente son asintomáticas. El Virus de JC (JC Virus, JCV) es más común que el Virus de BK (BK Virus, KBV). El JCV puede atravesar la barrera hematoencefálica, ingresar al sistema nervioso central y destrozar los oligodendrocitos, lo que genera Leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML), una enfermedad neurológica que se encuentra particularmente en pacientes inmunodeprimidos (inmunodepresión por trasplante de órganos, SIDA). El BKV se ha asociado a varias enfermedades renales, como nefritis intersticial, cistitis hemorrágica y estenosis uretral. Sin embargo, lo más importante es la reactivación en personas inmunoincompetentes. Probablemente, la infección del BKV sea por vía oral. Luego de la infección primaria subclínica que ocurre normalmente durante el comienzo de la infancia, el virus se reproduce en las células epiteliales del riñón y desarrolla latencia en los tejidos renales. Las infecciones latentes del cerebro son raras. La reactivación de los poliomavirus puede producirse durante la inmunodepresión posterior a un trasplante de órganos y el SIDA, pero también luego del embarazo. La introducción de nuevos fármacos inmunosupresivos produjo el afloramiento de la Nefropatía por poliomavirus (PVAN) hasta en el 10 % de todas las personas que recibieron un trasplante de riñón, lo que generó la disfunción persistente del injerto o la pérdida del órgano. Casi la mitad de los pacientes podrían perder sus injertos, a menos que sean diagnosticados en una etapa temprana (Singh et al., 2006) 1. En este caso, la reducción de la inmunosupresión ayuda a que el paciente aumente la respuesta inmunológica antiviral, pero también se ha aplicado el tratamiento con cidofovir. Diagnóstico La presencia de células decoy infectadas por poliomavirus (microscopio) en orina y/o altos niveles de BKV y menos extendidas en JCV en orina y plasma (o sangre) detectados por PCR son una señal de alerta para PVAN. Los niveles bajos de virus no son clínicamente relevantes (Randhawa et al., 2006) 2. La detección cuantitativa del BKV en pacientes con trasplantes renales ayuda a predecir qué pacientes se encuentran en riesgo de desarrollar PVAN, y puede utilizarse para realizar un seguimiento de la respuesta que tienen frente a la terapia. Se informó que el control en serie resulta más útil que la detección por única vez. La PCR cuantitativa en tiempo real se utiliza desde hace varios años para detectar el poliomavirus (Biel et al., 2000; Narayanan et al., 2007) 3,4, y comúnmente apunta a la región génica de los antígenos T conservados. Según la bibliografía, los pacientes con más de 10 4 copias del BKV/plasma en ml o >10 7 copias/orina en ml están en riesgo de desarrollar PVAN (Hirsch et al., 2002) 5. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 8 de 36 Versión

9 La PCR cuantitativa del BKV también puede resultar útil para controlar a pacientes con trasplantes de médula ósea que se encuentran en riesgo de padecer cistitis hemorrágica. 3.2 Metodología y principio del ensayo Este dispositivo detecta un fragmento del genoma de los Poliomavirus JC o BK en el extracto de ácido nucléico obtenido de la sangre o de la orina. Este dispositivo no detecta el Poliomavirus KI (Allander et al., 2007) 6 ni WU (Gaynor et al., 2007) 7. Se desconocen su patogenicidad y prevalencia; el virus de WU se ha encontrado, especialmente, en pacientes que padecen infección grave en el tracto respiratorio. Un fragmento largo de 172 a 175 bp del gen Antígeno T pequeño se amplifica con cebadores específicos, detectado con una sonda donora fluoresceina universal y sondas virus especificas marcadas con LightCycler Red 690 para el JCV y Red 640 para el BKV,Un ensayo similar ha sido descrito por Narayanan et al., Despues de cada ciclo de PCR las sondas se unen durante el paso annealing al target generado en la PCR y lleva a los fluoroforos a un proximidad cercana, resultando en una fluorescencia de resonancia de transferencia de energia. El fluoroforo donante fluoresceina es exitada por la luz del instrumento, y parte de la energia es transferida al fluoroforo aceptor LightCycler Red. La fluorescencia emitida por el aceptor es detectada por el instrumento. Después de la ejecución la instensidad de la fluorescencia se representa frente al número de ciclos para dar una imagen de la amplificación de PCR y para calcular un crossing point (Cp) que esta relacionado con el log de la concentración del of target en la muestra. Las sondas de Hibridacion pueden ser usadas para identificar el producto de PCR realizando un analisis de curva de melting después de la amplificacion y verificar que el producto correcto ha sido formado. La Tm es dependiente de la longuitud y el contenido de G+C, pero además del grado de homologia entre la sonda sensor y el ADN template. En este dispositivo el melting point no es usado para la discriminacion de virus y ligeros cambios de temperatura son aceptables como la forma de la curva depende también de la cantidad total del producto. De todos modos, una disminución significativa en la temperatura de melting indica variación de la secuencia en la región de unión de las sondas, explicando un eventual nivel de señal baja en la cuantificación y puede ser causa para un análisis posterior de la muestra por secuenciación de ADN (por favor contactenos a : service@tibmolbiol.de). El ADN de control suministrado permite la comparación con las muestras de pacientes desconocidos. 3.3 Reacción de control The Extraction Control Target (ECT) representa el control de reacción y produce un producto de PCR adicional de 658 pb detectado con una sonda muy corta visible solamente en el analisis de la curva de melting. No interfiere con la reacción específica del virus; está diseñada para ser más sensible a la presencia de inhibidors y fallará la amplificación en presencia de muestras altamente-positivas. El control de reacción presenta un pico de melting a una baja temperatura (49 C) en el canal 640 (como el BKV) para muestras negativas y de baja concentración. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 9 de 36 Versión

10 El Objetivo de control de extracción puede utilizarse con dos procedimientos diferentes: como Control de extracción adicional (3.3.1) o Control interno (3.3.2) Control de extracción adicional (sec) El procedimiento de Control de extracción adicional (sec) controla y evalúa la presencia de inhibidores de amplificación (procedimiento recomendado) Control interno (IC) El procedimiento de Control interno (IC) evalúa la presencia de inhibidores de amplificación, únicamente (descrito para obtener compatibilidad con el formato del kit utilizado en la investigación) Características de rendimiento Especificidad analítica La especificidad del gen target y la adecuación de la amplificación por PCR empleada en la presente prueba han sido evaluadas por la secuenciación directa del ADN del amplicón. Sensibilidad analítica La sensibilidad analítica para estándares clonados es de 10 copias por PCR correspondiente a 500 copias / ml en muestras clínicas, usando el factor de conversión 50x (véase 1.3.1). La sensibilidad analítica para muestras clínicas fue de 53 copias por PCR (95%) correspondiente a 2,650 copias / ml en muestras clínicas (Rubio et al., 2010) 8. Linealidad Se informó que los valores del Cp son lineales en el rango inferior a copias del BKV/ ml y copias del JC/ ml para plasma y orina (Rubio et al., 2010) 8. Variabilidad interensayo La variabilidad interensayo se obtiene en 14 y 10 ejecuciones consecutivas para el BKV y el JCV, respectivamente; el CV fue inferior al 4 % y los ensayos demostraron una repetibilidad consistente y una alta precisión (Rubio et al., 2010) 8. Especificidad del diagnóstico Los otros virus de ADN de patógenos humanos comunes no arrojan un resultado positivo, incluso los poliomavirus relacionados WU y KI. No se observó ninguna reactividad cruzada en el BKV ni en el JCV, y no se detectaron otros virus de ADN, como el Citomegalovirus (CMV) o el virus Epstein-Barr (EBV) (Rubio et al., 2010) 8. [Especificidad del diagnóstico = 100 %]. Sensibilidad del diagnóstico El estudio de evaluación se realizó en un grupo de 76 muestras adicionales y en un segundo conjunto de 22 especímenes positivos y 23 especímenes negativos (Rubio et al., 2010) 8 : Sensibilidad del BKV de la orina = 96,5 % Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 10 de 36 Versión

11 Sensibilidad del BKV del plasma = Sensibilidad del JCV de la orina = Sensibilidad del JCV del plasma = Sensibilidad promedio del diagnóstico = 100,0 % 96,4 % 100,0 % 97,9 % 4. Precauciones y advertencias Requisitos de manipulación El presente producto es un dispositivo de diagnóstico in vitro, por lo que debe ser utilizado por personal cualificado. Para manipular los materiales de laboratorio genéricos, es necesario tomar precauciones generales. El laboratorio de trabajo debe cumplir con las prácticas estándares. Debido al riesgo de contaminación, la preparación y amplificación de la PCR debe realizarse en zonas físicas separadas. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No utilice los reactivos después de la fecha de vencimiento. Utilice la versión del manual que se entrega con el kit (consulte la etiqueta del kit). Procedimientos de laboratorio generales Todos los materiales de origen humano y desechos relacionados deben considerarse como potencialmente infecciosos. Limpie por completo y trate todas las superficies de trabajo con desinfectantes aprobados por las autoridades locales. No coma, beba ni fume en el área de trabajo del laboratorio. No use las pipetas con la boca. Use guantes de protección desechables, guardapolvos y protección ocular adecuada durante la manipulación de las muestras y los componentes del kit. Evite la contaminación microbiana o por nucleasa de los reactivos durante el pipeteado de las alícuotas. El uso de puntas estériles desechables es fundamental. Lávese bien las manos después de manipular las muestras y los componentes del kit. Preparación de la muestra Con respecto a la manipulación y la eliminación, consulte las instrucciones de seguridad incluidas en el prospecto del producto empleado (consulte el capítulo 2.3). Amplificación y detección Antes de utilizar este producto, lea el Manual del usuario de LightCycler. Por favor salve un archivo de las muestras para identificar cada posición en el carrusel para permitir la identificación correcta de la muestra. Compruebe la configuración del instrumento LightCycler y asegúrese de que coincida con la que se indica en la siguiente sección "Protocolo de la PCR" específica de su instrumento. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 11 de 36 Versión

12 No toque la superficie del capilar ni la cubierta de la placa sin guantes. Consulte todas las instrucciones operativas y de seguridad del instrumento LightCycler. Manejo de residuos Deseche los reactivos no utilizados y los residuos de acuerdo con las leyes vigentes. 5. Preparación de la muestra 5.1 Preparación del Objetivo de control de extracción (ECT) Centrifugue el tubo a revoluciones por minuto (RPM) durante 1 minuto, disuelva el ECT en 1,2 ml de PBS (no se suministra con el kit), mezclar y centrifugar Uso del ECT como Control de extracción adicional (recomendado) Agregue 10 µl de Objetivo de control de extracción por 200 µl de muestra a extraer. 5.2 Plasma Realice la purificación del ácido nucléico con el kit Roche High Pure PCR Template Preparation o un instrumento de MagNA Pure con el kit de extracción adecuado (Kit de extracción Virus Total NA, consulte la sección 2. Dispositivos y reactivos adicionales) y como se describe en los respectivos protocolos de extracción. 5.3 Orina La orina se puede extraer con kits diseñados para extracción de sangre o suero. Lleve a cabo la purificación de ácidos nucleicos utilizando el kit Roche High Pure PCR Template Preparation o los instrumentos MagNA Pure LC con el kit de extracción adecuado para el instrumento MagNA Pure utilizado (consulte la sección 2. Dispositivos y reactivos adicionales) como se describe en los respectivos protocolos. Evite el procedimiento de control de extracción adicional si el extracto viene sucesivamente diluido, en lugar utilizar el procedimiento CI 5.4 Sangre completa Para preparar el ADN genómico, utilice sangre periférica humana (EDTA). Se desaconseja ampliamente el uso de heparina, dado que podría interferir con la PCR. Realice la purificación de ácidos nucléicos con el kit Roche High Pure PCR Template Preparation o los instrumentos de MagNA Pure LC con el kit de extracción de Virus Total NA adecuado para el Instrumento de MagNA Pure utilizado (consulte la sección 2. Dispositivos y reactivos adicionales) como se describe en los respectivos protocolos. 5.5 Factores de conversión Se tiene que tener en cuenta el volumen inicial de la muestra biológica y el volumen del búfer de elución utilizado en la purificación del ADN para calcular el número de copias virales expresado en copias/ml (consulte la sección 1.3.1). Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 12 de 36 Versión

13 Controles Número de copias virales expresado en copias/ml Tabla 4 Copias/ reacción Muestra de 200 µl/ Elución de 100 µl Muestra de 200 µl/ Elución de 50 µl Muestra de 200 µl/ Elución de 35 µl Vol. de elución x vol. de muestra/200 1E x 10 1E x 100 1E x E x E x E x BK x JC x Programación 6.1 Compensación de colores La compensación de colores es obligatoria para utilizar el Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK. Si se analizan los datos con la función 'Compensación de color' desactivada, se generarán lecturas no válidas de los resultados. 6.2 Instrumentos de capilares Para obtener más detalles, consulte el Manual del usuario de LightCycler. El protocolo está compuesto por cuatro pasos del programa (Tabla.5): 1. Desnaturalización de la muestra y activación de la enzima 2. Amplificación del ADN target 3. Melting identificación de la secuencia de ADN amplificada por PCR 4. Enfriamiento del instrumento Step: Parameter Analysis Mode None Quantification mode Melting Curves mode None Cycles Target [ C] Hold [hh:mm:ss] 00:10:00 00:00:05 00:00:05 00:00:15 00:00:20 00:00:20 00:00:0 0 00:00:30 Ramp Rate [ C/s]* Sec Target [ C] Step Size [ C] Step Delay [cycles] Acquisition Mode None None Single None None None Cont. None * Para los instrumentos LightCycler 1.x con software versión 3.5.3, consulte 'Tasa de transición de temperatura' [ C/seg] en lugar de Nivel aceleración. Tabla 5: Programación de instrumentos para capilares del Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 13 de 36 Versión

14 Nota: Durante la programación, mantenga los valores de software predeterminados: Muestras máx. = 32 y tamaño de capilares = 20 µl. Establezca la temperatura pretendida = 40 C y el canal = 640. Almacene el programa y los valores predeterminados como 'RUN Template' que pueden cargarse para iniciar el análisis de LightCycler para Poliomavirus JC y BK. Justo antes de comenzar el análisis, modifique el valor de máx. de muestras (predeterminado = 32) por el número de muestras más los controles incluidos en el análisis para evitar que el instrumento se detenga debido a la falta de capilares. Para obtener las instrucciones, consulte el Manual del usuario. 6.3 LightCycler 480 II y cobas z 480 Analyzer Para obtener más detalles, consulte el Manual del usuario de LightCycler. Formato de detección: TIB MOLBIOL Consulte el manual: LightMix Kit Color Compensation HybProbes Cat. N Volumen de la reacción: 20 µl Programación: El protocolo consta de cuatro pasos de programa (Tabla.6): 1. Desnaturalización de la muestra y activación de la enzima 2. Amplificación del ADN target Melting identificación de la secuencia de ADN amplificada por PCR 3. Enfriamiento del instrumento Step: Parameter Analysis Mode None Quantification mode Melting Curves mode None Cycles Target [ C] Acquisition Mode Hold [hh:mm:ss] Ramp Rate [C / s] 96 Ramp Rate [C / s] 384 Acquisitions [per C] Sec Target [ C] Step Size [ C] Step Delay [cycles] None None Single None None None Cont. None 00:10:00 00:00:05 00:00:05 00:00:15 00:00:30 00:02:00 00:00:00 00:00: , Tabla 6: Cómo programar el instrumento basado en multipocillos (formatos de 96 y 384 pocillos) y el instrumento de z 480 para utilizar el Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 14 de 36 Versión

15 Nota: a) Almacene el programa y los valores predeterminados como 'RUN Template'que pueden cargarse para iniciar el análisis de LightCycler para Poliomavirus JC y BK. b) Asegúrese de programar solo 1 adquisición por segundo en lugar del valor predeterminado c) más adquisiciones reducen la pendiente de la curva de fusión, aumentan el tiempo de experimentación y causan el mal funcionamiento del kit. 7. Protocolo experimental Programe el instrumento antes de preparar las soluciones (consulte la sección 5. Programación y lea el Manual del usuario de LightCycler para conocer los detalles). 7.1 Preparación de reactivos LightCycler FastStart DNA HybProbe Master 1 Mantenga la enzima LightCycler FastStart Enzyme 1a fría. Descongele la mezcla de reacción LightCycler FastStart 1b 2 calentando el tubo a C por 3-5 minutos. 3 Centrifugar rápidamente los tubos para recoger gotas. 4 La solución debe estar libre de partículas. 5 Agregue 60 µl de 1b al vial 1a. Mezcle la solución cuidadosamente con una pipeta. No agite. 6 Evite la formación de burbujas. 7 Centrifugar rápidamente los tubos para recoger gotas. 8 Utilice el reactivo para preparar la mezcla de reacción (consulte la sección 6.3). 9 Almacene el sobrenadante del reactivo a 4 C Preparación de reactivos específicos del parámetro (PSR) Cada tubo de reactivo PSR es suficiente para 32 reacciones. 1 Centrifugar el tubo de PSR premezclado a rpm durante 1 minuto. 2 Comprobar que el pellet se encuentra en la parte inferior 3 Agregue 66 µl de agua grado PCR a cada tubo de PSR. 4 Deje incubar durante 20 segundos a temperatura ambiente. 5 Mezcle con el Vortex durante 10 segundos. 6 Centrifugar rápidamente los tubos para recoger gotas. Use 2 µl de reactivo PSR para obtener una reacción de la PCR de 20 µl Sin control de plantillas (NTC) Llene el vial NTC con 950µl de agua graduada para la PCR. Agregue 50 µl de ECT, solo si ejecuta el procedimiento de Control de extracción adicional (sec) (consulte los capítulos y 5.1). El procedimiento NTC alcanza para 32 reacciones y para la preparación de estándares / controles. Use 5 µl de NTC para obtener una reacción de la PCR de 20 µl. No manipule el procedimiento NTC en el mismo lugar donde se utiliza la Tira estándar y los Controles. Nota: La extracción de un plásmido ya purificado no es tan eficiente como el ADN nativo, el factor de dilución compensa la pérdida esperada. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 15 de 36 Versión

16 7.1.4 Diluyentes para la Tira estándar y los Controles (DIL) Llene un vial limpio con 950µl de agua graduada para la PCR. Solamente si se ejecuta el spiked Extraction Control (sec) proceder a agregar 50 µl de ECT (véase capítulos y 5.1). DIL)es suficiente para la preparación de todos los estándares / controles: Debe prepararse en el momento y desecharse de inmediato, luego de su uso. La DIL, que se utiliza cerca de la Tira estándar y de los Controles podría contaminarse Preparación de tiras estándar El software de LightCycler puede calibrarse con los estándares de referencia para realizar una cuantificación automatizada de las muestras clínicas desconocidas. EL ADN del plásmido que se encuentra en el fondo de los pocillos de la tira es de color azul para mejorar su visualización. La concentración más baja (1E1 copias/reacción) se identifica por medio de una punta más larga (lip). 1 Sin alterar el pellet que se encuentra en el fondo del pocillo, perfore la tapa de aluminio con la punta de una pipeta, desde el pocillo N. 1(1E1 copias/reacción). Usando una nueva punta por cada pocillo: 2 Agregue 40 µl de DIL. 3 Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces 4 Deseche la punta. Use 5 µl de Estándares para una reacción de Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces PCR de Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces Todos los estándares deben utilizarse solo una vez para calibrar el módulo de cuantificación (primer análisis del lote); las tiras deben sellarse y desecharle de inmediato luego de la validación del lote. Tenga en cuenta: La apertura de los viales puede causar contaminaciones en el espacio de trabajo (aerosol) Preparación de controles positivos Cada tubo de reactivo de Control alcanza para 32 reacciones. Los controles se utilizan en ejecuciones posteriores para recuperar la curva estándar de la primera ejecución. 1 Centrifugar los dos tubos a RPM durante 1 minuto. 2 Compruebe que el pellet azul esté ubicado en la parte inferior del tubo. 3 Disuelva el pelet agregando 160 µl de DIL. 4 Deje incubar durante 20 segundos a temperatura ambiente. 5 Vortezar por 10 segundos y centrifugar los tubos para recolectar las gotas Use 5 µl de cada Control para obtener una reacción del PCR de 20 µl. En cada análisis, deben utilizarse los dos Controles. Tenga en cuenta: La apertura de los viales puede causar contaminaciones en el espacio de trabajo (aerosol). 7.2 Preparación de la mezcla de reacción Utilice el sec que figura en la columna izquierda o el procedimiento de Control de extracción adicional (consulte la sección y 5.1). Utilice el Control interno que figura en la columna derecha (IC) para el procedimiento de Control interno (consulte la sección 3.3.2) Preparación de la mezcla de 32 reacciones Recomendamos preparar las 32 reacciones para evitar el almacenamiento de reactivos disueltos o activados en diferentes volúmenes. Para preparar la mezcla de reacción en menos cantidad de muestras, diríjase hasta el paso Mezcla de reacción para una Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 16 de 36 Versión

17 sola reacción". Prepare la mezcla de reacción en el tubo del reactivo PSR: sec IC Componentes 32 reacciones Al tubo de PSR (tapa roja) que ya contiene 66.0 µl 66.0 µl Agregue: H2 O, graduada para PCR (tapa transparente) µl µl Solución de Mg 2+ de 25 mm (tapa azul) 66.0 µl 66.0 µl LightCycler FastStart DNA Master HybProbe (tapa roja), consulte la sección µl 66.0 µl El ECT, cuando se utiliza como Control interno (IC) (tapa blanca), consulte 33.0 µl --- la sección Reemplace la "tapa de cuello largo" del tubo de PSR con la tapa roja de FastStart Volumen total µl µl Tabla 7: Volúmenes de los componentes para preparar la mezcla de 32 reacciones Preparación de la mezcla de una sola reacción Prepare la mezcla de reacción al multiplicar cada volumen por el número de muestras biológicas que se analizarán, más cuatro reacciones (NTC, dos Controles, un exceso). En el primer análisis, agregue los doce Estándares. Prepare la mezcla de reacción en un vial enfriado: sec IC Componentes Una sola reacción H 2 O, grado PCR (tapa incolora) 9.0 µl 8.5 µl Solución de Mg 2+ de 25 mm (tapa azul) 2.0 µl 2.0 µl PSR (tapa azul), consulte la sección µl 2.0 µl LightCycler FastStart DNA Master HybProbe (tapa roja), consulte la sección µl 2.0 µl El ECT, cuando se utiliza como Control interno (IC) (tapa blanca), consulte la sección µl Volumen de la mezcla de reacción 15.0 µl 15.0 µl Tabla 8: Volúmenes de los componentes para preparar una mezcla de una sola reacción Pipetee la mezcla de reacción suavemente hacia arriba y hacia abajo. Un alto porcentaje de falla en el experimento se debe a una mezcla de reacción no homogénea Procedimiento de carga de capilares / pocillos Cada análisis debe incluir un Control negativo (NTC) para demostrar la ausencia de contaminaciones en el ADN diana o producto de la PCR, y al menos dos controles para garantizar el rendimiento del kit. Procedimiento de carga de capilares/pocillos Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 17 de 36 Versión

18 Recuerde incluir los controles cuando se pone a punto la ejecución. 1 Mezcle suavemente, centrifugue y compruebe la ausencia de burbujas de aire en el vial de la mezcla de reacción. 2 Distribuya 15 µl por capilar/pocillo de la mezcla de reacción. Obligatorio: Agregue 5 µl de H 2 O grado PCR como control negativo (NTC). en la posición 1 (A1). 3 Agregue 5 µl de Agregue 5 µl de JC+ Control BK+ Control en la posición 2 (A2). en la posición 3 (A3). En el primer análisis, únicamente: Agregue 5 µl de diluyentes para tiras del JCV en las posiciones 4 a 9 (de A4 a A9). Agregue 5 µl de diluyentes para tiras del BKV en las posiciones 10 a 15 (de A10 a A15). 4 Agregue 5 µl de la muestra en los capilares/pocillos restantes. 5 Cierre el capilar/pocillo y la centrífuga. Compruebe que no haya burbujas de aire. 6 Coloque el rotor/la placa en el instrumento de LightCycler. 7 Solo para usuarios de capilares: ingresar el número de muestras 8 Comience el análisis. 9 Introduzca el nombre del experimento cuando se solicite. 10 Guarde los datos de la muestra en la ventana de las muestras. * Consulte la sección 7.4 sobre la Carga de muestras y la calibración de estándares. 7.3 Almacenamiento y estabilidad de componentes diluidos Mezcla de reacción La mezcla de reacción completa contiene el Reactivo parámetro-específico (PSR), LightCycler FastStart DNA Master HybProbe y MgCl 2 se puede almacenar refrigerada (de 4 C a 8 C) durante 30 días. Evite la exposición prolongada a la luz. Reactivos específicos de parámetros (PSR) Una vez diluido, almacene el PSR refrigerado a una temperatura de 4 C a 8 C durante un período máximo de 30 días. LightCycler FastStart DNA Master HybProbe La mezcla maestra de FastStart (1a+1b) se puede almacenar refrigerada (de 4 C a 8 C) durante 30 días. Controles Los Controles disueltos se mantienen estables durante 30 días cuando se almacenan refrigerados (de 4 C a 8 C). Cuando son utilizados por un período de tiempo más prolongado, alicuótelos y almacénelos congelados a -20 C. Los controles almacenados a - 20 C se mantienen estables durante 180 días. Nota: Más de cinco (5) ciclos de congelamiento y descongelamiento de los controles podría producir un cambio en el valor de Cp, comparado con el vial que se disuelve en el momento; evite el uso del control cuando el valor de Cp cambia más de 1 ciclo. Estándares (Tira) Selle las tiras de inmediato luego de su uso, con el sellador que viene incluido, y deséchela después de la validación del lote. Se podría producir contaminación en el espa- Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 18 de 36 Versión

19 cio de trabajo y se podría evaporar el contenido de las tiras disueltas y no selladas. Las tiras de estándares disueltos se mantienen estables durante solo un día. 7.4 Cómo cargar estándares y controles Ejecuciones de rutina: Los Controles están resumidos en la siguiente tabla Pos. Nombre de la muestra Canal LC1.5 / 2.0 Canal LC480II Canal z 480 Tipo de muestra Copias por reacción De 498 a 640 De 498 a 645 Negativo --- NTC De 498 a 660 De 498 a 670 Negativo De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JC + Control De 498 a 660 De 498 a 670 Estándar 1.00E De 498 a 640 De 498 a 645 Estándar 1.00E5 BK + Control De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido Tabla 8 Los valores de la concentración insertada en la tabla mencionada anteriormente son las copias por reacción. Corrija los números mediante el Factor de conversión (consulte las secciones y 5.5). Primer análisis: Para el primer análisis (repita una vez por lote), utilice las filas de dilución y los dos controles. En la siguiente tabla se resumen los atributos de los estándares: Pos. Tipo de la muestra Canal LC1.5 / 2.0 Canal LC480II Canal z 480 Tipo de muestra Copias por reacción De 498 a 640 De 498 a 645 Negativo --- NTC De 498 a 660 De 498 a 670 Negativo De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JC + Control De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido BK + Control De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JCV De 498 a 660 De 498 a 670 Estándar 1.00E De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JCV De 498 a 660 De 498 a 670 Estándar 1.00E De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JCV De 498 a 660 De 498 a 670 Estándar 1.00E De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JCV De 498 a 660 De 498 a 670 Estándar 1.00E De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JCV De 498 a 660 De 498 a 670 Estándar 1.00E De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JCV De 498 a 660 De 498 a 670 Estándar 1.00E De 498 a 640 De 498 a 645 Estándar 1.00E1 BKV De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido De 498 a 640 De 498 a 645 Estándar 1.00E2 BKV De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido De 498 a 640 De 498 a 645 Estándar 1.00E3 BKV De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido De 498 a 640 De 498 a 645 Estándar 1.00E4 BKV De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido De 498 a 640 De 498 a 645 Estándar 1.00E5 BKV De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 19 de 36 Versión

20 De 498 a 640 De 498 a 645 Estándar 1.00E6 BKV De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido Tabla 9 Los valores de la concentración insertada en la tabla mencionada anteriormente son las copias por reacción. Corrija los números mediante el Factor de conversión (consulte las secciones y 5.5). Ejemplo de análisis: adaptado a copias / volumen: Para un volumen de muestra de 200 µl y un volumen de extracción final de 50 µl, utilice el factor de corrección x50 que da como resultado copias/ml en 'JC + control' y copias/ml en 'BK + control' : Pos. Tipo de muestra Canal LC1.5 / 2.0 Canal LC480II Canal z 480 Tipo de muestra Copias por muestra en ml De 498 a 640 De 498 a 645 Negativo --- NTC De 498 a 660 De 498 a 670 Negativo De 498 a 640 De 498 a 645 Desconocido JC + Control De 498 a 660 De 498 a 670 Estándar 5.00E De 498 a 640 De 498 a 645 Estándar 5.00E6 BK + Control De 498 a 660 De 498 a 670 Desconocido Tabla Instrumentos de capilares En Samples data - Capillary View (Datos de muestras - Vista de capilares), introduzca el nombre de la muestra como se describe en la segunda columna. Seleccione Analysis Type Abs Quant (Tipo de análisis - Cant. abs.). Únicamente seleccione los canales 640 y 705. En el menú desplegable, seleccione Sample Type (Tipo de muestra), como se indicó anteriormente e introduzca la concentración correspondiente. Para las versiones de software 3.5 de LightCycler 1.x, consulte el Manual del usuario Instrumentos de placas En la ventana Sample Editor (Editor de muestra), en la sección Step1: Select Workflow (Paso1: Seleccionar flujo de trabajo), seleccione Abs Quant (Cant. abs.). Introduzca la descripción en la columna Sample Name (Nombre de la muestra), En el menú desplegable, seleccione Quantification Sample Type (Tipo de muestra de cuantificación), como se indicó anteriormente e introduzca la concentración correspondiente. 8. Análisis e interpretación de datos 8.1 Límites e interferencias La presente prueba es específica para Poliomavirus JC y BK. Algunos virus que parecen ser positivos para el JCV y el BKV serán variantes del BKV que cuentan con una secuencia alterada en la región de unión de la sonda; consulte la sección 8.7. No se detectaron otros Poliomavirus, como KI y WU. En este ensayo, se desconocen interferencias particulares. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 20 de 36 Versión

21 8.2 Calibración La calibración debe realizarse conforme al procedimiento descrito en las secciones 7.1.5, 7.1.6, 7.2.3, 7.4, y Control de calidad: criterios de aceptación Para realizar un análisis de cuantificación confiable, es fundamental que se incluya el Control negativo NTC y todos los Controles en cada análisis. Además de los reactivos necesarios para detectar el JCV y el BKV, el PSR contiene además cebadores y sondas para la amplificación de un objetivo externo del ADN (ECT) incorporado a la PCR luego de los procedimientos de Control interno adicional (sec) (consulte la sección 3.3.1) o de Control interno (IC) (consulte la sección 3.3.2). Al final de la ejecución de un análisis de curva de fusión, aparecerá el pico de fusión en LC640 a una temperatura de 49 C, lo cual indicará la amplificación del ECT. La amplificación, realizada a una temperatura de annealing de 55ºC asegura que la temperatura de la ECT no es visible, por lo tanto no interfiere con la cuantifiación de BKV. Activar la compensación de color. Si se analizan los datos con la función 'Compensación de color' desactivada, se generarán lecturas no válidas de los resultados Control negativo (NTC) El Control negativo (NTC) es obligatorio: imita las muestras clínicas negativas. El análisis de amplificación del NTC debe proporcionar un resultado negativo. Si se visualiza alguna amplificación en cualquiera de los canales, se ha producido una contaminación o un error de pipeta; la sesión no es válida y debe repetirse todo el proceso (amplificación y detección). Si el problema persiste, cambie el agua y/o los reactivos y repita la sesión. El análisis de la curva de fusión del NTC debe proporcionar un resultado positivo. Un pico de melting de la amplificación del ECT debe ser detectado (Tm = 49ºC). Si no se encuentra el pico de fusión del ECT en el canal 640 a 49 C o se encuentra un pico de fusión a una temperatura diferente, o un pico en el canal 690, la sesión no es válida y se debe repetir todo el proceso (amplificación y detección) BK+ Control o Estándares Una curva de BK + Control o Estándares es obligatoria: imita las muestras positivas. El análisis de amplificación del BK + Control o Estándares debe proporcionar una amplificación positiva en el canal 640. El Cp debe satisfacer los resultados esperados (consulte la sección 8.5) Si no se encuentra la amplificación, consulte la instrucción en la sección Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 21 de 36 Versión

22 Si se observa alguna señal de amplificación de BK+ Control o Estándares en el canal 690, la sesión no es válida y se debe repetir todo el proceso. El análisis de la curva de fusión de BK+ Control o de Estándares debe proporcionar una curva de fusión con un Tm de aproximadamente 65 C en el canal 640; además, el pico de fusión del ECT a 49 C se detectarán en muestras con número de copia bajo; el ECT falla en las muestras con número de copia alto. Si en el canal 690 se encuentra un pico de fusión de BK+ Control y Estándares, la sesión no es válida y se debe repetir todo el proceso (amplificación y detección) JC+ Control o Estándares Es obligatoria una curva de JC + Control o una curva completa de Estándares. JC + Control imita las muestras clínicas positivas del JCV. El análisis de amplificación del JC + Control o Estándares debe proporcionar una amplificación positiva en el canal LC690. El valor del Cp debe satisfacer los resultados esperados (consulte la sección 8.5). Si no se encuentra la amplificación, consulte la instrucción en la sección Si se registra alguna señal de amplificación de JC+ Control o Estándares en el canal 640, la sesión no es válida y se debe repetir todo el proceso (amplificación y detección). El análisis de la curva de fusión de JC+ Control o Estándares debe proporcionar una curva de fusión con un Tm = 69 C en el canal 690. En el canal 640, pico de fusión del ECT (49 C) se detectará en muestras con número de copia bajo; el ECT falla en muestras con número de copia alto; si se encuentra algún otro pico de fusión en JC+ Control y Estándares en el canal 640, la sesión no es válida y se debe repetir todo el proceso (amplificación y detección) Fallas en las ejecuciones de Controles y estándares Los datos completos de las filas estándar y de controles son fundamentales para obtener resultados precisos para ejecuciones posteriores en muestras de pacientes. Puntos individuales de datos faltantes o los valores aberrantes individuales de la fila estándar (probablemente un error de pipeteo) en un análisis en el cual todos los demás resultados cumplen con los valores esperados de Ct que se describen en el certificado de análisis, pueden "deshabilitarse" al establecer el Tipo de muestra como "desconocido" (consulte la sección 7.4). En cualquier análisis que no tenga el número de copia más bajo, se debe repetir la curva de inmediato con el número de copia más bajo en triplicado, dado que no es posible validar el rendimiento del kit ni almacenar una curva estándar adecuada. Se debe registrar la desviación. Las ejecuciones que no arrojen resultados adecuados en los controles deben repetirse, de lo contrario, no es posible recuperar la curva estándar almacenada (consulte la sección 8.4) Antes de repetir un análisis, considere los errores comunes; verifique en especial el perfil de amplificación, utilice la mezcla maestra correcta y la concentración de MgCl 2 ; recuerde que el almacenamiento inadecuado de los reactivos podría causar una falla en el dispositivo Muestras Muestras clínicas positivas: Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 22 de 36 Versión

23 El Análisis de amplificación brinda una amplificación positiva en el canal correspondiente (640 para el BKV y 690 para el JCV). Nota:Se han observado muestras positivas en ambos canales. El análisis de la curva de fusión debe arrojar una curva de fusión en el canal correspondiente con un Tm = 56 C-65 C en el canal 640 o un Tm = 69 C en el canal 690. El pico de fusión derivado del ECT a un Tm = 49 C en el canal 640 se visualizará únicamente en muestras que tengan una copia de virus baja. Muestras clínicas negativas: El análisis de amplificación no brinda ninguna señal de amplificación en ninguno de los canales. El análisis de la curva de fusión debe exhibir el pico de fusión derivado del ECT a un Tm = 49 C en el canal 640. Las muestras clínicas que no muestran amplificación ni picos de fusión del ECT no son válidas y se debe repetir todo el proceso (preparación de la muestra, amplificación y detección) Valores de amplificación fuera del rango del Cp El software indicará todas las muestras biológicas que presenten valores fuera de las curvas estándar con un mensaje que dice out of range (fuera de rango). Informe las muestras de la siguiente manera: positive above 1E6 quantification limit (positiva por encima del límite de cuantificación 1E6) cuando el Cp sea superior a 1E6 y positive below 1E1 quantification limit (positiva por debajo del límite de cuantificación 1E1) cuando el Cp sea inferior a 1E1. Los mensajes "fuera de rango" son comunes Curvas de fusión anómalas A veces, se informan curvas de fusión anómalas que son generadas por variantes virales (consulte la Fig. 12 para obtener un ejemplo conocido). En este último caso otro método debe ser utilizado para la comparación / verificación del producto amplificado. Envíe el fragmento de la PCR para la secuenciación del ADN y confirmar la identificación viral. Informe las desviaciones a service@tib-molbiol.de. Siéntase libre de enviar muestras con curvas de melting desviadas a los laboratorios de Berlín para confirmar los resultados obtenidos por secuenciación de ADN. 8.4 Cómo guardar la curva de estándares externos Luego del análisis de cuantificación, verifique si los Controles y Estándares cumplen con los criterios de aprobación (consulte la sección 8.3 Control de calidad: criterios de aprobación), y verifique si los valores del Cp se encuentran dentro del ran- Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 23 de 36 Versión

24 go exigido (consulte el certificado de análisis), guarde la Curva de estándares de la siguiente manera y recupere las curvas en todas las ejecuciones sucesivas Instrumentos de capilares Análisis de cuantificación absoluta: en el menú desplegable Standard curve (In Run) (Curva estándar (en Análisis)), seleccione Save standards as External (Guardar estándares como Externos)... Repita el procedimiento para cada canal Instrumentos de placas En la ventana de análisis "Abs Quant/2nd Derivative Max" (Cant. abs./2. cant. máx. derivada) - "Calculate" (Calcular), en el menú Standard curve (In Run) (Curva estándar (en Análisis)), seleccione Save standards as External (Guardar estándares como Externos...). Repita el procedimiento para cada canal. 8.5 Cómo leer los resultados Realice el análisis de datos como se describe en los manuales del usuario de LightCycler. Active la compensación de color. Analizar los datos sin 'compensación de color' (con la función desactivada) generará lecturas inválidas de los resultados Análisis de fusión: Instrumentos para capilares Visualice los datos de la amplificación del JCV en LC 690 y de la amplificación del BKV en LC 640. Visualice los datos de la siguiente manera: En el Sistema LightCycler 2.0 (versión de software 4.0.5), seleccione: Modo de análisis de Absolute Quantification (Cuantificación absoluta). En el Sistema LightCycler 1.x (versión de software 4.0.5), seleccione: Modo de análisis de Absolute Quantification (Cuantificación absoluta). En el Sistema LightCycler 1.x ( 3.5), seleccione: Modo de Quantification Second Derivative Maximum (Cuantificación - Segunda cant. máx. derivada). Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 24 de 36 Versión

25 LC 690 1) El NTC debe mostrar una línea plana 2) JC + 4) JCV-1 5) JCV-2 6) JCV-3 7) JCV-4 8) JCV-5 9) JCV-6 Compare con los valores esperados del Cp que se describen en el certificado de análisis. Los Controles del BKV (líneas de color verde) deben mostrar una línea plana. Fig. 1: Datos de la muestra de amplificación del JCV. LC 640 1) El NTC debe mostrar una línea plana 3) BK + 10) BKV-1 11) BKV-2 12) BKV-3 13) BKV-4 14) BKV-5 15) BKV-6 Compare con los valores esperados del Cp que se describen en el certificado de análisis. Los Controles del JCV (líneas de color negro y amarillo) deben mostrar una línea plana. Fig. 2: Datos de la muestra de amplificación del BKV. Nota: Los valores del Punto de cruce (Cp) pueden variar ±1,5 ciclos entre diferentes experimentos. En caso de variaciones, consulte las instrucciones: Falta de amplificación en controles o estándares Análisis de la curva de fusión: Instrumentos para capilares Visualice los datos de la curva de fusión de sec/ic y BKV en LC640. Visualice los datos de la siguiente manera: En el instrumento de LightCycler 2.0 (versiones de software 4.0.5), seleccione: Curva de fusión: Modo de análisis Tm Calling (Llamada del Tm). En el instrumento de LightCycler 1.x (versiones de software 3.5), seleccione: Curva de fusión: Modo de análisis Melting Curve Manual Tm (Curva de fusión Tm manual). Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 25 de 36 Versión

26 LC640 Curva de fusión del BK a una temperatura de 59 a 66 C 1) El NTC NO debe mostrar ningún pico de fusión 2) El JC + NO debe mostrar ningún pico de fusión 3) BK + un pico de fusión de 64 C Muestras negativas NO muestran ningún pico de fusión Muestra positiva muestra un pico de fusión a una temperatura de 56 a 65 C Curva de fusión del ECT a 50 C 1) El NTC debe mostrar un pico de fusión 2) JC + debe mostrar un pico de fusión 3) BK + no es relevante Muestras negativas deben mostrar un pico de fusión Muestras positivas no son relevantes Fig. 3: Curva de fusión para ECT y BKV. Nota: Los valores de las temperaturas de fusión (Tm) del IC pueden variar ± 2,5 C entre diferentes experimentos. El Tm de las muestras positivas del BKV varía entre 56 y 65 C (consulte la sección 8.7. Picos de fusión inusuales para conocer los detalles). Curva de fusión del JCV en el canal LC690. La curva de fusión de las muestras positivas de JC + control y JCV no es relevante. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 26 de 36 Versión

27 8.5.3 Análisis de amplificación: Instrumentos para placas Visualice los datos de la amplificación del BKV en LC640 y de la amplificación del JCV en LC690. Visualice los datos de amplificación de la siguiente manera: En los instrumentos de LightCycler 480 II, seleccione: Amplificación: Modo de análisis Abs Quant/2nd Derivative Max (Cant. abs./2. cant. máx. derivada). LC690 1) El NTC debe mostrar una línea plana 2) JC + 4) JCV-1 5) JCV-2 6) JCV-3 7) JCV-4 8) JCV-5 9) JCV-6 Compare con los valores esperados del Cp que se describen en el certificado de análisis. Los Controles del BKV (líneas de color verde) deben mostrar una línea plana. Fig. 4: Datos de la muestra de amplificación del JCV. LC640 1) El NTC debe mostrar una línea plana 3) BK + 10) BKV-1 11) BKV-2 12) BKV-3 13) BKV-4 14) BKV-5 15) BKV-6 Compare con los valores esperados del Cp que se describen en el certificado de análisis. Los Controles del JCV (líneas de color negro y amarillo) deben mostrar una línea plana. Fig. 5: Datos de la muestra de amplificación del BKV. Nota: Los valores del Punto de cruce (Cp) pueden variar ±1,5 ciclos entre diferentes experimentos. En caso de variaciones, consulte las instrucciones: Falta de amplificación en controles o estándares. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 27 de 36 Versión

28 8.5.4 Análisis de la curva de fusión: Instrumentos para placas Visualice los datos de la curva de fusión de sec/ic y BKV en LC640. Visualice los datos de amplificación de la siguiente manera: En los instrumentos de LightCycler 480 II, seleccione: Curva de fusión: Modo de análisis Tm Calling (Llamada del Tm). LC640 Curva de fusión del BK a una temperatura de 59 a 66 C 1) El NTC NO debe mostrar ningún pico de fusión 2) El JC + NO debe mostrar ningún pico de fusión 3) BK + un pico de fusión de 64 C Muestras negativas NO muestran ningún pico de fusión Muestra positiva muestra un pico de fusión a una temperatura de 56 a 65 C Curva de fusión del ECT a 50 C 1) El NTC debe mostrar un pico de fusión 2) JC + debe mostrar un pico de fusión 3) BK + no es relevante Muestras negativas deben mostrar un pico de fusión Muestras positivas no son relevantes Fig. 6: Curva de fusión para ECT y BKV. Nota: Los valores de las temperaturas de fusión (Tm) del IC pueden variar ± 2,5 C entre diferentes experimentos. El Tm de las muestras positivas del BKV varía entre 56 y 65 C (consulte la sección 8.7. Picos de fusión inusuales para conocer los detalles). Curva de fusión del JCV en el canal LC690. La curva de fusión de las muestras positivas de JC + control y JCV no es relevante. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 28 de 36 Versión

29 8.6 Tabla de interpretación Primero, verifique los resultados obtenidos de los controles. Para lograr un análisis válido, se deben aprobar todos los controles: LC690 Amplificación Controles LC640 Amplificación LC640 Fusión Resultados NTC Negativo Negativo De 49 C a 50 C Control negativo aprobado Negativo Negativo Sin pico Amplificación Amplificación no son relevantes Controles positivos Error en el Control negativo Verifique si se utilizó el sec/ic. Error en el Control negativo Contaminación! Repita! Amplificación Negativo De 49 C a 50 C (1) JC+ Control positivo aprobados Negativo Negativo no son relevantes Error en JC+ Control positivo Negativo Amplificación De 56 C a 65 C (1) BK+ Control positivo aprobados Negativo Negativo no son relevantes Error en BK+ Control positivo Luego, lea los resultados de las muestras clínicas: LC690 Amplificación Muestra clínica LC640 Amplificación Nota: (1) El pico del ECT podría estar ausente LC640 Fusión Resultados Tabla 11 Negativo Negativo De 49 C a 50 C Amplificación Negativo no son relevantes Negativo para BKV / JCV (no detectable) Positivo para JCV Determinar carga viral Negativo Amplificación De 56 C a 66 C De 49 C a 50 C no son relevantes Positivo para BKV Determinar carga viral Amplificación Amplificación De 56 C a 66 C De 49 C a 50 C no son relevantes Negativo Negativo Sin pico Positivo para JCV y BKV (1) Determinar carga viral Problema/inhibición de la muestra: Repita desde la preparación de la muestra Informe la carga viral de todas las muestras positivas. (1) Si el Cp es el mismo en el BKV y en el JCV (+/- 0,5 Cp), es BKV. Consulte el capítulo 8.1 u 8.7 Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 29 de 36 Versión

30 8.7 Picos de fusión inusuales Tabla 12 La variación en las secuencias del virus produce diferente homología entre el producto de la PCR y las Sondas de hibridización; los gráficos representan la variabilidad esperada. LC640 Curva de fusión del BKV a una temperatura de 56 a 66 C Los diferentes subtipos de BKV producen la variación de la curva de fusión. El Tm esperado para la mayoría de los subtipos comunes I, V y VI es de aproximadamente 65 C; el Tm para los subtipos III y IV es de aproximadamente 61 C. Consulte la nomenclatura descrita en la ref. 9. No utilice el pico de fusión para la identificación del subtipo. Fig. 7: Rango de curva de fusión para el BKV. LC690 Curva de fusión del JCV a una temperatura de 63 a 73 C Los diferentes subtipos de JCV producen la variación de la curva de fusión. Nota: Varias muestras biológicas, como las que incluyen los estándares y controles de JC +, no producen una curva de fusión clara (Línea de color negro). Este evento es esperado. Fig. 8: Curva de fusión para el JCV. 8.8 Muestras de la Evaluación de calidad externa (EQA) Para ejecutar las muestras de la EQA, verifique las cantidades declaradas por ml y compárelas con el límite de detección de este dispositivo en los volúmenes de extracción correspondientes. Adapte, si es necesario, los volúmenes de la muestra y de la extracción antes de ejecutar las muestras de la EQA para detectar muestras de baja concentración. Kit LightMix para Poliomavirus JC y BK Página 30 de 36 Versión